Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Summary

Biopanning bacteriële display bibliotheken is een bewezen techniek voor ontdekking van peptide affiniteit reagentia, een robuust alternatief voor antilichamen. De semi-automatische sorteermethode hierin heeft gestroomlijnd biopanning als u wilt verkleinen van het optreden van valse positieven. We illustreren hier het denkproces en de technieken toegepast in de beoordeling van kandidaten en het minimaliseren van de downstream-analyse.

Abstract

Biopanning bacteriële display bibliotheken is een bewezen techniek voor peptide affiniteit reagens ontdekking voor erkenning van zowel biotische en abiotische doelen. Peptide affiniteit reagentia kunnen worden gebruikt voor soortgelijke toepassingen aan antilichamen, met inbegrip van sensing en therapeutiek, maar zijn robuuster en kunnen uitvoeren in meer extreme omgevingen. Specifieke verrijking van peptide vangen agenten aan een doel van de proteïne van belang is verbeterd met behulp van semi-automatische sorteren methoden die bindende verbeteren en wassen stappen en dus verminderen het optreden van valse positieve bindmiddelen. Een semi-automatische sorteermethode is beschreven hierin voor gebruik met een commerciële geautomatiseerde magnetische-geactiveerde cel Sorteren apparaat met een onbeperkte bacteriële weergave sorteren bibliotheek uiten willekeurige 15-mer peptiden. Met lichte wijzigingen, deze methoden zijn uitbreidbaar tot andere geautomatiseerde apparaten, andere sorteren bibliotheken en andere organismen. Een primair doel van dit werk is om een uitgebreide methodologie en uitleggen van het denkproces toegepast in het analyseren en het minimaliseren van de resulterende pool van kandidaten. Deze technieken omvatten analyse van aan-cel binding met behulp van fluorescentie-activated cell sorting (FACS), ter beoordeling van affiniteit en specificiteit bij het sorteren en vergelijken van individuele kandidaten, en de analyse van peptide reeksen om trends te identificeren en consensus reeksen voor inzicht en potentieel het verbeteren van de affiniteit met en de specificiteit voor de doelgroep van belang.

Introduction

Biopanning is een bewezen techniek voor affiniteit reagens ontdekking, met bacteriële display bibliotheken een handige bron voor peptide affiniteit reagentia ^{1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24}. Ook weergave van phage ^25,26 en gist weer ^27,28, de peptiden zijn blootgesteld aan de oppervlakte van de cel en zijn beschikbaar om te binden aan zowel biotische en abiotische doelen, met deze interacties gedreven door zowel de ruggengraat van de peptide en de unieke eigenschappen van het aminozuur zijketens ²⁹. In tegenstelling tot de bacteriofaag vertoning, de bacteriën zelf zijn zelfreplicerende en bevatten alle genetisch materiaal vereist voor de weergave zonder de elutie van afhankelijke bacteriofaag en herinfectie van cellen. In tegenstelling tot gist display is bacteriële vertoning sneller als gevolg van de snelle (ongeveer 20 min ³⁰) verdubbeling van tijd van Escherichia coli. De resulterende peptide affiniteit reagentia kunnen worden geproduceerd uit-cel voor gebruik in een verscheidenheid van sensing platformen ^16,17,26 en potentieel voor gebruik als levende materialen als weergegeven op-cel ^{2 , 31 , 32}. in vergelijking met monoklonale antilichamen voor erkenning van de specifieke doelstellingen, peptiden zijn veel kleiner en flexibeler, en peptide display bibliotheken kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd op DNA niveau om te voorkomen dat specifieke aminozuren, zoals cysteïne ³³ . Peptiden zijn steeds meer uitgebuit voor therapeutiek ^34,35,^,36 en andere toepassingen waar antilichamen zou normaal gesproken worden gebruikt vanwege hun gemak van ontdekking, reproduceerbare synthetische (af-cel ) productie en onderhoud van de superieure prestaties in extreme omgevingen, bieden een functionele reagens zelfs na blootstelling aan hoge temperaturen of langdurige opslag zonder koeling ^37,38. De mogelijkheid om de koudeketen voor opslag van de reagentia te overwinnen is van bijzonder belang zijn voor het ministerie van defensie, bijvoorbeeld, die in extreme omgevingen werken moet. Thermische stabiliteit was daarom een wenselijk functie voor de affiniteit reagentia herkennen de gekozen doelstellingen gegeven als voorbeelden in dit manuscript.

Biopanning bacteriële display bibliotheken geworden onlangs nog eenvoudig en betrouwbaar met het gebruik van semi-automatische magnetische-geactiveerde cel sorteren (MACS of MCS) methoden ^9,14,39. Deze methoden zijn aangetoond voor biologische doelstellingen met behulp van verschillende soortgelijke platforms met verschillende voordelen, waaronder een verkrijgbare sorteren geautomatiseerd magnetische-geactiveerde cel sorteren (autoMACS of autoMCS) instrument (zie tabel met materialen) ^1,14,15 en meer gespecialiseerde hulpmiddelen die omsluiten het monster in een wegwerp cartridge ^7,9 of chip ³⁹, een waardevolle specificatie voor gebruik met organismen of toxinen die Biosafety Level 2 (BSL-2) of hoger⁷. Deze semi-automatische methoden kunnen worden uitgebreid om te sorteren voor peptides kunnen binden aan de abiotische materialen als de materialen magnetisch zijn of de mogelijkheid hebben om op een magnetische kraal en voor gebruik met verschillende organismen (zoals anaërobe bacteriën) worden bekleed als het sorteren en groei voorwaarden zijn gewijzigd. Naast bacteriële display bibliotheken sorteren, is het instrument van de commerciële autoMCS die hier gebruikt ook gebruikt in deel voor de eerste stappen van de ontdekking van menselijke single-keten antilichamen fragmenten weergegeven op het oppervlak van de gist, gevolgd door verdere isolatie met behulp van fluorescerende geactiveerd Cell Sorting (FACS) ⁴⁰. De belangrijkste voordelen voor semi-automatisering zijn daalde sorteren van tijd en moeite, en meer robuuste en reproduceerbare eliminatie van niet-afhankelijke cellen uit de magnetische kralen tijdens wassen stappen, wat leidt tot lagere valse positieven, minder vereist sorteren rondes, en minder ingewikkeld stroomafwaarts analyse ^9,14. In het geval van de commerciële autoMCS-instrument, er zijn meerdere vooraf geladen programma's die optimaal is voor verschillende toepassingen, zoals negatieve sorteermachines (uitputting), prioriteren van zuiverheid, definitieve monstervolume minimaliseren en vergroten of afnemende gevoeligheid voor isolatie van zeldzame cellen ⁴¹.

De focus van dit werk is om aan te tonen van de methodologie voor biopanning een bibliotheek van de bacteriële weergeven met behulp van het instrument van de handel verkrijgbare autoMCS, en uit de gedachte-proces toegepast in het analyseren en het minimaliseren van de resulterende pool van kandidaten in te om van de uitbreiding naar andere toepassingen te vergemakkelijken. De bibliotheek van de display hier gebruikt (zie tabel van materialen) ^12,13 bevat ongeveer 10⁹- 10¹¹ unieke 15-mer peptiden weergegeven via een gewijzigde versie van de bacteriële buitenmembraan proteïne OmpX in een onbeperkte natuur op het celoppervlak, die wordt verondersteld te worden van de vertegenwoordiger van de gratis peptide in oplossing als synthetisch vervaardigd. Deze eiwit-steiger bevat bovendien een positieve controle P2X peptide in het C-terminus voor het toezicht op expressie via bindende aan YPet Mona. Echter moet een gekochte of nieuwe bibliotheek met geschikte diversiteit en andere eigenschappen die vereist zijn voor de specifieke toepassing gewenst werken op dezelfde manier met deze biopanning-procedure, hoewel enkele kleine veranderingen vereist worden kunnen. Een schematische voorstelling van dit protocol biopanning wordt geïllustreerd in Figuur 1. Bovendien, het protocol kan worden aangepast aan andere geautomatiseerde magnetische sorteren platformen en andere sorteren strategieën. Handmatige magnetische sorteren met een benchtop magneet is succesvol gebleken, zij het met meer ingewikkeld en tijdrovend downstream analysemethoden die nodig zijn wegens toegenomen valse positieven ¹⁴, en toch biedt een alternatieve optie om de autoMCS stappen als geen geautomatiseerde magnetische cel Sorteren apparaat beschikbaar is.

Protocol

1. Biopanning bacteriële Display bibliotheken met behulp van autoMCS

Opmerking: Dit autoMCS gebaseerde sorteren protocol is eerder beschreven ¹⁴, en een grondiger "uitgebreid Protocol voor nieuwe gebruikers" is beschikbaar in de aanvullende materialen voor dit manuscript voor verdere informatie, met inbegrip van een beschrijving van potentiële wijzigingen. Als een autoMCS-apparaat niet beschikbaar is voor het sorteren, zie het aanvullende protocol van Sarkes et al. 2015 aangezien een handleiding sorteren protocol ook in dat beschreven wordt werken ¹⁴. Het autoMCS-protocol voorwaarde hier verder is aangepast als u wilt opnemen van aanvullende negatieve sorteren stappen voor betere specificiteit ^1,15. Een schematische voorstelling van dit protocol biopanning wordt geïllustreerd in Figuur 1.

1. Negatieve sorteren als u wilt verwijderen van bindmiddelen kunnen Cross-React met magnetische kralen
   1. Inoculeer 500 mL Luria Bouillon Miller (LB) bevatten passende antibiotica met ongeveer 1 x 10¹¹cellen van een divers bacteriële weergeven sorteren bibliotheek (zie tabel van materialen).
      Opmerking: De bacteriële display peptide bibliotheek gebruikt hier (zie tabel van materialen) bevat ongeveer 10⁹- 10¹¹-unieke leden- ^8,12 en wordt geteeld in LB met 25 µg Mo/mL chlooramfenicol (LB Cm₂₅). De rest van dit protocol zal veronderstellen dat deze bibliotheek wordt gebruikt.
   2. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 225 t/min, totdat de cultuur een OD₆₀₀ van 0,5 bereikt - 0,55. Induceren van peptide expressie met 0,04% w/v L-arabinose door verdunning van een voorraad 1:100 van 4%, schudden bij 225 t/min gedurende 45 minuten bij 37 ° C.
   3. Plaats geïnduceerde cultuur op ijs. Centrifugeer ongeveer 2 x 10¹¹ cellen bij 6000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer de cellen in 1,5 mL PBS door voorzichtig te zwenken.
      Opmerking: Een OD-₆₀₀ voor 1.0 ongeveer gelijk is aan 1 x 10⁹ cellen/mL voor E. coli.
      Opmerking: niet VORTEX doen als dit kan lyse de cellen; met de hand of door kort schudden bij ≤ resuspendeer 225 RPM, 4° C.
   4. Cellen omzetten in microcentrifuge sproeibuis(-buizen) en spin bij 6.000 x g gedurende 5 min op RT of 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,5% bovien serumalbumine (BSA; PBS-B).
   5. Wassen 300 µL van daar beklede parels (ongeveer 3 x 10⁹ kralen, zie tabel van materialen) in 1 mL PBS-B en Centrifugeer gedurende 5 min op ≥5, 000 x g (bij RT). Plaats de buis in een bench top magnetische deeltjes scheidingsteken. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende substantie, het vermijden van de pellet.
   6. Resuspendeer de kralen in de cel plus PBS-B mengsel bereid boven. Incubeer bij 4° C op een roterend platform voor 45 min. plaats monsters op ijs.
   7. Inschakelen van autoMCS instrument voor het initialiseren van het systeem. Prime lijnen met behulp van fabrikant run en wassen buffers (zie tabel van materialen) door het selecteren van "Wash Now" aan de onderkant van het scherm in het menu "Scheiding" dan "Spoelen" en "Run".
   8. Prime het systeem met PBS-B, met behulp van PBS-B als zowel was Buffer en Buffer actief in de volgende stappen. Selecteer het menu "Scheiding" op de bovenste navigatiebalk en selecteer "Wash Now". Selecteer "Spoelen" en "Run" om te prime het systeem met verse PBS-B.
   9. Cel en parel mengsel uit de incubatie stap naar een conische tube van 15 mL overbrengen. Plaats deze buis in de sleuf van het monster, en leeg 15 mL conische buisjes in de positieve en negatieve selectie slots, voor een vooraf gekoeld (4 ° C)-rack (zie tabel van materialen). Plaats het rek op instrument-platform.
   10. Toewijzen van een scheiding programma voor elk monster op het rek (maximaal 5 monsters kan worden gesorteerd in een punt). Voeg een stap "Spoelen" tussen elk monster en na het laatste monster. Selecteer "Run" om te beginnen met de scheiding van de cel. Selecteer "OK" om te bevestigen dat genoeg buffer beschikbaar is.
       Opmerking: De "Posselds" scheiding programma werkt goed voor het sorteren van de negatieve en positieve sorteren van ronde 1 en "Posseld" is de voorkeur voor het sorteren van de ronden 2-4, maar beide programma's zijn met succes gebruikt voor alle negatieve en positieve sorteren rondes ^{14 ,15} en andere programma's kunnen blijken beter voor een bepaalde toepassing (beschreven verder in discussie).
   11. Wanneer het programma voltooid is, verwijdert het rek en behouden van de juiste breuk. Hier, bij een negatieve soort, behouden negatieve breuken (met cellen zonder kralen). Plaats op het ijs.
   12. Gebruik de negatieve soort breuk in zijn geheel om te enten 1L van LB Cm₂₅ met 0,2% w/v D-glucose. Groeien 's nachts bij 37 ° C, schudden bij 225 t/min.
   13. Voor het uitschakelen van het instrument autoMCS, omzetten in de buffers lopen en wassen van de fabrikant run en wassen buffers (zie tabel van materialen). Selecteer "Nu wassen", dan "Spoelen" en "Run". Wanneer u klaar bent, zeker er 70% ethanol in de lijn van de decontaminatie, druk op het "pictogram van de macht" in de rechter bovenhoek van het scherm en selecteer "Yes".
   14. Wanneer het systeem afsluiten is voltooid (de flessen zullen paarse), uitschakelen van de machine.
   15. De volgende dag, gebruik de overnachting cultuur om vriezer voorraden met ongeveer 1 x 10¹¹cellen per flacon in LB met 15% glycerol. Bovendien, of als alternatief, gebruik deze cultuur in de volgende stap: extra negatieve Sorteer (sectie 1.2) of de eerste ronde van de positieve sorteren (sectie 1.3).
2. Negatieve sorteren als u wilt verwijderen van bindmiddelen kunnen Cross-React met andere doelstellingen van belang
   Opmerking: Punt 1.2 kan worden overgeslagen als geen verdere negatieve sorteren is nodig of gewenst. In dat geval, ga naar afdeling 1.3. Residuele binding aan geen ongewenste doelstellingen kan worden geëvalueerd door FACS zoals in deel 2: FACS analyse van sorteren rondes.
   1. Voor het sorteren van de negatieve tegen een specifieke proteïne doel, bijvoorbeeld een soortgelijke proteïne met potentie om ook afhankelijk van de ontdekte peptiden ^1,15, Herhaaldestappen groei en inductie 1.1.1 - 1.1.3, beginnend met een bevroren voorraad van daar-verarmd bibliotheek uit stap 1.1.15 of de overnachting cultuur uit stap 1.1.12 (met behulp van OD₆₀₀ schatten te inoculeren met 1 x 10¹¹ cellen).
   2. Cellen omzetten in microcentrifuge sproeibuis(-buizen) en spin bij 6.000 x g gedurende 5 min op RT of 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof. Resuspendeer cel pellet in 1 mL PBS met 600 nM biotinyleerd cross-reactive eiwit doel. Incubeer bij 4 ° C voor 45 min op een draaiend platform.
      Opmerking: 600 nM is een voorgestelde beginconcentratie, die kan worden gewijzigd indien een bekende voordeel wordt waargenomen. Biotinylation van eiwit doel kan worden bereikt en gekwantificeerde met behulp van de reagentia stelde in de tabel van materialen.
   3. Ondertussen was 100 µL van daar beklede parels (parels van ongeveer 1 x 10⁹ ) in 1 mL PBS-B en Centrifugeer gedurende 5 min bij ≥ 5000 x g (bij RT). Breng buis in een bench top magnetische deeltjes scheidingsteken en zorgvuldig verwijderen bovendrijvende substantie, het vermijden van de pellet.
   4. Centrifugeer de doel-gebonden cellen bij 6.000 x g gedurende 5 min (RT of 4° C), verwijderen van supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL PBS-B. Resuspendeer kralen in de gehele volume van gewassen cellen die zijn gebonden aan cross-reactive eiwit doel. Incubeer bij 4° C op een roterend platform voor 30 min.
   5. Breng de monsterhoeveelheid op ijs en volledige stappen 1.1.7 - 1.1.15 voor een negatieve sorteren, maken van de juiste vriezer voorraden. Blijven sectie 1.3 voor een positieve sorteren als alle gewenste negatieve sorteren is bereikt, of herhaal punt 1.2 negatieve sorteren tegen een andere potentiële cross-reactive eiwit.
3. Ronde 1 positieve sorteren
   Opmerking: Ronde 1 positieve sorteren tegen een specifieke proteïne doel is vergelijkbaar met een negatieve soort tegen een specifiek streefcijfer voor sorteren (zie 1.2) behalve dat de kraal-bevattende, positieve breuk behouden blijft.
   1. Inoculeer 500 mL LB Cm₂₅ met ongeveer 1 x 10¹¹cellen van een divers bacteriële weergeven sorteren bibliotheek die is daar-uitgeput en overnachting (uit stap 1.1.12) of (uit stap 1.1.15) bevroren en ontdooide gegroeid op ijs, of dat is geweest verder uitgeput ringbanden met andere targets van de cross-reactive eiwitten (uit stap 1.2.5), zoals gewenst.
   2. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 225 t/min, totdat de cultuur een OD₆₀₀ van 0,5 bereikt - 0,55. Induceren van peptide expressie met 0,04% w/v L-arabinose door verdunning van een voorraad 1:100 van 4%, schudden bij 225 t/min gedurende 45 minuten bij 37 ° C.
   3. Plaats geïnduceerde cultuur op ijs. Centrifugeer ongeveer 2 x 10¹¹ cellen bij 6.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer de cellen in 1,5 mL PBS door voorzichtig te zwenken (met de hand of door kort schudden bij ≤ 225 RPM, 4° C).
   4. Cellen omzetten in microcentrifuge sproeibuis(-buizen) en spin bij 6.000 x g gedurende 5 min op RT of 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof.
   5. Resuspendeer cel pellet in 1 mL PBS met 600 nM biotinyleerd eiwit doel van belang. Incubeer bij 4 ° C voor 45 min op een draaiend platform.
      Opmerking: 600 nM is een voorgestelde beginconcentratie, die kan worden gewijzigd indien een bekende voordeel wordt waargenomen. Biotinylation van eiwit doel kan worden bereikt en gekwantificeerde met behulp van de reagentia stelde in de tabel van materialen.
   6. Ondertussen was 100 µL van daar beklede parels (parels van ongeveer 1 x 10⁹ ) in 1 mL PBS-B en Centrifugeer gedurende 5 min bij ≥ 5000 x g (bij RT). Plaats buis in een bench top magnetische deeltjes scheidingsteken en verwijder voorzichtig het supernatant, het vermijden van de pellet.
   7. Wanneer incubatie met doel voltooid is, centrifugeer de doel-gebonden cellen bij 6.000 x g gedurende 5 min (RT of 4° C) te verwijderen van een niet-afhankelijke doel-eiwit. Verwijderen van supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL PBS-B. Resuspendeer kralen in de gehele volume van gewassen cellen die zijn gebonden aan eiwitten doel. Incubeer bij 4° C op een roterend platform voor 30 min. plaats op het ijs.
   8. Inschakelen van autoMCS instrument voor het initialiseren van het systeem. Prime lijnen met behulp van fabrikant run en wassen buffers (zie tabel van materialen) door het selecteren van "Wash Now" aan de onderkant van het scherm in het menu van de scheiding, dan "Spoelen" en "Run".
   9. Prime het systeem met PBS-B, met behulp van PBS-B als zowel was Buffer en Buffer actief in de volgende stappen. Selecteer het menu van de scheiding in de bovenste navigatiebalk en selecteer nu wassen. Selecteer spoelen en uitvoeren op het systeem met verse PBS-B. prime
   10. Cel en parel mengsel van incubatie stap hierboven overbrengen naar een conische tube van 15 mL, spoelen van de buis met een extra 500 µl van PBS-B en de bundeling van de wassen met het monster. Plaats deze buis in de sleuf van het monster, en leeg 15 mL conische buisjes in de positieve en negatieve selectie slots, voor een vooraf gekoeld (4 ° C)-rack (zie tabel van materialen). Plaats het rek op instrument-platform.
   11. Toewijzen van een scheiding programma voor elk monster op het rek (maximaal 5 monsters kan worden gesorteerd in een punt). Voeg een stap "Spoelen" tussen elk monster en na het laatste monster. Selecteer "Run" om te beginnen met de scheiding van de cel. Selecteer "OK" of "Doorgaan" om te bevestigen dat genoeg buffer beschikbaar is.
       Opmerking: De "Posselds" scheiding programma werkt goed voor het sorteren van de negatieve en positieve sorteren van ronde 1 en "Posseld" is de voorkeur voor het sorteren van de ronden 2-4, maar beide programma's zijn met succes gebruikt voor alle negatieve en positieve sorteren rondes ^{14 , 15} en andere programma's kunnen blijken beter voor een bepaalde toepassing (beschreven verder in discussie).
   12. Wanneer het programma voltooid is, verwijdert het rek en behouden van de juiste breuk. Hier, voor een positieve soort, behouden positieve breuken (met cellen en kralen). Plaats op het ijs.
   13. Voor het uitschakelen van het instrument autoMCS, omzetten in de buffers lopen en wassen van de fabrikant run en wassen buffers (zie tabel van materialen). Selecteer "Nu wassen", dan "Spoelen" en "Run". Wanneer u klaar bent, zeker er 70% ethanol in de lijn van de decontaminatie, druk op het "pictogram van de macht" in de rechter bovenhoek van het scherm en selecteer "Yes".
   14. Wanneer het systeem afsluiten is voltooid (de flessen zullen paarse), uitschakelen van de machine.
   15. Gebruik de positieve soort breuk in zijn geheel om te enten 1L van LB Cm₂₅ met 0,2% w/v D-glucose. Groeien 's nachts bij 37 ° C, schudden bij 225 t/min.
   16. De volgende dag, de overnachting cultuur gebruik te maken van diepvries voorraden in LB met 15% glycerol en/of blijven positief sorteren ronde 2 in sectie 1.4.
4. Verdere positieve sorteren rondes
   Opmerking: Doorgaans vier sorteren rondes worden aanbevolen, hoewel drie sorteren rondes over het algemeen voldoende ^{14,15 zijn}. Wanneer om te stoppen met sorteren wordt bijgestaan door beschreven de FACS analyse van sorteren rondes in sectie 2. Concentraties van doel en magnetische kraal volume afnemen met elke latere positieve sorteren ronde.
   1. Met behulp van de overnachting cultuur van de vorige sorteren ronde (of een bevroren cel voorraad van die ronde), Inoculeer 5 mL LB Cm₂₅ met 100 µl cellen (1:50 verdunning). Incubeer bij 37° C met schudden bij 225 t/min, totdat de cultuur een OD₆₀₀ van 0,5 bereikt - 0,55.
   2. Induceren van peptide expressie met 0,04% w/v L-arabinose, schudden bij 225 t/min gedurende 45 minuten bij 37° C. Plaats geïnduceerde cellen op ijs.
      Opmerking: Deze geïnduceerde cultuur kan ook worden gebruikt ter beoordeling van bindende affiniteit en specificiteit voor de sorteer ronde die het vandaan, zoals beschreven in sectie 2 hieronder.
   3. Centrifugeer 1 x 10⁸ cellen bij 6.000 x g gedurende 5 min op RT of 4 ° C. Verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet cel in 50 µL PBS met de helft van de concentratie van biotinyleerd eiwit doel van belang voor de vorige ronde voor het sorteren gebruikt (dus 300 nM voor ronde 2, 150 nM voor ronde 3, en 75 nM voor ronde 4 van onze voorgestelde beginpunt). Incubeer gedurende 45 min op ijs (of bij 4 ° C een roterende platform).
   4. Ondertussen was daar beklede kralen (15 µL voor ronde 2, 8 µL voor ronde 3, en 4 µL voor ronde 4) in 1 mL PBS-B en Centrifugeer gedurende 5 min bij ≥ 5000 x g (bij RT). Breng buis in een bench top magnetische deeltjes scheidingsteken en zorgvuldig verwijderen bovendrijvende substantie, het vermijden van de pellet. Resuspendeer kralen in 50 µL PBS-B.
   5. Na de 45 min incubatie met doel in stap 1.4.3, centrifugeer de cellen bij 6.000 x g gedurende 5 min op RT of 4° C, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in de 50 µL gewassen kralen uit 1.4.4. Houd op ijs en volledige stappen 1.3.7 - 1.3.13 voor een positieve soort monster.
   6. Inoculeer 5 mL cultuur van LB Cm₂₅ aangevuld met 0,2% w/v D-glucose met de hele positieve, kraal-bevattende breuk van de soort.
   7. De volgende dag, de overnachting cultuur kunt vriezer voorraden in LB met 15% glycerol en/of blijven de volgende positieve sortering ronde, terug te keren naar stap 1.4.1.
      Opmerking: Met behulp van de geïnduceerde cultuur van 1.4.2 om bindende affiniteit en specificiteit te beoordelen zoals beschreven in sectie 2 hieronder kunt bepalen wanneer om te stoppen met sorteren. Als twee sorteer ronden in een rij Toon soortgelijk bindende affiniteit, of een latere ronde blijkt daalde van bindende affiniteit voor het doel van belang, dit een wenselijke plek om te stoppen met sorteren. Na de laatste ronde halte terug te keren naar stap 1.4.1 maar 1.4.2.

2. FACS analyse van sorteren rondes

1. De geïnduceerde cuvetten van stap 1.4.2 voor elke sorteren ronde of identieke culturen, 5 µL geïnduceerde cellen toevoegen aan 25 µL van elk van de volgende oplossingen voor bindende beoordeling opgesteld (Zie ook tabel van materialen): PBS alleen; PBS met 150 nM YPet Mona (YPet ^12,13; positieve controle voor expressie), indien beschikbaar; 900 nM eiwit doel geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstof, zoals amine-reactieve kleurstof met emissie/excitatie op 493 nm⁄518 nm (Target-488); 900 nM cross-reactive eiwit doelgroep gebruikt voor het sorteren van negatieve aangeduid met de dezelfde fluorescerende kleurstof (Cross-Reactive eiwit-488); en 900 nM streptavidine-R-phycoerythrin (SAPE). Incubeer op ijs voor 45 min.
   Opmerking: Als rechtstreeks vanuit stap 1.4.2, deze stap zal altijd blijven gebeuren de dag nadat de biopanning voor die ronde werd voltooid omdat de down-geselecteerde bibliotheek 's nachts werd gekweekt dan overgeënt en veroorzaakt de volgende dag. Culturen gegroeid en op vergelijkbare wijze wordt geïnduceerd uit bevroren sorteren ronde voorraden kunnen ook worden gebruikt; in dat geval kunnen alle rondes worden getest en vergeleken met een één experiment.
2. Centrifuge cellen bij 6.000 x g gedurende 5 min op RT of 4° C. Bovendrijvende vloeistof verwijderen en opslaan van monsters op ijs.
   Opmerking: Cel pellets kunnen worden opgeslagen op ijs totdat alle monsters klaar voor analyse zijn.
3. Zet het instrument FACS, de software, start het systeem niet openen en kalibreren instrument na ^43,44van de instructies van de fabrikant.
4. Binnen de FACS software, klik op 'Administrator' en klik op de gewenste map of maak een "nieuwe map". Klik op de "nieuw Experiment" pictogram aan de bovenkant verlaten van het scherm. Rechts klik op pictogram "Hernoem" experiment. Binnen dit experiment, klik op "Global werkbladen".
5. Klik op het pictogram "Dot Plot", klik dan op het wereldwijde werkblad werkblad maken deze scatterplot. Klik op de stip perceel grafiek zelf, dan selecteert u de "inspecteur" pictogram aan de bovenkant verlaten van het scherm en aanpassen van de assen biexponential weergeven door de selectievakjes naast "Y-as" en "X-as" in het venster openen. Sluit het venster van het beeldscherm biexponential door op de X te klikken.
6. Maak een "nieuwe buis" door te klikken op het pictogram aan de bovenkant verlaten van het scherm en de naam van het model met de juiste informatie door rechts te klikken van het specimen pictogram onder "globale werkblad" en selecteren "Hernoem". Het model uit te breiden door te klikken op de (+) teken, dan tweemaal klikken op het pictogram van de buis, vlak tikken daarop, en opnieuw Selecteer "rename" om te beschrijven van het monster.
7. Deze dot perceel grafiek gebruiken met standaard SSC-A vs FSC-A tot en met een negatieve controlemonster in PBS alleen uitgevoerd door dubbel te klikken op die tube of selecteren op de pijl ernaast. Net voordat u het voorbeeld uitvoert, resuspendeer de pellet cel in 500 µL ijs koud FACS met buffer en overdracht monster een FACS buis (zie tabel van materialen), mengen goed door pipetteren en flicking de buis. Plaats de geresuspendeerde cellen op de injectie monsterbuisje (SIT) van het instrument. Druk op "verwerven" met "Gebeurtenissen u wilt weergeven" op 30.000-50.000 en "Gebeurtenissen om op te nemen" 10.000, gegevensstroomdiagrammen laag tempo (om te beginnen; verhogen indien nodig), en "Flush zitten" geselecteerd.
   Opmerking: De juiste snelheid (laag, medium of hoog) is de snelheid waarmee het aantal evenementen/s ongeveer tussen de 200 en 2000.  Dit bereik gebruiken voor alle stappen.
8. Terwijl het verwerven, fotomultiplicator buis (PMT) spanning drempel aanpassen indien nodig door het selecteren van de "Drempel" tab. Klik op en wijzig de "waarde". De kruisspanning voor voorwaartse en zijdelingse scatter (FSC en SSC) zodanig dat negatieve controle cellen in PBS alleen iets onder het midden vallen.
   Opmerking: Aanvullende parameters (zoals WS) kunnen worden toegevoegd op het tabblad van de "Drempel" met behulp van het pictogram "toevoegen". Typisch, bet spanningen van ongeveer 700 V tot 1000V voor zowel FSC als SSC werken goed voor E. coli.
9. Als het monster goed leest is, pas het debiet weergeven van 200-2000 evenementen/s en druk op "Record Data". Wanneer u klaar bent met opnemen, buis uit SIT te verwijderen en plaatsen op het ijs.  Kies de "Veelhoek Gate"-pictogram en gebruik de muis om te tekenen van een hek rond de meerderheid van de bevolking van de cel in de scatterplot. Klik met de rechtermuisknop op stip perceel en selecteer "Toon bevolking hiërarchie".
10. Gebruik deze poort "P1" als een ouder door te klikken op "P1" in de hiërarchie van de bevolking. Maak een nieuwe stip plot volgende stap 2.5. Klik met de rechtermuisknop elke as en de y-as met FITC-A en de x-as omzetten in FSC-A. Poort de negatieve controle (PBS alleen) met behulp van het pictogram "veelhoek poort", met de poort zo strak mogelijk rond de kant van het boven- en linkerrand van de bevolking.
    Opmerking: Controleer de hiërarchie van de bevolking om ervoor te zorgen dat de P1-poort een ouder van de P2-poort is. Als het niet is, zal verschijnen in overeenstemming met de P1 poort en "Alle gebeurtenissen" zullen de ouder; de poort te verwijderen en opnieuw maken na de stap 2.10.
11. Selecteer "P2" in de hiërarchie van de bevolking, klik met de rechtermuisknop, en selecteer "omkeren gate". Klik met de rechtermuisknop op het perceel van de stip met P2 hek en selecteer "Toon populaties". Selecteer de bevolking "P2" en "Niet P2" voor weergave (minder dan 1% van de bevolking moeten vallen buiten de poort).
12. Klik met de rechtermuisknop de stip plot met P2 hek en selecteer "Create statistieken View". Klik met de rechtermuisknop het statistiekvenster weergave en selecteer "Statistieken weergave bewerken". Klik op het tabblad "Bevolking" en toevoegen of verwijderen van de bevolking, zoals gewenst, met inbegrip van de bovenliggende bevolking, P1 (P2, en niet P2 moeten al worden vermeld). Klik op het tabblad "Statistics" en voeg "FITC-A gemiddelde" en geen andere statistieken van belang. Sluit het venster door op OK te drukken.
13. Leiden tot een vergelijkbaar dot perceel grafiek voor PE-A vs FSC-A en poort met behulp van PBS alleen steekproef (vorige percelen kunnen worden gedupliceerd en gewijzigd). Gebruik dit werkblad om uit te voeren van alle monsters (met inbegrip van de negatieve controle cellen geïncubeerd met elk doel fluorophore-label) op deze wijze registreren van ongeveer 10.000 gebeurtenissen voor elk.
    Opmerking: De cellen die vallen buiten de poort na incubatie met de Target-488 proteïne, de positieve controle, etc. zijn bindmiddelen voor dat eiwit, en de waarde van "Niet PX" (waarbij X het nummer van de gated bevolking voor die grafiek is) moet worden geregistreerd als % gebonden YPet. Wanneer u SAPE als een negatieve controle, gebruiken de PE-A vs FSC-A plot. De intensiteit van de fluorescentie van de mediaan (MFI's) van P1 moet ook worden geregistreerd als dit informatie voorbij % bindend geeft, zodat de mate van binding in relatieve termen, en meer robuuste in aanwezigheid van uitschieters ⁴⁵is. Mediane fluorescentie intensiteit kunnen genormaliseerd (nMFI) door het verdelen van MFI van elke peptide door de MFI van een steiger alleen negatieve controle (met geen N-terminale peptide), of een kloon met een peptide-reeks die niet het doel van belang bindt, na een incubatieperiode van met hetzelfde doel geconjugeerd met de zelfde fluorophore ¹⁴. Als deze negatieve controle cellen beschikbaar zijn, kunnen uninduced cellen geïncubeerd met hetzelfde doel en gemarkeerd met de zelfde fluorophore ook worden gebruikt voor normalisatie.

3. sequentieanalyse van potentiële kandidaten en beoordeling van bindende affiniteit

1. Peptide volgorde bepaling
   1. Selecteer en volgorde van tientallen of honderden bacteriële kolonies van de laatste round(s) van biopanning (rondes 3 en/of 4 zijn meestal voldoende ¹⁴).
   2. Analyseren van de reeks gegevens met behulp van het macro-bestand die we hebben ontwikkeld (Zie ondersteunende informatie voor code, "Sub-eCPX_Sequencing") naar specifiek analyseren de sequenties die zijn gegenereerd op basis van biopanning de 15mer bacteriële display bibliotheek in de inhoudsopgave weergegeven materialen. De spreadsheetsoftware weergegeven in de tabel van de materialen, of andere gewenste compatibele software gebruiken.
      Opmerking: Een aantal hulpmiddelen zijn online beschikbaar die kunnen ook steun in de DNA sequentie analyse ⁴⁷. Indien gewenst, gebruik een andere gevestigde methode voor sequentieanalyse en verdergaan met stap 3.1.3.
      1. Het aantal bestanden met reeksen (.seq bestanden, tekstdocumenten ook werken) downloaden en uitpakken in een nieuwe map. Indien nodig, verplaatst of kopieert u de map naar de harde schijf van de computer (in tegenstelling tot een netwerkmap) voor verbeterde snelheid.
      2. Open een nieuw werkbladvenster. Zorg ervoor dat macro's inschakelen en schakel alle functies, als die berichten opduiken.
         Opmerking: Stap 3-6 hieronder maar moeten worden voltooid de eerste keer dat de macro wordt gebruikt. Voor latere analyse, gewoon "the Macro uitvoeren" vanaf stap 7.
      3. Kopieer de volledige inhoud van de macro in het bestand "Sub eCPX_Sequencing" gevonden.
         Opmerking: De huidige versie is ingesteld met de flankerende sequenties voor de bibliotheek van de 15-mer vermeld in de tabel van materialen en de aminozuren tussen hen zal vertalen. Extra sequenties kunnen worden ingevoerd door te kopiëren 5' flankerende sequenties in kolom A en 3' flankerende sequenties in kolom B van het werkblad, tot 10 sequenties voor elk, voordat u de macro uitvoert.
      4. In het bestand leeg werkblad, selecteer het tabblad "Weergave", en vervolgens tweevoudig tikken voort "Macro's." Selecteer de map personal.xlb. Als dit niet beschikbaar is, neemt u een macro eerst zodat deze verschijnen.
      5. Klik op "create" of "stap in", afhankelijk van wat kan worden benadrukt. Plak het gehele macro in de module.
      6. Klik op de opslaan pictogram of ga naar bestand, opslaan. Sluit de module af. Als een venster ijslollie opwaarts, drukt u op OK.
      7. De Macro uitvoeren: Ga naar de map waar de bestanden van de desired.seq zich bevinden. Klik op de balk naast het pictogram van de map aan de bovenkant om de maplocatie te bekijken. Kopiëren.
      8. Ga naar het nieuwe werkbladvenster. Selecteer het tabblad Weergave en dubbelklik op macro's. Selecteer "eCPX_Sequencing" in de lijst en klik "run".
      9. In het vak dat verschijnt, plak de locatie van het bestand gekopieerd stap 7 en druk op enter. De macro moet beginnen gaan door de sequenties en organiseren van hen in tabellen op verschillende bladen.
      10. Gebruik de "samenvatting" het blad om te bepalen als het nodige traceringsbestanden op fouten controleren en correcties aanbrengen handmatig (of reeksen 'X' bevatten kunnen niet worden vertaald).
          Opmerking: De "samenvatting tabel" toont de vertaalde peptide reeksen, gesorteerd per aminozuur volgorde (van A tot Z), tenzij een sequencing fout vertaling voorkomen. Een 'X' duidt een individuele aminozuur dat niet kon worden vastgesteld.
   3. Zodra de sequenties zijn vertaald, georganiseerd, en volgorde fouten gecorrigeerd, Controleer de lijst volgorde gesorteerde peptide op het blad "samenvatting" voor elke herhalende sequenties.
   4. Overnachting culturen voor gesequenceerd kolonies van belang (met inbegrip van de herhalingen en/of peptiden met merkbare trends minimaal) in 5 mL LB Cm₂₅ bij 37 ° C, schudden bij 225 t/min, groeien en sla vriezer voorraden de volgende dag in LB met 15% glycerol, zoals in stap 1.4.7. test de peptiden met herhalende sequenties voor bindende affiniteit en specificiteit met behulp van de methoden van de FACS beschreven in sectie 3.3 en de FASTA indeling van de volgorde lijst (volledige lijst en herhaalt alleen) gebruiken voor het uitlijnen van de sequenties voorkeur alignering gebruiken en analyse van programma's, zoals in punt 3.2.
2. Sequentie-alignering gebruiken Clustal Omega, Kalign en soortgelijke programma 's
   1. Kopiëren van sequenties in FASTA formaat uit het werkblad FASTA van de macro, of anders maak een lijst met FASTA bestanden uit de sequenties worden uitgelijnd (zulke zoals zulks vanuit stap 3.1.3).
      Opmerking: Kolom A bevat de FASTA bestanden in numerieke volgorde door "Seq #" terwijl kolom B gesorteerd op "AA sequence" uit het blad "samenvatting weergegeven". De lijst van peptide reeksen aminozuur volgorde gesorteerd zal onbruikbaar sequenties tonen bij de bovenkant, zoals lege vector (zoals "# leeg") en deze sequenties waarin noch de 5' of 3' zoekcriteria zijn gevonden (zoals "# waarde"). Deze functie zorgt voor gemakkelijk update of verwijdering van de sequenties van de analyse.
   2. Clustal Omega⁴⁸ of Kalign⁴⁹ software openen door naar de website ^50,51, of andere gewenste software voor sequentie alignering gebruiken. Kopieer en plak de FASTA volgorde lijst en het in het vak onder "sequenties in elke ondersteunde indeling" invoeren. Wijzigen "gap open penalty" 30 onder 'meer opties' in Kalign (dit is niet mogelijk in Clustal Omega), maar anders houden standaardinstellingen voordat u klikt op 'verzenden'.
   3. Analyseren van sequentie alignering softwarematig Jalview ^52,53 rechtstreeks binnen Clustal Omega en Kalign online software door de "resultaat samenvatting" tabblad boven de uitlijning te selecteren en vervolgens te klikken op het pictogram "Jalview".
      Opmerking: indien gewenst, of voor de analyse van reeks aanpassingen gegenereerd door alternatieve programma's, downloaden van ⁵⁴ de software afzonderlijk en kopieer en plak de uitlijning in het venster analyse, die wordt geopend door te klikken op "File", "Uitlijning van de Input", en " van Textbox". Dit biedt een manier om gemakkelijk als een opeenvolging van consensus in de input sequentie alignering aanwezig is.
3. Vergelijken van bindende affiniteit en specificiteit met behulp van FACS
   1. Inoculeer 5 mL LB Cm₂₅ aangevuld met 0,2% w/v D-glucose met elke individuele isolaat van belang (uit stap 3.1.4 en/of kolonies van belang van verdere sequentieanalyse in punt 3.2, etc.) en een passende negatieve controle (display steiger alleen of een peptide dat niet doel, bindt zoals beschreven in de nota voor stap 2.13). Groeien 's nachts bij 37 ° C, schudden bij 225 t/min.
   2. Gebruik van de overnachting culturen om te enten van 3 mL LB Cm₂₅ met 60 µl cellen (1:50 verdunning). Incubeer bij 37° C met schudden bij 225 t/min, totdat de cultuur een OD₆₀₀ van 0,5 bereikt - 0,55. Induceren van peptide expressie met 0,04% w/v L-arabinose plus 2 mM EDTA (voor versoepeling van de peptide display ⁴²), schudden bij 225 t/min gedurende 45 minuten bij 37 ° C.
   3. Plaats geïnduceerde culturen op het ijs. Voor elk isolaat, 5 µL cellen aan 25 µL PBS alleen of PBS met toevoegen: 150 nM YPet ^12,13 (positieve controle voor expressie), indien beschikbaar; 250 nM Target-488; 250 nM Cross-Reactive expressie gebrachte eiwitten-488; en 250 nM SAPE (zie 2.1 voor meer detail). Incubeer op ijs voor 45 min.
   4. Centrifuge cellen bij 6.000 x g gedurende 5 min op RT of 4° C. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof door vloeistof te trekken vanaf de andere kant van de pellet. Bewaren cel pellets op ijs tot alle monsters en zijn klaar voor analyse.
   5. Resuspendeer de pellet van elke cel in 500 µL ijs koud FACS uitvoeren buffer, mengen goed door pipetteren en flicking de buis, vlak voor de lezing met behulp van een stroom cytometer (zie tabel van materialen).
      Opmerking: Zie stap 2.13 merkt voor verdere uitleg van het gating en berekening van nMFI om bindende affiniteit en specificiteit te vergelijken. Non-bindmiddelen of aspecifieke bindmiddelen kunnen nu worden verwijderd uit verdere analyse, en de hoogste affiniteit bindmiddelen moeten opnieuw worden beoordeeld door sequentie alignering na punt 3.2 op zoek naar verdere trends die kunnen hebben gemist in de eerste sequenced bevolking. Secties 3.2 en 3.3 kunnen worden herhaald als nodig als nieuwe trends en consensus sequenties worden vermeld. Deze analyse kan meer willekeurige sequenties bevatten als trends zijn niet gezien.

Representative Results

Met het gebruik van geautomatiseerde magnetische-geactiveerde cel (autoMCS) in plaats van handmatig magnetische cel sorteren sorteren, zijn valse negatieve kandidaten aanzienlijk verminderd tijdens biopanning van bacteriële display bibliotheken ^9,14. Negatieve sorteren stappen kan worden ook behoefte worden toegevoegd om niet-specifieke bindmiddelen naar het doel van belang, en minimaal wordt gesuggereerd om toe te voegen een negatieve soort tegen de magnetische kralen zich vooraan. Deze negatieve selectie tegen de magnetische kralen zelf werd voltooid voordat vier rondes van biopanning de gekozen bacteriële bibliotheek voor bindmiddelen in beschermende antigeen (PA), weergeven zoals aangegeven in Figuur 2, en voor extra negatieve selectie tegen rivax en vier rondes van positieve selectie voor abrax, zoals afgebeeld in Figuur 3. De kralen die hier gebruikt zijn geconjugeerd met streptavidine voor het vastleggen van biotinyleerd eiwitten, dus onbedoelde isolatie van peptides binden aan daar zelf een bron van zorg is en wordt bewaakt met behulp van FACS met daar-geconjugeerd met Phycoerythrin (Figuur 3 , SAPE). Minimaal moet binding aan daar worden getest voor een veelbelovende individuele kandidaten, bij de beoordeling van de binding aan de target-eiwit. Zowel de percentage bindende en nMFI voor SAPE moet lage waarden in alle sorteer rondes. Het niveau van de binding aan daar kan enigszins met elke Sorteer ronde, zoals gebeurd is in Figuur 3, omdat de bevolking wordt herhaaldelijk blootgesteld aan de daar beklede magnetische kralen na elke Sorteer ronde verhogen. Als het niveau van achtergrond daar binding problematisch downstream analyse wordt, kon verdere negatieve sorteren tegen de magnetische kralen worden uitgevoerd na de positieve sorteren ronde waarin de bevolking daar bindende toename om met het verminderen van de stroomafwaartse screening van valse positieven. Wanneer eiwitten of materialen beschikbaar zijn die specifiek kunnen interfereren met stroomafwaartse gebruik van de peptide voor een bepaalde toepassing, of die naar cross-react met affiniteit reagentia voor de doelgroep als het gevolg van structurele en/of sequentie gelijkenis, verwachting verdere negatieve sorteren daartegen eiwit of materiaal wordt aanbevolen. Een voorbeeld is de negatieve sorteren tegen rivax vóór Isolatievan abrax bindende peptides, als gevolg van de structurele gelijkenis en volgorde homologie van deze twee eiwitten ^1,15. Nogmaals, cross-reactive binding aan eiwitten gebruikt voor negatieve sorteren stappen kan worden gecontroleerd tijdens de analyse van het sorteren van de rondes met behulp van FACS (Figuur 3Rivax-488). In het gunstigste geval zijn percentage bindende en nMFI laag, zoals in dit voorbeeld.

Indien beschikbaar, kunt een vaste positieve controle peptide, zoals de P2X-peptide in het C-terminus van de steiger van de display geproduceerd door de bacteriële display-bibliotheek gebruikt in de representatieve resultaten hier, u bepalen als gebrek aan bindende affiniteit in de FACS assay Steigerwerk wegens gebrek aan expressie van de display zelf, in plaats van gebrek aan affiniteit van de peptide(s) voor het doel. In Figuur 2 en Figuur 3, YPet Mona binden aan deze P2X peptide wordt gecontroleerd en toont aan dat de eerste rondes voor het sorteren van de steiger slecht express. Dit is waarschijnlijk voornamelijk te wijten aan de hoge frequentie van stop codonen in N-terminale peptiden in de willekeurige bibliotheek, wat inhoudt dat de steiger zelf niet was geproduceerd. Andere effecten kunnen bovendien bijdragen, zoals de aanwezigheid van peptiden met onverwachte toxische effecten aan de E. coli, of groei of peptide display tarieven verlaagd om andere redenen (zoals mutaties in het bacteriële genoom). Toevoeging van EDTA tijdens inductie meningsuiting tijdens deze vroege rondes voor het sorteren van ⁴²kan verbeteren, maar is nog niet getest. Binden aan YPet Mona in elke biopanning is bevolking aanzienlijk verbeterd door ronde 3. Figuur 2 Figuur3 vergelijkt, blijkt het ook dat de expressie niveau kan worden verbeterd door het verhogen van inductie tijd tot 90 min (zoals in afbeelding 2YPet Mona) in plaats van 45 min (zoals in Figuur 3YPet Mona), Hoewel 45 min meestal voldoende is. Merk op dat de nMFI voor YPet Mona is genormaliseerd naar het niveau van de bindende YPet Mona van de negatieve controle cellen, zodat de waarden in de buurt van 1.0 zijn typische als expressie niveau aanvaardbaar is. YPet Mona MFI naar PBS alleen MFI normaliseren van hetzelfde monster is ook een geldige manier om te vergelijken van de relatieve expressie niveaus, maar geeft veel hogere waarden (Vergelijk Figuur 2 en Figuur 3 met resultaten uit Sarkes et al. 2015 ¹⁵).

Verrijking van de bibliotheek voor peptides te binden aan de specifieke doelgroep van belang wordt meestal bereikt binnen drie positieve sorteren rondes, maar blijven een vierde ronde van het sorteren kan zinvol zijn, zoals weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3 . Hier, procent gebonden cellen en nMFI blijven stijgen vanaf ronde 3 ronde 4 voor zowel voorbeeld streefcijfers, PA en abrax, die zijn verpakt in rood weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3, respectievelijk. De hoogste affiniteit peptide reeksen mogelijk al aanwezig in ronde 3, maar zijn waarschijnlijk verder verrijken in ronde 4, die helpt bij down-selectie van potentiële kandidaten ¹⁴. Analyse van sequenties van ronde 4 neigt te onthullen herhalende sequenties, en deze herhalende sequenties zijn een uitstekend uitgangspunt voor affiniteit en specificiteit volgorde bepaling van analyse en consensus. De eCPX_Sequencing macro bedoeld als aanvulling op dit manuscript helpt bij het stroomlijnen van deze eerste analyse, zoals weergegeven in Figuur 4. Begin met een omslag van .seq of tekstbestanden, de opeenvolging van DNA, die tussen de gekozen 5' en 3' sequenties ligt is vertaald, georganiseerd door aminozuur opeenvolging en geanalyseerd voor aantal individuele aminozuurresidu's in elke peptide. De gesorteerde lijst van geïsoleerde peptide reeksen, kan zoals te zien op de screenshot blad samenvatting tabel in Figuur 4, worden gebruikt om eenvoudig bepalen welke sequenties herhalen en met welke frequentie. De cellen in dit werkblad met herhalende sequenties zijn beschreven in verschillende kleuren voor gemakkelijker kunt analyseren. Het is raadzaam om te controleren van deze herhalende sequenties voor consensus sequenties en andere trends. Dit is geholpen door reeks uitlijning software zoals Kalign en Clustal Omega, en analyse kan worden uitgevoerd op de uitgang van de hele reeks (met inbegrip van zowel kunt u herhalende en niet-herhalende sequenties op de frequentie die ze verscheen) en op de down-geselecteerde lijst van herhalende sequenties (met of zonder hun relatieve frequentie). Representatieve resultaten voor PA en abrax herhalende sequenties, waarbij de frequentie rekening worden weergegeven in figuur 5A en 5B, respectievelijk. Merk op dat in figuur 5A voor het PA-doel, verscheidene van de afzonderlijke herhalende sequenties zelf bevatten de consensus sequentie WFCFTC (of een soortgelijk sequentie), rood, die werd bepaald onderstreept door Jalview software analyse toe te passen op een Kalign sequentie-alignering van de herhalende sequenties. Deze consensus, was als WXCFTC, eerder een PA bindende consensus, waarin vertrouwen in de sorteer methode ⁹vastgesteld. In figuur 5B, waar herhalende sequenties voor het doel van de abrax werden geanalyseerd op dezelfde wijze, was het resultaat heel anders. Eerst waren er slechts vijf sequenties die herhaald in ronde 4 van biopanning voor abrax bindmiddelen, in tegenstelling tot de vijftien herhalende sequenties geïsoleerd van ronde 4 van biopanning voor PA bindmiddelen (hoewel 44% meer kolonies werden ook sequenced voor PA). Ten tweede, geen van de vijf herhalende sequenties bevatte de meest veelbelovende "consensus"-reeks (FWAWF, onderstreepte in paars), hoewel de kandidaat AX-A15 bevatte de volgorde die het best afgestemd (FWDTWF). Verdere analyse, met inbegrip van bindende affiniteit en specificiteit bepalen, hielp om de consensus van FWDTWF vastgesteld op basis van de top vijf kandidaten voor de binding van de abrax in figuur 5C, zoals hieronder uitgelegd.

Een representatieve kolonie van elke herhalende reeks kan verder worden geanalyseerd voor op-cel affiniteit en specificiteit met behulp van FACS, zoals in figuur 6A voor de herhalende sequenties van biopanning voor abrax bindende peptides. Hier is het duidelijk dat alle vijf herhalende sequenties hogere affiniteit voor abrax, het beoogde doel, dan de rivax, het structureel vergelijkbaar eiwit gebruikt voor negatieve sorteren of streptavidine hebben, die is aanwezig tijdens de sorteerbewerking vanwege de magnetische kralen gebruikt voor biopanning. Dit komt overeen met de al veelbelovende resultaten voor affiniteit en specificiteit van de sorteer rondes afgebeeld in Figuur 3, waar het is duidelijk dat verrijking voor binding aan de beoogde doelstelling, abrax, groeit met elke ronde van biopanning terwijl affiniteit voor de soortgelijke proteïne, rivax, is het niet. Echter, een bevredigende consensus-reeks was niet bepaald voor het sorteren van de abrax met behulp van de herhalende sequenties van ronde 4 alleen (figuur 5B en boven discussie). Terugkeer naar de 100 gesequenceerd kolonies van ronde 4, echter werd het opgemerkt door oog wanneer zoekt sequenties vergelijkbaar met de beste match voor de voorspelde consensus dat een extra kandidaat, AX-A12, bevatte de volgorde van de FWDTWF die werd opgemerkt in het isoleren van AX-A15 , en dat een andere kandidaat, AX-A14, bevatte een soortgelijke volgnummer, DWNTWF. Deze en andere reeksen waarin opgenomen overeenkomsten aan de herhalende sequenties, overeenkomsten met andere niet-herhalende sequenties aangetoond, of willekeurig, werden gekozen werden geanalyseerd door FACS voor bindende affiniteit en specificiteit. Die getest zijn gerangschikt in Sarkes et al. 2016 ¹ en de top 5 bindmiddelen uit deze analyse worden weergegeven in figuur 6B, met de volgorde van de consensus vastgesteld dat FWDTWF, getoond in figuur 5C.

Een soortgelijke analyse van bindende affiniteit voor herhalende peptide reeksen in ronde 4 van biopanning voor peptides die de doelgroep PA herkent geopenbaard dat de beste bindmiddelen, zoals gerangschikt door de verhouding van de PA-488 nMFI:SAPE nMFI, de WXCFTC consensus of een soortgelijke bevatte volgorde (tabel 1). Met behulp van deze verhouding, de reeksen zelf onderverdeeld in degenen die deel uitmaakt van de consensus en degenen die dat niet deden. De top kandidaten, allemaal met sequenties aan de consensus, gerelateerde Evenzo werden geanalyseerd aan de methoden die hierboven wordt beschreven voor abrax in Figuur 6, zoals gepresenteerd in Sarkes et al. 2015 ¹⁴. Deze resultaten tonen aan dat voor sommige doelen, analyse van peptides met herhalende sequenties kan worden volstaan om te verkrijgen bindmiddelen met significante affiniteit en specificiteit voor een gekozen doelgroep, en om te bepalen van de volgorde van een consensus die kan worden, op zichzelf, voldoende voor een inbinding. Merk echter op dat het aantal herhalingen niet noodzakelijk met de relatieve bindende affiniteit voor de doelgroep van belang (tabel 1 overeen). Wanneer de analyse van herhalende sequenties alleen is niet voldoende om een patroon vast te stellen, is het handig om te schakelen tussen sequentieanalyse en bindende analyse te verfijnen van het zwembad van de kandidaten en het bestuderen van de trends onder de kandidaten met hogere affiniteit . Zelfs wanneer een trend wordt waargenomen van het analyseren van de herhalende sequenties alleen, kunnen extra niet-herhalende sequenties dezelfde trends en andere trends, bij nader onderzoek aantonen.

Figuur 1: schematische van biopanning protocol voor bacteriële display bibliotheken. Zoals hier wordt geïllustreerd, biopanning bacteriële display bibliotheken is een cyclisch proces. Elke cel in de bibliotheek van bacteriële display bevat (zie tabel van materialen) plasmide-DNA die behouden blijft zolang de cellen worden gekweekt in de aanwezigheid van het antibioticum waarvoor het plasmide een resistentie gen (choloramphenicol in dit geval bevat). Elke plasmide codeert ook het display steiger-eiwit dat een willekeurige peptide aan de buitenkant van de cel bloot. Aangezien elke cel alleen een enkele plasmide DNA-sequentie bevatten mag, moet elke cel een enkele peptide, alleen weergegeven op meerdere plaatsen in de celmembraan. Afhankelijk van de mate van diversiteit van de bibliotheek aan het begin van de biopanning en na elke Sorteer ronde, al de opeenvolging van DNA kan dan niet uniek van cel naar cel. Biopanning begint met de groei en de inductie van de bibliotheek van de cel voor weergave van afzonderlijke peptiden op hun buitenste membraan. Deze peptiden kunnen vervolgens interactief werken met een doel-eiwit (die biotinyleerd is of anders gelabeld voor vangst). Voor magnetische-geactiveerde cel sorteren (MCS), niet-afhankelijke eiwitten wordt verwijderd en de cellen worden geïncubeerd met magnetische kralen die zijn bekleed met een opname-eiwit (streptavidine in dit voorbeeld, dat een sterke wisselwerking met biotine is). De hele cultuur is vervolgens blootgesteld aan een magneet om te scheiden van de afhankelijke cellen uit niet-afhankelijke cellen. Met behulp van een geautomatiseerde magnetische sorterende apparaat is de voorkeur voor cel scheiding om valse positieven. Hier wordt geïllustreerd, is een positieve soort, waarin de cellen die zijn gebonden aan en mede Elueer met de magnetische kralen worden bewaard. Het proces is hetzelfde voor een negatieve soort, die we meestal vooraan vervullen, behalve dat de cellen die zijn gewassen off van de magnetische kralen in plaats daarvan worden bewaard. De Fractie van de bibliotheek van belang, gebonden (positieve soort) of niet-afhankelijke (negatieve soort), is's nachts gegroeid en gebruikt in de volgende ronde van het sorteren. Elke daaropvolgende Ronde van positieve biopanning vereist een afname van de concentratie en parel doelvolume te verbeteren van striktheid. Na elke ronde van biopanning, worden affiniteit en de specificiteit van de peptiden voor het eiwit doel beoordeeld met behulp van fluorescentie-activated cell sorting (FACS) om te bepalen wanneer om te stoppen biopanning en beginnen met het onderzoeken van individuele kandidaten. Zo nodig, worden DNA sequencing en peptide sequentieanalyse uitgevoerd. Deze analyse-stappen kunnen op zichzelf een cyclisch proces, met name voor het openbaren van trends in de individuele isolaten na de laatste ronde van de biopanning. Op dit punt, zijn peptide reeks trends en/of consensus gecorreleerd met bindende affiniteit en specificiteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: voorbeeldgegevens voor FACS analyse van het sorteren van rondes: PA doel. Bindende affiniteit zoals bepaald door FACS blijkt na 4 rondes van biopanning (positieve soort) de gekozen bacteriële weergeven bibliotheek voor peptides bindend aan de doelgroep, beschermende antigeen (PA). Dit werd uitgevoerd na het uitvoeren van een negatieve soort tegen de daar beklede magnetische kralen. Voor bindende beoordeling, werden cellen geïnduceerde met 0,4% L-arabinose voor 90 min vóór incubatie met de doel- en controle-oplossingen en analyseren door FACS. Bindende affiniteit analyse voor het beoogde doel is verpakt in het rood. Aangetoond hier scatter percelen van FITC-A vs FSC-A en waarden voor percentage cellen gebonden (in vergelijking met de gated negatieve controle geïncubeerd met PBS alleen) en genormaliseerd mediaan fluorescentie intensiteit (nMFI, in vergelijking met peptide-vrij negatieve controle geïncubeerd met hetzelfde fluorophore-geëtiketteerden eiwit) geïnduceerde cellen die werden geïncubeerd voor 45 min met: PBS buffer alleen, 150 nM YPet Mona (positieve controle voor peptide expressie) of 250 nM PA-488 (met het label doel). Opmerking de toenemende verrijking in bindende affiniteit voor de doelgroep van belang na elke ronde van biopanning. In tegenstelling tot Figuur 3, werden alle autoMCS cel scheidingen voltooid met behulp van programma Posselds. Deel van deze gegevens kan ook worden gevisualiseerd op de scatter percelen van FITC-H vs FSC-H in Sarkes et al. 2015 ¹⁴ voor de vergelijking op de FITC-A vs FSC-A percelen hier weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: voorbeeldgegevens voor FACS analyse van het sorteren van rondes: target abrax. Op dezelfde manier naar Figuur 2, hier is vergelijkende bindende affiniteit voor een volledige biopanning experiment, zoals bepaald door FACS komt te staan. De bacteriële display bibliotheek werd blootgesteld aan negatieve sorteren tegen de daar beklede magnetische kralen, zoals in Figuur 2, maar vervolgens werd onderworpen aan een extra ronde van negatieve sorteren tegen een homologe eiwit met soortgelijke structuur en functie, rivax, voor het uitvoeren van 4 rondes van positieve biopanning voor peptides te binden aan het beoogde doel, abrax. Voor bindende beoordeling, werden cellen geïnduceerde met 0,4% L-arabinose voor 45 min vóór bindende doelstelling, positieve controle en negatieve controles en lezen op FACS. Bindende affiniteit voor het beoogde doel is verpakt in het rood. Aangetoond hier scatter percelen van FITC-A vs FSC-A (of PE-A vs FSC-A in het geval van SAPE) waarden voor percentage cellen gebonden (in vergelijking met de gated negatieve controle geïncubeerd met PBS alleen) en nMFI van geïnduceerde cellen die werden geïncubeerd voor 45 min met : PBS buffer alleen, 150 nM YPet Mona (positieve controle voor peptide expressie), 250 nM Abrax-488 (gelabelde eiwit target), 250 nM Rivax-488 (gelabelde potentieel doelwit van de cross-reactive eiwitten) of 250 nM SAPE (negatieve controle voor directe binding met daar beklede magnetische kralen). Opmerking de toenemende verrijking in bindende affiniteit voor het doel van belang, abrax, na elke ronde van biopanning, en minimale bindende affiniteit voor het structureel vergelijkbaar eiwit, rivax. In tegenstelling tot Figuur 2, positieve biopanning ronde 1 werd uitgevoerd met behulp van de autoMCS Posselds programma terwijl latere sorteren rondes werden voltooid met behulp van programma Posseld, zoals voor biopanning in dit manuscript. Deze gegevens kan ook worden gevisualiseerd op de scatter percelen van FITC-H vs FSC-H in Sarkes et al. 2016 ¹⁵ voor vergelijking op de FITC-A vs FSC-A percelen hier weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: voorbeeld sequentieanalyse uitvoer via "eCPX_Sequencing" macro. Komt te staan is een screenshot van 48 gesequenceerd kolonies van ronde 4 van biopanning de bibliotheek gekozen bacteriële weergave van PA binders met behulp van de methode Posselds. Het blad "samenvatting" wordt hier weergegeven. Merk op dat de koloniën werden genummerd in alfabetische volgorde van hun gegeven bestandsnaam tijdens het rangschikken proces en dat de vakken rond sequenties die ten minste eenmaal herhaald worden uiteengezet in verschillende kleuren voor gemakkelijker data-analyse. De macro eCPX_Sequencing wordt geleverd als een aanvullende code-bestand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: volgnummer van uitlijning en consensus bepaling over twee verschillende eiwit streefcijfers. Alle afbeeldingen hier getoond werden gegenereerd met behulp van de Jalview software met Clustal_X kleuren na uitlijnen sequenties met behulp van Kalign online analyse software ⁵¹. A) uitlijning van herhalende sequenties van PA biopanning ronde 4 (komt overeen met tabel 1). B) uitlijning van herhalende sequenties van abrax biopanning ronde 4 (komt overeen met figuur 6A). C) aanpassing van de top 5 kandidaten uit abrax biopanning ronde 4, zoals bepaald door FACS analyse van individuele kandidaten (komt overeen met figuur 6B). De rode lijn wijst op de volgorde van de consensus in A en C, terwijl de paarse lijn in B de voorloper van de volgorde van de consensus vastgesteld voor abrax onderstreept bij de behandeling van herhalende sequenties alleen bindend markeren het potentieel moet testen bindende affiniteit met behulp van FACS voordat een consensus kan in sommige gevallen worden vastgesteld. Soortgelijke aanpassingen gegenereerd met verschillende analysesoftware kunnen worden gezien in Sarkes et al. 2015 ¹⁴ en Sarkes et al. 2016 ¹. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: voorbeeld bindende affiniteit en specificiteit voor individuele kandidaten geanalyseerd met behulp van FACS. Hier afgebeeld is de genormaliseerde mediaan fluorescentie-intensiteit (nMFI) bepaald met behulp van FACS voor A) herhalende sequenties en B) de top 5 kandidaten, zoals bepaald door vergelijkende bindende affiniteit met de doelgroep, abrax, van ronde 4 van biopanning. De gegevens vormen de gemiddelde (balken) en de standaarddeviatie (foutbalken) van drie onafhankelijke repliceren experimenten. Merk op dat alle kandidaten weergegeven heel specifiek voor abrax (abrax-488, groene balken) over een structureel vergelijkbaar eiwit, rivax (Rivax-488, rode balken), en de daar negatieve controle (SAPE, zwarte balken zijn). Hoewel twee van de herhalende sequenties in een (AX-07 en AX-15) ook onder de top 5 kandidaten in B waren, vergelijking van de resultaten in A en B toont aan dat de analyse van herhalende sequenties alleen mogelijk niet genoeg om te isoleren van de hoogste affiniteit peptiden. Gegevens hieronder werd aangepast van Sarkes et al. 2016 ¹. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1: verhouding van specifieke binding aan niet-specifieke binding voor individuele herhalen kandidaten. In dit voorbeeld wordt het aantal herhalen sequenties en de verhouding van PA (target) nMFI naar SAPE (negatieve controle) nMFI weergegeven voor de herhalende sequenties van PA biopanning ronde 4 twee kandidaat-lidstaten. Deze gegevens was relatieve PA nMFI:SAPE nMFI verhouding gesorteerd en geanalyseerd voor de aanwezigheid van de bekende WXCFTC consensus, of een soortgelijke reeks, die is onderstreept en weergegeven in een vet lettertype. Merk op dat de reeksen zelf organiseren zodat deze kandidaten met de consensus de hoogste PA nMFI:SAPE nMFI verhouding hebben, en dus meer in het bijzonder met het doel interactie. De resultaten zijn van een enkele FACS experiment. Peptiden met laagste affiniteit voor het doel werden uitgesloten van de extra wordt gerepliceerd en analyse die werden gepubliceerd in Sarkes et al. 2015 ¹⁴.

Suppplemental bestand 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Suppplemental bestand 2: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Biopanning bacteriële display bibliotheken is een succesvolle aanpak aan het isolement van affiniteit reagentia en peptiden bieden een goed alternatief voor antilichamen voor erkenning als specifieke criteria vereist, zoals stabiliteit in extreme omgevingen zijn. Biopanning van deze bibliotheken is gestroomlijnd met behulp van de methoden van de autoMCS hier, en een commercieel verkrijgbare autoMCS platform breidt deze technologie voor een veel breder publiek. In vergelijking met traditionele afwisselend MCS/FACS sorteren methoden voor bacteriële display bibliotheken, autoMCS methoden zijn minder duur, omdat zij vereisen geen investeringen in een duurdere FACS instrument kunnen sorteren en isoleren van de afhankelijke cellen, in plaats van het type stroom cytometer die hier wordt gebruikt, die is alleen geschikt voor analyse ¹⁴. De kritische stappen voor succesvol biopanning van autoMCS omvatten scheiding programma selectie, negatieve sorteren tegen potentiële Kruis-reactanten om valse positieven, bibliotheek verrijking FACS gebruiken om te bepalen wanneer te stoppen biopanning, toezicht en slimme analyse van de pool van de kandidaat-lidstaten om te voorkomen dat omslachtig screening van honderden kandidaten.

De hierin beschreven voorbeelden succesvolle biopanning van de bibliotheek van de gekozen bacteriële display voor twee afzonderlijke doelstellingen, PA en abrax, hoewel met lichtjes verschillend analyse strategieën als gevolg van verschillen in de peptide reeksen voor elke groep van kandidaten na vier rondes van biopanning. PA was het ongecompliceerder geval met sequentieanalyse tonen duidelijke trends van de peptide reeksen gegenereerd, waarvan ten minste eenmaal herhaald in 144 kolonies. Dit alleen al was genoeg om te bepalen van de volgorde van een consensus voor het doel van de PA, en die kolonies die deel uitmaakt van de consensus of een soortgelijke reeks waren de beste kandidaten in termen van de verhouding van binding aan PA versus binding met de negatieve controle van daar. Echter, dit zal niet altijd gebeuren. Voor het doel van de abrax, sequencing 100 kolonies geleid tot vijf herhalende sequenties, maar de trend in deze sequenties minder duidelijk was, dan een tendens aromatische aminozuurresidu's en asparaginezuur of asparagine bevatten. De voorspelde "consensus" van de herhalende sequenties alleen kon zijn geproduceerd en getest voor affiniteit met abrax, maar omdat geen bovenliggende sequenties die exacte consensus-reeks bevatte, we keerde terug naar de lijst van gesequenceerd kolonies en waargenomen dat andere kandidaten die meer trends met elkaar gemeen hadden. In feite, bevatte twee kolonies een soortgelijke reeks naar de "consensus" van de herhalingen alleen (FWDTWF in plaats van FWAWF), die had dezelfde trend van tryptofaan, fenylalanine, asparaginezuur en residuen, maar met verschillende tussenruimte. Een van deze peptiden was een herhalende reeks, een was niet. Deze twee reeksen, samen met een derde reeks met een gelijkaardige variant, behoorden tot de top 5 bindmiddelen getest in termen van affiniteit voor abrax. De bovenste binder algemeen, AX-A05, ook weergegeven vergelijkbaar trends. De resultaten voor de abrax tonen aan dat een benadering die wisselt meerdere malen tussen sequentieanalyse en affiniteit en specificiteit analyse soms nodig, afhankelijk van de gekozen doelgroep zijn zal. De resultaten voor het doel van de abrax tonen ook aan het niveau van specificiteit die kan worden bereikt over een zeer vergelijkbaar eiwit (rivax ^1,,¹⁵).

Het programma van de autoMCS's geselecteerd voor onze studies waren Posselds en Posseld, die beide voor positieve selectie van gelabelde doelcellen met lage frequentie, minder dan 5% van de oorspronkelijke bevolking. In beide gevallen passeren cellen in twee magnetische kolommen. In het geval van het Posselds-programma, echter passeren cellen trager de eerste kolom toe blootstelling tijd ⁴¹. Naast het programma beschrijvingen gegeven door de fabrikant van het apparaat van de commerciële autoMCS (Zie Materialen tabel) ⁴¹, deze programma's werden gekozen na een eerste vergelijking van verschillende mogelijke programma's. Elke programma's vermogen om te voorkomen trekken uit valse positieven van een homogene cultuur van negatieve controle cellen, en met succes een bekende binder naar een doel van belang om van te isoleren een gemengde cultuur met negatieve controle cellen verrijkt met een afnemende percentage van de bekende binder, werden vergeleken. Als die aanzienlijk afwijkt van de hier beschreven toepassingen, is een soortgelijke vergelijking zou nuttig zijn bij het programma selectie voor de nieuwe toepassing. Echter, eerder gepubliceerde resultaten vergelijken van deze twee programma's (Posseld en Posselds) voor isolatie van peptide affiniteit reagentia voor PA bleek dat met behulp van een van deze programma's voor alle vier rondes van biopanning tot de isolatie van peptides met soortgelijke leidde affiniteit en specificiteit voor PA en bepaling van de WXCFTC-consensus. De belangrijkste verschillen zijn dat Posseld, met haar sneller debiet, gesorteerd op sneller en bindende affiniteit voor het doel was daarom hoger na slechts twee ronden van biopanning, terwijl met behulp van Posselds geleid tot meer unieke reeksen na vier rondes van biopanning ¹⁴. leren van dit, de strategie was lichtjes veranderd wanneer biopanning voor abrax bindende peptides te nemen beide voordelen: Posselds werd gebruikt voor ronde 1 blootstellingstijd te geven meer tijdens deze kritieke stap waar diversiteit het hoogst, maar dan is de programma was overgestapt naar Posseld voor sneller isolatie van de hoogste affiniteit bindmiddelen tijdens ronden 2-4 ^1,15. Dit bleek ideaal voor abrax, vooral omdat de nMFI en het percentage bindend waren beiden hoger voor abrax ronde 4 ten opzichte van PA ronde 4 met beide programma sorteren sorteren (Figuur 2 en Figuur 3 en Sarkes et al. 2015 ¹⁴), maar een directe vergelijking met behulp van een strategie ten opzichte van de andere met hetzelfde doel voor een meer overtuigend vergelijking nodig zou zijn. Welk programma het beste is voor een bepaalde toepassing kan afhangen van de individuele doelstelling, de sorteer bibliotheek gebruikt, en het niveau van peptide-expressie die wordt bereikt met een wijziging van de voorwaarden beschreven hier.

Hier zijn mogelijke resultaten van biopanning met het abiotische materialen niet besproken, maar we hebben ook dezelfde bacteriële display bibliotheek biopanning tegen bulk aluminium ²gebruikt. Deze studie werd niet uitgevoerd met behulp van autoMCS, maar soortgelijke studies kon worden bereikt met behulp van autoMCS als het materiaal is beschikbaar op, of kon worden gecoat of geconjugeerd met, een magnetische kraal. In de bulk aluminium studie was individuele aminozuur analyse en modellering van de secundaire structuur behulpzaam bij het begrijpen van wat was het besturen van de bindende affiniteit van de geïsoleerde peptides, aangezien geen consensus volgorde vastbesloten ^{2 was}. Zelfs met biologische doelstellingen, kan dit worden verlangd om te begrijpen wat is het besturen van de bindende affiniteit voor sommige doelen, dat is waarom het werkblad gegenereerd op basis van de "eCPX_Sequencing" macro een tabblad met individuele residu frequentie-analyse bevat. Als er geen herhalende sequenties zijn naast het ontbreken van een consensus, en residu frequentie toont geen patroon, niettemin, kunnen andere soorten analyse worden verlangd. Bovendien, verder sorteren rondes mogelijk moet vermijden screening van een veel groter aantal kandidaten voor down-selectie van mensen met voldoende affiniteit met de gewenste doelgroep.

Met de toenemende beschikbaarheid van de volgende generatie sequencing, kon een grondiger onderzoek worden uitgevoerd om te bepalen van de meest veelbelovende kandidaten vóór de proef affiniteit en om te bepalen van de omvang van verrijking na elke ronde van biopanning. Echter wellicht sequenties over te gaan tot de bindende analyse stap opnieuw worden gemaakt door middel van klonen, indien zij niet hoog genoeg frequentie te gemakkelijk isoleren met routine kolonie sequentiebepaling van tientallen of honderden kolonies. Als deze technologie vooruitgaat, steeds minder duur en meer routine, en vooral met een optie voor isolatie van de kolonie, het zal waarschijnlijk worden de beste manier om biopanning gegevens te analyseren. Het kan leiden tot opheldering van de manier waarop individuele sequenties, en de gehele bibliotheek, evolueren. Bovendien, kunnen de bacteriën in de bibliotheek sorteren muteren na verloop van tijd, die kan vertekening sorteren naar cellen met snellere groei of bacteriën die genomische eiwitten kunnen binden een materiaal zelfs zonder display steiger en peptide expressie, voor overexpress aanleg. Om die reden zodra veelbelovende kandidaten zich voordoen, is het waard het plasmide DNA te isoleren, verse E. coli, retransforming en bevestiging van peptide bindende via FACS. Als plan te gebruiken van de peptide in een cel-vrij formaat, moet affiniteit ook beoordeeld worden voor de gratis peptide. Peptide affiniteit reagentia ontdekt via bacteriële display voor het doel SEB werden bijvoorbeeld synthetisch geproduceerd uit-cel en geanalyseerd door de meer traditionele methoden zoals enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA), en op-cel (via FACS) en uit cellen (via ELISA) affiniteit werden vergeleken met behulp van de K_ds bepaald door beide methoden ⁷.

Hoewel de sterkte van de interactie van biotine-daar het een ideale strategie voor het vastleggen van eiwit doelgroep en afhankelijke peptiden maakt, kan deze procedure worden gewijzigd voor andere strategieën van de inneming. Directe koppeling van eiwitten aan magnetische kralen, zoals epoxy en carbonzuur kralen, succesvol is geweest en een bindende stap verwijdert. Rechtstreekse aansluiting kan echter potentiële bandplaatsen belemmeren in een specifieke of aspecifieke wijze, afhankelijk van de strategie van de bijlage. Een extra voordeel van het gebruik daar kralen is dat doelen minder stabiele eiwitten vers biotinyleerd in 30 min kunnen of opgeslagen bevroren, indien nodig, terwijl de parels zelf de neiging om langer incubatie met het eiwit nodig voor dwarsbinding en zijn in het algemeen opgeslagen bij 2-8° C. De voorgestelde beginconcentratie van biotinyleerd eiwit richten hier, 600 nM, geslaagd voor meerdere doelen, maar het wellicht mogelijk om te isoleren van peptide vangen reagentia met toegenomen affiniteit als deze concentratie wordt verminderd. Bovendien, kan deze methode worden uitgebreid tot en aangepast voor andere bacteriële display bibliotheken en andere organismen. Bijvoorbeeld, kunnen deze stappen worden uitgevoerd bij afwezigheid van zuurstof voor gebruik met sporenvormende anaerobe bacteriën, of in andere omgevingen voor gebruik met extremofielen te isoleren van peptiden met unieke eigenschappen. De peptiden en/of consensus vastgesteld voor een bepaald doel van belang mogelijk kan worden gebruikt op-cel een levende materiaal of synthetisch geproduceerde af-cel. Synthetisch geproduceerde peptiden kunnen verder worden verviel voor de ontwikkeling van nog hogere affiniteit en robuustere eiwit gekatalyseerd vangen (PCC) agenten voor gebruik in sensoren, of voor andere toepassingen waar antilichamen gewoonlijk zou worden gebruikt voor bindende of erkenning ^38,55. Moleculaire modellering kan ook worden gebruikt om te bepalen in figuur 5C ¹bedoelde bindende locatie van de peptide met haar doelstelling, zoals onlangs werd uitgevoerd voor de abrax bindende peptiden en consensus. Over het algemeen biopanning bacteriële display bibliotheken voor peptide affiniteit reagentia is een snel, eenvoudig en krachtig alternatief voor de productie van antilichamen voor erkenning en opsporing van eiwit doelen, en deze semi-automatische biopanning aanpak betrouwbare resultaten met verstrekkende toepassingen heeft opgeleverd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545	Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB)	Fisher Scientific	BP1426-500	Growth medium
Chloramphenicol	Fisher BioReagents	BP904-100	Antibiotic
Agar	Fisher Scientific	BP2641-500	Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library	Cytomx Therapeutics	N/A; http://cytomx.com/contact/	On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose	Sigma	A3256-500G	Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)	Amresco	0780-10L	Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh	Thermo Scientific	PI21327	Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit	Thermo Scientific	PI28005	Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads	Invitrogen	65601	Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9647-100G	Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose	Sigma	G8270-1KG	Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona	UCSB and ARL	N/A	Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester	Thermo Scientific	46403	For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)	Thermo Scientific	S866	Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow	Becton, Dickinson, and Company	342003	Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns	Miltenyi Biotech	130-021-101	For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer	Miltenyi Biotech	130-091-221	For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution	Miltenyi Biotech	130-092-987	For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol	VWR	E505-4L	Decontamination of autoMACS
Glycerol	Sigma	G6279-1L	For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack	Miltenyi Biotec	130-092-952	For MACS Separation
BD FACSCanto II	Becton, Dickinson, and Company	744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview	For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software	Becton, Dickinson, and Company	659523	For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator	Thermo Scientific	A13346	Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing	Genewiz	N/A; https://www.genewiz.com/	DNA and Colony Sequencing Services
Excel	Microsoft	323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400	For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA)	List Biological Laboratories, Inc.	171	Target protein used as example for representative results.
Abrax	ECBC and ARL	N/A	Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax	ECBC and ARL	N/A	Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.