Summary
筛选细菌显示库是一种被证实的技术, 用于发现肽亲和试剂, 一种强有力的替代抗体。本文的半自动排序方法简化了筛选, 减少了误报的发生。在这里, 我们说明的思想过程和技术应用于评价候选人和最小化下游分析。
Abstract
筛选细菌显示库是一种成熟的技术, 用于多肽亲和试剂的发现, 既能识别生物目标, 也可用于非生化指标。肽亲和试剂可以用于类似的抗体的应用, 包括传感和治疗, 但更健壮, 能够在更极端的环境中执行。利用半自动化分选方法提高了多肽捕获剂对蛋白质目标的特异性, 改善了结合和洗涤步骤, 从而减少了假阳性粘合剂的发生。本文介绍了一种半自动的分拣方法, 它与一个具有无约束细菌显示分拣库的商用自动磁激活细胞分拣装置一起使用, 它表达了随机15多肽。稍加修改, 这些方法可扩展到其他自动化设备、其他分类库和其他有机体。这项工作的一个主要目标是提供一个全面的方法, 并阐述了在分析和尽量减少所产生的候选人库中应用的思维过程。这些技术包括使用荧光活化细胞分类 (外地) 对细胞结合进行分析, 在分类和比较个别候选者时评估亲和性和特异性, 并分析肽序列以确定趋势和共识序列的理解和潜在改善的亲和力和针对性的目标利益。
Introduction
筛选是一个证明的技术为亲和试剂发现, 与细菌显示图书馆一个方便来源为肽亲和性试剂1,2,3,4,5, 6,7,8,91011,1213,14 15,16,17,181920,2122,23 24。类似于噬菌体显示25,26和酵母显示27,28, 多肽在细胞表面上暴露, 并可绑定到生物和非生化目标, 与这些相互作用由肽骨架和氨基酸侧链的独特特性驱动的29。与噬菌体的显示相反, 细菌本身是自我复制的, 包含所有的遗传物质, 不需要洗脱的噬菌体和细胞的再感染。与酵母显示相比, 细菌显示更快 (约20分钟的30) 倍, 因为大肠杆菌的时间较快。所产生的肽亲和试剂可以在各种传感平台上产生非细胞, 16,17,26 , 并且在显示在单元格2时有可能用作生活材料。,31,32. 与用于识别特定目标的单克隆抗体相比 , 多肽更小、更灵活 , 而多肽显示库可以在 DNA 水平上很容易地纵 , 以避免特定的氨基酸 , 如半胱氨酸33.肽是越来越多的利用治疗34,35,36和其他应用程序, 抗体通常会被利用, 由于其易于发现, 可重复合成 (细胞) 在极端环境下的生产和优异的性能维护, 即使在高温或长期存储的情况下也不需要冷藏37,38, 也可以提供功能性试剂。克服冷链储存试剂的能力是国防部特别关心的, 例如, 它必须在极端环境下运作。因此, 热稳定性是一个可取的特点, 对亲和试剂识别选定的目标作为例子在这篇手稿。
最近, 筛选细菌显示库变得更加直接和可靠的使用半自动化磁激活细胞分类 (mac 或 MCS) 方法9,14,39。这些方法已经证明了生物目标使用几个类似的排序平台, 具有不同的优势, 包括一个商业可用的自动磁活化细胞分拣 (autoMACS 或 autoMCS) 仪器 (见表材料) 1,14,15和其他更专门的设备, 其中包含的样品在一次性墨盒7,9或芯片39, 一个有价值的规范使用生物安全等级 2 (BSL-2) 或更高的7的有机体或毒素。这些半自动的方法可以扩展到排序的多肽能够绑定到非生物材料, 如果材料是磁性或有能力被涂上磁珠, 并用于不同的生物体 (如厌氧菌), 如果排序和生长条件被改变。除了对细菌显示库进行分类外, 这里使用的商用 autoMCS 仪器还部分用于发现酵母表面显示的人类单链抗体片段的初步步骤, 然后进一步隔离使用荧光活化的细胞分类 (外地) 40。半自动化的主要优点是减少了分选时间和精力, 并且在洗涤步骤中更健壮和可重复地消除磁性珠子中的未绑定细胞, 导致误报率降低, 需要的分类轮数减少, 而复杂的下游分析9,14。在商业 autoMCS 仪器的情况下, 有多个预先加载的程序, 可能是最佳的不同的应用, 如负预排序 (损耗), 优先级纯度, 最小化最终样本量, 并增加或减少稀有单元隔离的灵敏度41。
这项工作的重点是演示筛选的方法, 使用商业上可用的 autoMCS 仪器的细菌显示库, 并阐述了思想的过程中应用在分析和尽量减少所产生的候选人池为了便于扩展到其他应用程序。此处使用的显示库 (参见资料表) 12,13包含大约 1091011独特的 15-滨海肽, 通过修改后的细菌外膜蛋白 OmpX 的版本显示在无约束性质的细胞表面, 这是预期的代表自由肽的解决方案, 如果综合生产。该蛋白支架还包含一个积极的控制 P2X 肽在 C-总站的监测表达通过结合到 YPet 莫娜。然而, 购买或新颖的图书馆具有适当的多样性和其他特性所需的具体应用, 应与此筛选程序类似, 虽然可能需要一些细微的变化。此筛选协议的示意图如图 1所示。此外, 该协议可以适应其他自动磁分拣平台和其他排序策略。手动磁选与台式磁铁已经成功地证明, 虽然更复杂和耗时的下游分析需要由于增加误报14, 但仍然提供了一个替代选项的autoMCS 步骤, 如果没有自动磁性细胞分拣设备可用。
Protocol
1. 使用 autoMCS 的筛选细菌显示库
注意: 此基于 autoMCS 的排序协议以前已被描述为14, 在本手稿的补充材料中可获得更详尽的 "新用户扩展协议", 进一步详细说明, 包括对潜在修改.如果 autoMCS 设备无法进行排序, 请参阅 Sarkes et al. 2015 中的补充协议, 因为在该工作中还描述了手动排序协议14。此处提供的 autoMCS 协议已进一步适应, 包括对改进的特异性的附加负排序步骤1,15。此筛选协议的示意图如图 1所示。
- 负分选去除可能与磁珠交叉反应的粘合剂
- 接种500毫升的 Luria 汤米勒 (LB) 含有适当的抗生素与大约 1 x 1011细胞的不同细菌显示分拣库 (见材料表)。
注: 此处使用的细菌显示肽库 (参见材料表) 包含大约 109-1011唯一成员8,12 , 并在 lb 中包含25µg/毫升氯霉素 (磅 Cm25)。本协议的其余部分将假定使用此库。 - 孵育在37° c 与摇晃在 225 RPM 直到文化到达 OD600 0.5-0.55。通过稀释4% 股 1:100, 在37° c 下晃动 225 RPM, 诱导肽表达与 0.04% w/v L 糖。
- 把诱导的文化放在冰上。离心机大约 2 x 1011细胞在 6000 x g 为 20 min 在4° c。轻轻旋转, 去除1.5 毫升 PBS 中的上清和重细胞。
注: 用于大肠杆菌的 OD600 1.0 大约等于 1 x 109单元格/mL。
注意: 不要涡流, 因为这可能溶解细胞;重用手或在≤ 225 RPM, 4 ° c 的短暂晃动。 - 将细胞转移到离心管, 在 RT 或4° c 的 6000 x g 处旋转5分钟。除去上清液。重1毫升磷酸缓冲盐水 (PBS) 中含有0.5% 牛血清白蛋白 (BSA) 的细胞颗粒;PBS-B)。
- 洗涤300µL 亲和包覆的珠子 (大约 3 x 109珠子, 看见材料表) 在1毫升 PBS B 和离心机为5分钟在≥5,000 x g (在 RT)。把管子放在一台顶部磁粉分离器上。小心地除去上清, 避免颗粒。
- 重在细胞中的珠子加上 PBS B 混合物上面准备。在一个旋转平台上孵育4° c, 在冰上放置样品45分钟。
- 打开 autoMCS 仪器初始化系统。黄金线使用制造商的运行和洗涤缓冲器 (见材料表) 选择 "现在洗" 在屏幕底部的 "分离" 菜单, 然后 "冲洗" 和 "运行"。
- 用 pbs-b 作为清洗缓冲器, 在接下来的步骤中运行缓冲, 以 pbs b 作为系统的质数。从上部导航栏中选择 "分离" 菜单, 然后选择 "立即清洗"。选择 "冲洗" 和 "运行", 以新鲜的 PBS-b 的系统。
- 转移细胞和珠混合物从孵化步到15毫升锥形管。把这个管子放在样品槽里, 在正面和反面的选择槽中放上15毫升的锥形管, 预冷 (4 ° c) 机架 (见材料表)。在仪器平台上放置机架。
- 为机架上的每个样本分配一个分离程序 (最多可在一次运行中对5样本进行排序)。在每个样品和最后一个样品之间添加一个 "冲洗" 步骤。选择 "运行" 以启动单元格分离。选择 "确定" 以确认有足够的缓冲区可用。
注: "Posselds" 分离程序适用于负排序和正排序1轮和 "Posseld" 是排序回合 2-4 的首选, 但这两个程序已成功地用于所有负面和积极的排序回合14 、15和其他程序对于特定应用程序可能会更好 (在讨论中进一步介绍)。 - 当程序完成时, 卸下机架并保留适当的分数。在这里, 对于一个负的排序, 保留负分数 (包含没有珠子的细胞)。在冰上的地方。
- 使用负排序分数的整体, 以接种1L 磅 Cm25与0.2% 瓦特/v d-葡萄糖。在37° c 的夜间生长, 晃动 225 RPM。
- 在关闭 autoMCS 仪器之前, 请将运行和洗涤缓冲器更改为制造商的运行和洗涤缓冲器 (参见材料表)。选择 "立即清洗", 然后 "冲洗" 和 "运行"。完成后, 请确保净化线上有70% 乙醇, 然后按屏幕右上角的 "电源图标", 然后选择 "是"。
- 当系统关闭完成 (瓶子将是紫色的), 关闭机器。
- 第二天, 使用隔夜文化, 使冷藏库的每瓶约 1 x 1011细胞在 LB 与15% 甘油。另外, 或者, 在下一步中使用此区域性: 附加的负排序 (1.2 节) 或第一轮正排序 (第1.3 节)。
- 接种500毫升的 Luria 汤米勒 (LB) 含有适当的抗生素与大约 1 x 1011细胞的不同细菌显示分拣库 (见材料表)。
- 负排序, 以消除粘合剂可能与其他利益目标的交叉反应
注意: 如果不需要进一步的负排序, 则可以跳过1.2 节。在这种情况下, 请继续执行1.3 节。对任何不受欢迎的目标的剩余约束力可由外地资产管制局评估, 如2节: 分类的分区域分析。- 对于针对特定蛋白质靶的负排序, 如具有潜在的类似蛋白质, 也可绑定到发现的多肽1,15, 重复增长和归纳步骤 1.1.1-1.1.3, 从冻结的库存开始亲和从步骤1.1.15 或隔夜文化从步骤 1.1.12 (使用 OD600估计和接种 1 x 1011单元格) 的库。
- 将细胞转移到离心管, 在 RT 或4° c 的 6000 x g 处旋转5分钟。除去上清液。重细胞颗粒在1毫升 PBS 含有 600 nM 化交叉反应蛋白靶。在4° c 的旋转平台上孵育45分钟。
注: 600 nM 是一个建议的起始浓度, 这可以改变, 如果有注意到的好处。利用材料表中所建议的试剂, 可以达到和量化蛋白质靶的法。 - 同时, 洗涤100µL 亲和包覆的珠子 (大约 1 x 109珠) 在1毫升 PBS B 和离心机为 5 min 在≥ 5000 x g (在 RT)。将管放在一台台式磁性微粒分离器上, 小心地除去上清, 避免颗粒。
- 将靶向细胞在 6000 x g 离心5分钟 (RT 或4° c), 去除上清, 并重1毫升 PBS B 中的细胞颗粒。重珠在整个洗净的细胞量中都有一定的交叉反应蛋白靶。在旋转平台上孵育4° c 30 分钟。
- 将样品放在冰上, 完成 1.1.7-1.1.15 的步骤, 制作出合适的冷藏库。如果所有所需的负排序已实现, 则继续到1.3 节, 或者对另一潜在的交叉反应蛋白重复第1.2 节, 以负排序。
- 1轮正面排序
注: 1 轮对特定蛋白质靶的正排序类似于对特定分类目标的负排序 (见 1.2), 但保留含珠的阳性分数。- 接种500毫升的 LB Cm25与大约 1 x 1011细胞的不同细菌显示排序库已亲和耗尽和成长过夜 (从步骤 1.1.12) 或冻结 (从步骤 1.1.15) 和解冻冰, 或已进一步耗尽粘合剂到其他交叉反应蛋白靶点 (从步 1.2.5), 如所希望的。
- 孵育在37° c 与摇晃在 225 RPM 直到文化到达 OD600 0.5-0.55。通过稀释4% 股 1:100, 在37° c 下晃动 225 RPM, 诱导肽表达与 0.04% w/v L 糖。
- 把诱导的文化放在冰上。离心机大约 2 x 1011细胞在 6000 x g 为 20 min 在4° c。在1.5 毫升 PBS 中, 通过轻轻旋转 (手动或在≤ 225 RPM, 4 ° c 下轻微晃动) 去除上清和重细胞。
- 将细胞转移到离心管, 在 RT 或4° c 的 6000 x g 处旋转5分钟。除去上清液。
- 重细胞颗粒在1毫升 PBS 含有 600 nM 化蛋白目标的兴趣。在4° c 的旋转平台上孵育45分钟。
注: 600 nM 是一个建议的起始浓度, 这可以改变, 如果有注意到的好处。利用材料表中所建议的试剂, 可以达到和量化蛋白质靶的法。 - 同时, 洗涤100µL 亲和包覆的珠子 (大约 1 x 109珠) 在1毫升 PBS B 和离心机为 5 min 在≥ 5000 x g (在 RT)。把管放在一台顶部的磁性微粒分离器上, 小心地除去上清, 避免颗粒。
- 当靶向的孵育完成后, 将靶向细胞在 6000 x g 处离心5分钟 (RT 或4° c), 去除任何未粘合的靶蛋白。去除上清液, 重1毫升的细胞颗粒。重珠在整个容积的洗涤细胞中一定要达到蛋白靶。在一个旋转平台上孵育4° c, 在冰上放置30分钟。
- 打开 autoMCS 仪器初始化系统。黄金线使用制造商的运行和洗涤缓冲器 (见材料表) 选择 "现在洗" 在屏幕底部的分离菜单, 然后 "冲洗" 和 "运行"。
- 用 pbs-b 作为清洗缓冲器, 在接下来的步骤中运行缓冲, 以 pbs b 作为系统的质数。从上导航栏中选择 "分离" 菜单, 然后选择 "立即清洗"。选择冲洗和运行, 以新鲜的 PBS-b 系统的黄金。
- 转移细胞和珠混合物从孵化步骤以上到一个15毫升锥形管, 冲洗管与一个额外的500µl 的 PBS-b 和汇集与样品洗涤。把这个管子放在样品槽里, 在正面和反面的选择槽中放上15毫升的锥形管, 预冷 (4 ° c) 机架 (见材料表)。在仪器平台上放置机架。
- 为机架上的每个样本分配一个分离程序 (最多可在一次运行中对5样本进行排序)。在每个样品和最后一个样品之间添加一个 "冲洗" 步骤。选择 "运行" 以启动单元格分离。选择 "确定" 或 "继续" 以确认有足够的缓冲区可用。
注: "Posselds" 分离程序适用于负排序和正排序1轮和 "Posseld" 是排序回合 2-4 的首选, 但这两个程序已成功地用于所有负面和积极的排序回合14,15和其他程序对于特定应用程序可能会更好 (在讨论中进一步介绍)。 - 当程序完成时, 卸下机架并保留适当的分数。在这里, 积极的排序, 保持积极的分数 (包含细胞和珠子)。在冰上的地方。
- 在关闭 autoMCS 仪器之前, 请将运行和洗涤缓冲器更改为制造商的运行和洗涤缓冲器 (参见材料表)。选择 "立即清洗", 然后 "冲洗" 和 "运行"。完成后, 请确保净化线上有70% 乙醇, 然后按屏幕右上角的 "电源图标", 然后选择 "是"。
- 当系统关闭完成 (瓶子将是紫色的), 关闭机器。
- 使用阳性排序分数的整体, 接种1L 磅 Cm25与0.2% 瓦特/v d-葡萄糖。在37° c 的夜间生长, 晃动 225 RPM。
- 第二天, 使用隔夜文化, 使冷冻储存在 LB 含有15% 的甘油, 和/或继续积极排序轮2在1.4 节。
- 后续的正分类轮
注意: 通常, 建议使用四排序圆, 但三排序轮通常足够14,15。在2节所述的对分类回合进行的资产管制分析中, 协助停止分类。目标和磁珠体积的浓度随其后的每一次正分类而减小。- 使用隔夜文化从早先排序圆 (或一个冷冻的细胞存货从那圆), 接种 5 mL LB Cm25与100µl 细胞 (1:50 稀释)。在37° c 下孵育, 以 225 RPM 晃动, 直到培养达到 0.5-0.55 的 OD600 。
- 诱导多肽表达与 0.04% w/v L-糖, 震动在 225 RPM 45 分钟在37° c。在冰上放置诱导细胞。
注: 这种诱导培养也可用于评估其起源于分类的结合亲和性和特异性, 如下文2节所述。 - 离心机 1 x 108细胞在 6000 x g 为 5 min 在 RT 或4° c。在50µL PBS 中去除上清和重细胞颗粒, 其中含有化前一轮排序所用的一半浓度的蛋白质目标 (因此 300 nm 为圆 2, 150 nm 为圆 3, 75 nm 为圆 4, 从我们的建议起始点)。在冰上孵育45分钟 (或在4° c 旋转平台)。
- 同时, 洗涤亲和包覆的珠子 (15 µL 为圆 2, 8 µL 为圆3和4µL 为圆 4) 在1毫升 PBS B 和离心机为 5 min 在≥ 5000 x g (在 RT)。将管放在一台台式磁性微粒分离器上, 小心地除去上清, 避免颗粒。重珠在50µL PBS-B。
- 在45分钟孵化与目标在步骤 1.4.3, 离心的细胞在 6000 x g 5 分钟在 RT 或4° c, 去除上清, 和重的细胞在50µL 洗涤珠从1.4.4。保持样品在冰和完整步骤 1.3.7-1.3.13 为积极的排序。
- 接种一个5毫升的 LB Cm 的文化25补充与0.2% 瓦特/v d-葡萄糖与整个积极的, 珠含分数从排序。
- 第二天, 使用隔夜文化, 使冷冻储存在 LB 含有15% 甘油和/或继续下积极排序轮, 返回到步骤1.4.1。
注意: 使用1.4.2 中的诱导培养来评估下面2节中描述的结合亲和性和特异性, 可以帮助确定何时停止排序。如果行中的两个排序回合显示相似的绑定关系, 或稍后的圆显示对感兴趣的目标的绑定关联减少, 这是停止排序的理想地方。最后一轮后, 回到 1.4.1, 但停止在1.4.2。
2. 分类回合的外地资产管制分析
- 使用从步骤1.4.2 的诱导细胞, 为每一个排序轮, 或相同的文化, 添加5µL 诱导细胞到25µL 的每个准备的解决方案的约束力评估 (也见材料表): 单独 PBS;PBS 与150毫微米 YPet Mona (YPet 12,13; 正面控制为表示), 如果可利用;900 nm 蛋白靶共轭到荧光染料, 如胺反应染料与发射/激发在 493 nm⁄518 nm (Target-488);900 nM 交叉反应蛋白靶 (s) 用于标有相同荧光染料的负分选 (交叉反应 Protein-488);和 900 nM 亲和-R-藻 (SAPE)。在冰上孵育45分钟。
注: 如果继续直接从步骤 1.4.2, 这一步将始终是完成后的第二天, 筛选为该轮已完成, 因为向下选择的图书馆是成长过夜, 然后继和诱导第二天。同样地, 也可以使用从冻结的分类轮股中种植和诱导的文化;在这种情况下, 所有的回合都可以在一次试验中进行测试和比较。 - 在 RT 或4° c 下离心 6000 x g 的细胞5分钟。清除上清液, 在冰上储存样品。
注: 细胞颗粒可以储存在冰上, 直到所有样品都准备好进行分析。 - 打开该系统的仪器, 开启软件, 启动, 并校准仪器按照制造商的说明43,44。
- 在资产管理系统软件中, 单击 "管理员", 然后单击所需的文件夹或创建一个 "新文件夹"。点击屏幕左上方的 "新实验" 图标。右键单击图标以 "重命名" 实验。在该实验中, 单击 "全局工作表"。
- 单击 "点图" 图标, 然后单击全局工作表电子表格以创建此散。点击点图本身, 然后选择屏幕左上方的 "检查器" 图标, 通过在打开的窗口中选择 "Y 轴" 和 "X 轴" 旁边的框来调整坐标轴以 biexponential 显示。单击 "x", 关闭 biexponential 显示窗口。
- 通过单击屏幕左上方的图标并通过右键单击 "全局工作表" 下的标本图标并选择 "重命名" 来重命名标本, 从而创建 "新管道"。通过点击 (+) 的标志展开标本, 然后双击管图标, 右键点击它, 再次选择 "重命名" 来描述样品。
- 使用此点图形与默认 SSC-a vs FSC-一个运行一个负控制样本在 PBS 单独通过双击该管或选择它旁边的箭头。在运行样本前, 重500µL 冰冷的细胞团运行的缓冲和转移样本到一个外地资产管制局 (见材料表), 混合良好的移和弹管。将悬浮细胞放在仪器的样品注射管 (坐) 上。按 "获取数据" 与 "事件显示" 在 3万-5万和 "事件记录" 在 1万, 流速在低 (开始; 增加, 如果需要), 和 "坐冲洗" 选择。
注: 适当的速度 (低, 中, 或高) 是速度的事件/秒的数量大约在200和2000之间。 对所有步骤使用此范围。 - 在获取时, 通过选择 "阈值" 选项卡, 调整光电倍增管 (PMT) 电压阈值. 点击并更改 "值"。调整向前和侧面散射 (FSC 和 SSC) 的电压, 使 PBS 中的负控制单元仅在中心下方略有下降。
注意: 可以使用 "添加" 图标在 "阈值" 选项卡中添加附加参数 (如 SSC)。通常, SSC 和 FSC 的 PMT 电压大约为700伏到 1000V, 对于大肠杆菌很管用。 - 如果样本读取正确, 请调整流量以显示200-2000 事件/秒, 然后按 "记录数据"。录音完成后, 从坐在冰上的地方取下管子。 选择 "多边形门" 图标, 使用鼠标在散中的大多数单元格中绘制一个门。右击点图, 然后选择 "显示填充层次结构"。
- 通过在 "填充" 层次结构中单击 "P1", 可以使用此 "P1" 门作为父级。在步骤2.5 之后创建一个新的点图。右键单击每个轴, 并将 Y 轴更改为 FITC a 和 X 轴到 FSC a。门的负控制 (PBS 单独) 使用 "多边形门" 图标, 与门尽可能紧周围的顶部和左侧的人口。
注: 双检查人口层次结构, 确保 P1 门是 P2 门的父级。如果不是, 它将出现与 P1 门和 "所有事件" 将是父母;删除该门并在步骤2.10 之后重新创建它。 - 在填充层次结构中选择 "P2", 右键单击, 然后选择 "反转门"。右击点图与 P2 门和选择 "显示人口"。选择 "P2" 和 "不 P2" 显示的人群 (少于1% 的人口应该落在门外)。
- 右键单击 P2 门的点图, 然后选择 "创建统计视图"。右键单击 "统计视图" 窗口, 然后选择 "编辑统计视图"。单击 "填充" 选项卡, 并按需要添加或移除填充, 包括父填充、P1 (P2, 而非 P2 应已显示)。点击 "统计" 选项卡并添加 "FITC-中位数" 和任何其他感兴趣的统计数据。按 "确定" 关闭窗口。
- 创建一个类似的点图的 PE-a vs FSC-和门使用 PBS 单独样本 (以前的地块可以复制和改变)。使用此电子表格可以运行所有示例 (包括与每个荧光标记的目标一起孵育的负控制单元), 以此方式记录每项的大约1万事件。
注: Target-488 蛋白孵化后脱落的细胞, YPet 阳性对照等是该蛋白的粘合剂, 而 "非 PX" (其中 X 是该图的门控种群数) 的值应记录为%。当使用 SAPE 作为负控制, 使用 PE-a vs FSC-一个情节。P1 的中位荧光强度也应该被记录下来, 因为这提供了超过% 绑定的信息, 以相对的术语显示绑定的程度, 并且在异常值45存在时更健壮。中位荧光强度可以归一化 (nMFI), 通过将每种肽的多边基金会划分为一个仅为负控制的支架 (无 N 端肽), 或一个含有不束缚目标利益的肽序列的克隆, 在孵化后与相同的目标共轭到相同的荧光14。如果这些负控制单元不可用, uninduced 细胞与同一目标一起孵育, 并用相同的荧光标记, 也可用于正常化。
3. 潜在候选者的序列分析和结合亲和性评估
- 多肽序列测定
- 从筛选的最后一轮 (通常是圆3和/或 4) 中选择并排列数十或数百个细菌菌落.
- 使用我们开发的宏文件分析序列数据 (参见代码的支持信息 "子 eCPX_Sequencing"), 专门分析筛选中列出的15mer 细菌显示库中生成的序列。材料.使用材料表中列出的电子表格软件或其他首选兼容软件。
注意: 许多工具在网上都可以使用, 这也有助于 DNA 序列分析47。如果首选, 则使用不同的已建立方法进行序列分析, 然后跳到步骤3.1.3。- 下载一组序列文件 (. seq 文件, 文本文档也可以工作) 并将它们解压到一个新文件夹中。如有必要, 请将文件夹移动或复制到计算机的硬盘驱动器 (与网络文件夹相对) 以提高速度。
- 打开一个新的电子表格窗口。如果这些消息弹出, 请确保启用宏并启用所有功能。
注意: 下面的步骤3-6 只需要在第一次使用宏时完成。对于后续分析, 只需从步骤7开始 "运行宏"。 - 复制在 "子 eCPX_Sequencing" 文件中找到的宏的全部内容。
注: 目前的版本是建立与侧翼序列的 15-滨海图书馆列出的材料表, 并将翻译的氨基酸之间。在运行该宏之前, 可以通过在电子表格的 B 栏中复制5个侧翼序列, 在 a 列和3的侧翼序列中输入其他序列, 最多10序列。 - 在空白电子表格文件中, 选择 "查看" 选项卡, 然后双击 "宏"。选择个人. xlb 文件夹。如果此项不可用, 请先录制宏以使其显示。
- 根据可以高亮显示的内容, 单击 "创建" 或 "步入"。将整个宏粘贴到模块中。
- 单击保存图标或转到文件, 保存。退出模块。如果弹出窗口, 请按 "确定"。
- 运行宏: 转到所需的. seq 文件所在的文件夹。单击顶部文件夹图标旁边的栏, 查看文件夹位置。复制它。
- 转到新的电子表格窗口。选择 "视图" 选项卡, 然后双击 "宏"。从列表中选择 "eCPX_Sequencing", 然后单击 "运行"。
- 在弹出的框中, 粘贴在步骤7中复制的文件位置并命中 enter。宏应该开始遍历序列, 并将它们组织到不同的表中。
- 使用 "汇总表" 表确定是否需要检查跟踪文件是否有错误并手动进行更正 (如果序列包含 "X" 或无法翻译)。
注: "汇总表" 显示翻译的肽序列, 按氨基酸序列 (从 a 到 Z) 排序, 除非顺序错误阻止翻译。"X" 表示无法确定的单个氨基酸。
- 一旦序列被翻译, 组织, 并纠正任何顺序错误, 检查在 "摘要表" 表上的任何重复序列的排序肽序列列表。
- 在5毫升磅 Cm25 ° c 下, 以 225 RPM 晃动, 并在第二天以 lb 含15% 甘油保存冷冻库库存, 在一步1.4.7. 使用3.3 节所述的资产管制方案方法, 用重复序列测试多肽的结合亲和性和特异性, 并使用序列列表的 FASTA 格式 (仅限完整列表和重复) 来对序列使用首选对齐和分析程序, 如3.2 节。
- 使用 Clustal ω、Kalign 和类似程序的序列对齐
- 从宏的 FASTA 电子表格中复制 FASTA 格式的序列, 或者从要对齐的序列中创建一个 FASTA 文件的列表 (例如, 步骤3.1.3 中的那些)。
注意: 列 a 按 "Seq #" 的数值顺序包含 FASTA 文件, 而 B 列按 "汇总表" 表中的 "AA 序列" 显示它们。按氨基酸序列排序的肽序列列表将在顶部显示不可用的序列, 如空向量 (如 "# 空") 和未找到 5 "或 3" 搜索条件的序列 (如 "# 值")。此功能允许从分析中轻松更新或删除这些序列。 - 打开 Clustal 欧米茄48或 Kalign49软件, 方法是访问网站50、51, 或使用其他首选软件进行序列对齐。复制并粘贴 FASTA 序列列表, 并将其输入 "任何受支持格式的序列" 下面的框中。在 Kalign 的 "更多选项" 下, 将 "缺口开放罚款" 更改为 30 (这在 Clustal 欧米茄中是不可能的), 但在单击 "提交" 之前保留默认设置。
- 使用 Jalview 52,53软件直接在 Clustal 欧米茄和 Kalign 在线软件中分析序列对齐方式, 方法是选择对齐方式上方的 "结果摘要" 选项卡, 然后单击 "Jalview" 图标。
注意: 如果首选, 或用于分析其他程序生成的序列对齐方式, 请分别下载54软件, 然后将对齐方法复制并粘贴到分析窗口中, 单击 "文件"、"输入对齐" 和 "从文本框 "。这提供了一种方法来轻松确定输入序列对齐中是否存在协商一致序列。
- 从宏的 FASTA 电子表格中复制 FASTA 格式的序列, 或者从要对齐的序列中创建一个 FASTA 文件的列表 (例如, 步骤3.1.3 中的那些)。
- 使用外地资产管制法比较装订亲和性
- 接种5毫升 LB Cm25 , 并辅以 0.2% w/v D-葡萄糖与每一个单独的利益隔离 (从步骤3.1.4 和/或利益殖民地的进一步序列分析在3.2 节,等) 和适当的负控制 (显示仅限脚手架或不绑定目标的多肽, 如步骤2.13 的说明中所述)。在37° c 的夜间生长, 晃动 225 RPM。
- 使用隔夜文化接种3毫升 LB Cm25与60µl 细胞 (1:50 稀释)。在37° c 下孵育, 以 225 RPM 晃动, 直到培养达到 0.5-0.55 的 OD600 。诱导肽表达与 0.04% w/v L 糖加2毫米 EDTA (为促进肽显示42), 晃动在 225 RPM 为45分钟在37° c。
- 在冰上放置诱导的文化。对于每个隔离, 添加5µL 细胞到25µL pbs 单独或 pbs 包含: 150 nM YPet 12,13 (对表达式的正控制), 如果可用;250 nM Target-488;250 nM 交叉反应蛋白-488;和 250 nM SAPE (见2.1 更详细)。在冰上孵育45分钟。
- 在 RT 或4° c 下离心 6000 x g 的细胞5分钟。小心地从球团的另一侧提取液体。储存细胞颗粒在冰上, 直到所有样品和准备分析。
- 重每个细胞颗粒在500µL 冰冷的场内运行缓冲, 混合良好的移和弹管, 就在阅读使用流式细胞仪 (见材料表)。
注: 请参见步骤2.13 说明, 以进一步解释浇口和 nMFI 的计算, 以比较结合亲和性和特异性。非粘结剂或非特定粘合剂现在可以从进一步的分析中移除, 而最高亲和粘合剂应在3.2 节之后按顺序对齐来重新评估, 以寻找在初始测序中可能遗漏的进一步趋势人口.3.2 和3.3 节可以在需要时重复, 因为新的趋势和共识序列被注意到。这种分析可以包括更多的随机序列, 如果没有看到趋势。
Representative Results
使用自动磁激活细胞分选 (autoMCS) 而不是手动磁细胞分类, 假阴性候选在细菌显示库的筛选中明显减少9,14。还可以根据需要添加负排序步骤, 以减少非特定的粘合剂对目标的兴趣, 并建议在最低限度添加一个负面的排序对磁珠自己前面。这对磁珠本身的负面选择完成前四轮筛选的选择细菌显示库的保护性抗原 (PA) 粘合剂, 如图 2所示, 并在附加的否定选择之前针对 abrax 的 rivax 和四轮阳性选择, 如图 3所示。这里使用的珠子被共轭到亲和捕获的化蛋白, 所以无意隔离的多肽绑定到亲和本身是一个关注和监测使用的外地资产管制与亲和-共轭藻 (图3 , SAPE)。在评估对目标蛋白的约束力时, 至少应该对有希望的个体候选者进行亲和测试。SAPE 的百分比绑定和 nMFI 都应该是所有排序回合中的低值。绑定到亲和的级别可能会随着每一次排序而有所增加, 如图 3所示, 因为在每一次排序后, 填充的亲和磁珠会被反复暴露。如果背景亲和结合的水平成为问题到下游分析, 进一步的负面分类对磁珠可以执行后, 积极排序轮亲和结合人口增加为了减少对假阳性的下游筛选。当蛋白质或材料有可能具体干扰下游使用肽的特定应用, 或预期与亲和试剂的目标, 由于结构和/或序列相似性,建议对该蛋白质或材料进行进一步的阴性分类。一个例子是在 abrax 结合肽的分离前对 rivax 进行负排序, 这是由于这两种蛋白质的结构相似性和序列同源性1,15。再次, 对用于负分步步骤的蛋白质进行交叉反应结合, 可以在使用外地资产管制局 (图 3, Rivax-488) 对分类回合进行分析期间进行监测。在最佳情况下, 百分比绑定和 nMFI 都很低, 如本例中所示。
当可用时, 一个固定的阳性控制肽, 如 P2X 肽在显示脚手架的 C 端的细菌显示库所产生的在这里的代表性结果, 可以帮助确定是否缺乏约束力的亲和性在外地资产管制系统的检测是由于缺乏表达的显示脚手架本身, 而不是缺乏亲和力的肽 (s) 的目标。在图 2和 图 3中, 对此 P2X 多肽的 YPet Mona 绑定进行了监视, 并证明了早期的分类对支架的表达很差。这很可能主要是由于在随机库的 N 端多肽中停止密码的频率很高, 这意味着该支架本身没有产生。其他作用可能另外贡献, 例如存在多肽以意想不到的毒性作用对大肠杆菌, 或者减少的成长或肽显示率由于其他原因 (例如细菌基因组的变异)。在诱导过程中加入 EDTA 可以改善在这些早期的排序42中的表达, 但尚未进行测试。在每个筛选种群中, 对 YPet 莫娜的约束力显著提高3轮。将图 2与图 3进行比较, 也可以明显地提高表达式的水平, 增加到 90 min (如图 2, YPet mona) 而不是 45 min (如在图 3, YPet mona中),虽然45分钟通常是充足的。请注意, YPet mona 的 nMFI 是归一化到负控制单元的 YPet mona 绑定级别, 因此, 如果表达式水平是可接受的, 则值接近1.0 是典型的。从同一个样本中对 YPet Mona 的多边基金会进行规范化也是比较相对表达式级别的有效方法, 但给出了更高的值 (比较图 2和 图 3和等 Sarkes 的结果 al。2015 15)。
丰富的多肽库绑定到特定的兴趣目标通常在三积极的排序回合内实现, 但继续进行第四轮排序是有益的, 如图 2和 图3所示.这里, 在图 2和 图 3中, 分别为示例目标、PA 和 abrax 的绑定单元格和 nMFI 的百分比继续从3到4轮增加。最高亲和肽序列可能已经出现在3轮, 但也可能进一步丰富的4轮, 这有助于降低选择潜在候选14。从4轮的序列分析往往揭示重复序列, 这些重复序列是一个良好的出发点, 亲和力和特异性分析和一致的顺序确定。作为此手稿的补充提供的 eCPX_Sequencing 宏有助于简化此初始分析, 如图 4所示。从. seq 或文本文件的文件夹开始, 在选择的 5 ' 和 3 ' 序列之间的 DNA 序列被翻译, 由氨基酸序列组织, 并分析每个肽中的单个氨基酸残滓的数量。如图 4中的摘要表单屏幕截图所示, 分离的肽序列的排序列表可以用来轻松地确定重复的序列和频率。此电子表格中包含重复序列的单元格以不同的颜色进行概述, 以便于分析。建议检查这些重复序列的一致性序列和其他趋势。这是由序列对齐软件, 如 Kalign 和 Clustal 欧米茄, 和分析可以对整个序列输出 (包括重复和非重复序列的频率, 他们出现) 和在下面的选择列表重复序列 (有或没有它们的相对频率)。PA 和 abrax 重复序列的代表性结果, 在不考虑频率的情况下, 分别显示在图 5A和 5B中。请注意, 在 PA 目标的图 5A中, 几个单独的重复序列本身包含了一致的序列 WFCFTC (或类似的序列), 红色下划线, 这是通过将 Jalview 软件分析应用于 Kalign 而确定的。重复序列的序列对齐方式。作为 WXCFTC, 这一协商一致意见以前被确定为 PA 绑定协商一致, 这为排序方法9提供了信心。在图 5B中, abrax 目标的重复序列以相同的方式进行分析, 结果是完全不同的。首先, 只有五个序列, 重复在4轮筛选的 abrax 粘合剂, 而不是十五重复序列从4轮筛选为 pa 粘合剂 (虽然44% 多个殖民地也测序为 pa)。第二, 五重复序列中没有一个包含最有希望的 "共识" 序列 (FWAWF, 在紫色下划线), 尽管候选 AX-A15 包含最匹配的序列 (FWDTWF)。进一步的分析, 包括具有约束力的亲和性和专一性的决心, 有助于提供的共识, FWDTWF 确定从前五候选人的 abrax 绑定在图 5C, 如下所述。
从每个重复序列的一个代表性的菌落可以进一步分析的细胞亲和性和特异性使用的外地资产管制, 如在图 6A的重复序列从筛选的 abrax 结合肽。这里很清楚, 所有五重复序列有更高的亲和性为 abrax, 意欲的目标, 比 rivax, 结构地相似的蛋白质用于阴性排序, 或者亲和, 是存在在排序期间由于磁珠用于筛选.这与图 3中所示的排序回合的亲和力和特异性已经很有希望的结果一致, 在这里清楚地看到, 对预定目标的绑定的富集, abrax, 随着每一轮筛选而相似蛋白的亲和性, rivax, 不是。然而, 没有确定一个令人满意的协商一致的序列使用的重复序列从 4 abrax 单独 (图 5B和以上讨论)。返回到100测序的殖民地从4轮, 但是, 它被注意到, 当搜索序列类似的最佳匹配的预测共识, 一个额外的候选人, AX-A12, 包含 FWDTWF 序列, 是在隔离 AX-A15, 另一个候选人, AX-A14, 包含一个类似的序列, DWNTWF。这些和其他序列, 要么包含相同的重复序列, 显示相似性的其他非重复序列, 或随机选择, 分析了外地资产管制的结合亲和力和特殊性。这些测试在 Sarkes et al. 2016 1中排列, 此分析中的前5活页夹显示在图 6B中, 该一致性序列确定为 FWDTWF, 如图 5C中所示。
对重复肽序列的结合亲和性的类似分析在筛选的4轮中, 对于识别 PA 目标的多肽来说, 最好的粘合剂, 按 PA-488 nMFI 的比例排列: SAPE nMFI, 包含了 WXCFTC 共识或类似序列 (表 1)。使用这个比率, 序列自组织入那些包含了一致意见和那些没有。顶层候选项, 所有包含与协商一致相关的序列, 都与上述在图 6中 abrax 的方法进行了相似的分析, 如 Sarkes et al. 2015 14中所示。这些结果表明, 对于某些目标, 具有重复序列的多肽的分析可能足以获得所选目标的具有显著亲和力和特异性的粘合剂, 并确定一个一致的序列, 它本身就足以用于绑定。但是, 请注意, 重复次数不一定反映感兴趣目标的相对绑定关联 (表 1)。当对重复序列的分析不足以确定一个模式时, 可以在序列分析和绑定分析之间交替进行, 以缩小候选库的范围, 并重新审视那些具有较高亲和力的候选者的趋势。.即使从单独分析重复序列的趋势来看, 附加的非重复序列也可能在进一步调查时显示相同的趋势或其他趋势。
图 1: 细菌显示库的筛选协议示意图如图所示, 筛选细菌显示库是一个周期性的过程。细菌显示库中的每个细胞 (见材料表) 都含有质粒 DNA, 只要细胞在含有抗性基因的抗生素存在的情况下生长, 它就会被保留。每个质粒还对显示支架蛋白进行编码, 并将随机肽暴露在细胞的外部。由于每个细胞只应包含一个单一的质粒 DNA 序列, 每个细胞应该只显示一个单一的肽, 在多个位置在整个细胞膜。根据筛选开始时的图书馆多样性水平和每轮排序后, DNA 序列可能或可能不是唯一的从细胞到细胞。筛选从细胞库的生长和诱导开始, 在其外膜上显示单个肽。这些肽然后可以与目标蛋白 (这是化或其他标记的捕获) 互动。对于磁性活化细胞分选 (MCS), 未绑定的蛋白质被去除, 并且细胞被培养与磁性珠子被涂覆与捕获蛋白质 (亲和在这个例子, 与生物素的强的交互作用)。然后将整个区域性暴露给磁体, 以便将绑定的单元格与未绑定的单元格分开。使用自动磁选设备是首选的细胞分离, 以减少误报。这里图解的是一个正的排序, 其中的细胞绑定和洗与磁珠保留。对于一个负的排序, 我们通常在前面执行, 该过程是相同的, 除了被洗掉的磁珠的细胞, 而不是保留。图书馆的兴趣, 绑定 (积极排序) 或未绑定 (负面排序) 的分数, 是增长过夜, 并用于下一轮排序。每后一轮的积极筛选要求减少目标浓度和珠体积, 以改善严格。在每一次筛选, 蛋白质靶的多肽的亲和力和特异性评估使用荧光活化细胞分类 (外地), 以帮助确定何时停止筛选和开始调查个人候选人。根据需要, 进行 DNA 测序和肽序列分析。这些分析步骤本身可能是一个周期性的过程, 特别是在最后一轮筛选之后, 揭示个别菌株的趋势。在这一点上, 肽序列的趋势和/或共识与结合亲和力和特异性相关。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 对分类回合进行的资产管制分析的示例数据: PA 目标.在4回合的筛选 (阳性) 后, 显示出与目标、保护性抗原 (PA) 结合的多肽的细菌显示库。这是执行后, 第一次对亲和涂层磁珠的负面排序。对于结合评估, 细胞诱导与 0.4% l-糖90分钟前孵化与目标和控制解决方案和分析的外地资产管制系统。预期目标的绑定关联性分析是以红色装箱的。这里显示的是 FITC 的散射图-a vs FSC a 和百分比单元格的值 (与单独与 PBS 一起孵育的门控负控制相比) 和归一化中位荧光强度 (nMFI, 与无肽阴性对照培养相同的荧光标记蛋白) 的诱导细胞, 孵化45分钟与: PBS 缓冲单独, 150 nm YPet Mona (积极控制肽表达), 或 250 nm PA-488 (标记目标)。注意在每一轮筛选后, 对目标利益的约束亲和性越来越丰富。与图 3相反, 所有 autoMCS 单元格的分离都是使用程序 Posselds 完成的。这部分数据也可以在 Sarkes et al. 2015 14中的 FITC 与 fsc 的散点图中进行可视化, 以比较 FITC-a vs fsc-此处显示的图形。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 对分类回合进行的资产管制分析的示例数据: abrax 目标.与图 2类似, 这里显示的是一个完整的筛选实验的比较绑定亲和力, 由外地资产管制组确定。细菌显示库受到对亲和涂层磁珠的负分选, 如图 2所示, 但随后又受到对类似结构的同源蛋白的另一轮负排序功能, rivax 之前, 执行4回合的积极筛选肽绑定到预期的目标, abrax。对于结合评估, 细胞诱导与 0.4% l-糖45分钟前绑定到目标, 积极控制, 负控制和阅读的资产管制系统。预期目标的绑定关联以红色装箱。这里显示的是 FITC 的散射图-a vs fsc-a (或 PE-a vs fsc-在 SAPE 的情况下) 和百分比单元格的值 (与单独的 PBS 培养的门控负控制相比) 和 nMFI 的诱导细胞, 孵育45分钟: 仅 PBS 缓冲, 150 nm YPet Mona (对多肽表达的阳性控制), 250 nm Abrax-488 (标记蛋白靶), 250 nm Rivax-488 (标记潜在的交叉反应蛋白靶), 或 250 nm SAPE (负控制直接绑定到亲和涂层磁珠)。注意, 在 abrax, 每轮筛选后, 与结构相似的蛋白质的最小结合亲和性, rivax。与图 2相反, 正筛选轮1是使用 autoMCS Posselds 程序执行的, 而随后的分类回合则是使用程序 Posseld 完成的, 如本手稿中筛选所建议的那样。这些数据也可以在 Sarkes et al. 2016 15中的 FITC 与 fsc h 的散点图中进行可视化, 以比较 FITC-a vs fsc-此处显示的图形。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 使用 "eCPX_Sequencing" 宏的序列分析输出示例.显示的是一个截图48测序殖民地从4圆筛选的选择细菌显示库的 PA 粘合剂使用 Posselds 方法。此处显示 "汇总表" 表。请注意, 在排序过程中, 殖民地是按其给定文件名的字母顺序编号的, 并且至少重复一次的框周围的序列是用不同的颜色来描述的, 以便于数据分析。eCPX_Sequencing 宏作为补充代码文件提供。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 两个不同的蛋白质目标的序列对齐和一致确定.此处显示的所有图像都是使用 Jalview 软件在使用 Kalign 在线分析软件51对齐序列后生成的 Clustal_X 着色的。A) 从 PA 筛选4轮 (与表 1对应) 的重复序列的对齐方式。B) 从 abrax 筛选4轮 (与图 6A对应) 的重复序列的对齐方式。C) 对来自 abrax 筛选4轮的前5名候选人进行排列, 这是由对个别候选人的外地资产管制分析所确定的 (对应于图 6B)。红线强调 A 和 C 中的协商一致序列, 而 B 中的紫色线则强调在仅检查重复序列时确定的 abrax 绑定的前体, 突出显示测试绑定关联的潜在需要在某些情况下可以确定在协商一致之前使用外地资产管制。在 Sarkes et al. 2015 14和 Sarkes et al. 2016 1中, 可以看到与不同分析软件生成的相似的对齐。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 使用外地资产管制办法分析的个人候选人的结合亲和性和特异性的例子.这里显示的是正常化的中位荧光强度 (nMFI) 确定使用外地资产管制的 A) 重复序列和 B) 的前5名候选人, 由比较结合的亲和力为目标, abrax, 从4轮的筛选。数据表示三独立复制实验的平均值 (条形) 和标准偏差 (误差线)。请注意, 所有显示的候选人都是相当具体的 abrax (abrax-488, 绿色酒吧) 在结构上类似的蛋白质, rivax (Rivax-488, 红酒吧), 和亲和阴性控制 (SAPE, 黑条)。尽管 a (AX-07 和 AX-15) 中的两个重复序列也在 b 的前5候选项中, 但 a 和 b 中的结果比较表明, 仅对重复序列的分析可能不足以分离出最高亲和肽。此处显示的数据是从 Sarkes et al. 2016 1改编的。请单击此处查看此图的较大版本.
表 1: 针对单个重复候选者的特定绑定与非特定绑定的比率.在这个例子中, 重复序列的数量和 pa (目标) nMFI 到 SAPE (负控制) nMFI 的比率显示为重复候选序列从 pa 筛选轮4。此数据按相对 PA nMFI: SAPE nMFI 比率进行排序, 并分析了已知的 WXCFTC 协商一致, 或类似的序列, 用粗体字体和下划线显示。请注意, 序列自组织, 使那些具有一致意见的候选者具有最高的 PA nMFI: SAPE nMFI 比, 因此更具体地与目标交互。结果表明, 一个单一的外地资产管制实验。在 Sarkes et al. 2015 14中发布的附加复制和分析排除了目标的最低亲和性的多肽。
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Discussion
筛选细菌显示库是一种成功的方法隔离亲和试剂, 和多肽提供了一个有用的替代抗体的识别时, 特定的标准, 如在极端环境的稳定性。这些库的筛选已通过这里描述的 autoMCS 方法进行了简化, 而商业上可用的 autoMCS 平台将此技术扩展到更广泛的用户。与传统的细菌显示库的交替式 MCS/外地资产管制分类方法相比, autoMCS 方法的费用较低, 因为它们不需要投资于一个更昂贵的、能够对绑定单元进行分类和隔离的外地机构。而不是这里使用的流式细胞仪的类型, 它只能够分析14。autoMCS 成功筛选的关键步骤包括分离方案选择, 对潜在的交叉反应物进行负排序, 以减少误报, 利用外地资产管理系统监测图书馆的丰富性, 以确定何时停止筛选, 以及对候选池进行智能分析, 以避免对数百名候选者进行繁琐的筛选。
本文中的例子说明了选择的细菌显示库的成功筛选两个单独的目标, PA 和 abrax, 虽然稍有不同的分析策略, 由于不同的肽序列为每个池候选人经过四轮的筛选。PA 是更直接的情况下, 序列分析显示明确的趋势, 从多肽序列, 重复至少一次在144殖民地。仅此一项就足以确定 pa 目标的协商一致序列, 而那些包含共识或类似序列的殖民地是在绑定到 pa 与绑定到亲和负控制的比率方面的最佳候选者。然而, 情况并非总是如此。对于 abrax 目标, 测序100菌落导致五重复序列, 但这些序列中的趋势是不太清楚, 除了倾向于含有芳香氨基酸残留物和天门冬氨酸或胺。从重复序列中所预测的 "共识" 只能产生和测试与 abrax 的亲和性, 但由于没有父序列包含精确的一致序列, 我们返回到序列化的菌落列表, 并观察到其他有更多共同倾向的候选人。事实上, 两个殖民地包含了一个类似的序列的 "共识" 从单独的重复, (FWDTWF 而不是 FWAWF), 这有相同的趋势, 色氨酸, 苯丙胺, 和天门冬氨酸残留, 但有不同的间距。其中一个肽是重复序列, 一个不是。这两个序列, 连同第三个序列包含一个类似的变体, 是在前5的粘合剂测试的亲和力的 abrax。顶部粘合剂整体, AX-A05, 也显示相似的趋向。abrax 的结果表明, 根据所选择的目标, 有时需要在序列分析与亲和性和特异性分析之间进行多次交替的方法。abrax 目标的结果还显示了在非常相似的蛋白质 (rivax 1,15) 上可以实现的特异性级别。
为我们的研究选择的 autoMCS 程序是 Posselds 和 Posseld, 这都是为积极选择的标记目标细胞低频, 少于5% 的初始人口。在这两种情况下, 细胞通过两个磁性柱。但是, 在 Posselds 程序的情况下, 单元格通过第一列的速度更慢, 从而增加曝光时间41。除了商用 autoMCS 设备制造商提供的程序说明 (请参见材料表) 41, 这些程序是在对几个潜在程序进行初步比较后选择的。每个程序的能力, 以避免从一个同质的负面控制细胞培养假阳性, 并成功地将已知的粘结剂从含有负控制细胞的混合培养中分离出来, 以减少比较已知粘合剂的百分比。如果与此处描述的应用程序有明显的偏差, 类似的比较可能有助于新应用程序的程序选择。然而, 以前公布的结果比较这两种程序 (Posseld 和 Posselds) 分离肽亲和试剂的 PA 表明, 使用这些程序的所有四轮筛选导致的多肽的分离与类似PA 的亲和性和特异性以及 WXCFTC 共识的确定。主要区别是 Posseld, 以它的快速的流速, 排序更加快速地和结合的亲和力为目标是更高的, 因此在仅二个轮筛选之后, 而使用 Posselds 导致了更加独特的序列在四轮以后筛选14. 从这一点中学习, 当筛选 abrax 结合肽以合并两种好处时, 策略略有变化: Posselds 用于1轮, 允许在这一关键步骤中有更多的曝光时间, 其中的多样性最高, 但随后在 2-4 1,15中, 程序被切换到 Posseld 以更快地隔离最高的亲和力活页夹。这似乎是理想的 abrax, 特别是因为 nMFI 和百分比绑定都更高的 abrax 排序轮4相比, PA 分类轮4与任何程序 (图 2和 图 3和 Sarkes et al. 201514), 但要进行更具决定性的比较, 则需要使用一种策略与同一目标进行直接比较。哪个程序最适合特定的应用程序可能取决于单个目标、所使用的排序库以及在此处描述的条件发生任何更改时所达到的多肽表达式的级别。
没有讨论这里是潜在的结果从筛选与非生物材料, 但我们也使用了相同的细菌显示库的筛选反对散装铝2。这项研究没有使用 autoMCS, 但类似的研究可以完成使用 autoMCS 如果材料是可用的, 或可以涂上或共轭, 磁珠。在大块铝研究中, 个体氨基酸分析和二级结构建模有助于了解什么是驱动的结合亲和性的分离肽, 因为没有共识序列确定2。即使有了生物目标, 这可能需要了解什么是驱动绑定亲和力的一些目标, 这就是为什么电子表格生成的 "eCPX_Sequencing" 宏包括一个标签与个别残留频率分析。如果除了缺乏共识外, 没有出现重复序列, 而且剩余频率没有显示任何模式, 则可能需要其他类型的分析。此外, 可能还需要进一步的分类, 以避免筛选出更多的候选者, 以便选择那些与预期目标有足够亲和力的候选人。
随着下一代测序的增加, 可以进行更深入的研究, 以确定最有希望的候选者, 然后再测试亲和性, 并确定每轮筛选后的富集程度。但是, 如果这些序列没有足够高的频率以在数十个或数以百计的蚁群中进行常规的菌落测序, 那么移动到绑定分析步骤的顺序可能需要由克隆来重新创建。随着这项技术的进步, 变得越来越不昂贵和更常规, 特别是有一个选择的殖民地隔离, 这将可能是最好的方式来分析筛选数据。它可能会导致解释的方式个别序列, 和整个图书馆, 演变。此外, 分类库中的细菌可能随着时间的推移而变异, 这可能会对细胞进行分类, 使其具有更快的生长速率或细菌, 过度基因组蛋白能够结合材料, 即使没有显示支架和肽表达,实例.因此, 一旦有希望的候选者出现, 就值得分离质粒 DNA, retransforming 新鲜的大肠杆菌,和通过外地资产管制组确认多肽结合。如果计划使用的肽在一个无细胞的格式, 亲和性也应评估的自由肽。例如, 通过对靶点的细菌显示进行多肽亲和试剂的合成, 并采用酶联 immunosorbant 法 (ELISA) 和细胞 (通过) 和离体细胞等传统方法进行分析。(通过 ELISA) 亲和性的比较使用的 Kd由两种方法确定的7。
虽然生物素-亲和相互作用的强度使它成为捕获蛋白质靶和结合肽的理想策略, 但此过程可以被修改以获取其他捕获策略。直接耦合蛋白质的磁性珠子, 如环氧树脂和羧酸珠, 已经成功, 并取消了一个结合的步骤。但是, 根据附件策略, 直接附件可能会以特定或非特定的方式阻碍潜在的绑定站点。一个额外的优势, 使用亲和珠是不稳定的蛋白质目标可以新鲜化在30分钟或储存冷冻, 如果需要, 而珠子本身往往需要更长的孵化与蛋白质的交叉连接, 并一般存储在 2-c。建议的化蛋白靶的起始浓度在这里, 600 nM, 已经成功的多个目标, 但它可能是可能的分离肽捕获试剂增加亲和力, 如果这种浓度降低。此外, 该方法还可以扩展到其他细菌显示库和其他生物体。例如, 这些步骤可以在没有氧气的情况下进行, 用于厌氧, 或在其他环境中使用以极端分离具有独特特性的多肽。为某一特定目标确定的多肽和/或共识可作为活体材料, 或合成的细胞。合成的多肽可以进一步成熟的发展, 甚至更高的亲和力和更强健的蛋白质催化捕获 (PCC) 剂, 用于传感器, 或其他应用, 抗体通常会被用于捆绑或识别38,55。分子建模也可用于帮助确定肽与其目标的结合位置, 如最近在图 5C 1中所列的 abrax 结合肽和共识所执行的操作。总的来说, 筛选细菌显示库的肽亲和试剂是一个快速, 直接, 和强大的替代品生产抗体的识别和检测的蛋白质目标, 这半自动化筛选方法已取得了可靠的结果, 具有深远的应用。
Disclosures
作者没有透露
Acknowledgments
作者要感谢美国陆军研究实验室 (ARL) 博士后奖学金计划的支持, 由橡树岭联合大学管理, 通过与 ARL 的合同, 通过任命 Dr. 贾斯汀 p. Jahnke。剩余资金由 ARL 的传感器和电子设备局提供。作者还要感谢多尔蒂实验室在 UCSB 共享细菌显示库和信息克隆的 YPet mona 试剂, Dr. 布林亚当斯支持克隆 YPet 蒙娜丽莎试剂在 ARL, Dr. 约书亚 Kogot 为他的初步工作和在细菌显示库筛选的训练, 阿丽娜伍德化学和生物中心的平静, 用于表达和纯化 abrax 和 rivax 蛋白的质粒, 用于分离 PA 结合肽的技术支持, 秦郭为 abrax 结合肽的初步实验提供技术支持, Dr. 洁西卡特雷尔为有关此手稿的有益讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | Automated cell separator for use with magnetic beads |
| Luria Broth, Miller (LB) | Fisher Scientific | BP1426-500 | Growth medium |
| Chloramphenicol | Fisher BioReagents | BP904-100 | Antibiotic |
| Agar | Fisher Scientific | BP2641-500 | Thickening/geling agent |
| eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library | Cytomx Therapeutics | N/A; http://cytomx.com/contact/ | On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB. |
| L-arabinose | Sigma | A3256-500G | Sugar, for induction of protein expression |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) | Amresco | 0780-10L | Buffer |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh | Thermo Scientific | PI21327 | Adds biotin molecule to primary amines |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | PI28005 | Ensures biotin molecule is covalently bound to protein |
| Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads | Invitrogen | 65601 | Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | Protein, used as blocking agent for non-specific binding |
| D-glucose | Sigma | G8270-1KG | Sugar, for growth and impeding inducible protein expression |
| Ypet Mona | UCSB and ARL | N/A | Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13. |
| Dylight 488 NHS Ester | Thermo Scientific | 46403 | For conjugating protein target to fluorophore |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) | Thermo Scientific | S866 | Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin |
| BD FACSFlow | Becton, Dickinson, and Company | 342003 | Buffer for running FACS instrument |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotech | 130-021-101 | For MACS Separation |
| autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotech | 130-091-221 | For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide. |
| autoMACS Pro Washing Solution | Miltenyi Biotech | 130-092-987 | For autoMACS instrument maintenance |
| 70% Ethanol | VWR | E505-4L | Decontamination of autoMACS |
| Glycerol | Sigma | G6279-1L | For bacterial freezer stocks |
| Chill 15 rack | Miltenyi Biotec | 130-092-952 | For MACS Separation |
| BD FACSCanto II | Becton, Dickinson, and Company | 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview | For assessment of peptide binding to target |
| BD FACSDiva Software | Becton, Dickinson, and Company | 659523 | For assessment of peptide binding to target |
| Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator | Thermo Scientific | A13346 | Bench top cell separator for use with magnetic beads |
| Colony Sequencing | Genewiz | N/A; https://www.genewiz.com/ | DNA and Colony Sequencing Services |
| Excel | Microsoft | 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 | For use with sequence analysis macro |
| Anthrax Protective Antigen (PA) | List Biological Laboratories, Inc. | 171 | Target protein used as example for representative results. |
| Abrax | ECBC and ARL | N/A | Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15. |
| Rivax | ECBC and ARL | N/A | Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15. |
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