Summary
Door in situ vloeistof Scanning elektronen microscopie presenteren we een procedure voor real-time beeldvorming en elementaire samenstelling analyse van böhmiet deeltjes in gedeïoniseerd water.
Abstract
In situ beeldvorming en elementaire analyse van böhmiet (AlOOH) deeltjes in water wordt gerealiseerd met behulp van het systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm Interface (SALVI) en Scanning elektronenmicroscopie (SEM). Deze paper beschrijft de methode en sleutel stappen bij de integratie van het vacuüm compatibel SAVLI SEM en verkrijgen van secundaire elektron (SE) beelden van deeltjes in de vloeistof in hoog vacuüm. Energie dispersieve x-stralen spectroscopie (EDX) wordt gebruikt voor het verkrijgen van de elementaire analyse van deeltjes in de vloeistof en controle monsters met inbegrip van gedeïoniseerd water (DI) alleen en een leeg kanaal ook. Samengestelde böhmiet (AlOOH) deeltjes die in de vloeistof worden gebruikt als een model in de vloeibare SEM-afbeelding. De resultaten tonen aan dat de deeltjes in de SE modus met goede resolutie image kunnen worden gemaakt (dat wil zeggen, 400 nm). Het spectrum AlOOH EDX toont belangrijke signaal van de aluminium (Al) in vergelijking met de DI-water en de lege kanalige aansturing. In situ vloeibare SEM is een krachtige techniek om te studeren van deeltjes in de vloeistof met veel interessante toepassingen. Deze procedure heeft tot doel technische know-how om te voeren vloeibare SEM beeldvorming en EDX analyse met behulp van SALVI en om potentiële valkuilen bij het gebruik van deze aanpak.
Introduction
Scannende elektronenmicroscoop (SEM) is algemeen toegepast om te onderzoeken van een verscheidenheid van specimens door het produceren van hoge resolutie beeldvormende1. De energie dispersieve x-stralen spectroscopie (EDX) die zijn gekoppeld aan de SEM kan de bepaling van elementaire samenstelling1. SEM wordt traditioneel toegepast voor imaging-alleen droge en vaste monsters. In de afgelopen dertig jaar, werd milieu SEM (ESEM) ontwikkeld voor het analyseren van de gedeeltelijke gehydrateerd monsters in een damp milieu2,3,4,5. ESEM is echter niet in staat om het imago van de natte, volledig vloeibare monsters met gewenste hoge resolutie6. Natte SEM cellen werden ook ontwikkeld voor afbeelding NAT specimens met SEM7,8; echter deze cellen werden ontwikkeld vooral voor biologische specimens terugverstrooide elektron imaging en meer toegankelijk zijn voor toepassingen met deze ontwerpen9,10.
Om de uitdagingen in het analyseren van verschillende monsters in hun oorspronkelijke vloeibare omgeving met behulp van SEM, we een vacuüm compatibel microfluidic apparaat, systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm Interface (SALVI), om hoge ruimtelijke resolutie secundaire uitgevonden elektron (SE) beeldvorming en elementaire analyse van vloeibare monsters met behulp van de hoog vacuüm modus in SEM. Deze nieuwe techniek omvat de volgende unieke eigenschappen: 1) vloeistof direct wordt onderzocht in een klein diafragma van 1-2 µm in diameter; 2) vloeistof wordt gehouden binnen het gat door oppervlaktespanning; en 3) SALVI is draagbaar en kan worden aangepast aan meer dan één analytische platform11,12,13,14,15,16,17 ,18.
SALVI bestaat uit een 100 nm dikke siliciumnitride (SiN) membraan en een 200 µm breed microchannel gemaakt van Polydimethylsiloxaan (PDMS) blok. Het venster van de membraan zonde wordt toegepast om te verzegelen de microchannel. De details van de fabricage en de belangrijke ontwerpoverwegingen waren gedetailleerd in vorige documenten en octrooien11,19,20. Op dit moment, heeft een toonaangevende fabrikant en distributeur van verbruikbare aanbod voor microscopie gekocht de licentie te verkopen SALVI apparaten commercieel voor vloeibare SEM toepassingen-21,22.
De toepassingen van SALVI in vacuüm gebaseerde analytische instrumenten zijn aangetoond met behulp van een verscheidenheid van waterige oplossingen en complexe vloeibare mengsels met inbegrip van biofilms, cellen van zoogdieren, nanodeeltjes en elektrode materialen12, 14 , 17 , 20 , 23 , 24. echter de meeste van de bovengenoemde werkzaamheden secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie (ToF-SIMS) gebruikt als de belangrijkste analysefunctie, dus de toepassing van vloeistof SEM met SALVI is niet volledig onderzocht. In dit werk, is SALVI gebruikt om te studeren van grotere niet-bolvormige colloïdale deeltjes in de vloeistof met behulp van vloeibare SEM beeldvorming en de elementaire analyse EDX. Het voorbeeld bestaat uit AlOOH deeltjes gesynthetiseerd in ons laboratorium. Submicrometer middelgrote böhmiet deeltjes zijn bekend in hoogradioactief afval op de Hanford site. Ze zijn traag te ontbinden en Rheologische problemen kunnen veroorzaken in de afvalverwerking. Daarom is het belangrijk dat de mogelijkheid om het karakteriseren van böhmiet deeltjes in de vloeibare25. Deze technische benadering kan worden gebruikt om te studeren van böhmiet in verschillende fysisch-chemische voorwaarden voor beter begrip van deze deeltjes en bijbehorende reologische eigenschappen. Deze deeltjes werden gebruikt om aan te tonen hoe hoog vacuüm SEM SALVI toepassen om te studeren in vloeistof zwevende deeltjes stapsgewijze. Belangrijkste technische punten voor SALVI en SEM integratie en SEM data-acquisitie worden gemarkeerd in het papier.
Het protocol biedt demonstratie van de analyse van de vloeibare monster met behulp van SALVI en vloeibare SEM imaging, voor degenen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van deze nieuwe techniek in diverse toepassingen van vloeibare SEM in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiden AlOOH vloeibare monster
Opmerking: Raak niet het model of iets binnen de SEM-kamer met blote handen. Poeder gratis handschoenen moeten gedragen worden in alle tijden wanneer behandeling het SALVI-apparaat en mounten op de SEM etappe teneinde mogelijke besmetting tijdens oppervlakteanalyse.
- Maken van een stamoplossing van AlOOH (1 mg/mL)
- los AlOOH poeder in 10 mL DI water om de 1 mg/mL stockoplossing AlOOH 10 mg.
- Ultrasonicate de stockoplossing voor 5 min.
Opmerking: De pH van de stockoplossing is ongeveer 4,6 van een pH-meter gemeten. De oplossing voor pH is niet aangepast en zoals het is in dit werk gebruikt.
- Maken een verdunde oplossing van 10 µg/mL
- de stamoplossing van het AlOOH tot 10 µg/mL 1 mg/mL verdund door verstrekking van 1 mL in 99 mL DI water via Pipetteer.
- Ultrasonicate de oplossing voor 5 min.
Opmerking: De pH van de stockoplossing is ongeveer 5,8 van een pH-meter gemeten na verdunning.
2. Sputter jas het SALVI zonde membraan venster met Carbon
- Invoegen de staaf van de koolstof in de roede houder.
Opmerking: De staaf houder kan worden geïdentificeerd als het stuk dat is gekoppeld aan het scharnierende deksel. - Gebruiken een paar pincet en verwijder voorzichtig de tape op de SALVI ' s zonde membraan raamkozijn.
Opmerking: De tape wordt gebruikt ter bescherming van de membraan van de zonde voordat oppervlakteanalyse. - Beveiligen het rechtop in de koolstof-coater kamer met behulp van koolstof tape om op te lossen de polytetrafluorethyleen buis van het SALVI-apparaat op het podium van de coater SALVI-apparaat. Sluit het deksel.
- Druk op de " macht " knop tot de vacuümpomp.
- Druk op de " spanning " knop op het voorpaneel van de koolstof-coater en de waarde instelt op 4,6 V door aanpassing van de up (▲) en naar beneden (▼) knoppen voor deze bewerking.
Opmerking: De instelling van de spanning kan verschillen als gevolg van verschillende koolstof coaters. - Inschakelen de laagdikte monitor door over te schakelen op de " macht " knop. Schakel de lezing weergegeven in het scherm van " dikte (nm) " tot nul door op de knop " nul " als de lezing niet nul is. Druk op de " TIMER " op de koolstof-coater ' s voorpaneel om de afzetting tijd tot 30 s door het aanpassen van de up (▲) en naar beneden (▼) knoppen.
- Houden de koolstof-coater ' s bedieningsmodus in op automatisch door over te schakelen van de knop " AUTO ◄ ► MANUAL " op " AUTO ". Schakelaar de " START/STOP " knop " START " wanneer het vacuüm bereikt ongeveer 4 × 10 -4 mbar zoals gemeten door de vacuum-meter op de koolstof-coater ' s voorpaneel.
- Zodra de dikte monitor geeft aan dat de coating van de koolstof heeft bereikt 20 nm, druk op de " stoppen " knop te beëindigen van het coatingproces en het vacuüm zegel vent.
- Open het deksel en de koolstof gecoat SALVI apparaat met behulp van vinylhandschoenen bij het verwerken van het apparaat nemen.
Opmerking: Coating van het monster met carbon maakt een geleidende laag op het monster remmen het opladen effect en verbetering van het SE signaal nodig zijn voor de SEM beeldvorming. Bewaar het gecoate apparaat veilig in een schone petrischaal met een cover totdat het apparaat is klaar om te worden geïnstalleerd in de SEM-fase. Om ervoor te zorgen dat het membraan van de zonde is voldoende bekleed, is het aanbevolen om het apparaat na de coating visueel te controleren. Als de coating niet dik genoeg is, een tweede keer van sputter coating kan worden toegepast met de dikte gemeten tot 10 nm.
3. Montage van de apparaat en gebruik SEM/focus Ion Beam (FIB) aan openingen maken op de SALVI zonde membraan met behulp van FIB
- de SEM specimen zaal Open
- Open de bijbehorende Microscoop besturingssoftware op het SEM-instrument besturingscomputer.
Opmerking: De controle-software kan variëren als gevolg van verschillende SEMs. - Vent het specimen kamer door te klikken op " Vent " op de grafische gebruikersinterface (GUI) van de software van de controle van het bijbehorende Microscoop onder " Beam Control " tabblad om te openen de deur van de kamer.
- De kamer deur open zorgvuldig (zodra ontluchting is voltooid).
- Open de bijbehorende Microscoop besturingssoftware op het SEM-instrument besturingscomputer.
- Mount het SALVI-apparaat op het podium van SEM
Opmerking: controleren van het oppervlak van het membraan van de zonde om te zien of het intact ofwel visueel of met behulp van een lichte Microscoop vóór montage. Het SALVI apparaat gemonteerd op de SEM-fase moet de detector Everhart Thornley Detector (ETD) binnen het specimen kamer niet aanraken.- Selecteer de standaard SEM monster houder stub. De stub vast in het midden van het werkgebied met de juiste bout en hex moersleutel.
- Plaats twee stroken van koolstof dubbelzijdige tape op de stub.
- Stick het SALVI-apparaat op de koolstof-tape geplaatst op de stub met de zonde membraan zijde naar omhoog
- Veilig immobiliseren de SALVI op de stub met behulp van een extra twee stroken van koper tape ' single-sided binden het SALVI PDMS blok aan de SEM metalen stub. Daarnaast gebruiken de koperen tapes om verbinding te maken met het frame van de zonde en de metalen stub. Zorg ervoor dat de tape niet volledig de zonde membraan dekt.
Opmerking: Het gebruik van koolstof- en koper-tapes helpen zorgen voor een continue vliegverbod pad voor de verwijdering van heffing van de zonde-membraan tijdens de SEM-meting. De positie van de tape op de rand van het frame van de zonde is zeer belangrijk, omdat het zorgt voor aarding en vermindert opladen tijdens de analyse. De onderzijde van het apparaat moet ook volledige contact hebben met de SEM-stub via koolstof dubbelzijdige tape. De band moet geen betrekking op het membraan van de zonde om mogelijke schade in behandeling voorkomen.
- Pomp beneden het specimen kamer
- de specimen kamer deur dicht. Selecteer de " hoog vacuüm "-modus op de SEM software GUI onder de " Beam Control " pagina.
- Klik op de " pomp " knop op de " Beam Control " pagina start stofzuigen en toepassen van druk met de hand op de deur van de kamer totdat het gewenste vacuüm is vastgesteld.
Opmerking: De kamer druk moet ten minste 1,0 × 10 -5 Torr bereiken en moet gestaag blijven op of onder deze waarde voor imaging. Dit is een belangrijke stap om de resolutie zeer opgelost voor imaging. De druk-instelling kan worden gecontroleerd van de juiste hoek van de GUI.
- Maken van openingen in het membraan van de zonde met behulp van FIB
- activeren de elektronenbundel opnamegebied door te klikken op de " onderbreken " pictogram op de werkbalk. De elektronenbundel inschakelen door te klikken op de " balk op " knop op de " Beam Control " pagina. Selecteer de ETD-detector en de SE-modus voor beeldvorming van de " detectoren " drop-down menu.
Opmerking: De detector kan variëren als gevolg van verschillende configuratie van de SEMs. De detector in-lens is ook van toepassing voor vloeibare SEM analyse. - Link de Z coördineren waarde voor de werkelijke Free werkt afstand (FWD) waarde door te klikken op de " Link " pictogram op de werkbalk. Instellen van de afstand (WD) als 10 mm door te typen het aantal 10 in het tekstvak coördinaat " Z " op de " navigatie " pagina wanneer de " werkelijk " afstand is geselecteerd.
Opmerking: De WD kan variëren als gevolg van verschillende SEMs. - De elektronenbundel huidige instelt op 0.47 nb, de versnellende spanning tot en met 8 keV, en de resolutie 1024 × 884 van de desbetreffende keuzelijsten weergegeven op de werkbalk op de elektronenbundel opnamegebied.
Opmerking: De huidige en de spanning instelling kunnen variëren als gevolg van verschillende SEMs. - Zoek de microchannel (0,2 x 1,5 mm) door het verdraaien van de " X " en " Y " Schakelpook op het bord van de handleiding User Interface (MUI) te observeren het live beeld op de monitor control. Teken een lijn parallel aan de microchannel van de ene kant naar de andere met behulp van de muis. Klik op " xT uitlijnen functie " uit het drop down menu van " stadium " tabblad op de werkbalk en selecteer " horizontale " uitlijnen de microchannel.
- Stelt de fase tilt tot 0 ° door de waarde uit te schakelen de " T " keuzelijst op de " navigatie " pagina. Zoek een functie van de verschillende deeltjes in de buurt van de microchannel en centreren onder het gele kruis door het bewegen van de etappe, met behulp van de " X " en " Y " Schakelpook. Vergroten van de functie 1.000 X en draai de " Contrast ", " helderheid ", " grof ", en " fijn " knoppen op het MUI voor het optimaliseren van het beeld van de functie van de particle.
- De etappe naar 15 ° kantelen door het selecteren van de waarde van de " T " keuzelijst op de " navigatie " pagina. Gebruik " Z-control " door te drukken beneden het wieltje op de muis en sleep de functie terug onder het gele kruis op het scherm van de elektronenbundel opnamegebied nadat het werkgebied wordt gekanteld.
- Het toneel weer tot 30 ° kantelen en brengen de functie weer onder het Kruis met behulp van de " Z-besturingselement ". Het werkgebied terug naar 0 ° kantelen en observeren van de locatie van de functie; de hoogte van de eucentric wordt bevestigd als de functie doet niet aanzienlijk verschuiving.
Opmerking: Het lokaliseren van de hoogte van de eucentric wordt uitgevoerd om de ion beam en de elektronenbundel gericht op dezelfde positie te bereiken goede FIB precisie frezen te houden. Herhaal de processen in stap 3.4.6 als de functie aanzienlijk verschuivingen na de fase terug naar 0 ° kantelen. De hoogte van de eucentric moet worden aangepast voor elk nieuw gemonteerde monster voor de grootste nauwkeurigheid.
- Het toneel weer tot 30 ° kantelen en brengen de functie weer onder het Kruis met behulp van de " Z-besturingselement ". Het werkgebied terug naar 0 ° kantelen en observeren van de locatie van de functie; de hoogte van de eucentric wordt bevestigd als de functie doet niet aanzienlijk verschuiving.
- Het podium tot 52° kantelen door het selecteren van de waarde van de " T " keuzelijst op de " navigatie " pagina.
Opmerking: De kantelbare mate kan variëren als gevolg van verschillende SEMs. - Deactiveren de " onderbreken " pictogram op de werkbalk door te klikken op de knop om ervoor te zorgen dat de Ion beam opnamegebied brandt. Het gallium bron ion beam inschakelen door te klikken op de " balk op " knop onder de " Beam Control " pagina.
- De versnellende spanning van de ion beam ingesteld op 30 keV en balk huidige naar 0.3 nA deze door waarden te selecteren van de overeenkomstige spanning en huidige keuzelijsten op de werkbalk gelegen. De microchannel brengen naar het midden van dit opnamegebied.
- Kiezen van de cirkel als het patroon door het selecteren van deze functie in de keuzelijst van " patroon " op de " patronen " pagina. Instellen de " buitendiameter " tot 1 µm, de " binnendiameter " naar 0 µm, de " Z grootte " tot 500 nm, en het " wonen tijd " aan 1 µs in het bijbehorende tekstvak.
- Type " Si " in de " toepassing " tekstvak omdat het hoofdonderdeel van het over-te-worden-gemalen detectie-venster is siliciumnitride. Klik vervolgens op de " patronen menu/Start patronen " knop om te beginnen de gaatjes in de detectie-venster waarop de microchannel frezen. Herhaal het frezen proces meerdere keren te verkrijgen van een aantal ronde gaten. In een experiment, verschillende gaten kunnen geschieden.
Opmerking: De gaten zijn 100 µm uit elkaar, van de ene kant van de microchannel naar de andere. Verplaats snel naar het minimaliseren van de schade van de lichtbundel op de membraan van de zonde. Het SEM-FIB frezen proces gewoonlijk begint vanaf de zeer linker- of weerszijden van de microchannel nummer de openingen gemakkelijk te volgen. De operator kan kiezen om te gaan vanuit de onderkant of de bovenkant afhankelijk van de oriëntatie van het kanaal en de persoonlijke voorkeur. Zorgen dat het SEM FIB frezen is voltooid en voldoende, zodat het model kan worden gesondeerd binnen de openingen.
- Type " Si " in de " toepassing " tekstvak omdat het hoofdonderdeel van het over-te-worden-gemalen detectie-venster is siliciumnitride. Klik vervolgens op de " patronen menu/Start patronen " knop om te beginnen de gaatjes in de detectie-venster waarop de microchannel frezen. Herhaal het frezen proces meerdere keren te verkrijgen van een aantal ronde gaten. In een experiment, verschillende gaten kunnen geschieden.
- activeren de elektronenbundel opnamegebied door te klikken op de " onderbreken " pictogram op de werkbalk. De elektronenbundel inschakelen door te klikken op de " balk op " knop op de " Beam Control " pagina. Selecteer de ETD-detector en de SE-modus voor beeldvorming van de " detectoren " drop-down menu.
- De kamer na de SEM/FIB vent
- het podium terug naar 0 ° kantelen door het selecteren van 0 van de " T " keuzelijst op de " navigatie " pagina. Zowel de elektronenbundel en ion beam uitschakelen door te klikken op " Beam op " Wanneer de bijbehorende balk opnamegebied is geactiveerd. Klik op " Vent " op de " Beam Control " pagina om te ventileren van de kamer van het specimen.
4. Laden SALVI met vloeibare monsters
- de SALVI met behulp van DI water schoon
- zorgvuldig de SEM kamer deur open nadat het volledig is geventileerd, en het apparaat SALVI laten zoals het is in het werkgebied.
Opmerking: Om tijd te besparen op de montage van het apparaat en zich te concentreren, wordt aangeraden om te houden van het apparaat op het podium tijdens het laden van het monster. - Trekken 1 mL DI water in een steriele injectiespuit sluit de spuit met de inlaat van het microfluidic-apparaat met behulp van een adapter van polytetrafluorethyleen buis montage en langzaam het injecteren van de vloeistof voor 3-5 min.
Opmerking: Een spuitpomp wordt aanbevolen voor alle maatregelen waar het injecteren van oplossingen in de SALVI vereist is. Dit kan gebeuren in deze stap door het instellen van een 1 mL steriele injectiespuit met de oplossing voor een debiet van 100-250 µL/min. met behulp van een spuitpomp op een constant debiet kan verminderen de kans op schade aan de zonde membraan. - Herhaal stap 4.1.2 driemaal met 1 mL 10 µg/ml AlOOH, bereid in stap 1, om de concentratie van het monster wordt niet verdund door het water DI voorgeladen.
- Na de injectie, het verwijderen van de spuit. Sluit de inlaat en uitlaat van SALVI met behulp van het polyether ether keton Unie. Iedere vloeistof buiten het SALVI met lab doekjes droog. Als er bubbels binnen de polytetrafluorethyleen buis- of microchannel, opnieuw de AlOOH monster injectie totdat er geen luchtbellen worden gezien binnen de buis polytetrafluorethyleen.
Opmerking: Draai de polyether ether keton Unie. Gebruik niet teveel kracht wanneer aanscherping van de Unie te vermijden dat er een aanzienlijke interne drukverhoging binnen in het apparaat SALVI, die leiden schade aan de zonde membraan tot kan.
Opmerking: De bubbels in de microchannel kunnen gevolgen hebben voor het scannen en veroorzaken beeld shIFT. Iedere vloeistof buiten het apparaat de vacuüm toestand zal beïnvloeden, dus de buitenkant van de SALVI en polytetrafluorethyleen buis voorafgaand aan het invoegen om de Vacuuemcel grondig moet worden gedroogd. Het apparaat moet bovendien geen fysieke schade (bijvoorbeeld bezuinigen op de buis, gebroken zonde membraan venster) die tot het lekken leidt. Anders, de kamer druk bereikt mogelijk niet de gewenste hoog vacuüm, bubbels kunnen vormen in de slang en het vloeibare monster zullen verloren gaan tijdens het stofzuigen.
- zorgvuldig de SEM kamer deur open nadat het volledig is geventileerd, en het apparaat SALVI laten zoals het is in het werkgebied.
5. Vloeibare SEM Imaging en elementaire analyse
- nemen de beelden met behulp van de ETD detector en SE mode
- sluit de deur van de kamer specimen. Selecteer de " hoog vacuüm "-modus op de SEM software GUI onder de " Beam Control " pagina. Klik op de " pomp " knop op de " Beam Control " pagina om te starten met het stofzuigen en hand druk uitoefenen op de deur van de kamer totdat het gewenste vacuüm is vastgesteld.
- Activeren de elektronenbundel opnamegebied door te klikken op de " onderbreken " pictogram op de werkbalk. De elektronenbundel inschakelen door te klikken op de " balk op " knop op de " Beam Control " pagina. Selecteer de ETD-detector en de SE-modus voor beeldvorming van de " detectoren " drop-down menu.
- Instellen de versnellende spanning tot en met 8 keV en balk 0.47 nA stroom van de corresponderende keuzelijsten weergegeven op de werkbalk van de GUI op de elektronenbundel opnamegebied. Instellen van de WD als 7 mm door het getal te typen " 7 " in het tekstvak van de coördinaat " Z " op de " navigatie " pagina wanneer de " werkelijk " afstand is geselecteerd.
Opmerking: De parameters van de lichtbundel spanning, stroom en afstand kunnen variëren als gevolg van verschillende SEMs.
- Instellen de versnellende spanning tot en met 8 keV en balk 0.47 nA stroom van de corresponderende keuzelijsten weergegeven op de werkbalk van de GUI op de elektronenbundel opnamegebied. Instellen van de WD als 7 mm door het getal te typen " 7 " in het tekstvak van de coördinaat " Z " op de " navigatie " pagina wanneer de " werkelijk " afstand is geselecteerd.
- Vergroten de functie 1000 × en draai de " Contrast ", " helderheid ", " grof ", en " fijn " knoppen op het MUI voor het optimaliseren van het beeld van de functie van de particle.
- Center het eerste gat in het live beeld van de elektronenbundel opnamegebied door het verdraaien van de " X " en " Y " Schakelpook op het MUI-bord. De beelden met deeltjes aan vergroting 200.000 × vergroten door het draaien het " vergroting " knop op het MUI-bord. Selecteer de schermresolutie " 1024 × 884 " uit de keuzelijst op de werkbalk.
- Instellen de scanfrequentie als 30 µs in de keuzelijst op de werkbalk. Druk op F4 om de momentopname van de huidige afbeelding weergegeven in de elektronenbundel opnamegebied.
- Druk op Ctrl + S sleutels op te slaan van het afbeeldingsbestand voor de as.tif naar de gewenste locatie met de gedefinieerde bestandsnaam met inbegrip van een oplopend nummer.
- Zoomen door te draaien de " vergroting " knop te vinden het volgende aangrenzende gat. Herhaal de bewerkingen in stappen 5.1.4 - 5.1.6 om het imago van de AlOOH deeltjes in de rest van de gaatjes.
- Uitvoeren van elementaire analyse met behulp van EDX
- Invoegen de energie dispersieve spectroscopie (EDS)-detectoren in de bedwelmingsruimte.
- Selecteer de ETD-detector op de Microscoop controle monitor en SE-modus voor het bekijken van het monster op de electron beam opnamegebied. De versnellende spanning ingesteld op 8 keV, de huidige 0.47 nb en de WD tot 7 mm zoals beschreven in stap 5.1.2.
- De AlOOH deeltjes in elk gat met vergroting 200.000 X vergroten door het draaien het " vergroting " knop op het bord MUI.
Opmerking: Houd de elektronenbundel gericht op dezelfde plek zodat meer gelokaliseerde elementaire informatie. Een afbeelding van AlOOH vindt u in Figuur 1a. - Open de bijbehorende software voor EDAX.
Opmerking: De bijbehorende software kan variëren als gevolg van verschillende instrumenten ' configuraties. - Klik " beginnen met het opnemen van nieuwe spectra " in de gebruikersinterface (UI) voor het verzamelen van het spectrum van EDX. Selecteer " Peak ID " om te kiezen van de waarschijnlijke elementen van het spectrum. Type in waargenomen elementen, bijvoorbeeld, zuurstof in dit geval, in de " Element " veld. Klik op " toevoegen " toe te passen van het element op het spectrum.
- Klik op " bestand " en klik vervolgens op " opslaan als ". Opslaan van de spectrale gegevens in.csv formaat met behulp van de naam van het gewenste bestand voor verdere plotten met behulp van een grafische software.
- Herhaal de bewerkingen in stappen 5.3.3 - 5.3.6 opnemen de EDX spectrum van elke hole.
- Na het beëindigen van de beeldvorming en spectrum opnemen voor elk van de gaten, uitschakelen de elektronenbundel door te klikken op " Beam op " knop op de " Beam Control " pagina wanneer de elektronenbundel opnamegebied ingeschakeld is. Het SEM-kamer ventileren door te klikken op " Vent " op dezelfde pagina. Het monster van het podium zorgvuldig te nemen door het verwijderen van alle tapes, nadat de kamer deur openstaat.
- Herhaal de procedure om uit te voeren van de experimenten van de controle met behulp van het DI-water en een lege microchannel.
6. De EDX-Spectrum plot
- the.csv spectrum-bestand importeren in een grafische software.
- Plot het spectrum met behulp van de energie-niveau als de x-as en de intensiteit ontvangen en verwerkt door de EDX als de y-as te tonen van de gereconstrueerde spectra, zoals in Figuren 2a , 2b en 2 c.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve resultaten om aan te tonen hoe de deeltjes zijn beeld worden gepresenteerd en geanalyseerd met behulp van in situ vloeibare SEM imaging, in combinatie met EDX. De resultaten omvatten SE afbeeldingen en spectra van EDX. De SE beelden werden verkregen op 100.000 X en 200.000 X vergrotingsfactor in Figuur 1. Figuur 1a beeldt het SE beeld van de AlOOH, Figuur 1b DI water en Figuur 1 c het gat in een leeg kanaal. De beelden werden verkregen door toepassing van SE met 8 keV versnellende spanning en 0.47 nb beam stroom. De schermresolutie die gebruikt was 1024 × 884 met een scanfrequentie van 30 µs. dienovereenkomstig, Figuur 2 toont de EDX spectra van de AlOOH deeltjes in water (Figuur 2a), DI watermonster (Figuur 2b) en het gat in een leeg kanaal (gevonden Figuur 2 c), op basis van de gemeten elementaire samenstelling. De EDX spectra werden verkregen met behulp van de huidige hetzelfde en de spanning instellen als die voor de SE beelden. De diepte van de informatie is uit de ondiepe regio aan het monster oppervlak als gevolg van de keuze van laagspanning. De ruwe gegevens van de elementaire spectra is uitgestuurd as.csv bestand en uitgezet met behulp van een grafische software voor presentatie.
Figuur 1: SE Images. Deze beelden werden verkregen door toepassing van SE met 8 keV versnellende spanning en 0.47 nb beam stroom. De schermresolutie die gebruikt was 1024 × 884 met een scanfrequentie van 30 µs. (1a) AlOOH bij 200, 000 X, (1b) DI water op 100, 000 X (1 c) en een leeg kanaal op 200, 000 X. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: EDX Spectra. EDX spectra werden verworven in de SE modus met 8 kV versnellende spanning en 0.47 nb beam stroom. (2a) Spectrum van AlOOH in water. (2b) Spectrum van DI water monster. (c) Spectrum van het gat in een leeg kanaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SEM is een krachtige techniek in de karakterisering van het oppervlak van organische en anorganische materialen op een niveau van de nanoschaal (nm) met hoge resolutie1. Bijvoorbeeld, wordt het wijd gebruikt voor het analyseren van de solide en droge monsters zoals geologische materialen26 en halfgeleider27. Het heeft echter beperkingen in het karakteriseren van de natte en vloeibare monsters als gevolg van de incompatibiliteit van vloeistof binnen de zeer Stofzuig omgeving vereist voor elektronenmicroscopie1. SEM monstervoorbereiding vaak vereist uitdroging of een gehydrateerde monster, en met name biologische monsters2trekkers. Dientengevolge, is het uitdagend om de informatie van natuurlijk gehydrateerd of vloeibare stalen, nauwkeurig te vangen als hun intrinsieke informatie mogelijk verloren tijdens de sample voorbereiding proces28,29. Dit kan omvatten maar is niet beperkt tot, biologische activiteit in cellen, synthese van nanodeeltjes in oplossing, aggregatie van deeltjes in complexe vloeistof en elektrochemische reacties. Hoewel de ESEM beeld kunt gehydrateerd monsters in een omgeving met gecontroleerde damp, kon de resolutie van de afbeeldingen niet zo hoog als de SEM-beelden van de solide monsters in de hoog vacuüm modus30,31,32 bereiken , 33. onlangs, natte monsters werden gedekt door een elektron transparante dunne film6 of verzegeld door een specimen capsule30 toen SEM werkte, en terugverstrooide elektronen werden verzameld voor beelden met behulp van deze aanpak.
SALVI is een veelzijdig microfluidic-interface die oppervlakteanalyse van vloeistoffen met behulp van vacuüm gebaseerde instrumenten zoals TEM en ToF-SIMS heeft ingeschakeld. 11 , 12 , 13 , 14 onze techniek met behulp van SALVI en geoptimaliseerd SEM voorwaarden kan SE beelden en EDX compositorische informatie bieden. Figuur 1a presenteert de SE afbeelding van böhmiet deeltjes op DI water met een submicron-schaal (400 nm) en hoge vergroting van 200.000. Het SEM-beeld toont de morfologie en de distributie van de böhmiet deeltjes in vloeibare, dat bevestigt dat de deeltjes in de vloeistof kunnen worden gezien en veilig binnen de membraan van de zonde door oppervlaktespanning20gehouden. Cijfers 1b toont daarentegen de SE beelden van de DI-water binnen het gat op 100.000 × vergrotingsfactor. Het biedt direct bewijs dat het water kunnen vasthouden door de oppervlaktespanning zonder lekken buiten. Bovendien, was de kamer druk constant gehouden op 1.0 × 10-5 Torr tijdens de meting. Figuur 1 c presenteert een gat in een leeg kanaal met 200.000 × vergroting; niets wordt waargenomen binnen het gat onder de huidige hetzelfde voltage instellingen en. De SE vloeibare imaging mogelijkheid via deze aanpak levert hoge resolutie SE beelden in vergelijking met de resolutie van de micrometer van terugverstrooide elektron beelden verkregen met behulp van de gerapporteerde natte SEM techniek30.
EDX elemental toewijzing wordt geleid gebruikend AlOOH deeltjes in DI water, DI water alleen en het lege kanaal, respectievelijk. De laatste twee worden gebruikt als referentie controles. Zoals blijkt uit Figuur 2a, de aluminium-piek treedt op bij ongeveer 1,5 keV met belangrijke signaal, hoewel er geen prominente piek aan dezelfde energie in het DI-water en de lege kanaal EDX spectra verschijnen. De zuurstof-signaal is dominant in zowel AlOOH als DI water, die bevestigt dat dit signaal afkomstig is van water. Dit bevestigt verder dat deeltjes worden ondergedompeld in water tijdens imaging. De C en Si pieken in cijfers 2a, 2b en 2 c zijn van de koolstof-coating op het venster van de detectie en de zonde membraan vormen het detectie-gebied, respectievelijk. De N-piek is ook van het membraan van de zonde. De EDX vergelijking toont de detectie van de aluminium samenstelling van AlOOH in water, die aangeeft dat de böhmiet deeltjes inderdaad worden nageleefd.
In eerdere artikelen, hebben we de haalbaarheid van het gebruik van een microfluidic cel en hoog vacuüm SEM beeld en karakteriseren van het vloeibare monster, aangetoond met behulp van DI water en immunoglobuline G (IgG) gouden nanodeeltjes12,20. In deze eerdere werken, gouden nanodeeltjes kleiner waren dan 10 nm. In dit werk, tonen we dat böhmiet deeltjes met een veel grotere maten (< 100 nm) kan ook worden bestudeerd door middel van vloeibare SEM. De grootte van het gat werd berekend om voldoende opnamegebied nog genoeg oppervlaktespanning te houden van de vloeistof binnen. Oorspronkelijk werd het gat vervaardigd met behulp van de gallium ion beam om ronde openingen van 2 µm in diameter vóór de vergadering van het apparaat in de oorspronkelijke uitvinding12,20. In deze update, laten we zien dat de detectie openingen kunnen worden gemaakt nadat het apparaat is gemonteerd, waardoor het hele proces meer gestroomlijnd. Een kan ook open te stellen zoveel detectie windows zo nodig in een analyse, en wordt niet beperkt door de gaten gemaakt voor een experiment. De 2 µm diameter detectie ramen zijn geschikt voor technieken zoals ToF-SIMS, en het is ook mogelijk in vloeibare SEM. Vanwege het hoge vergroting vermogen van SEM, toont het nieuwe resultaat dat kleinere diafragma (bv1 2 µm) werkt goed in SEM (Figuur 1a).
Verschillende technische details zijn vermeldenswaard om in situ metingen van vloeibare SEM succesvol maken. Ten eerste, moet het apparaat worden bekleed met koolstof of goud teneinde opladen tijdens de metingen. Ten tweede, de montage apparaat is vrij kritisch in deze procedure. Losse contact van het apparaat met het stadium van de montage zal leiden tot aanzienlijke opladen, moeite met concentreren, en slechte beelden. Ten derde, als men wil meer dan één monster met behulp van hetzelfde apparaat te analyseren, de volgorde van de steekproef moet nadenken. Hoewel het apparaat beschikbaar is, is het waarschijnlijk dat een apparaat kan meerdere malen worden gebruikt. Men kan bijvoorbeeld water of het oplosmiddel gebruiken voor het verkrijgen van gegevens van de controlemonster gevolgd door de analyse van een monster met deeltjes of andere soorten van belang met behulp van hetzelfde oplosmiddel. Het wordt aanbevolen om de invoering van het monster na het SALVI-apparaat is beveiligd en detectie gaten zijn gemaakt met behulp van SEM/FIB. De FIB wordt alleen voor het frezen van de openingen van de detectie venster membraan gebruikt. Als het membraan wordt bereid door een ander instrument of het membraan rijggat ter beschikking wordt gesteld van de leveranciers, is het niet nodig om FIB te maak gaatjes voorafgaand aan de SEM-analyse. Verplaatsen van het apparaat uit de buurt van het podium van de steekproef voor monster invoering en bandenwissel het weer afval veel tijd, maar ook voegt toe het risico van slechte verbindingen tussen het apparaat en het monster stadium en wat resulteert in een verschillende afstand. De exploitant SEM wellicht ook te heroriënteren en vinden van het kanaal en micrometer formaat ronde detectie windows opnieuw.
Met submicron resolutie en precieze elementaire informatie getoond in deze studie, wij voorzien dat de integratie van de vacuüm-compatibele microfluidic cel (d.w.z., SALVI) met de hoog vacuüm modus SEM grote schaal kan worden gebruikt bij het identificeren en observeren van verschillende natuurlijk gehydrateerd specimens, geologische specimens, biologische monsters en nanomateriaal gesynthetiseerd in vloeistof. Met de technologische verbeteringen aan devloeibare SEM aanpak zijn eerder besproken, we laten zien dat een grotere verscheidenheid van submicron deeltjes van verschillende grootte kan worden onderzocht met behulp van deze nieuwe aanpak. Uiteindelijk, in situ vloeibare SEM opent meer kansen om te studeren specimens in vloeistof met behulp van hoog vacuüm SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan de Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) nucleaire proces wetenschap initiatief (NPSI)-laboratorium gericht onderzoek en ontwikkeling (LDRD) Fonds voor steun. Dr. Sayandev Chatterjee geboden de samengestelde böhmiet deeltjes. Instrumentale toegang werd verleend door middel van een algemene gebruiker voorstel van W. R. Wiley milieu Molecular Sciences Laboratory (EMSL). EMSL is een faciliteit van de nationale wetenschappelijke gebruiker gesponsord door het Office van biologische en ecologische onderzoek (BER) op PNNL. PNNL wordt beheerd door Battelle voor het DOE onder Contract DE-AC05-76RL01830.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Coater | Cressington | 208 Carbon | It is accompanied with thickness monitor MTM-10. |
| SEM | FEI | Quanta 3D FEG | It provides highly resolved scanning electron microscopy and elemental analysis. |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, vacuum compatible microfluidic cell that enables the characterization of the liquid sample using vacuu- based scientific instrument. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | The polyether ether ketone union is used for connecting the inlet and outlet of SALVI |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 mL |
| Pipette Tip 1 | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL |
| Pipette Tip 2 | Rainin | 17001865 | 20 µL |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2213 | It is used to inject the liquid sample into the SALVI device. |
| pH meter | Fisher Scientific/accumet | 13-636-AP72 | It is used for measuring the pH of AlOOH in DI water. |
| Barnstead Ultrapure Water System, UV/UF | Thermo Scientific Barnstead | Nanopure diamond D11931 | It is used for producing DI water. |
| Centrifuge tubes | Fisher scientific/Falcon | 15-527-90 | 15 mL |
| Bransonic ultrasonic cleaner | Sigma-Aldrich | 2510 | It is used to ultrasonicate the AlOOH liquid sample. |
| Balance | Mettler Toledo | 11106015 | XS64 |
| AlOOH | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | It is synthesized by scientists at Pacific Northwest National Laboratory. |
| xT microscope Control | FEI | Quanta 3D FEG | Default microscope control software of SEM Quanta 3D FEG |
| EDAX Genesis software | EDAX | N/A | The software is used for collecting the EDX elemental information of the samples. |
| Teflon tubing | SUPELCO | 58697-U | It is used for introducing the sample into the microchannel and holding adequate volume of liquid. |
References
- Goldstein, J., et al. Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis: A Text for Biologists, Materials Scientists, and Geologists. , 2nd ed, (1992).
- Donald, A. M. The use of environmental scanning electron microscopy for imaging wet and insulating materials. Nat Mater. 2 (8), 511-516 (2003).
- Rossi, M. P., et al. Environmental Scanning Electron Microscopy Study of Water in Carbon Nanopipes. Nano Lett. 4 (5), 989-993 (2004).
- Nune, S. K., et al. Anomalous water expulsion from carbon-based rods at high humidity. Nat Nano. 11 (9), 791-797 (2016).
- Soumya, E. A., et al. Scanning Electron Microscopy (SEM) and Environmental SEM: Suitable Tools for Study of Adhesion Stage and Biofilm Formation. , (2012).
- Thiberge, S. Y., Nechushtan, A., Sprinzak, D., Moses, E. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (10), 3346-3351 (2004).
- Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (10), 3346-3351 (2004).
- Thiberge, S., Zik, O., Moses, E. An apparatus for imaging liquids, cells, and other wet samples in the scanning electron microscopy. Rev Sci Instrum. 75 (7), 2280-2289 (2004).
- QuantomiX WETSEM®. , Available from: http://www.wetsem.com/ (2017).
- Wet Cell Kit. , Available from: http://www.2spi.com/catalog/instruments/silicon-nitride-wet-cell-kits-use-instructions.html (2017).
- Yu, X. -Y., et al. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. USA patent. , 8,555,710 (2011).
- Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).
- Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).
- Ding, Y., et al. In situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix. Anal Chem. 88 (22), 11244-11252 (2016).
- Hua, X., et al. Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry. Biomicrofluidics. 9 (3), 031101 (2015).
- Hua, X., et al. Chemical imaging of molecular changes in a hydrated single cell by dynamic secondary ion mass spectrometry and super-resolution microscopy. Integr Biol. 8 (5), 635-644 (2016).
- Hua, X., et al. In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
- Yu, J., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52 (73), 10952-10955 (2016).
- Yang, L., et al. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J Vac Sci Technol, A. 29 (6), (2011).
- Yang, L., et al. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
- SPI Supplies Inc. , Available from: http://www.2spi.com/ (2017).
- Wet Cell II Liquid Probe System for SEM/EDS, EPMA and TOF-SIMS. , Available from: http://www.2spi.com/item/12130-ab/ (2017).
- Yao, J., et al. Switchable 1,8-diazabicycloundec-7-ene and 1-hexanol ionic liquid analyzed by liquid ToF-SIMS. Surf Sci Spectra. 23 (1), 9-28 (2016).
- Yu, J., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52 (73), 10952-10955 (2016).
- Clark, S. B., Buchanan, M., Wilmarth, B. Basic Research Needs for Environmental Management. , Department of Energy. (2016).
- Mills, O. P., Rose, W. I. Shape and surface area measurements using scanning electron microscope stereo-pair images of volcanic ash particles. Geosphere. 6, 805-811 (2010).
- Li, S., Jiang, F., Yin, Q., Jin, Y. Scanning electron acoustic microscopy of semiconductor materials. Solid State Commun. 99 (11), 853-857 (1996).
- Dohnalkova, A. C., et al. Imaging Hydrated Microbial Extracellular Polymers: Comparative Analysis by Electron Microscopy. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1254-1262 (2011).
- Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. Imaging liquids using microfluidic cells. Microfluid Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).
- Barshack, I., et al. A Novel Method for "Wet" SEM. Ultrastruct Pathol. 28 (1), 29-31 (2004).
- Cameron, R. E., Donald, A. M. Minizing sample evaporation in the Environmental Scanning Microscope. J Microsc. (Oxford, U. K.). 173 (3), 227-237 (1994).
- Danilatos, G. D. REVIEW AND OUTLINE OF ENVIRONMENTAL SEM AT PRESENT. J Microsc (Oxford, U.K.). 162 (3), 391-402 (1991).
- Stokes, D. J. Recent advances in electron imaging, image interpretation and applications: environmental scanning electron microscopy. Philos Trans R Soc, A. 361 (1813), 2771-2787 (2003).
