Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Live avbildning av primära hjärnbarken celler använder ett 2D kultur

Published: August 9, 2017 doi: 10.3791/56063

Summary

Levande bildbehandling är ett kraftfullt verktyg att studera cellulära beteenden i realtid. Här beskriver vi ett protokoll för time-lapse video-mikroskopi av primära hjärnbarken celler som gör att en detaljerad granskning av de faser som antogs under härstamning progression från primära neurala stamceller till differentierade nervceller och glia.

Abstract

Under hjärnbarken utveckling genomgå stamceller flera omgångar av symmetriska och asymmetriska celldelningar att generera nya föräldraparets eller postmitotic nervceller. Senare, byta några föräldraparets till ett gliogenic öde, att lägga till de astrocyt och oligodendrocyte populationerna. Med time-lapse video-mikroskopi av primära hjärnbarken cellkulturer, är det möjligt att studera de cellulära och molekylära mekanismer som styr funktionsläget av celldelning och cellcykeln parametrar av stamceller. Likaså kan ödet för postmitotic celler undersökas med hjälp av cell-specifika fluorescerande reporter proteiner eller efter imaging immuncytokemi. Viktigare, kan alla dessa funktioner analyseras på enskild cell nivå, möjliggör identifiering av föräldraparets begått till generation av specifika celltyper. Manipulation av genuttryck kan också utföras med viral-medierad transfection, möjliggör studiet av cell-självständiga och icke-cell-autonoma fenomen. Slutligen, användning av fusion fluorescerande proteiner gör studien av symmetriska och asymmetriska fördelningen av valda proteiner under avdelningen och sambandet med dottercellerna öde. Här, beskriver vi metoden time-lapse video-mikroskopi för att bilden primära hjärnbarken murina celler för upp till flera dagar och analysera läget för celldelning, cellcykelns längd och ödet av nygenererad celler. Vi beskriver också en enkel metod för att transfect stamceller, som kan tillämpas för att manipulera gener av intresse eller helt enkelt etikettera celler med reporter proteiner.

Introduction

Neurala stamceller (NSC) generera nervceller och macroglial celler under hjärnbarken utveckling. På tidigt-corticogenesis, Karolina genomgå flera omgångar av symmetriska celldelning och expandera stamcellspoolen. Sedan, Karolina klyftan asymmetriskt att generera nervceller direkt eller indirekt genom intermediärer1. Endast på Växla mitten av - till sent-corticogenesis, stamfäder för att generera astrocyter och oligodendrocyter2,3,4. De fullständiga mekanismer som styr cellproliferation och differentiering, samt bidraget från öde-begränsad stamfäder till generation av unika typer av nervceller eller macroglial celler är dock en fråga om intensiv debatt4,5,6. Enskilda kortikala Karolina potential att generera nervceller, astrocyter och oligodendrocyter har varit flitigt studerade in vitro- och in-vivo med en myriad av tekniker såsom: live imaging i encelliga kulturer7,8,9,10,11,12,13. Live-imaging i hög densitet kulturer kulturer3,14,15. Live-imaging i slice kulturer16,17,18. klonal analys med viral vektor-medierad genetiska märkning i hög densitet kulturer14,15,19,20,21. klonal analys i vivo som använder retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; och klonal analys i vivo med transgena djur34.

Var och en av dessa tekniker utgör för- och nackdelar. Exempelvis är i vivo lineage tracing mottagliga till bunta och blixtra fel3, leder till motstridiga slutsatser om potentialen av enskilda kortikala stamfäder. Dessutom både in vitro och in-vivo studier utifrån märkningen av stamceller på tidiga tidpunkter och bakre analys av cell härstamningar kan påverkas av oupptäckt förekomsten av celldöd under härstamning-progression35. Därför måste ett lämpligt system att analysera potentialen för enda Karolina tillåta identifiering av alla celler genereras, samt lämpliga karakterisering av cell öden av härstamning. Kombinationen av primär cellkultur och levande imaging ger inställningen. Använda single-cell kultur och time-lapse video mikroskopi, har templet et al. visat växeln i linjen av enskilda hjärnbarken stamfäder från neurogenes till gliogenesis11. Senare, används de samma system för att visa att olika typer av nervceller genereras från en enda kortikala stamceller12. Men detta system utgör en viktig varning: endast 1% av kortikala föräldraparets isolerad på tidig corticogenesis generera kloner av 4 eller fler avkommor9. Efter tillägg av FGF2 ökar frekvensen av celler som genererar 4 eller fler celler till 8-10%9. Detta nummer är dock för liten med tanke på att nästan alla kortikala föräldraparets proliferativ i detta skede. Dessutom uteslutas inte de potentiella effekterna av FGF2 på öde-specifikation36. För att kringgå dessa begränsningar, vi använde högdensitets cellkulturer som stöder spridningen av både ventrikulära (Pax6-uttrycker) och subventrikulära (Tbr2-uttryckande) kortikala föräldraparets15. Realtid observation av dessa kulturer har dessutom visat att flera funktioner av NSC härstamning progression återges under dessa förhållanden, som funktionsläget av celldelning, förlängning av cellcykeln, enstaka celler potential att generera nervceller och glia, bland annat3,15. Mer nyligen har vi också använt detta system för att visa att CREB-signalering påverkar cellöverlevnad av omogna hjärnbarken nervceller i möss37. Således anser vi att time-lapse video-mikroskopi av primära murina hjärnbarken celler odlade i hög densitet är en kraftfull och tillgängliga verktyg att studera cellulära och molekylära mekanismer av cellcykelns förlopp, celldelning, cellöverlevnad och cell öde specifikation. Dessa produkter kan åstadkommas med transgena djur, möjliggör identifiering av viss cell öden på realtid38,39,40 eller användning av efter imaging immuncytokemi3,38,41,42.

Här, ger vi en steg för steg-protokollet för att förbereda primära hjärnbarken cellkultur stödja spridningen av Karolina och den efterföljande generationen av nervceller och macroglial celler. Vi diskuterar också användningen av retroviral-medierad transfection att manipulera genuttryck av enskilda celler, som kan identifieras och spåras på enskild cell nivå med time-lapse video mikroskopi. Detta protokoll kan användas för att studera primära hjärnbarken celler isolerade från början till slutet av corticogenesis hos gnagare, men några justeringar kan krävas enligt den scen14. Karolina isolerade från andra källor kan också studeras med time-lapse video mikroskopi av 2D kulturer, men lämpliga culturing systemet bör fastställas genom att jämföra cell beteenden in vitro- och in-vivo38,43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Realtid observation av primära hjärnbarken celler gör analysen av cellproliferation, celldelning, cellcykelns längd, celldifferentiering och cell överlevnad3,14,15,37. Viktigare, tillåter det studier av encelliga härstamningar, leder till identifiering av de mellanliggande etapperna antagit under progression från Karolina till nervceller3. Slutligen, kombinationen av denna kultur system med bioteknik verktyg för att manipulera genuttryck är en kraftfull teknik för att studera cell-självständiga effekten av valda mål5. Den metod som beskrivs här kan ändras för att studera linjen av hjärnbarken föräldraparets isolerad på olika utvecklingsstadier14, samt Karolina isolerade från andra källor38,42. Liknande metoder har också använts för att studera cell härstamningar i den framkallande näthinnan41.

Här visar vi ett enkelt experiment med retrovirala-medierad transfection till etikett stamceller med en reporter fluorescerande protein. Men kan liknande mål uppnås med andra virala vektorer, kemisk/elektrisk transfection eller transgena djur uttrycker fluorescerande proteiner under kontroll av neurala cell-typ specifika initiativtagare38,39. Alla dessa metoder att styra genuttrycket kan också användas för att inducera eller hämma uttrycket av gener av intresse, möjliggör studier av molekylära mekanismer involverade i neurala stamceller härstamning progression15,18,39. Vi förutser också att detta system kan användas för att utvärdera hur olika uttryck nivåer av specifika proteiner reglerar NSC beteende och neuronala/macroglial differentiering, liknar vad har gjorts i det hematopoetiska systemet40. Också, det kan hjälpa för att belysa enda föräldraparets potential att generera separat neuronala härstamningar.

Jämfört med andra tekniker som syftar till att imaging däggdjur Karolina i live-djur eller slice kulturer, har den metod som beskrivs här några viktiga fördelar. För det första, låg-metoden kostar en betydande fördel. Enkelt omvänt Mikroskop utrustat med överförda och fluorescens lampor och en kamera som kontrolleras av dator-baserad programvara kan användas för att förvärva bilder av 2D kulturer för upp till flera veckor. För det andra, antalet djur som används för dessa experiment är betydligt mindre än i andra metoder. För det tredje tillåter systemet en exakt kontroll av miljöförhållanden, således tillåter analys av cell-självständiga och icke-cell-självständiga effekter av olika manipulationer. Slutligen, enskilda celler otvetydigt kan observeras i upp till 15 dagar, tillåter exakt återuppbyggnaden av stora härstamning träd, som för närvarande inte möjligt både i hjärnbarken slice kulturer eller in vivo. Däremot, kan systemet presenterar nackdelarna med förlusten av vävnad organisation. Därför rekommenderar vi att de cellulära beteenden som observerats i dessa 2D kulturer idealiskt bör bekräftas av andra experiment i vivo.

Tidigare data med hjälp av detta system visar att cellen cykel förlängning av kortikala stamceller i vivo48 är återgivna i vitro15. Den neurogena och gliogenic potentialen hos enskilda hjärnbarken stamfäder är också härmade i 2D kultur systemet beskrivs här3. Slutligen, cellproliferation och cellcykeln exit nyckeltal observerats i vivo kan också vara härmade använder denna cell kultur system15,18. Således anser vi att live-imaging av primära hjärnbarken celler odlade i de förhållanden som beskrivs i detta protokoll är en kraftfull och användarvänlig metod att studera cellulära och molekylära mekanismer som styr stamceller cellproliferation, neuronala och gliaceller celldifferentiering och cell öde specifikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av CNPq (Conselho Nacional de skattemyndigheten Científico e Tecnológico), uddar (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) och FAPERN (Fundação de Amparo en Pesquisa do Rio Grande do Norte).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen Life Technologies 14175129
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco 12400-024
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437028
Glucose Gibco A2494001
B27 Gibco 17504044
trypsin-EDTA (0.05%) Gibco 25300054
Paraformaldehyde Sigma 16005
Goat serum Sigma-Aldrich 69023
Triton X-100 VWR International Ltd. 306324N
Isoflurane Sigma 792632
anti-MAP2, mouse Sigma M4403
anti-GFP chicken Aves 0511FP12
DAPI Sigma D9542
Goat anti-mouse alexa 594 Invitrogen A11005
Goat anti-chicken alexa 488 Invitrogen A11039
ImageJ NIH
tTt ETH Zurich
Cell observer microscope Zeiss
Pasteur pipette
PBS
The Tracking Tool (tTt) software https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html download link

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
  3. Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
  4. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  5. Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449 (2015).
  6. Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76 (2015).
  7. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
  8. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
  9. Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
  10. Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
  11. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
  12. Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
  13. Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
  14. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  15. Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
  18. Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
  19. Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
  20. Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
  21. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
  22. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  23. Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
  24. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
  25. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
  26. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
  27. Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
  28. Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
  29. Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
  30. Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
  31. Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
  32. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  33. Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
  34. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  35. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
  36. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
  37. Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
  38. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
  39. Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
  40. Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
  41. Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
  42. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
  43. Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
  44. Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
  45. Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
  46. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  47. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
  48. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).

Tags

Neurobiologi fråga 126 primära cellkulturer hjärnbarken time-lapse video-mikroskopi cellproliferation neuronal differentiering cellöverlevnad.
Live avbildning av primära hjärnbarken celler använder ett 2D kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landeira, B. S., Araújo, J. A.More

Landeira, B. S., Araújo, J. A. d. M., Schroeder, T., Müller, U., Costa, M. R. Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System. J. Vis. Exp. (126), e56063, doi:10.3791/56063 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter