Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56061
Automatic Translation
1, 1, 1
1Sensors and Electron Devices Directorate, US Army Research Laboratory

Summary

Biopanning бактериальной отображения библиотек является Проверенная техника для обнаружения пептид сродство реагентов, надежной альтернативой антител. Полуавтоматический метод сортировки здесь усовершенствовал biopanning для уменьшения количества ложных срабатываний. Здесь мы показываем, мыслительный процесс и методы, применяемые в оценке кандидатов и минимизации течению анализа.

Abstract

Biopanning бактериальной отображения библиотек является Проверенная техника для пептида сродство реагент обнаружения для распознавания биотических и абиотических целей. Пептид сродство реагенты могут быть использованы для аналогичных приложений для антител, в том числе зондирования и терапии, но более надежные и способны выполнять в более экстремальных условиях. Конкретные обогащения агентов захвата пептида протеина цели интерес усиливается с использованием полуавтоматического сортировки методов, которые улучшают привязки и мыть шаги и таким образом уменьшить появление ложных положительных связующих. Полуавтоматический метод сортировки описан здесь для использования с коммерческих автоматизированных магнитные активированный ячейку Сортировка устройств с неограниченной бактериальных дисплеем, сортировка Библиотека, выражая случайные 15-mer пептиды. С незначительными изменениями, эти методы являются расширяемой для других автоматизированных устройств, другие сортировки библиотеки и других организмов. Основная цель этой работы заключается в предоставления всеобъемлющей методологии и излагать мысли процесс применяется в анализе и минимизации результирующего числа кандидатов. Эти методы включают анализ по ячейку привязки с помощью активированного флуоресценции клеток, сортируя (FACS), оценить сходства и специфичность в ходе сортировки и сравнения отдельных кандидатов, и анализ пептид последовательностей для выявления тенденций и консенсуса последовательности для понимания и повышение потенциально сродством к и специфичности для целевого объекта интереса.

Introduction

Biopanning является Проверенная техника для сходства реагент обнаружения, с бактериальной отображения библиотек удобный источник для пептида сродство реагенты 1,2,3,4,5, 6,,78,9,10,11,12,13,14, 15,16,,1718,19,20,21,,2223, 24. Аналогично к ФАГ отображения 25,26 и дрожжи отображения 27,28, пептиды подвергаются на поверхности клеток и доступны для привязки к биотическим и абиотическим цели, с этими взаимодействиями движимый пептида позвоночника и уникальные свойства боковой цепи аминокислоты 29. В отличие от фага дисплей бактерии сами самовоспроизводящихся и содержат все генетического материала, необходимые для отображения без элюции связанных ФАГ и повторного заражения клеток. В отличие от дрожжей дисплей бактериальных дисплей быстрее из-за быстрого (примерно 20 минут 30) время Escherichia coliудвоения. Полученный пептид сродство реагенты могут быть произведены вне ячейки для использования в различных зондирования платформ 16,17,26 и имеют потенциал для использования как живые материалы при отображении ячейки 2 , 31 , 32. по сравнению с моноклональных антител для признания конкретных целей, пептиды, гораздо меньше и более гибкой, и пептида дисплея библиотек можно легко манипулировать на уровне ДНК, чтобы избежать определенных аминокислот, например хвоща 33 . Пептиды все чаще используются для терапии 34,,3536 и других применений, где антитела обычно будет использоваться из-за их легкости открытия, воспроизводимые синтетические (с клеток ) производства и превосходное обслуживание работы в экстремальных условиях, обеспечивая функциональные реагент даже после воздействия высокой температуры или длительного хранения без охлаждения 37,38. Способность преодолевать холодовой цепи для хранения реагентов представляет особый интерес для министерства обороны, к примеру, который должен функционировать в экстремальных условиях. Термостабильность был поэтому желательно особенность сродство реагентов, признавая выбранной цели, в качестве примеров в этой рукописи.

Недавно biopanning бактериальной отображения библиотеки стал еще более простым и надежным с использованием полуавтоматического магнитные активации клеток, сортировка (MACS или MCS) методы 9,14,39. Эти методы были продемонстрированы для биологических объектов, используя несколько аналогичных сортировки платформ с различными преимуществами, включая коммерчески доступных автоматизированных магнитные активации клеток, сортировка (autoMACS или autoMCS) инструмент (см. таблицу материалы) 1,,1415 и более специализированных устройств, которые заключают образца в одноразовые патрон 7,9 или чип 39, ценный спецификации для использования с организмов или токсины, которые являются 2-го уровня биобезопасности (BSL-2) или выше7. Эти полуавтоматические методов может быть продлен для сортировки для пептиды способны связывать абиотические материалы, если материалы, магнитного или имеют возможность быть покрыты на магнитный шарик и для использования в различных организмов (например, анаэробных бактерий), если сортировка и меняются условия роста. Помимо сортировки бактериальных отображения библиотек, коммерческих autoMCS инструмент, используемый здесь также был использован в части для первоначальных шагов обнаружения фрагментов человеческих антител сингл цепи, отображается на поверхности дрожжей, после чего дальнейшей изоляции использование флуоресцентных активирован ячейку Сортировка (FACS) 40. Основные преимущества для полу автоматизации уменьшаются сортировки времени и усилий и более надежных и воспроизводимых ликвидации свободных клеток от магнитной бусины во время стирки шаги, ведущие к сокращению ложных срабатываний, меньшее количество необходимых раундов сортировки и менее сложный анализ вниз по течению 9,14. В случае коммерческих autoMCS инструмент, существует несколько предварительно загруженных программ, которые может быть оптимальным для различных приложений, таких как негативные предварительной сортировки (истощение), приоритетности чистоту, свести к минимуму объем окончательного образца и увеличение или уменьшение чувствительности для изоляции редких клетки 41.

В центре внимания этой работы является продемонстрировать методологии biopanning бактериальной отображения библиотеки с помощью инструмента коммерчески доступных autoMCS и излагать мысли процесс применяется в анализе и минимизации результирующего числа кандидатов в чтобы облегчить расширение в другие приложения. Здесь используется библиотека отображения (см. таблицу материалов) 12,13 содержит около 109- 1011 уникальный 15-mer пептиды отображается через модифицированную версию бактериальной внешней мембраны белка OmpX в непринужденный характер на поверхности клеток, который, как ожидается, будет представитель свободного пептида в растворе, если производится синтетически. Этот белок эшафот дополнительно содержит положительный контроль P2X пептид в C-terminus для наблюдения за выражение через привязку YPet Мона. Однако купленных или Роман библиотека с подходящим разнообразия и другие характеристики, необходимые для конкретного приложения желаемого следует аналогичным образом работать с этой процедурой biopanning, хотя некоторые незначительные изменения могут потребоваться. Схема этого протокола biopanning показано на рисунке 1. Кроме того, протокол могут быть адаптированы для других автоматизированных магнитные сортировки платформ и другие стратегии сортировки. Ручная сортировка магнитные с магнитом benchtop было успешно продемонстрировано, хотя и с более сложным и трудоемким течению анализа требуется из-за ложных срабатываний 14увеличилось и тем не менее обеспечивает альтернативный вариант для autoMCS шаги, если не автоматизированных магнитные ячейку Сортировка устройств доступен.

Protocol

1. Biopanning бактериальной отображения библиотек с помощью autoMCS

Примечание: Этот autoMCS-протокол на основе сортировки был ранее описанных 14, и более тщательный» расширил протокол для новых пользователей» доступен в разделе дополнительных материалов для этой рукописи для дальнейшей детализации, включая объяснение потенциал изменения. Если autoMCS устройство недоступно для сортировки, см. дополнительный протокол от Sarkes et al. 2015, поскольку руководство сортировки протокол также описан в том, что работают 14. Протокол autoMCS условии, здесь был еще адаптировать включить дополнительные негативные сортировки шаги для повышения специфичности 1,15. Схема этого протокола biopanning показано на рисунке 1.

  1. Отрицательные, сортировка для удаления вяжущих, вероятно, Cross-React с магнитной бусины
    1. Прививать 500 мл Миллер бульоне Лурия (LB), содержащего соответствующий антибиотик с приблизительно 1 x 1011клетки различных бактериальных отображения сортировки библиотеки (см. таблицу материалов).
      Примечание: Бактериальные дисплей пептид библиотека используется здесь (см. таблицу материалов) содержит около 109- 8,уникальный членов 101112 и выращивается в LB, содержащие хлорамфеникол 25 мкг/мл (25LB см). Остальная часть этого протокола будет предположить, что эта библиотека используется.
    2. Инкубировать при 37 ° C при встряхивании в 225 об/мин, до тех пор, пока культура достигает ОД600 0,5 - 0,55. Побудить пептид выражение с 0,04% w/v L-арабинозы путем разбавления 4% акций 1: 100, тряски на 225 RPM для 45 минут при 37 ° C.
    3. Место индуцированной культуры на льду. Центрифуга примерно 2 х 1011 клетки на 6000 x g 20 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл PBS, нежно закрученной.
      Примечание: OD600 1.0 приблизительно равна 1 х 109 клеток/мл для E. coli.
      Примечание: как это сделать не VORTEX могут лизировать клетки; Ресуспензируйте вручную или кратко встряхивания на ≤ 225 RPM, 4° C.
    4. Клетки перехода к microcentrifuge трубки и спина на 6000 x g 5 мин на RT или 4 ° C. Удалите супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл фосфатный буфер (PBS) содержащий 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА; PBS-B).
    5. Вымойте 300 мкл стрептавидина покрытием бисер (бусины около 3 х 109 , см. таблицу материалов) в 1 мл PBS-B и центрифуги для 5 мин на ≥5, 000 x g (RT). Место труб в разделителе Топ магнитопорошковый скамейке. Тщательно удалите супернатант, избегая гранулы.
    6. Ресуспензируйте бусины в ячейке плюс PBS-B смесь подготовленные выше. Инкубируйте на 4° C на вращающейся платформе для 45 мин место образцов на льду.
    7. Включите инструмент autoMCS для инициализации системы. Премьер линии, с помощью запуска изготовителя и мыть буферов (см. таблицу материалов), выбрав «Мыть сейчас» в нижней части экрана в меню «Разделения», затем «Промыть» и «Запустить».
    8. Премьер системы с PBS-B, с помощью PBS-B как мыть буфер и работает буфер в следующих шагах. Выберите в меню «Разделения» на верхней навигационной панели и выберите «Мыть сейчас». Выберите «Промыть» и «Запустить», чтобы премьер системы с свежими PBS-B.
    9. Передавать клеток и шарик смесь из шага инкубации 15 мл Конические трубки. Поместите эту трубку в образце слот и пустые 15 мл конические трубы в положительные и отрицательные выбор слотов, стойки предварительно охлажденные (4 ° C) (см. таблицу материалов). Установьте шкаф на платформе инструмент.
    10. Назначить программу разделения для каждого образца на стойке (в возрасте до 5 образцов могут быть отсортированы в один проход). Добавьте шаг «Промыть» между каждой выборки и после последнего образца. Выберите «Запустить» для запуска разделения клеток. Выберите «OK» для подтверждения, что достаточно буфер доступен.
      Примечание: Программа разделения «Posselds» хорошо работает для отрицательных сортировки и позитивные, сортировка раунд 1 и «Posseld» является предпочтительным для сортировки раундов 2-4, но обе эти программы были успешно использованы для всех отрицательных и положительных сортировки раундов 14 ,15 и другие программы, может оказаться лучше для конкретного приложения (описывается далее в ходе обсуждения).
    11. Когда программа завершится, снимите стойку и удержания соответствующей фракции. Здесь для сортировки по негативным, сохраняют негативные фракций (содержащие клетки без бисера). Место на льду.
    12. Используйте отрицательные сортировки фракция во всей его полноте для инокуляции 1 Л25 LB см с 0,2% w/v D-глюкозы. Растут на ночь при 37 ° C, тряски на 225 об/мин.
    13. Перед выключением инструмента autoMCS, измените запуска и мыть буферов производителя и мыть буферов (см. таблицу материалов). Выберите «Промыть», затем «Промыть» и «Запустить». После завершения, убедитесь, что есть 70% этанола в строке обеззараживания, а затем нажмите значок «power» в правом верхнем углу экрана и выберите «Да».
    14. Когда полное завершение работы системы (бутылки будет фиолетовый), выключите машину.
    15. Следующий день, используйте ночь культуры сделать запасы Морозильник с около 1 x 1011ячеек на флаконе в LB с 15% глицерина. Кроме того, или альтернативно, используйте эту культуру на следующем шаге: дополнительные негативные сортировки (раздел 1.2) или первый раунд положительных сортировки (раздел 1.3).
  2. Отрицательные, сортировка для удаления вяжущих, вероятно, Cross-React с другими целями интереса
    Примечание: В разделе 1.2 могут быть пропущены, если никаких дальнейших негативных сортировки требуется или желательно. В этом случае перейдите к разделу 1.3. Остаточные привязку любых нежелательных цели можно оценить по СУИМ и в раздел 2: анализ СУИМ сортировки раундов.
    1. Для отрицательных сортировки против специфического протеина цели, как аналогичные белка с потенциалом также привязать к обнаружили пептидами 1,15, повторите шаги роста и индукции в 1.1.1 - 1.1.3, начиная с замороженных запас обедненный стрептавидина библиотека из шаг 1.1.15 или ночь культуры от шага 1.1.12 (с помощью ОД600 для оценки и прививать с ячейками 1 x 10-11 ).
    2. Клетки перехода к microcentrifuge трубки и спина на 6000 x g 5 мин на RT или 4 ° C. Удалите супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS, содержащие целевой cross-reactive белка биотинилированным 600 Нм. Инкубируйте на 4 ° C на 45 минут на вращающейся платформе.
      Примечание: 600 Нм достигается предложил начиная концентрации, которые могут быть изменены, если наблюдается отметил пользу. Biotinylation протеин цели могут быть достигнуты и количественных с использованием реагентов предложил в таблице материалов.
    3. Тем временем мыть 100 мкл стрептавидина покрытием бусины (около 1 х 109 бисерин) в 1 мл PBS-B и центрифуги для 5 мин на ≥ 5000 x g (RT). Место трубки в скамейке Топ магнитопорошковый сепаратор и тщательно удалить супернатант, избегая гранулы.
    4. Центрифуга для целевого объекта привязки клетки на 6000 x g 5 мин (RT или 4° C), удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS-B. Ресуспензируйте бусины в весь объем промывают клеток, привязан к целевой cross-reactive белка. Инкубируйте на 4° C на вращающейся платформе для 30 мин.
    5. Поместите образец на льду и полный шаги 1.1.7 - 1.1.15 для отрицательных сортировки, делая соответствующие морозильник запасов. Продолжать раздел 1.3 для положительных сортировки, если был достигнут желаемого все негативные сортировки, или повторите раздел 1.2 негативного рода против другой потенциальный cross-reactive белка.
  3. Раунд 1 позитивные сортировка
    Примечание: Раунд 1 позитивные сортировки против специфического протеина цели похож на негативного рода против конкретных сортировки (см. 1.2), за исключением что шарик содержащих, позитивные фракция сохраняется.
    1. Прививать 500 мл LB см25 с приблизительно 1 х 1011клетки различных бактериальных отображения сортировки библиотеки, был исчерпан стрептавидина и вырос на ночь (из шага 1.1.12) или замороженные (из шага 1.1.15) и талой на льду, или это было Далее в исчерпаны вяжущих материалов на другие цели cross-reactive белка (от шага 1.2.5), по желанию.
    2. Инкубировать при 37 ° C при встряхивании в 225 об/мин, до тех пор, пока культура достигает ОД600 0,5 - 0,55. Побудить пептид выражение с 0,04% w/v L-арабинозы путем разбавления 4% акций 1: 100, тряски на 225 RPM для 45 минут при 37 ° C.
    3. Место индуцированной культуры на льду. Центрифуга примерно 2 х 1011 клетки на 6000 x g 20 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл PBS, нежно закрученного (вручную или путем встряхивания кратко на ≤ 225 RPM, 4° C).
    4. Клетки перехода к microcentrifuge трубки и спина на 6000 x g 5 мин на RT или 4 ° C. Удалите супернатант.
    5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS, содержащие 600 Нм биотинилированным белка объектом интереса. Инкубируйте на 4 ° C на 45 минут на вращающейся платформе.
      Примечание: 600 Нм достигается предложил начиная концентрации, которые могут быть изменены, если наблюдается отметил пользу. Biotinylation протеин цели могут быть достигнуты и количественных с использованием реагентов предложил в таблице материалов.
    6. Тем временем мыть 100 мкл стрептавидина покрытием бусины (около 1 х 109 бисерин) в 1 мл PBS-B и центрифуги для 5 мин на ≥ 5000 x g (RT). Место труб в разделителе Топ магнитопорошковый скамейке и тщательно удалить супернатант, избегая гранулы.
    7. При инкубации с целью завершения, центрифуга целевого объекта привязки клетки на 6000 x g 5 мин (RT или 4° C), чтобы удалить любые свободные целевого белка. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл PBS-B. Ресуспензируйте бусины в весь объем промывают клеток, обязан целевого белка. Инкубируйте на 4° C на вращающейся платформе для 30 min. место на льду.
    8. Включите инструмент autoMCS для инициализации системы. Премьер линии, с помощью запуска изготовителя и мыть буферов (см. таблицу материалов), выбрав «Мыть сейчас» в нижней части экрана в меню разделения, а затем «Промыть» и «Запустить».
    9. Премьер системы с PBS-B, с помощью PBS-B как мыть буфер и работает буфер в следующих шагах. Выберите в меню разделения на верхней навигационной панели и мыть сейчас. Выберите полоскания и запустить премьер системы с свежими PBS-B.
    10. Передать клеток и шарик смесь от инкубации шаг выше 15 мл Конические трубки, ополаскивание трубку с дополнительных 500 мкл PBS-b и объединение мыть с образцом. Поместите эту трубку в образце слот и пустые 15 мл конические трубы в положительные и отрицательные выбор слотов, стойки предварительно охлажденные (4 ° C) (см. таблицу материалов). Установьте шкаф на платформе инструмент.
    11. Назначить программу разделения для каждого образца на стойке (в возрасте до 5 образцов могут быть отсортированы в один проход). Добавьте шаг «Промыть» между каждой выборки и после последнего образца. Выберите «Запустить» для запуска разделения клеток. Выберите «OK» или «Продолжить» для подтверждения, что достаточно буфер доступен.
      Примечание: Программа разделения «Posselds» работает хорошо для сортировки негативные и позитивные сортировка круглых 1 и «Posseld» является предпочтительным для сортировки раундов 2-4, но обе эти программы были успешно использованы для всех отрицательных и положительных сортировки раундов 14 , 15 и другие программы, может оказаться лучше для конкретного приложения (описывается далее в ходе обсуждения).
    12. Когда программа завершится, снимите стойку и удержания соответствующей фракции. Здесь для положительных сортировки, сохраняют позитивный фракций (содержащие клетки и бусы). Место на льду.
    13. Перед выключением инструмента autoMCS, измените запуска и мыть буферов производителя и мыть буферов (см. таблицу материалов). Выберите «Промыть», затем «Промыть» и «Запустить». После завершения, убедитесь, что есть 70% этанола в строке обеззараживания, а затем нажмите значок «power» в правом верхнем углу экрана и выберите «Да».
    14. Когда полное завершение работы системы (бутылки будет фиолетовый), выключите машину.
    15. Используйте часть положительных сортировки во всей его полноте для инокуляции 1 Л25 LB см с 0,2% w/v D-глюкозы. Растут на ночь при 37 ° C, тряски на 225 об/мин.
    16. Следующий день, ночь культуры сделать морозильник запасов в LB, содержащий 15% глицерина, и/или продолжать позитивным сортировки раунд 2 в разделе 1.4.
  4. Последующие раунды позитивные сортировки
    Примечание: Как правило, четыре раунда сортировки рекомендуется, хотя три раунда сортировки, как правило, достаточно 14,15. Когда остановить сортировка оказывает анализ СУИМ сортировки раундов описаны в разделе 2. Концентрации целевых и магнитный шарик объем уменьшается с каждого последующего раунда положительный сортировки.
    1. С помощью ночь культуры от предыдущих сортировки круглых (или замороженных клеток запас от этого раунда), прививать 5 мл LB см25 с 100 мкл клеток (1:50 разрежения). Инкубировать при 37° C при встряхивании в 225 об/мин, до тех пор, пока культура достигает ОД600 0,5 - 0,55.
    2. Побудить пептид выражение с 0,04% w/v L-арабинозы, тряски на 225 RPM для 45 минут при 37° C. Место индуцированной клетки на льду.
      Примечание: Этот индуцированных культуры также может использоваться для оценки сродство и специфичности для сортировки круглых, она возникла из, как описано в разделе 2 ниже.
    3. Центрифуга 1 x 108 клеток на 6000 x g 5 мин на RT или 4 ° C. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл PBS, содержащий половину концентрация целевого белка биотинилированным интерес для предыдущего раунда сортировки (поэтому 300 Нм для круглые 2, 150 Нм для круглых 3 и 75 Нм для раунд 4 из наших предложенных Начальная точка). Инкубируйте 45 мин на льду (или на 4 ° C вращающейся платформе).
    4. Тем временем, мыть с покрытием стрептавидина бусины (15 мкл для круглые 2, 8 мкл для раунд 3 и 4 мкл для 4 раунд) в 1 мл PBS-B и центрифуги для 5 мин на ≥ 5000 x g (RT). Место трубки в скамейке Топ магнитопорошковый сепаратор и тщательно удалить супернатант, избегая гранулы. Ресуспензируйте бусины в 50 мкл PBS-B.
    5. После 45 минут инкубации с цели на шаге 1.4.3, центрифуга клетки на 6000 x g 5 мин на RT или 4° C, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 50 мкл, промывают бусы из 1.4.4. Держите образец на льду и полный шаги 1.3.7 - 1.3.13 для положительных результатов сортировки.
    6. Прививать культуру 5 мл LB см25 дополнена 0,2% w/v D-глюкозы с всего позитивный, шарик содержащих дроби от сортировки.
    7. Следующий день, используйте ночь культуры сделать морозильник запасов в LB, содержащий 15% глицерина и/или продолжать следующего позитивные сортировка круглых, вернуться к шагу 1.4.1.
      Примечание: Использование искусственных культуры от 1.4.2 оценить сродство и специфика как описано в разделе 2 ниже может помочь определить, когда следует прекратить сортировки. Если два сортировки раундов подряд показывают аналогичные сродство, или позднее раунд показывает снижение сродство для целевого объекта интерес, это желательно место, чтобы остановить сортировки. После финального раунда возвращение к шагу 1.4.1 но останавливаться на 1.4.2.

2. СУИМ анализ сортировки раундов

  1. С помощью искусственных клеток от шага 1.4.2 для каждого сортировки круглых или идентичные культур, добавить 5 мкл индуцированной клетки 25 мкл каждого из следующих подготовленные решения для обязательной оценки (см. также таблицу материалов): PBS самостоятельно; PBS с 150 Нм YPet Mona (YPet 12,13; положительный контроль за выражение), если таковые имеются; 900 нм целевого белка конъюгированных флуоресцентного красителя, например Амин реактивных красителей с выбросов/возбуждения 493 nm⁄518 Нм (цель-488); 900 нм cross-reactive белка ориентация для отрицательных сортировки помечены же флуоресцентного красителя (Cross-Reactive белок-488); и 900 нм стрептавидина R-фикоэритрин (SAPE). Инкубируйте на льду по 45 мин.
    Примечание: Если продолжения непосредственно из шага 1.4.2, этот шаг будет всегда осуществляться на следующий день после biopanning для этого раунда было завершено, поскольку выбранные вниз библиотека была выращена на ночь затем subcultured и индуцированных следующий день. Может также использоваться культур выращивается и аналогичным образом индуцированной из замороженных сортировки круглых запасов; в этом случае все раунды можно протестированы и сравнении в одном эксперименте.
  2. Центрифуга клетки на 6000 x g 5 мин на RT или 4° C. Удалить супернатант и хранить образцы на льду.
    Примечание: Гранулы клетки могут храниться на льду, до тех пор, пока все образцы готовы для анализа.
  3. Включите инструмент СУИМ, откройте программное обеспечение, запуск системы и калибровки инструмента, следуя инструкциям производителя 43,44.
  4. В рамках программного обеспечения СУИМ нажмите на «Администратор» и нажмите на нужную папку или создать «Новую папку». Нажмите на «Новый эксперимент» значок в верхнем левом углу экрана. Щелкните правой кнопкой мыши значок эксперимент «переименовать». В рамках этого эксперимента нажмите на «Глобальные листов».
  5. Нажмите на значок «Dot участок», затем нажмите на глобальной листа электронной таблицы для создания этого рассеяния. Щелкните в графе участок точка, а затем выберите «Инспектор» значок в верхней левой части экрана и настройка осей biexponential дисплей, установив флажки рядом с «Ось Y» и «Ось X» в открывшемся окне. Закройте окно отображения biexponential, нажав кнопку X.
  6. Создание «Новой трубки», нажав на иконку в верхней левой части экрана и переименовать образец с соответствующей информацией, щелкнув правой кнопкой мыши значок образца под «глобальные лист» и выбрав команду «Переименовать». Разверните образец, нажав кнопку (+) знак, а затем дважды щелкните на значок трубки, щелкните правой кнопкой мыши на нем, и снова выберите «Переименовать», чтобы описать образца.
  7. Используйте этот точка диаграммы с vs SSC-A по умолчанию FSC-A для запуска образца отрицательный контроль в одиночку PBS, двойной щелчок на этой трубе или выбрав стрелку рядом с ним. Перед запуском образца Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл лед холодной СУИМ работает буфер и передачи образца к FACS трубки (см. таблицу материалов), смешивая хорошо, закупорить и стряхивая трубки. Место ресуспензированы клеток на трубе инъекции образца (SIT) инструмента. Пресс «приобрести» с «События для отображения «в 30000-50000 и «События для записи» на 10000, поток данных ставки на низком уровне (чтобы начать; увеличение при необходимости) и «Сидеть заподлицо» выбран.
    Примечание: Скорость (низкий, средний или высокий) является скорость, с которой приблизительно между 200 и 2000 количество событий/сек.  Используйте этот диапазон для всех шагов.
  8. Во время приобретения, настроить трубки (ПЛТ) фотоэлектронный умножитель напряжения порога, при необходимости, выбрав вкладку «Порог» нажмите на и изменить «Значение». Отрегулируйте напряжение для передней и боковых точечной (FSC и SSC), таким образом, что отрицательный контроль клетки в PBS только чуть ниже центра.
    Примечание: Дополнительные параметры (такие как SSC) могут быть добавлены в закладке «Порог», используя значок «Добавить». Обычно плт напряжений около 700 V до 1000В ККК и FSC хорошо работать для E. coli.
  9. Если образец читает правильно, отрегулируйте скорость потока для отображения 200-2000 события/s и нажмите «Запись данных». Закончив запись, удалите трубки из SIT и место на льду.  Выберите значок «Полигон ворота» и использовать мышь, чтобы нарисовать ворот вокруг большинство популяции клеток в рассеяния. Щелкните правой кнопкой мыши на участке точка и выберите «Показать иерархию населения».
  10. Используйте этот «P1» ворота как родитель, нажав на «P1» в иерархии населения. Создайте новый участок точка после шаг 2,5. Щелкните правой кнопкой мыши каждую ось и изменить оси x и оси y на FITC-A на FSC-A. Ворота отрицательный контроль (PBS только) используя значок «полигон ворота» с ворот как можно вокруг верхней и левой части населения.
    Примечание: Дважды проверьте иерархии населения для обеспечения того, чтобы ворота P1 родитель P2 ворот. Если это не так, он будет отображаться в соответствии с P1 ворота и «Все события» будет родителя; Удаление ворота и повторно создать его следующий шаг 2.10.
  11. Выберите «P2» в иерархии населения, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Инвертировать ворота». Щелкните правой кнопкой мыши на участке точка с P2 ворота и выберите «Показать населения». Выберите населения «P2» и «Не P2» для отображения (менее 1% населения должны подпадать ворот).
  12. Щелкните правой кнопкой мыши точка сюжет с P2 ворота и выберите «Создать представление статистики». Щелкните правой кнопкой мыши окно представления статистических данных и выберите пункт «Изменить вид статистики». Перейдите на вкладку «Население» и добавить или удалить населения, по желанию, включая родительский населения, P1 (P2, а не P2 должен уже быть показано). Щелкните на закладке «Статистика» и добавить «Медиана FITC-A» и других статистических данных, представляющих интерес. Закройте окно, нажав кнопку OK.
  13. Создание аналогичных точка диаграммы для PE-A против FSC-A и ворот, используя только образец PBS (предыдущий участки могут быть дублируется и изменены). Используйте эту таблицу для запуска всех образцов (включая отрицательный контроль клетки инкубировали с каждой Флюорофор меченых цели) таким образом, для каждой записи около 10 000 событий.
    Примечание: Клетки, попадающих за пределами ворот после инкубации с целевой-488 белка, YPet, положительный контроль и т.д., связующих веществ, белка, и значение «Не PX» (где X — количество закрытых населения для этого графика) должны учитываться как % связаны. При использовании SAPE, как отрицательный контроль, используйте PE-A против FSC-A сюжет. Средний флуоресценции интенсивности (MFI) P1 также должны быть записаны, как это дает информацию за пределами % привязки, чтобы показать степень связывания в относительном выражении и является более надежной, в присутствии останцы 45. Средний флуоресценции интенсивности может быть нормализованный (НМФИ) путем деления МФО Каждый пептид МФО эшафот только отрицательный контроль (с не N-терминальный пептида) или клон, содержащий последовательность пептид, не связывают объектом интереса, после инкубации с той же цели, конъюгированных с же Флюорофор 14. Если эти клетки негативные управления недоступны, uninduced клетки инкубировали с той же цели и помечены же Флюорофор может также использоваться для нормализации.

3. последовательность анализа потенциальных кандидатов и оценки привязки сходства

  1. Определение последовательности пептида
    1. Выберите и последовательности десятки или сотни бактериальных колоний от окончательного раундам biopanning (обычно 3 или 4 раундов являются достаточно 14).
    2. Анализировать последовательность данных с помощью файла макроса, который мы разработали (см. информацию в поддержку кода, «Sub eCPX_Sequencing») специально для анализа последовательностей, созданный из biopanning, 15mer библиотека бактериальных отображения перечисленных в таблице материалы. Используйте программное обеспечение электронной таблицы, перечисленные в таблице материалов, или другим предпочтительным совместимого программного обеспечения.
      Примечание: Ряд инструментов доступны онлайн, что может также помочь в анализе последовательности ДНК 47. Если предпочтительнее, использовать другой метод установленных для анализа последовательностей и перейдите к шагу 3.1.3.
      1. Скачать набор последовательности файлов (.seq файлы, текстовые документы также работы) и распакуйте их в новую папку. При необходимости, переместить или скопировать папку на жестком диске компьютера (а не в сетевой папке) для улучшения скорости.
      2. Откройте новое окно таблицы. Убедитесь в том включить макросы и включить все функции, если эти сообщения всплывал.
        Примечание: Шаги 3-6 ниже только должны быть завершены в первый раз, когда этот макрос используется. Для последующего анализа, просто «запуск макроса «начиная с шага 7.
      3. Скопируйте все содержимое макроса, найденные в файле «Sub eCPX_Sequencing».
        Примечание: Текущая версия создана с Фланкируя последовательности для 15-mer библиотеки, перечисленные в таблице материалов и будет переводить аминокислот между ними. Дополнительные последовательности может быть введен путем копирования 5' Фланкируя последовательности в столбце A и 3' Фланкируя последовательности в колонке B таблицы, до 10 последовательностей для каждого, перед запуском макроса.
      4. В файле пустой таблицы выберите вкладку «Вид», затем дважды щелкните на «Макросы». Выберите папку personal.xlb. Если это недоступно, запишите макрос сначала сделать этот появляются.
      5. Нажмите кнопку «Создать» или «шаг в», в зависимости от того, что могут быть выделены. Вставьте в модуль макроса.
      6. Нажмите кнопку Сохранить значок или выберите файл, сохранить. Выхода из модуля. Если всплывающее окно, нажмите кнопку ОК.
      7. Запустите макрос: перейдите к папке, где расположены файлы desired.seq. Нажмите на панели рядом со значком папки сверху, чтобы посмотреть местоположение папки. Скопируйте его.
      8. Перейдите в новое окно таблицы. Выберите вкладку Вид, а затем дважды щелкните Макросы. Выберите «eCPX_Sequencing» из списка и нажмите кнопку «запустить».
      9. В поле что хлопает вверх, вставьте местоположение файла копируются в шаге 7, и нажмите enter. Макрос должен начать через последовательности и организуя их в таблицы на разных листах.
      10. Используйте лист «Сводная таблица», чтобы определить, если это будет необходимо проверить файлы трассировки для ошибки и внести исправления вручную (если последовательности содержат «X» или не может быть переведено).
        Примечание: «Сводная таблица» отображает последовательности переведенные пептид, отсортированных по аминокислотной последовательности (от A до Z), пока не последовательность ошибки перевода. «Х» обозначает отдельные аминокислоты, которые не могут быть определены.
    3. После последовательности переводятся, организованной, и исправить любые ошибки последовательности, проверьте список последовательности сортировки пептид на листе «Сводная таблица» для любых повторяющихся последовательностей.
    4. Растут на ночь культур для виртуализированного колоний интерес (в том числе повторений или пептиды с заметных тенденций как минимум) в 5 мл LB см25 при 37 ° C, тряски на 225 об/мин и сохранить запасы морозильник следующий день в LB, содержащий 15% глицерина, как шаг 1.4.7. тест пептиды с повторением последовательности для привязки сходства и специфика использования СУИМ методы, описанные в раздел 3.3 и использовать для выравнивания последовательностей с использованием предпочтительного выравнивание FASTA формат списка последовательности (полный список и повторяется только) и анализ программ, как и раздел 3.2.
  2. Выравнивание последовательностей с использованием Clustal Омега, Kalign и аналогичных программ
    1. Копирование последовательностей в формате FASTA из таблицы FASTA макроса, или в противном случае создайте список FASTA файлов из последовательности, чтобы быть выровнены (например, из шага 3.1.3).
      Примечание: Столбец A содержит файлы FASTA в числовом порядке, «Seq #» в то время как столбец B отображает их сортировка последовательностью «AA» из окна «Сводная таблица». Список последовательностей пептид, отсортированных по аминокислотной последовательности будет отображать непригодным последовательности в верхней, как пустой вектор (как «# пустой») и те последовательности, в которых не были найдены 5' и 3' критерии поиска (как «# значение»). Эта функция позволяет легко обновление или удаление этих последовательностей из анализа.
    2. Откройте Clustal Омега48 или49 Kalign программного обеспечения, перейдя на веб-сайте 50,51, или использовать другие предпочтительным программным обеспечением для выравнивания последовательности. Скопировать и вставить список последовательности FASTA и ввод его в поле ниже «последовательности в любом поддерживаемом формате». Измените «разрыв открытых пенальти» на 30 под «дополнительные параметры» в Kalign (это не возможно в Clustal Омега), но в противном случае оставьте параметры по умолчанию перед нажатием кнопки «Отправить».
    3. Анализ последовательности выравнивание с помощью программного обеспечения53 52,Jalview непосредственно в рамках Clustal Омега и Kalign онлайн программное обеспечение, выбрав вкладку «результат резюме» выше выравнивание и затем щелкнув значок «Jalview».
      Примечание: если предпочтительный или для анализа выравниваний последовательности, генерируемые альтернативных программ, скачать 54 программного обеспечения отдельно и скопируйте и вставьте выравнивание в окне анализа, который открыт, нажав кнопку «Файл», «Выравнивание ввода», и» в текстовом поле». Это позволяет легко определить, присутствует ли последовательность консенсуса в выравнивание входной последовательности.
  3. Сравнение сродство и специфика использования СУИМ
    1. Прививать 5 мл LB см25 дополнена 0,2% w/v D-глюкозы с каждым отдельным изолировать интерес (с шагом 3.1.4 и/или колонии интереса от дальнейшего анализа последовательностей в разделе 3.2, и т.д.) и соответствующие отрицательный контроль (дисплей эшафот только или пептид, который не привязывает целевого объекта, как описано в примечании для шага 2.13). Растут на ночь при 37 ° C, тряски на 225 об/мин.
    2. Используйте ночи культур для инокуляции 3 мл LB см25 с 60 мкл клеток (1:50 разрежения). Инкубировать при 37° C при встряхивании в 225 об/мин, до тех пор, пока культура достигает ОД600 0,5 - 0,55. Побудить пептид выражение с 0,04% w/v L-арабинозы плюс 2 мм ЭДТА (для облегчения пептида дисплея 42), тряски на 225 RPM для 45 минут при 37 ° C.
    3. Место индуцированной культур на льду. Для каждого изолировать, добавить 5 мкл клеток в 25 мкл PBS одиночку или содержащие PBS: 150 Нм YPet 12,13 (положительный контроль за выражение), если таковые имеются; 250 Нм целевой-488; 250 Нм Cross-Reactive белки-488; и 250 Нм SAPE (см. 2.1 для более подробной информации). Инкубируйте на льду по 45 мин.
    4. Центрифуга клетки на 6000 x g 5 мин на RT или 4° C. Тщательно удалите супернатант путем рисования жидкости с противоположной стороны гранул. Хранить клетки окатышей на льду до всех образцов и готовы для анализа.
    5. Ресуспензируйте каждой ячейки Пелле в 500 мкл лед холодной СУИМ работает буфер, смешивая хорошо, закупорить и стряхивая трубку, как раз перед чтением с помощью проточный цитометр (см. таблицу материалов).
      Примечание: См. шаг 2.13 отмечает для дальнейшего объяснения стробирования и расчета НМФИ для сравнения сродство и специфичности. Non вяжущих или неспецифических Биндеры теперь могут быть удалены из дальнейшего анализа, и высокие сходства вяжущие следует повторно оценены выравнивание последовательностей, после раздела 3.2 искать дальнейшие тенденции, которые могут быть пропущены в первоначальной последовательности населения. Разделами 3.2 и 3.3 может быть повторенны по мере необходимости новые тенденции и отметил консенсус последовательности. Этот анализ может включать более случайных последовательностей, если тенденции не видны.

Representative Results

С использованием автоматизированных магнитные активации клеток, сортировка (autoMCS) вместо ручной магнитный ячейку сортировку ложные отрицательные кандидатов значительно сокращаются во время biopanning бактериальной отображения библиотеки 9,14. Отрицательные, сортировка шаги будут также могут быть добавлены для уменьшения неспецифической связующих с целевым показателем интереса, и как минимум предлагается, чтобы добавить негативных сортировки против магнитной бусины сами фронт. Этот негативный выбор против магнитные бусы, сами была завершена до четырех раундов biopanning выбрали бактериальных отображения библиотеки для связывателей защитные антигена (ПА), как показано на рисунке 2и перед дополнительный негативный выбор против rivax и четыре раунда положительный выбор для abrax, как показано на рисунке 3. Бусы, используемый здесь сопряжены для стрептавидина для захвата биотинилированным белков, поэтому непреднамеренные изоляции пептидов, привязка к стрептавидина, сам является проблемой и контролируется с помощью СУИМ с стрептавидина конъюгированных к фикоэритрин (рис. 3 , SAPE). Как минимум привязки к стрептавидина должны испытываться на любых перспективных отдельных кандидатов при оценке привязки для целевого белка. Как процент привязки, так и НМФИ для SAPE следует низкие значения во всех раундах сортировки. Уровень привязки стрептавидина может увеличить несколько с каждым раундом сортировки, как это произошло в рисунке 3, потому что население неоднократно подвергается стрептавидина покрытием магнитные бусы после каждого раунда сортировки. Если уровень фона стрептавидина привязки становится проблематичным по течению анализа, дальнейшие негативные сортировка против магнитной бусины может быть выполнена после положительных сортировки раунд, в котором стрептавидина привязки населения увеличилась в чтобы уменьшить ниже по течению скрининг ложных срабатываний. Когда белки или материалы доступны который может специально вмешиваться с использованием пептида для конкретного приложения, или которые, как ожидается, cross-react с реагентами сродство для мишени за счет структурных или последовательность сходства, дальнейшие негативные сортировки против этого белка или материал рекомендуется. Примером является отрицательным сортировки против rivax до изоляции abrax привязки пептидов, благодаря структурным сходством и последовательностью Гомологичность 1,этих двух белков15. Опять же cross-reactive, связывание с белками, используемые для отрицательных сортировки шаги могут контролироваться в ходе анализа сортировки раундов, с помощью СУИМ (рис. 3Rivax-488). В лучшем случае процент привязки и НМФИ являются низкими, как в этом примере.

При наличии, фиксированной положительный контроль пептид, например P2X пептида в C-terminus отображения эшафот, получают путем бактериального отображения Библиотека, используемая в результатах представительных здесь, может помочь определить, является ли отсутствие привязки сходства в assay СУИМ из-за отсутствия выражения отображения эшафот сама, а не отсутствие сходства peptide(s) для целевого объекта. На рисунке 2 и на рисунке 3, YPet Мона привязки к этой P2X пептид контролируется и демонстрирует, что ранних раундах сортировки Экспресс леска плохо. Это, вероятно, преимущественно из-за высокой частоты стоп кодонов в N-терминальный пептидов в библиотеке случайные, что означает, что леску, сам не производится. Другие эффекты могут дополнительно способствовать, как присутствие пептиды с неожиданной токсические эффекты в E. coli, или снижение роста или пептиды отображения ставок по другим причинам (например мутаций в бактериальных геномов). Добавление ЭДТА во время индукции может улучшить выражение во время этих ранних раундов сортировки 42, но еще не были протестированы. Раунд 3 значительно улучшилось населения привязки YPet Мона в каждом biopanning. Сравнивая Рисунок 2 на рисунке 3, это также очевидно, что уровень выражения могут быть улучшены путем увеличения индукции время 90 мин (как на рисунке 2YPet Mona) вместо 45 мин (как показано на рисунке 3YPet Mona), Хотя обычно достаточно 45 мин. Обратите внимание, что НМФИ для YPet Мона нормализуется уровень привязки YPet Mona отрицательный контроль клеток, поэтому значения вблизи 1.0 типичным, если уровень выражения является приемлемым. Нормализация YPet Мона MFI PBS только МФО из того же образца является также допустимым способом для сравнения относительной выражение уровня, но дает гораздо более высокие значения (Сравните Рисунок 2 и рис с результаты от Sarkes и др. 2015 15).

Обогащение библиотеки для пептидов, привязки к конкретной цели интерес обычно достигается в течение трех раундов позитивные сортировки, но продолжая к четвертому раунду сортировки может быть полезным, как показано на рисунке 2 и Рисунок 3 . Здесь, % связаны клетки и НМФИ продолжают расти с 3 раунда в раунд 4 для целей примера, ПА и abrax, которые упакованы красным на рисунке 2 и на рисунке 3, соответственно. Высокие сходства пептид последовательности может уже присутствовать в 3 раунда, но скорее всего дальнейшего обогащения в раунд 4 а, которая помогает в вниз подбор потенциальных кандидатов 14. Анализ последовательностей от раунд 4 стремится выявить повторяющиеся последовательности, и эти повторяющиеся последовательности являются отличной отправной точкой для определения последовательности сродства и специфика анализа и консенсуса. Макрос eCPX_Sequencing, в дополнение к этой рукописи помогает упорядочить этот первоначальный анализ, как показано на рисунке 4. Начиная с папкой .seq или текстовых файлов, последовательности ДНК, которая лежит между выбранной 5' и 3' последовательности перевод, организованный аминокислотной последовательности и проанализированы для количество отдельных аминокислотных остатков в каждом пептид. Отсортированный список изолированных пептид последовательности, как показано на скриншоте лист Сводная таблица на рисунке 4, может использоваться для легко определить, какие последовательности повторить и на какой частоте. Клетки в эту таблицу, содержащую повторяющиеся последовательности, изложены в различных цветов, облегчающей их анализ. Рекомендуется проверить эти повторяющиеся последовательности для последовательности консенсуса и другие тенденции. Это способствует последовательности выравнивание программного обеспечения таких как Kalign и Clustal Омега, и анализ может выполняться на всей последовательности вывода (включая повторяющиеся и non повторяющийся последовательностей с частотой, которую они появились) и вниз выбранный список повторяющиеся последовательности (с или без их относительной частоты). Представитель результаты ПА и abrax повторяющихся последовательностей, без учета частоты во внимание, показаны на рис 5A и 5B, соответственно. Обратите внимание, что в Рисунок 5A для целевой па, несколько индивидуальных повторяющихся последовательностей, сами содержат последовательность консенсуса WFCFTC (или аналогичные последовательности), подчеркнул красным, которая определяется путем применения Jalview программное обеспечение анализа к Kalign Выравнивание последовательностей повторяющихся последовательностей. Этот консенсус, как WXCFTC, был ранее определен ПА привязки консенсус, который обеспечивает уверенность в сортировки метод 9. В рисунке 5B, где были проанализированы повторяющихся последовательностей для целевого объекта abrax таким же образом, результат был совсем другой. Во-первых там были только пять последовательностей, которые повторяются в раунд 4 biopanning для abrax вяжущих, в отличие от пятнадцати повторяющихся последовательностей, изолированы от раунд 4 biopanning ПА связующих (хотя 44% больше колонии были также виртуализации для ПА). Во-вторых ни один из пяти повторяющихся последовательностей содержатся наиболее перспективных последовательности «консенсус» (FWAWF, подчеркнул в фиолетовый), хотя кандидат AX-A15 содержится последовательность, которая наилучшим образом соответствует (FWDTWF). Дальнейшего анализа, включая определение привязки аффинити и специфика, помогла обеспечить консенсус по FWDTWF определяется из Топ пять кандидатов для привязки abrax в Рисунок 5 c, как описано ниже.

Представитель колонии от каждой повторяющейся последовательности могут быть далее проанализированы для на клеточной аффинити и специфика использования СУИМ, как Рисунок 6А для повторяющихся последовательностей от biopanning для abrax привязки пептидов. Здесь ясно, что все пять повторяющихся последовательностей имеют выше сродство для abrax, намеченной цели, чем rivax, структурно аналогичных белок используется для отрицательных сортировки или стрептавидина, который присутствует во время сортировки благодаря магнитной бусины, используется для biopanning. Это согласуется с уже многообещающие результаты для сходства и специфика сортировки раундов, показано на рисунке 3, где ясно что обогащения для привязки к намеченной цели, abrax, растет с каждым раундом biopanning во время сродство для аналогичных белка, rivax, не является. Однако, последовательность удовлетворительного консенсуса не был определен для сортировки abrax, используя повторяющийся последовательностей от раунд 4 только (Рисунок 5B и выше обсуждения). Возвращаясь к 100 виртуализированного колоний от раунд 4, однако, было отмечено на глаз при поиске последовательности похож на лучший матч для прогнозируемого консенсуса, что еще один кандидат, AX-A12, содержится последовательность FWDTWF, что было отмечено в изолировать AX-A15 , и что другой кандидат, AX-A14, содержится аналогичная последовательность, DWNTWF. Эти и другие последовательности, которые содержатся сходства к повторяющейся последовательности, продемонстрировал сходство с другими non повторяющийся последовательностей либо были выбраны случайным образом, были проанализированы СУИМ для привязки аффинити и специфичности. Те испытания ранжируются в Sarkes et al. 2016 1 и топ 5 связующие из этого анализа приводятся в рисунке 6B, с последовательностью консенсуса, определено как FWDTWF, показано на рисунке 5 c.

Аналогичный анализ обязательных сродство для повторяющихся последовательностей пептида в раунд 4 biopanning для пептидов, которые признают целевой па показало, что лучшие вяжущие, как рейтинг на коэффициент НМФИ nMFI:SAPE ПА-488, содержат WXCFTC консенсуса или аналогичный последовательность (Таблица 1). Используя этот показатель, последовательности самостоятельно организовал в те, которые содержали консенсус и те, которые не. Топ кандидаты, все содержащие последовательности, относящиеся к консенсусу, были проанализированы аналогично методы, описанные выше для abrax на рисунке 6, как представлены в Sarkes et al. 2015 14. Эти результаты показывают, что для некоторых целей, анализ пептиды с повторением последовательности может быть достаточно для получения связующих с значительные сходства и специфичности для выбранной цели и определить последовательность консенсуса, который может быть, сама по себе, достаточно для привязки. Заметьте, однако, что количество повторений не обязательно отражает относительная сродство для целевого объекта интерес (Таблица 1). Когда анализ повторяющихся последовательностей только не является достаточным, чтобы определить шаблон, это полезно для альтернативные между последовательности анализа и привязки для сужения списка кандидатов и пересмотреть тенденции среди тех кандидатов, с более высокой аффинностью . Даже тогда, когда от анализа повторяющейся последовательности только наблюдается тенденция, дополнительные non повторяющийся последовательностей могут продемонстрировать те же тенденции, или другие тенденции, после дальнейшего расследования.

Figure 1
Рисунок 1: схема biopanning протокола для бактериальных отображения библиотек. Как показано здесь, biopanning бактериальной отображения библиотек является циклический процесс. Каждая ячейка в библиотеке бактериальных дисплея (см. таблицу материалов) содержит плазмида ДНК, которая сохраняется до тех пор, как клетки растут в присутствии антибиотик, для которого плазмида содержит ген сопротивления (choloramphenicol в данном случае). Каждый плазмиды также кодирует белок эшафот дисплей, который предоставляет случайных пептида в экстерьер ячейки. Поскольку каждая ячейка должна содержать только одну плазмида ДНК последовательности, каждая ячейка следует отображать только один пептид, в нескольких местах по всей клеточной мембраны. В зависимости от уровня разнообразия библиотеки в начале biopanning и после каждого раунда сортировки последовательности ДНК могут или не могут быть уникальными от ячейки к ячейке. Biopanning начинается с роста и индукции клетки библиотеки для отображения отдельных пептидов на их наружной мембраны. Эти пептиды могут взаимодействовать с целевого белка (который является биотинилированным или иным образом помечены для захвата). Магнитные активированный ячейку Сортировка (MCS) несвязанных белок удаляется и клетки инкубируют с магнитной бусины, которые покрыты захвата белка (стрептавидина в этом примере, который имеет сильное взаимодействие с биотин). Вся культура затем подвергается магнитом для отдельных привязанных клетки от свободных клеток. С помощью автоматизированной магнитные устройства сортировки является предпочтительным для разделения клеток для уменьшения ложных срабатываний. Иллюстрированный здесь является позитивным сортировки, в котором сохраняются клетки, которые привязаны к и совместно элюировать с магнитной бусины. Для отрицательных сортировки, который мы обычно выполняют вверх-противостоьте, процесс такой же, за исключением того, что клетки, которые помыты прочь магнитные шарики вместо этого сохраняются. Библиотека часть интерес, связаны (положительный сортировка) или несвязанных (отрицательный сортировка), выращенных на ночь и используется в следующем раунде сортировки. Каждый последующий тур положительных biopanning требует снижения объема целевых концентрации и шарик для повышения жесткости. После каждого раунда biopanning близость и специфичность пептиды для целевого белка оцениваются с помощью активированного флуоресценции клеток, сортируя (FACS) чтобы помочь определить, когда следует остановить biopanning и начать расследование отдельных кандидатов. При необходимости, выполняются секвенирования ДНК и анализа последовательности пептида. Эти шаги анализа могут быть сами по себе циклический процесс, особенно для выявления тенденций в отдельных изолятов после финального раунда biopanning. На данный момент пептид последовательности тенденции и/или консенсуса коррелируются с привязки аффинити и специфичности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: пример данных для анализа СУИМ сортировки раундов: целевой па. Привязка соответствия определяется СУИМ показывается после 4 раундов biopanning (положительный сортировка) выбранной бактериальных отображения библиотеки для пептидов, привязки к целевому объекту, защитные антигена (PA). Это была выполнена после первого выполнения негативного рода против стрептавидина покрытием магнитные бусы. Для оценки привязки, клетки были индуцированной с 0,4% L-арабинозы 90 мин до инкубации с целевой и управления решениями и анализ СУИМ. Привязка анализ соответствия намечаемой цели будет выделено красным цветом. Показано здесь являются точечные участки FITC-A против FSC-A и значения для процент клеток связаны (по сравнению с условным отрицательный контроль, инкубировали с PBS только) и интенсивности флуоресценции средний (НМФИ, по сравнению с пептида бесплатно отрицательный контроль, инкубировали с же Флюорофор меченых белка) индуцированного клеток, которые были инкубировали в течение 45 мин с: PBS буфера одиночку, 150 Нм YPet Мона (положительный контроль для выражения пептида), или 250 Нм ПА-488 (обозначены цели). Обратите внимание на увеличение обогащения в обязательных сродство для целевого объекта интерес после каждого раунда biopanning. В отличие от Рисунок 3все autoMCS клеток увольнений были завершены с помощью программы Posselds. Часть этих данных также могут быть визуализированы в точечные участки vs FSC-H FITC-H в Sarkes et al. 2015 14 для сравнения на FITC-A против FSC-A участки, показанный здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: пример данных для анализа СУИМ сортировки раундов: целевой abrax. Аналогичным образом на Рисунок 2, здесь показан сравнительный сродство для полного biopanning эксперимента, как определяется СУИМ. Бактериальные отображения библиотеки был подвергнут негативные сортировка против стрептавидина покрытием магнитные шарики, как показано на рисунке 2, но был затем подвергнут дополнительный раунд негативных сортировки против гомологичных белки с аналогичной структурой и функция, rivax, перед выполнением 4 раундов положительных biopanning для привязки к намеченной цели, abrax пептидов. Для оценки привязки, клетки были индуцированной с 0,4% L-арабинозы за 45 мин до привязки к целевой, положительный контроль и негативный контроль и чтения на СУИМ. Привязка соответствия намечаемой цели будет выделено красным цветом. Показано здесь являются точечные участки FITC-A против FSC-A (или PE-A против FSC-A в случае SAPE) и значения для процент клеток связаны (по сравнению с условным отрицательный контроль, инкубировали с PBS только) и НМФИ из индуцированных клетки, которые были инкубировали в течение 45 мин с : PBS буфера одиночку, 150 Нм YPet Мона (положительный контроль для выражения пептида), 250 Нм Abrax-488 (помечены белка цель), 250 Нм Rivax-488 (помечены потенциальной мишенью cross-reactive белка), или 250 Нм SAPE (отрицательный контроль для прямой привязки к с покрытием стрептавидина магнитные бусы). Обратите внимание на увеличение обогащения сродство для целевого объекта интерес, abrax, после каждого раунда biopanning, и минимальным сродство для структурно аналогичных белка, rivax. В отличие от Рисунок 2позитивные biopanning раунд 1 была выполнена с использованием autoMCS Posselds программа хотя последующее сортировка раундов были завершены с помощью программы Posseld, как это предлагается для biopanning в этой рукописи. Эти данные также могут быть визуализированы в точечные участки vs FSC-H FITC-H в Sarkes et al. 2016 15 для сравнения на FITC-A против FSC-A участки, показанный здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: пример анализа последовательности вывода с помощью макроса «eCPX_Sequencing». Показано это скриншот 48 виртуализированного колоний от раунд 4 biopanning библиотека выбранного бактериальных дисплей для связывателей PA с помощью метода Posselds. Здесь показан лист «Сводная таблица». Обратите внимание, что колонии были пронумерованы в алфавитном порядке по их заданному имени файла во время процесса виртуализации и что коробки вокруг последовательностей, которые повторяются по крайней мере один раз изложены в разные цвета для облегчает анализ данных. Макрос eCPX_Sequencing предоставляется как файл дополнительного кода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: последовательность определение выравнивания и консенсуса для двух различных белковых мишеней. Все изображения, показанные здесь были получены с помощью программного обеспечения Jalview с Clustal_X окраски после выравнивания последовательностей с использованием Kalign онлайн анализ программного обеспечения 51. A) выравнивание повторяющихся последовательностей от ПА biopanning раунд 4 (соответствует Таблица 1). B) выравнивание повторяющихся последовательностей из abrax biopanning раунд 4 (соответствует рис. 6А). C) выравнивание Топ 5 кандидатов от abrax biopanning раунд 4, как определяется СУИМ анализ отдельных кандидатов (соответствует Рисунок 6B). Красная линия подчеркивает последовательность консенсуса в A и C, в то время как фиолетовая линия в B подчеркивает предшественником последовательность консенсуса определяется для abrax привязки при рассмотрении повторяющейся последовательности только, подчеркнув потенциал необходимо проверить сродство Использование СУИМ, прежде чем консенсус может быть определена в некоторых случаях. Подобные трасс с различными анализ программного обеспечения можно увидеть в Sarkes et al. 2015 14 и Sarkes et al. 2016 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: пример сродство и специфику отдельных кандидатов анализируются с помощью СУИМ. Здесь показан нормализованных средний флуоресценции интенсивность (НМФИ) определяется с помощью СУИМ для A) повторяющихся последовательностей и B Топ 5 кандидатов, как это определяется сравнительной сродство для целевого объекта, abrax, от раунд 4 biopanning. Данные представляют собой средние (бары) и стандартное отклонение (планки погрешностей) трех независимых реплицировать экспериментов. Обратите внимание, что все кандидаты показан весьма специфична для abrax (abrax-488, зеленые бары) над структурно аналогичных белок, rivax (Rivax-488, красные полосы) и отрицательный контроль стрептавидина (SAPE, черные полосы). Хотя два повторяющихся последовательностей в (AX-07 и AX-15) были также среди топ 5 кандидатов в B, сравнение результатов в A и B показывает, что анализ повторяющихся последовательностей в одиночку не может быть достаточно изолировать высокие сходства пептиды. Данные, показанные здесь был адаптирован от Sarkes et al. 2016 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Table 1
Таблица 1: соотношение конкретной привязки неспецифической привязку для отдельных кандидатов повторных. В этом примере количество повторных последовательностей и соотношение ПА (целевой) НМФИ для НМФИ SAPE (отрицательный контроль) отображается для повторяющихся последовательностей кандидат от ПА biopanning раунд 4. Эти данные сортируются по относительной ПА nMFI:SAPE НМФИ соотношение и анализируется на наличие известных WXCFTC консенсуса, или аналогичные последовательности, который является полужирным шрифтом и подчеркнул. Обратите внимание, что последовательности самостоятельно организовать таким образом, чтобы те кандидаты с консенсусом имеют самый высокий коэффициент НМФИ nMFI:SAPE ПА и поэтому взаимодействовать более конкретно с целью. Результаты показали, от одного эксперимента СУИМ. Пептиды с низким сродством для цели были исключены из дополнительных реплицирует и анализа, которые были опубликованы в Sarkes et al. 2015 года 14.

Suppplemental файл 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл Suppplemental 2: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Biopanning бактериальной отображения библиотек был успешный подход к изоляции сродство реагентов, и пептиды предлагают полезной альтернативой антитела для распознавания, когда требуются конкретные критерии, такие, как стабильность в экстремальных условиях. Biopanning этих библиотек была оптимизирована с использованием autoMCS методов, описанных здесь, и коммерчески доступных autoMCS платформа расширяет эту технологию к гораздо широке аудитории. По сравнению с традиционными чередуя MCS/FACS сортировки методы для бактериального отображения библиотек, autoMCS методы являются менее дорогостоящими, потому что они не требуют инвестиций в более дорогих СУИМ инструмент, способный сортировки и изолировать связанной ячейки, вместо типа проточный цитометр, которая используется здесь, который способен только анализ 14. Важнейших шагах для его успешной biopanning по autoMCS включают в себя разделение выбор программы, отрицательные, сортировка против потенциальных кросс реактивы для уменьшения ложных срабатываний, мониторинг библиотека обогащения с помощью СУИМ, чтобы определить, когда следует прекратить biopanning, и умный анализ кандидатов, чтобы избежать громоздких скрининг сотен кандидатов.

В описанных примерах успешных biopanning выбранной бактериальных отображения библиотеки для двух отдельных целей, ПА и abrax, хотя и с несколько иной анализ стратегии из-за различий в пептидной последовательности для каждого пула кандидаты после четырех раундов biopanning. ПА было более простым, с анализа последовательностей, демонстрируя четкие тенденции от пептида последовательностей, которые повторяются по крайней мере один раз в 144 колоний. Это само по себе было достаточно определить последовательность консенсуса для целевой ПА и тех колоний, которые содержали консенсус или аналогичной последовательности были лучших кандидатов с точки зрения соотношения привязки ПА против привязки к стрептавидина отрицательного контроля. Однако это не всегда будет так. Для цели abrax 100 колоний секвенирования привело к пяти повторяющейся последовательности, но в этих последовательностей тенденция менее ясно, склонны содержать ароматических аминокислотных остатков и аспарагиновой кислоты или аспарагин. Предсказал «консенсус» от повторяющихся последовательностей только могли были подготовлены и испытаны для сродством к abrax, но поскольку последовательности не родитель содержится последовательность что точное консенсуса, мы вернулись к списку виртуализированного колоний и отметил, что другие кандидаты, которые были более тенденции общего друг с другом. В самом деле две колонии содержится аналогичной последовательности «консенсус» от повторяется только (FWDTWF вместо FWAWF), которые имели ту же тенденцию, триптофан, фенилаланин и аспарагиновой кислоты остатков, но с другой интервал. Один из этих пептидов было повторяющуюся последовательность, один не был. Эти две последовательности, наряду с третьего последовательность, содержащую подобный вариант, были среди топ 5 связующие, протестированы с точки зрения сродство для abrax. Топ связывателя общей, AX-A05, также отображается аналогичные тенденции. Результаты для abrax показывают, что подход, который чередует несколько раз между последовательность анализа и аффинити и специфика иногда потребуется, в зависимости от выбранной цели. Результаты для целевого объекта abrax также продемонстрировать уровень конкретности, которая может быть достигнута через очень похожа белка (rivax 1,,15).

AutoMCS программы, выбранные для нашего исследования были Posselds и Posseld, которые оба для позитивного выбора помечены целевых клеток с низкой частотой, менее 5% от первоначального населения. В обоих случаях клетки проходят через два магнитных столбцы. В случае Posselds программы Однако, клетки проходят более медленно через первый столбец увеличить время экспозиции 41. Помимо описания программы, указанным производителем коммерческих autoMCS устройства (см. Таблицу материалов) 41, эти программы были выбраны после первоначального сравнение нескольких потенциальных программ. Каждой программы возможность избежать потянув ложных срабатываний от однородной культуры клеток отрицательного контроля и успешно изолировать связыватель известным объектом интереса от смешанные культуры, содержащих отрицательный контроль клетки шипами с уменьшением процент известных связывателя, были сопоставлены. Если значительно отличающиеся от приложений, описанных здесь, аналогичное сравнение может быть полезно в программе отбора для нового приложения. Однако ранее опубликованные результаты, сравнивая эти две программы (Posseld и Posselds) для изоляции пептид сродство реагентов для ПА, показали, что использование любой из этих программ для всех четырех раундов biopanning привело к изоляции пептиды с аналогичными близость и специфики для ПА и определение WXCFTC консенсуса. Основные отличия были что Posseld, с его быстрее скорости потока, сортировка более быстро и сродство для целевого объекта привязки поэтому выше после только два раунда biopanning, в то время как с помощью Posselds привело к более уникальных последовательностей после четырех раундов biopanning 14. обучения от этого, стратегия была слегка меняется, когда biopanning для abrax привязки пептиды включить оба преимущества: Posselds был использован для раунд 1 чтобы позволить больше Выдержка в течение этот критический шаг, где разнообразие является самым высоким, но затем Программа был переведён в Posseld быстрее изоляции во время раундов 2-4 в 1,15связывателей высоких сродства. Это, как представляется, быть идеально подходит для abrax, тем более, что оба выше для сортировки раунд 4 по сравнению с ПА, сортировка раунд 4 с любой программой abrax были НМФИ и процент привязки (рис. 2 и на рисунке 3 и Sarkes et al. 2015 14), но для более убедительных сравнения потребуется прямое сравнение с использованием одной из стратегий по сравнению с другими с той же цели. Какая программа лучше всего подходит для конкретного приложения может зависеть отдельных целевых объектов, сортировки Библиотека, используемая и уровень пептида выражение, которое достигается с помощью каких-либо изменений в условиях, описанных здесь.

Не обсуждается здесь являются потенциальные результаты от biopanning с абиотические материалы, но мы также использовали же бактериальных отображения библиотеки для biopanning против массовых алюминия 2. Это исследование не проводилось с использованием autoMCS, но аналогичные исследования может быть выполнено с помощью autoMCS, если материал доступен на, или может быть покрытием на или конъюгированных с, магнитный шарик. В исследовании алюминия оптом отдельные аминокислоты анализ и моделирование вторичной структуры был полезным для понимания, что ехал сродство отдельные пептиды, поскольку не последовательность консенсуса определяется 2. Даже с биологической цели это может быть необходимо понять, что движет сродство для некоторых целей, именно поэтому таблицы, созданные из макроса «eCPX_Sequencing» включает в себя вкладка с индивидуальных остатков частотный анализ. Если не повторяющейся последовательности рассматриваются наряду с отсутствием консенсуса, и остатки частот показывает не шаблон, однако, другие виды анализа может потребоваться. Кроме того дальнейшая сортировка раундов может быть необходимо избегать скрининг гораздо большее число кандидатов для вниз выбор тех, кто с достаточной сродством к желаемой цели.

С повышение доступности следующего поколения последовательности могут выполняться более тщательное исследование для определения наиболее перспективных кандидатов до тестирования сходства и определить степень обогащения после каждого раунда biopanning. Однако последовательности, перейти к шагу анализа привязки может потребоваться повторно создаваться путем клонирования, если они не являются достаточно высокой частоты, чтобы легко изолировать с обычной колонии sequencing десятки или сотни колоний. Как этой технологии, стать менее дорогой и более обычные, и особенно с возможностью для изоляции колонии, он будет скорее всего будет лучшим способом анализа данных biopanning. Это может привести к разяснения пути отдельных последовательностей, и вся библиотека, развиваться. Кроме того бактерии в библиотеке сортировки может мутировать во времени, что может смещения сортировки к клетки с быстрее темпы роста или бактерии, которые overexpress геномной белки способны связывать материал даже без отображения леску и пептида выражения, для экземпляр. По этой причине после того, как возникают перспективных кандидатов, стоит изоляции дна плазмиды, retransforming свежий E. coli и подтверждающие пептид привязки через СУИМ. Если вы планируете использовать пептида в формате свободной ячейки, близость следует также оценить для свободного пептид. К примеру пептид сродство реагентов обнаружил через бактериальный дисплей для целевого SEB были синтетический-клеток и проанализированы более традиционными методами, такими как immunosorbant энзим соединенный assay (ELISA) и в клеток (через FACS) и -cell (через ELISA) сходства были сопоставлены с помощью sdK, определяются как методы 7.

Хотя сила взаимодействия биотин стрептавидина делает его идеальной стратегии для захвата целевых белков и пептидов, связанного, этой процедуры могут быть изменены для других стратегий захвата. Прямых муфт белка магнитные бусы, например эпоксидной и карбоновые кислоты бусы, был успешным и удаляет шага привязки. Однако прямых вложений может препятствовать потенциальных сайтов связывания на основе конкретных или неспецифических, в зависимости от стратегии вложения. Дополнительным преимуществом использования стрептавидина бисер является что менее стабильного белка цели могут быть свеже биотинилированным в 30 мин или хранятся замороженные, при необходимости, в то время как бусы, сами, как правило, требуют больше инкубации с белками для сшивки и являются как правило, хранятся в 2-8° C. Предложил начиная концентрация белка биотинилированным цель здесь, 600 Нм, был успешным для нескольких целей, но это может быть возможность изолировать пептид захвата реагентов с повышенной сходства, если эта концентрация уменьшается. Кроме того этот метод можно распространить и модифицированы для других бактериальная отображения библиотек и других организмов. Например эти действия могут выполняться в отсутствие кислорода для использования с анаэробов, или в других средах для использования с экстремофилы изолировать пептиды с уникальными свойствами. Пептиды и/или консенсус определяется для конкретного целевого интерес может быть потенциально используется на клетки как живой материал, или синтетически произведенные вне клетки. Синтетическим пептиды могут далее созрели для развития еще больше аффинити и более надежного захвата катализировано белка (PCC) агенты для использования в датчики, или для других приложений, где антитела обычно будет использоваться для привязки или 55признание 38,. Молекулярное моделирование может также использоваться для определения привязки расположение пептида с ее цель, как было недавно исполнил для abrax привязки пептидов и консенсуса, перечисленных в рисунке 5 c 1. В целом, biopanning бактериальной отображения библиотек для пептида сродство реагентов является быстрый, простой и мощный альтернативой для производства антител для распознавания и выявления белковых мишеней и это полуавтоматическое biopanning подход подготовила надежные результаты далеко идущие приложения.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать

Acknowledgments

Авторы хотели бы отметить поддержку лаборатории исследований армии США (СВМ) программа Докторантура стипендий, ведении дуб Ридж ассоциированных университетов через контракт с АВМ, путем назначения д-ра Джастин P. Янке. Оставшиеся средства были предоставлены датчиков и электронных устройств дирекции на ARL. Авторы также хотел бы поблагодарить лаборатории Догерти на UCSB для обмена бактериальной отображения библиотеки и информацию для клонирования YPet Mona реагент, доктор Брин Адамс для поддержки клонирования YPet Mona реагента в АРЛЬ, д-р Джошуа Kogot для его первоначальной работы по и обучение в biopanning бактериальной отображения библиотек, Алена спокойствие Edgewood химических и биологических центр для обмена плазмид, используется для выражения и очистить abrax и rivax белки, Brandi Dorsey технической поддержки для изоляции ПА привязки пептидов, Цинь Guo для технической поддержки предварительных экспериментов для изоляции abrax привязки пептидов, и доктор Джессика Terrell для полезной дискуссии относительно этой рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545 Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB) Fisher Scientific BP1426-500 Growth medium
Chloramphenicol Fisher BioReagents BP904-100 Antibiotic
Agar Fisher Scientific BP2641-500 Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library Cytomx Therapeutics N/A; http://cytomx.com/contact/ On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose Sigma A3256-500G Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) Amresco 0780-10L Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Thermo Scientific PI21327 Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific PI28005 Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads Invitrogen 65601 Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647-100G Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose Sigma G8270-1KG Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona UCSB and ARL N/A Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester Thermo Scientific 46403 For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) Thermo Scientific S866 Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow Becton, Dickinson, and Company 342003 Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns Miltenyi Biotech 130-021-101 For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer Miltenyi Biotech 130-091-221 For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotech 130-092-987 For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol VWR E505-4L Decontamination of autoMACS
Glycerol Sigma G6279-1L For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack Miltenyi Biotec 130-092-952 For MACS Separation
BD FACSCanto II Becton, Dickinson, and Company 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software Becton, Dickinson, and Company 659523 For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator Thermo Scientific A13346 Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing Genewiz N/A; https://www.genewiz.com/ DNA and Colony Sequencing Services
Excel Microsoft 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA) List Biological Laboratories, Inc. 171 Target protein used as example for representative results.
Abrax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sarkes, D. A., Hurley, M. M., Stratis-Cullum, D. N. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21 (11), 1504 (2016).
  2. Adams, B. L., Finch, A. S., Hurley, M. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25 (33), 4585-4591 (2013).
  3. Bessette, P. H., Rice, J. J., Daugherty, P. S. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17 (10), 731-739 (2004).
  4. Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17 (4), 474-480 (2007).
  5. Getz, J. A., Schoep, T. D., Daugherty, P. S. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75 (2012).
  6. Kenrick, S. A., Daugherty, P. S. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).
  7. Kogot, J. M., et al. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27 (12), 739-745 (2014).
  8. Kogot, J. M., Pennington, J. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N., Pellegrino, P. M. Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. , US Army Research Laboratory, Sensors and Electron Devices Directorate. Adelphi, MD. (2011).
  9. Kogot, J. M. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6 (11), e26925 (2011).
  10. Little, L. E., Dane, K. Y., Daugherty, P. S., Healy, K. E., Schaffer, D. V. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32 (6), 1484-1494 (2011).
  11. Pennington, J. M., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Pellegrino, P. M., Stratis-Cullum, D. N. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. , (2012).
  12. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21 (7), 435-442 (2008).
  13. Rice, J. J., Schohn, A., Bessette, P. H., Boulware, K. T., Daugherty, P. S. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15 (4), 825-836 (2006).
  14. Sarkes, D. A., Dorsey, B. L., Finch, A. S., Stratis-Cullum, D. N. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6 (4), 1 (2015).
  15. Sarkes, D. A. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. , (2016).
  16. Stratis-Cullum, D., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Val-Addo, I., Pellegrino, P. M. Chapter 30, Bacterial display peptides for use in biosensing applications. On Biomimetics. Pramatarova, L. , InTech. 629-642 (2011).
  17. Stratis-Cullum, D. N., Finch, A. S. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7 (009), (2013).
  18. Rockberg, J., Löfblom, J., Hjelm, B., Uhlén, M., Ståhl, S. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5 (12), 1039-1045 (2008).
  19. Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L., Georgiou, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10444-10448 (1993).
  20. Georgiou, G. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15 (1), 29-34 (1997).
  21. Löfblom, J., Wernérus, H., Ståhl, S. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248 (2), 189-198 (2005).
  22. Kjærgaard, K., Sørensen, J. K., Schembri, M. A., Klemm, P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66 (1), 10-14 (2000).
  23. Kishimoto, J., Fukuma, Y., Mizuno, A., Nemoto, T. K. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10 (4), 296-311 (2005).
  24. Westerlund-Wikström, B. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290 (3), 223-230 (2000).
  25. Gaskin, D. J., Starck, K., Turner, N. A., Vulfson, E. N. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28 (9), 766-772 (2001).
  26. Goldman, E. R. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13 (6), 382-387 (2000).
  27. Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15 (6), 553-557 (1997).
  28. Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. , 155-175 (2015).
  29. London, N., Movshovitz-Attias, D., Schueler-Furman, O. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18 (2), 188-199 (2010).
  30. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  31. Jahnke, J. P., Terrell, J. L., Smith, A. M., Cheng, X., Stratis-Cullum, D. N. Influences of Adhesion Variability on the "Living" Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21 (8), 985 (2016).
  32. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13 (5), 515-523 (2014).
  33. Löfblom, J., Frejd, F. Y., Ståhl, S. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22 (6), 843-848 (2011).
  34. Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9 (12), 525-529 (2004).
  35. Pini, A., Falciani, C., Bracci, L. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9 (5), 468-477 (2008).
  36. Gongora-Benitez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2013).
  37. Coppock, M. B., et al. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. , (2014).
  38. Coppock, M. B. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. , (2016).
  39. Bessette, P. H., Hu, X., Soh, H. T., Daugherty, P. S. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79 (5), 2174-2178 (2007).
  40. Chao, G. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1 (2), 755-768 (2006).
  41. Miltenyi Biotec GmbH. autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. , Miltenyi Biotec GmbH. Bergisch Gladbach, Germany. (2007).
  42. Henriques, S. T., et al. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8 (11), e80474 (2013).
  43. BD FACSCanto II Operator Course Workbook. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  44. BD FACSCanto II Instructions For Use. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  45. Chan, L. Y., Yim, E. K., Choo, A. B. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (2), 156-165 (2012).
  46. Genewiz. DNA Sequencing Services. , Available from: https://www.genewiz.com/ (2017).
  47. Honegger, A., PluÈckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309 (3), 657-670 (2001).
  48. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7 (1), 539 (2011).
  49. Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6 (1), 298 (2005).
  50. EMBL-EBI. Clutal Omega. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (2017).
  51. EMBL-EBI. Kalign. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/ (2017).
  52. Clamp, M., Cuff, J., Searle, S. M., Barton, G. J. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20 (3), 426-427 (2004).
  53. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., Barton, G. J. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  54. Jalview. , Available from: http://www.jalview.org/Download (2017).
  55. Farrow, B., et al. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7 (10), 9452-9460 (2013).

Tags

Биохимия выпуск 130 бактериальных дисплей biopanning пептид близость реагент autoMACS biosensing
Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P.,… More

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter