Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Episcopische Microscopie met hoge resolutie (HREM) - Eenvoudige en robuuste protocollen voor het verwerken en visualiseren van organische materialen

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC, Medical University of Vienna

Summary

Wij bieden eenvoudige en robuuste protocollen voor het verwerken van biopsiemateriaal van verschillende soorten, embryo's van biomedische modelorganismen en monsters van andere organische weefsels om de digitale volumegegevensopwekking mogelijk te maken met de hoge resolutie episcopische microscopie methode.

Abstract

Wij bieden eenvoudige protocollen voor het genereren van digitale volumedata met de hoge-resolutie episcopische microscopie (HREM) methode. HREM kan organische materialen met volumes tot 5 x 5 x 7 mm 3 weergeven in typische numerieke resoluties tussen 1 x 1 x 1 en 5 x 5 x 5 μm 3 . Exemplaren zijn ingebed in methacrylaathars en gesneden op een microtome. Na elke sectie wordt een afbeelding van het blokoppervlak vastgelegd met een digitale videocamera die op de fotobuis zit die verbonden is met de samengestelde microscoopkop. De optische as passeert door een filterkubus met groene fluorescerende eiwitten en is afgestemd op een positie waarbij de bockhouderarm na elke sectie rust. Op deze manier worden een reeks van inherent uitgelijste digitale beelden, die de daaropvolgende blokoppervlakken weergeven, geproduceerd. Het laden van een dergelijke serie in driedimensionale (3D) visualisatie software vergemakkelijkt de directe conversie naar digitale volumegegevens, waardoor virtuele sEctioning in verschillende orthogonale en schuine vlakken en het creëren van volume en oppervlak gesmolten computermodellen. Wij presenteren drie eenvoudige, weefselspecifieke protocollen voor het verwerken van verschillende groepen organische exemplaren, waaronder muis-, kuiken-, kwartels-, kikker- en zebravisembryo's, humaan biopsiemateriaal, niet-bekleed papier en huidvervangend materiaal.

Introduction

Structurele analyse van organische en anorganische materialen is de eerste stap in het begrijpen van hun fysieke eigenschappen en functie. De basis voor deze analyse is vaak tweedimensionale (2D) informatie die wordt verkregen door zorgvuldige observatie van histologische afdelingen, met een verscheidenheid aan eenvoudige en verfijnde beeldvormingsmethoden die details van weefselarchitectuur, celmorfologie en topologie, moleculaire samenstelling en biomechanische eigenschappen 1 , 2 , 3 . Echter, 2D informatie is niet geschikt voor het onderzoeken van ruimtelijk complexe afspraken. Vandaar dat in de laatste decennia een groeiend aantal in vivo en ex vivo methoden die de opwekking van digitale volumegegevens mogelijk maken, zijn vastgesteld en nog veel meer onder ontwikkeling zijn.

Het methodische principe van methoden voor het genereren van de meeste data is het genereren van virtuele stapelsVan digitale afbeeldingen die secties weergeven die worden verkregen door virtuele of fysieke sectie van een object. Als de afbeeldingsafbeeldingen correct zijn uitgelijnd, creëert dit een volume, dat opnieuw kan worden gescoord in virtuele sectievlakken, of gebruikt voor het maken van 3D-oppervlak- en volumegereide modellen. Populaire technieken voor het visualiseren van mensen en grotere biologische monsters zijn magnetische resonantie tomografie (MRT), computertomografie (CT), positronemissie tomografie (PET) en single-foton emissie computertomografie (SPECT). Kleine exemplaren worden meestal door middel van micro-magnetische resonantiebeeldvorming (μMRI), optische projectie tomografie (OPT), optische coherentie-tomografie (OCT), foto-akoestische tomografie (PAT), histologische sectie gebaseerde methoden, confocale microscopie en elektronentomografie 5 , 6 weergegeven , 7 , 8 , 9 , 10 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Een relatief nieuwe volume data-generatietechniek, die digitale gegevens van kleine monsters en histologische weefselmonsters produceert, is de HREM-methode, die in nauwe samenwerking met Tim Mohun 18 , 19 is ontwikkeld . Het is een eenvoudige microscoop gebaseerde techniek, die digitale volumegegevens uit hars-ingebed materiaal produceert dat op een microtome is gesneden. De data vergemakkelijken gedetailleerde analyse van weefselarchitectuur en celverdelingen, evenals metrische analyse van kleine functies op een intermediair lichtmicroscopisch niveau.

HREM produceert stapels inherent uitgelijste digitale afbeeldingen die verschijnen alsof ze van e zijn gevangenOsin-gekleurde histologische afdelingen. Weefselcontrast en data-resolutie ten opzichte van het gezichtsveld overschrijden die van de gegevens die zijn geproduceerd met μCT, μMRI en OPT, maar zijn lager dan die met confocal-, licht- en elektronenmicroscopie 20 bereikbaar zijn. In tegenstelling tot deze laatste is HREM echter in staat om exemplaren te visualiseren met relatief grote volumes tot 5 x 5 x 7 mm 3 in histologische kwaliteit. Een aantal recente studies geven gedetailleerde karakteriseringen en vergelijkingen van voor- en nadelen van de enkele beeldvormingstechnieken en verwijzen we om redenen van objectiviteit naar die voor verdere informatie over hun beperkingen en mogelijke toepassingsgebieden 4 , 21 , 22 , 23 , 24 .

Deze studie richt zich op de HREM imaging methode en streeft ernaar om te voorzienZeer eenvoudige protocollen voor het genereren van HREM data van een breed spectrum van organische materialen, evenals voorbeelden van hun toepassing. De workflow voor het creëren van HREM data is eenvoudig en geldt voor alle materialen die kunnen worden ingebed in methacrylaathars ( Figuur 1 ). Toch zijn er weefselspecifieke verschillen in steekproefbereiding, die moet worden overwogen. Daarom bieden we drie standaardprotocollen voor het voorbereiden van verschillende monsters. Embedding en data generatie protocol stappen zijn identiek voor alle van hen.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen van de Medische Universiteit van Wenen.

1. Voorbeeld Bereiding

  1. Voorbereiding van embryo's en embryoweefsels (tot 5 x 5 x 5 mm 3 )
    1. Bevestig de embryo's of delen van de embryo's in 4% PFA / PBS of Bouin's fixatief bij 4 ° C gedurende minstens 16-24 uur onder constante schommeling.
      OPMERKING: Embryo's van verschillende soorten en verschillende ontwikkelingsstadia kunnen gebruikt worden, zoals 48-h zebravis, 19-uur-kuiken en kwartels, en ook prenatale muisembryo's, die hier gebruikt werden (zie Representatieve resultaten ). De monsters werden geoogst en overgebracht in PBS bij kamertemperatuur voor het plaatsen, voordat ze in fixatief werden gebracht. Indien nodig, snijd de specimens met micro-scharen of scalpels voorafgaand aan de fixatie om in de embedding matrijzen te passen.
    2. Verwijder de fixatie en wrijf het embryoweefsel in PBS bij 4 ° C onder constante rockinG voor 24 uur (2-3 veranderingen).
    3. De monsters worden gedurende 2 tot 3 uur elk gedroogd in 70%, 80%, 90%, 96% ethanol bij 4 ° C. Plaats buizen die de monsters op een rotator bevatten.
      OPMERKING: voor kleine monsters (<2 x 2 x 2 mm 3 ) kan de tijd die een monster in elke ethanol rust, tot 60 minuten worden gereduceerd. Voor grote monsters (> 5 x 5 x 5 mm 3 ), kan het worden verlengd tot 4 uur.
    4. Voer de volgende infiltratie stappen uit onder een dampkap met beschermende handschoenen.
      1. Bereid de infiltratieoplossing door 1,25 g benzoylperoxide (geplastificeerde katalysator) en 0,4 g eosine toe te voegen aan 100 ml oplossing A (voor meer details zie tabel van materialen ). Roer dit in een beker op een magnetische roerplaat bij 4 ° C totdat eosine en katalysator volledig opgelost zijn (2 - 3 uur).
      2. Plaats de monsters gedurende 12 - 24 uur in de infiltratieoplossing. Houd het bij 4 ° C onder continue schommeling of rotatie. Vervang infiltratie oplossing met verse oplossing na 3 en 12h.
        OPMERKING: Verleng de infiltratie tijd tot 48 uur voor grote embryo's (> 1 cm kroon / kruislengte).
  2. Voorbereiding van volwassen weefselmonsters (tot 5 x 5 x 7 mm 3 )
    1. Bevestig de weefsels in 2% PFA / PBS die 4% carbolzuur bij minstens 4 dagen bij 4 ° C bevat.
      OPMERKING: Weefselmonster uit huid-, lever-, pancreas-, nier-, schildklier-, hart-, gestreepte spieren, hersenen, zenuwen en tumormodellen van verschillende neonatale en volwassen mensen, knaagdieren, varkens, fruitvliegen en zebravissen kunnen in deze oplossing worden opgelost. En vervolgens verwerkt voor HREM imaging (we tonen de vaststelling van de monsters, zie Representatieve resultaten ). Accijns de weefselmonsters met scalpels, scharen of biopsie stoten en zet ze direct in fixatief. Voor fixatie van zenuwweefsel gebruik 4% PFA / PBS.
    2. Verwijder de fixatie en doe het weefsel gedurende 3 tot 6 uur onder stromend kraanwater.
    3. Ontduik de monsters met behulp van latere placZe in 70%, 80%, 90%, 96% ethanol, gemengd met 0,4 g eosine per 100 ml (2 - 3 uur elk). Houd de oplossingen bij monsters bij 4 ° C bij constant roteren of op een rotator.
      OPMERKING: voor kleine monsters (<2 x 2 x 2 mm 3 ) kan de tijd die een monster in elke ethanol rust, tot 60 minuten worden gereduceerd. Voor grote monsters (> 5 x 5 x 5 mm 3 ), kan het worden verlengd tot 4-8 uur.
    4. Voer alle volgende infiltratie stappen uit onder een dampkap met beschermende handschoenen.
      1. Bereid de infiltratieoplossing door 1,25 g benzoylperoxide (geplastificeerde katalysator) en 0,4 g eosine toe te voegen aan 100 ml oplossing A (voor meer details zie tabel van materialen ). Roer een beker op een magnetische roerplaat bij 4 ° C tot de eosine en katalysator volledig opgelost zijn (2 - 3 uur).
      2. Plaats monsters in infiltratieoplossing gedurende 24 - 36 uur. Houd het bij 4 ° C onder continue schommeling of rotatie. Vervang infiltratie oplossing met verse oplossing na 3 en12 uur.
        OPMERKING: Voor grote monsters (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) verleng de infiltratie tijd tot 48 uur.
  3. Voorbereiding van ander organisch materiaal
    OPMERKING: Trim huidvervangers en papier naar de gewenste maat met gewone schaar. Geen fixatie is nodig.
    1. Sla fixatie, was- en uitdrogingstappen over.
    2. Voer alle volgende infiltratie stappen uit onder een dampkap met beschermende handschoenen.
      1. Bereid de infiltratieoplossing door 1,25 g benzoylperoxide (geplastificeerde katalysator) en 0,4 g eosine toe te voegen aan 100 ml oplossing A (voor meer details zie tabel van materialen ). Roer een beker bij 4 ° C op een magnetische roerplaat totdat eosine en katalysator volledig opgelost zijn (2 - 3 uur).
      2. Plaats monsters in infiltratieoplossing gedurende 3 - 12 uur. Houd het bij 4 ° C onder continue schommeling of rotatie. Vervang infiltratie oplossing met verse oplossing na 1 en 2 - 4 uur.
      </ Li>

2. Inbedding

OPMERKING: Voer alle stappen uit onder een dampkap met beschermende handschoenen.

  1. Maak een nieuwe infiltratieoplossing zoals hierboven beschreven (stap 1.1.4.1). Voeg 4 ml oplossing B (voor details, zie Tabel van Materialen ) toe aan 100 ml infiltratieoplossing om de embeddingsoplossing voor te bereiden.
    OPMERKING: als er precieze oriëntatie van het monster in de embeddingvormen nodig is en om de parallelle inbedding van meerdere monsters in te zetten, vertraag de polymerisatie van de voorraadoplossing door de beker in een ijsbad te zetten.
  2. Gebruik gietbakken (voor meer informatie zie Tabel van Materialen ) met matrijzen met een routinevolume van 6 x 8 x 5 mm 3 of 13 x 19 x 5 mm 3 of aangepaste matrijzen met een volume van maximaal 8 x 10 x 15 mm 3 ( figuur 2 ).
  3. Vul de matrijzen met embedding oplossing en overbrengen van het monster in de vorm met behulp vaneen lepel. Tijdens de overdracht moet u ervoor zorgen dat het monster volledig is bedekt met een inbedding oplossing om luchtvallen te vermijden.
    OPMERKING: dit kan bij kamertemperatuur gebeuren, indien onmiddellijk na het verzamelen van de monsters en de embeddingoplossing uit de koelkast gestart.
    1. Richt het monster in de vorm met behulp van naalden of pennen.
    2. Zodra de ingebouwde oplossing viskeus wordt, plaats een blokhouder (zie tabel van materiaal ) bovenop de mal en voeg de inbedding oplossing door het middelste gat van de blokhouder tot de basis van de blokhouder bedekt is met 1 - 2 Mm van inbedding oplossing.
    3. Verzegel de gietbaklade door het met vloeibare paraffinewas te bedekken en wacht tot het verhard is. Als alternatief plaatst u een tweede gietbakje ondersteboven op de gietbak met monsters en afdicht het met kleefband tegen luchtdichtheid.
  4. Laat blokken toe om polymerisatie te voltooien door de verzegelde gietbakken op te slaan voor 1 -2 dagen bij kamertemperatuur.
  5. Voor postpolymerisatieverwerking, plaats de gietbakjes met de gepolymeriseerde blokken in een standaardlaboratoriumoven en bak minimaal 1 tot 2 dagen bij 70 - 80 ° C tot ze donkerrood worden. Breng de bakjes uit de oven en verwijder de blokken uit de vorm.
    OPMERKING: Bakken kan onder normale omgevingsomstandigheden worden uitgevoerd. De afdekgietbak, die in de eerste fase na inbedding luchtdichte afdichting verzekert, kan verwijderd worden om de kleur van de hars na 10 uur te kunnen controleren. Onmiddellijk na het bakken is de hars zacht en kunnen de blokken makkelijk verwijderd worden uit de gietbak. Binnen 2 tot 3 uur zijn ze moeilijk en kunnen ze enkele maanden bij kamertemperatuur worden opgeslagen.

3. Gegevensopwekking

OPMERKING: Het HREM prototype 18 , 25 dat hier wordt gebruikt, omvat de volgende onderdelen: (i) Roterende microtoom met een blokhouderDat stopt na elke snede bij het bovenste keerpunt. (Ii) Standaard, niet-wegwerpbaar microtoommes, hardmetaal, profiel D (voor details, zie Tabel van Materialen ). (Iii) Hoofd van fluorescentiemengselmicroscoop met objectieve revolver en een GFP-filterkubus (excitatie 470/40; emissiefilter 525/50) in zijn optische as. De optische as is loodrecht op het vers gesneden oppervlak van een blok gemonteerd op de microtome en is vastgehouden door een inrichting dat op- en neerwaartse beweging mogelijk maakt. (Iv) Gemotoriseerde kruistafel die de microtome draagt. De tafel kan worden verplaatst in de richting van de optische as en zijdelings. (V) Digitale videocamera bevestigd aan de fluorescerende verbinding microscoop. (Vi) Monochrome lichtbron (470 nm). (Vii) Computer aangesloten op de camera, met data generatie software (voor meer informatie zie Tabel van Materialen ).

  1. Procedure
    1. Geef de regio van belang aan.
      1. Gebruik standaard laboratorium liGht bron (zie tabel van materialen ) om wit licht schuin naar het blokoppervlak te leiden.
      2. Identificeer de omtrek van het ingebedde materiaal als het aan het blokoppervlak projecteert. Duid het gebied van belang en latere zichtveld op het blokoppervlak met behulp van een pen of scheermesje.
        OPMERKING: Deze stap is verplicht om de omvang van het zichtveld te definiëren alvorens de sectie te delen.
    2. Definieer het gebied van de weergave.
      1. Monteer het harsblok met monster op de microtome.
      2. Verplaats de blokhouder naar zijn stoppositie (bovenste keerpunt van de blokhouderuitstap).
      3. Start de digitale camera en data generatie software, en verwerven een live image.
      4. Kies een objectieflens, met een passende vergroting om het gebied van belang op het blokoppervlak te bedekken.
        OPMERKING: Doelstellingen met vergrotingen 2.5X, 5X, 10X, 20X en numerieke diafragma tussen 0,07 en 0,40 worden vaak gebruikt. Verplaats de optiek omhoog en naar beneden en de microtome lateraal met behulp van de gemotoriseerde kruistafel tot het belang van de omgeving overeenkomt met het zichtveld dat op het computerscherm wordt weergegeven.
    3. Focus.
      1. Voer stap voor stap handmatig door tot de eerste structuren van het monster zichtbaar zijn.
      2. Rangschik het blokoppervlak in het focusvlak van de optiek, door de microtome in de richting van de optische as te bewegen.
      3. Kies de sectie dikte; Sectie diktes van 0,5 tot 5 μm worden aanbevolen.
  2. Gegenereerde gegevens en verwerking
    1. Start software routine die sectie- en beeldopname organiseert. Volg de gedocumenteerde instructie van de imaging capture software.
    2. Stop de software routine en stel een schaalglijbaan voor het blokoppervlak zodra het monster volledig is gesneden.
    3. Capture een afbeelding interactief voor latere calibratie.
      OPMERKING: dit moet gebeuren telkens wanneer een object wordt gebruikt in een nieuw geregelde set-up.
    4. Zet de beeldreeks om naar 8 bit grijsschaalbeelden in.jpg-formaat.
    5. Laad de beeldreeks in 3D visualisatie software en stel contrasten aan.
      OPMERKING: Beeldconversie en 3D visualisatie kunnen worden uitgevoerd met diverse commercieel of vrij verkrijgbare standaardsoftwarepakketten, volgens de instructies van de betreffende software.

Representative Results

HREM genereert serie van inherent uitgelijste digitale beelden met contrasten die vergelijkbaar zijn met beelden van hematoxyline / eosin-gekleurde histologische afdelingen. In tegenstelling tot 2D-afbeeldingen maken stapels HREM-afbeeldingen mogelijk voor het visualiseren en analyseren van de weefselarchitectuur, morfologie en topologie van een breed scala aan organische materialen in 3D. Het hoge contrast vergemakkelijkt vaak snelle en eenvoudige 3D-visualisatie van volumegerevenerde computermodellen en semiautomatische contourbevindingen voor het genereren van oppervlakgebaseerde modellen.

De grootte van de HREM-gegevens varieert afhankelijk van de grootte van het cameramodel, de modus van het vastleggen van beelden (8, 12, 16 bit, grijsschaal, kleur) en het aantal single-face-afbeeldingen. Kleiner datasets van 1.000 8-bit.jpg grijze schaalafbeeldingen van 2.048 pixels x 2.048 pixels hebben een grootte van ongeveer 900 MB. Grotere datasets van 3.000 8-bit.jpg grijze schaalafbeeldingen van 4.096 pIxel x 4.096 pixel heeft volumes van ongeveer 20 GB.

De verstrekte protocollen zijn eenvoudig en robuust, en in het laatste decennium waren ze in dienst voor het genereren van HREM data van veel verschillende monsters. Protocolsectie 1.1 is geoptimaliseerd voor de verwerking van hele embryo's van biomedische modelorganen met een lengte van maximaal 1 cm en embryoweefselmonsters met een afmeting van maximaal 5 x 5 x 5 mm 3 ; We hebben deze methode gebruikt voor het produceren van HREM-gegevens van embryo's van de volgende soorten: muis ( Mus musculus) , kuiken ( Gallus gallus ), Zebravis ( Danio Rerio ), Kwartel ( Coturnix Coturnix) , Klauwkikker ( Xenopus laevis ), Paard Equus ferus caballus ), melkweefsel ( Oncopeltus fasciatus ), krokodil ( Crocodylia ) en octopus ( Octopus vulgaris ). De gegevens van alle soorten waren van uitstekende kwaliteit ( bijv . Figuur 3 )

3 en gebruikt voor het visualiseren van weefselmonsters van de Huid-, lever-, pancreas-, nier-, schildklier-, hart-, gestreepte spier-, hersen-, zenuw- en tumormodellen die worden geoogst van mensen ( Homo sapiens ), muizen ( Mus musculus ), ratten ( Rattus norvegicus ), varkens ( Sus scrofa domestica ) Furo ), fruitvlieg ( Drosophila melanogaster ) en zebravis ( Danio rerio ). Hoewel de resultaten uitstekend waren bij de meeste monsters ( bijv . Figuur 4 , Animatie 1 ) bleven de zeer centrale delen van huid (met epidermis) en hersenmonsters groter dan 3 x 3 x 3 mm 3 vaak ongebleekt door onvoldoende penetratie van eosine door Deze weefsels.

Protocol sEctie 1.3 werd geoptimaliseerd voor het verwerken van vezelachtig organisch materiaal en gebruikt voor het visualiseren van de vezelarchitectuur van gecoat papier, niet-bekleed papier, natief dermaal substitutiemateriaal en stamcelzaad dermaal vervangend materiaal. Deze monsters waren gemakkelijk en snel te verwerken. De gegevens van het niet-beklede papier en de meeste huidvervangers waren van goede kwaliteit ( Figuur 5 , Animatie 2 ). Er zijn problemen ondervonden bij het verwerken van het gecoate papier, wanneer het anorganische materiaal belemmerde penetratie van eosine. Er is een ander probleem opgetreden bij het verwerken van de huidvervangers op basis van agar omdat ze gedeeltelijk door de infiltratieoplossing worden verteerd.

Figuur 1
Figuur 1: Workflow. Stappen die in de rode dozen worden getoond, vereisen aanpassingen volgens de steekproefkenmerken. Stappen in de groene dozen zijn die dieZijn vergelijkbaar in alle monsters. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Aangepaste Vormen. Moulds kunnen worden aangepast door een gat in de originele vorm te snijden, de gloeilamp van een Pasteurpipet te plaatsen en te verzegelen met modelmateriaal. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Voorbeelden van gesimboliseerde embryo's. (A, B) Muisembryo geoogst op embryonale dag, E = 9,5. HREM sectie afbeelding wordt getoond in (A) (B) . (C) Virtueel sagittale gedeelte door middel van een volume-gered model van de hals van een E15.5-muis embryo. (D) Kippenembryo bij ontwikkelingshamburger Hamilton (HH) stadium 18. Oppervlakmodel van de luminaire van de cardiovasculaire componenten gecombineerd met volumebeweging van alle embryoweefsels. Schaalstaven = 200 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Voorbeelden van gesynchroniseerde volwassen weefselmonsters. (A) Een deel van een HREM sectie beeld door een menselijke zenuw. Inlay toont een gedeelte van de afbeelding meer in detail. (B) Een deel van een HREM sectie afbeelding via varkenslever. Let op de nuclei. (C) Een deel van een HREM sectie afbeelding van menselijk lymfestisch weefsel. (D, E) Dikke huid van een menselijk duimen. Volume gesmolten 3D-model van de gehele biopsie. (D) Oppervlakte-gereduceerde modellen van slagaders, aderen en zenuwen voor een virtuele resectie via HREM-gegevens (E) . (F) Experimentele tumor in volwassen muisweefsel. Volume gelewer 3D model voor drie virtuele secties via HREM data. Let op de necrotische delen (arrowheads). Schaalstaven = 200 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5: Voorbeelden van gefibreerde vezelmateriaal. (A, B) HREM sectie afbeelding van niet-bekleed, bruin papier. (B) (A) . Let op de vezels en hun lumen. (C) HREM gedeelte van gecoat papier. Merk op dat de vezels onbeschadigd blijven. (D) Volume gesmolten model van naturel dermaal vervangend materiaal. Let op de verschillende kaliber en vorm van de vezels. Schaalstaven = 100 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Film 1
Animatie 1: Volume Gegeven Model van Dikke Huid van een Menselijke Duimstootkussen. De grootte van het weefselblok is ongeveer 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . Voxel grootte is 1,07 x 1,07 x 2 μm 3 . Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)


Animatie 2: Volume Gender Model van Naturel Dermaal Vervangend Materiaal. De grootte van het monster is ongeveer 1,2 x 0,85 x 0,4 mm 3 . Voxel grootte is 0,54 x 0,54 x 2 μm 3 . Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussion

HREM is een zeer robuuste microscopische methode die ideaal is voor het visualiseren van een breed spectrum van organische materialen die in biomedicine en industrie worden gebruikt 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . Het kan gebruikt worden als een exclusieve beeldvormende modaliteit, zoals momenteel gebruikt door het Programma van Ontwikkelingsstoornissen (DMDD) programma 41 , 42 43 , 44 , of als een integratief deel van multimodale beeldpijpleidingen 45 .

Een volledig functionerend HREM data generatie apparaat kan worden samengesteld uit conventionele laboratoriumcomponenten en omvat een gemotoriseerde microtome, microscoop, gemotoriseerde kruistafel en een computer met geschikte software 25 . Het is cruciaal om een ​​microtome te gebruiken die is uitgerust met een blokhouder die reproduceerbaar stopt na elke sectie op een bepaalde positie en GFP filterblokken in de optische weg. Echter, volledig functionerende all-inclusive oplossingen kunnen worden gekocht bij bedrijven zoals Indigo Scientific.

HREM heeft dezelfde beperkingen als alle histologische technieken, behalve dat er geen artefacten worden geïntroduceerd tijdens sectie of sectie montage. Er zijn echter beperkingen, die voortvloeien uit de noodzaak om specimens te vleken alvorens te snijden enVan de eigenschappen van het inbeddingsmateriaal. Penetratie van eosine door het gehele monster is nodig om voldoende weefselcontrasten te verkrijgen; Zeer dicht materiaal, vetweefsels en anorganische stoffen belemmeren eosinpenetratie effectief en dit resulteert in onbeschadigde weefsels in het midden van de voorwerpen. Het gebruik van speciale fixatiemiddelen helpt vlek huidmonsters, maar er is nog steeds geen goede methode om het probleem helemaal te overwinnen. Een andere beperking is dat harsen die hoger zijn dan 2 cm blijken te breken tijdens het snijden. Dit kan gedeeltelijk vermeden worden door de specimens en verwerkingsdelen afzonderlijk te snijden.

Correcte positionering van kleine monsters of monsters met onregelmatige oppervlakken in de matrijzen tijdens het inbedden is vaak problematisch. Om de monsters te behandelen met agarose en het verwerken van de agarose blokken zoals beschreven in het protocol, lost dit probleem gewoonlijk af 19 . Een alternatieve aanpak, die ook helpt als blokken tijdens sectie brekenAan het verwijderen van het reeds geharde blok van zijn houder en opnieuw inbedden, volgens de beschreven inbedding procedure.

Een typische HREM dataset omvat 500 tot 3000 single images. De numerieke resolutie wordt bepaald door de afstand tussen de opeenvolgende beelden ( dwz door sectie dikte), het kenmerk van het camera doel en de eigenschappen van de gebruikte optica. We gebruikten sectie diktes tussen 1 μm en 5 μm en behaalde goede resultaten, hoewel de gepresenteerde protocollen helemaal niet helemaal van de artefacten 20 , 46 schijnen. Deze artefacten worden veroorzaakt door intensief gekleurde weefsels, die diep in het blok liggen, waardoor vervuiling van weefselinformatie op de blokoppervlakken door.

De camera's hadden doeldimensies van 2.560 x 1.920 pixels 2 , 2.048 x 2.048 pixels 2 en 4.096 x 4.096 pixels 2 en waren combiNed met objectieven van 1.25X, 2.5X, 5X, 10X en 20X. Dit resulteerde in numerieke pixelformaten tussen 0,18 x 0,18 μm 2 en 5,92 x 5,92 μm 2 , die voldoende bleek voor 3D analyse van weefselarchitectuur en celvormen, en zelfs voor het visualiseren van kernen. Gezien de hoge numerieke resolutie, moeten andere celorganellen ook zichtbaar zijn. Onvoldoende contrasten door eenvoudige eosinverf, en de optische eigenschappen van de doelstellingen beperken de mogelijkheid om structuren te onderscheiden. De maximale echte ruimtelijke resolutie van de HREM-gegevens, waarbij rekening wordt gehouden met de numerieke diafragma, is ongeveer 1 x 1 x 1 μm 3 en maakt derhalve alleen effectieve discriminatie van structuren groter dan ongeveer 3 x 3 x 3 μm 3 mogelijk .

Een algemeen probleem voor alle digitale beeldvormingstechnieken is de afwijking tussen de grootte van het gezichtsveld, dat het deel van het specimen definieert dat kan worden weergegevenD op het camera doel en de numerieke resolutie van de afbeelding. Hoe groter het gezichtsveld, hoe lager de maximale numerieke resolutie 46 . De HREM-opstelling die hier wordt gebruikt, maakt het mogelijk om HREM-gegevens te genereren met een zichtveld tussen 0,74 x 0,74 mm 2 (20X objectief) weergegeven in een numerieke resolutie van 0,18 x 0,18 μm 2 en 12,12 x 12,12 mm 2 (1.25X objectief) Een numerieke resolutie van 2,96 x 2,96 μm 2 . Alternatieve, gecommercialiseerde set-ups kunnen grotere vakgebieden bieden, maar ten koste van echte resolutie. Desalniettemin leveren ze uitstekende resultaten, zoals duidelijk uit de gegevens die op de homepage van het DMDD-programma 47 worden weergegeven .

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Tim Mohun voor zijn invalubale bijdragen bij het ontwikkelen van HREM en Petra Heffeter voor het leveren van monsters.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JB-4 Plus Embedding Kit Polysciences Europe GmbH 18570-1 includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B
Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177A-3
Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177C-3
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences Europe GmbH 15899-50
Eosin Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma 1A-196
Microtec CUT 4060E rotary microtome
Leica DM LM, fluorescence compound microscope Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
GFP filter set Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H 11090937180000
Motorised cross table Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG KT5-LSMA
Digital video camera SPOT-FLEX Visitron Systems GmbH.
precisExcite High-Power LED Visitron Systems GmbH. light source
VisiView 2.1.4 Visitron Systems GmbH. Image capturing software
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCD Schott AG light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, K. K., Seneviratne, C. A., Ghorai, S. High resolution laser mass spectrometry bioimaging. Methods. 104, 118-126 (2016).
  2. Holzlechner, M., et al. In Situ Characterization of Tissue-Resident Immune Cells by MALDI Mass Spectrometry Imaging. J Proteome Res. 16 (1), 65-76 (2017).
  3. Elsayad, K., et al. Spectrally coded optical nanosectioning (SpecON) with biocompatible metal-dielectric-coated substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20069-20074 (2013).
  4. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29 (12), 700-711 (2013).
  5. Schneider, J. E., et al. High-resolution imaging of normal anatomy, and neural and adrenal malformations in mouse embryos using magnetic resonance microscopy. J Anat. 202 (2), 239-247 (2003).
  6. Sharpe, J. Optical projection tomography as a new tool for studying embryo anatomy. J Anat. 202 (2), 175-181 (2003).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Dev Dyn. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Syed, S. H., Larin, K. V., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Optical coherence tomography for high-resolution imaging of mouse development in utero. J Biomed Opt. 16 (4), 046004 (2011).
  9. Zhang, E. Z., et al. Multimodal photoacoustic and optical coherence tomography scanner using an all optical detection scheme for 3D morphological skin imaging. Biomed Opt Express. 2 (8), 2202-2215 (2011).
  10. Singh, M., et al. Applicability, usability, and limitations of murine embryonic imaging with optical coherence tomography and optical projection tomography. Biomed Opt Express. 7 (6), 2295-2310 (2016).
  11. Weninger, W. J., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-D reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anat Embryol (Berl). 197 (5), 341-348 (1998).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat Genet. 30 (1), 59-65 (2002).
  13. Khairy, K., Keller, P. J. Reconstructing embryonic development. Genesis. 49 (7), 488-513 (2011).
  14. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  15. Berrios-Otero, C. A., Wadghiri, Y. Z., Nieman, B. J., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Three-dimensional micro-MRI analysis of cerebral artery development in mouse embryos. Magn Reson Med. 62 (6), 1431-1439 (2009).
  16. Liu, M., et al. Dual modality optical coherence and whole-body photoacoustic tomography imaging of chick embryos in multiple development stages. Biomed Opt Express. 5 (9), 3150-3159 (2014).
  17. Mohun, T. J., Leong, L. M., Weninger, W. J., Sparrow, D. B. The morphology of heart development in Xenopus laevis. Dev Biol. 218 (1), 74-88 (2000).
  18. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211 (3), 213-221 (2006).
  19. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding Embryos for High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. 2012 (6), 678-680 (2012).
  20. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Weninger, W. J. Visualizing vertebrate embryos with episcopic 3D imaging techniques. ScientificWorldJournal. 9, 1423-1437 (2009).
  21. Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
  22. Adams, D., et al. Bloomsbury report on mouse embryo phenotyping: recommendations from the IMPC workshop on embryonic lethal screening. Dis Model Mech. 6 (3), 571-579 (2013).
  23. Heddleston, J. M., Chew, T. L. Light sheet microscopes: Novel imaging toolbox for visualizing life's processes. Int J Biochem Cell Biol. 80, 119-123 (2016).
  24. Powell, K. A., Wilson, D. 3-dimensional imaging modalities for phenotyping genetically engineered mice. Vet Pathol. 49 (1), 106-115 (2012).
  25. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Kamolz, L. P., Weninger, W. J. High resolution episcopic microscopy - current applications. Current Biotechnology. 1 (4), 281-286 (2012).
  26. Weninger, W. J., Maurer, B., Zendron, B., Dorfmeister, K., Geyer, S. H. Measurements of the diameters of the great arteries and semi-lunar valves of chick and mouse embryos. J Microsc. 234 (2), 173-190 (2009).
  27. Geyer, S. H., Maurer, B., Dirnbacher, K., Weninger, W. J. Dimensions of the great intrathoracic arteries of early mouse fetuses of the C57BL/6J strain. The Open Anatomy Journal. 4 (1), 1-6 (2012).
  28. Geyer, S. H., Maurer, B., Pötz, L., Singh, J., Weninger, W. J. High-Resolution Episcopic Microscopy Data-Based Measurements of the Arteries of Mouse Embryos: Evaluation of Significance and Reproducibility under Routine Conditions. Cells Tissues Organs. 195 (6), 524-534 (2012).
  29. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Some Mice Feature 5th Pharyngeal Arch Arteries and Double-Lumen Aortic Arch Malformations. Cells Tissues Organs. 196 (1), 90-98 (2012).
  30. Kee, H. J., et al. Ret finger protein inhibits muscle differentiation by modulating serum response factor and enhancer of polycomb1. Cell Death Differ. 19 (1), 121-131 (2012).
  31. Geyer, S. H., Nohammer, M. M., Tinhofer, I. E., Weninger, W. J. The dermal arteries of the human thumb pad. J Anat. 223 (6), 603-609 (2013).
  32. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Metric characterization of the aortic arch of early mouse fetuses and of a fetus featuring a double lumen aortic arch malformation. Ann Anat. 195 (2), 175-182 (2013).
  33. Maurer, B., Geyer, S. H., Weninger, W. J. A Chick Embryo With a yet Unclassified Type of Cephalothoracopagus Malformation and a Hypothesis for Explaining its Genesis. Anat Histol Embryol. 42 (3), 191-200 (2013).
  34. Geyer, S. H., et al. High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM): A Tool for Visualizing Skin Biopsies. Microsc Microanal. 20 (5), 1356-1364 (2014).
  35. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis Model Mech. 7 (10), 1143-1152 (2014).
  36. Geyer, S. H., et al. High-resolution episcopic microscopy (HREM): A useful technique for research in wound care. Ann Anat. 197, 3-10 (2015).
  37. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. 229 (2), 314-325 (2016).
  38. Wong, R., Geyer, S., Weninger, W., Guimberteau, J. C., Wong, J. K. The dynamic anatomy and patterning of skin. Exp Dermatol. 25 (2), 92-98 (2016).
  39. Jenner, F., et al. The embryogenesis of the equine femorotibial joint: The equine interzone. Equine Vet J. 47 (5), 620-622 (2015).
  40. Wiedner, M., et al. Simultaneous dermal matrix and autologous split-thickness skin graft transplantation in a porcine wound model: a three-dimensional histological analysis of revascularization. Wound Repair Regen. 22 (6), 749-754 (2014).
  41. Mohun, T., et al. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD): a new programme for phenotyping embryonic lethal mice. Dis Model Mech. 6 (3), 562-566 (2013).
  42. Wilson, R., et al. Highly variable penetrance of abnormal phenotypes in embryonic lethal knockout mice. Wellcome Open Res. 1, 1 (2016).
  43. Wilson, R., McGuire, C., Mohun, T. Deciphering the mechanisms of developmental disorders: phenotype analysis of embryos from mutant mouse lines. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D855-D861 (2016).
  44. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  45. Pieles, G., et al. microMRI-HREM pipeline for high-throughput, high-resolution phenotyping of murine embryos. J Anat. 211 (1), 132-137 (2007).
  46. Weninger, W. J., Geyer, S. H. Episcopic 3D Imaging Methods: Tools for Researching Gene Function. Curr Genomics. 9, 282-289 (2008).
  47. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders: DMDD. , Available from: https://dmdd.org.uk/ (2017).

Tags

Ontwikkelingsbiologie Episcopische imaging 3D modellering embryo biopsie menselijk muis kuiken zebravis kikker
Episcopische Microscopie met hoge resolutie (HREM) - Eenvoudige en robuuste protocollen voor het verwerken en visualiseren van organische materialen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B.,… More

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B., Reissig, L. F., Weninger, W. J. High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials. J. Vis. Exp. (125), e56071, doi:10.3791/56071 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter