Summary
אנו מספקים פרוטוקולים פשוטים וחזקים לעיבוד חומר ביופסיה של מינים שונים, עוברים של אורגניזמים מודל ביו-רפואי ודגימות של רקמות אורגניות אחרות על מנת לאפשר דיגיטלי נפח נתונים הדור עם ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית האפיסקופיים שיטה.
Abstract
אנו מספקים פרוטוקולים פשוטים להפקת נתונים נפח דיגיטלי עם ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית האפיסקופית (HREM) שיטה. HREM מסוגל הדמיה חומרים אורגניים עם כרכים עד 5 x 5 x 7 מ"מ 3 ברזולוציות מספריים טיפוסי בין 1 x 1 x 1 ו 5 x 5 x 5 מיקרומטר 3 . דגימות מוטמעים שרף methacrylate ו חתך על microtome. לאחר כל קטע תמונה של משטח לחסום נתפס עם מצלמת וידאו דיגיטלית שיושב על phototube מחובר הראש מיקרוסקופ המתחם. הציר האופטי עובר דרך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) קוביית מסנן והוא מיושר עם עמדה, שבה זרוע מחזיק בוק מגיע לנוח אחרי כל מקטע. בדרך זו, סדרה של תמונות מיושרות מיסודו מיושר, הצגת משטחי בלוק הבאים מיוצרים. טעינת סדרת תמונות כזו בתוכנת הדמיה תלת מימדית (3D) מאפשרת המרה מיידית לנתוני נפח דיגיטלי, המאפשרים וירטואליזציהEctioning שונים מטוסים אורתוגונליים ו אלכסוני ויצירת נפח ו משטח המחשב שניתנו מודלים. אנו מציגים שלושה פשוטים, רקמות ספציפיות רקמות לעיבוד קבוצות שונות של דגימות אורגניות, כולל עכבר, אפרוח, שליו, צפרדע ועופות זברה דגים, חומר ביופסיה האדם, נייר uncoated והחלפת העור החומר.
Introduction
ניתוח מבני של חומרים אורגניים ואנאורגניים הוא הצעד הראשון בהבנת התכונות הפיזיות שלהם ותפקודם. הבסיס לאנליזה כזו הוא מידע דו מימדי (2D) שנרכש על ידי התבוננות זהירה בקטעים היסטולוגיים, עם מגוון שיטות דימות פשוטות ומתוחכמות המפיקות פרטים על ארכיטקטורת רקמות, מורפולוגיה של תאים וטופולוגיה, הרכב מולקולרי ותכונות ביומכניות 1 , 2 , 3 . עם זאת, מידע דו-ממדי אינו מתאים לחקר הסדרים מורכבים מרחביים. לפיכך מספר גדל והולך של vivo ו vivo שיטות לשעבר המאפשרים את הדור של נפח נתונים דיגיטליים הוקמו בעשורים האחרונים 4 ועוד רבים נמצאים בפיתוח.
העיקרון השיטתי של רוב שיטות הדור נתונים הוא הדור של ערימות וירטואליותשל תמונות דיגיטליות המציגות קטעים שנרכשו על ידי חתך וירטואלי או פיזי של אובייקט. אם תמונות הקטעים מיושרות כהלכה, הדבר יוצר אמצעי אחסון, וניתן לחלק אותו מחדש במטוסי מקטע וירטואלי, או להשתמש בו ליצירת מודלים תלת-ממדיים של שטח ונפח. טכניקות פופולריות לדמיין בני אדם ודגימות ביולוגיות גדולות יותר הם טומוגרפיית תהודה מגנטית (MRT), טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) וטומוגרפיה ממוחשבת של פוטון בודד (SPECT). הדגימות הקטנות מדמיינות בדרך כלל באמצעות הדמיית תהודה מיקרו-מגנטית (μMRI), טומוגרפיה של הקרנת אופטי (OPT), טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית (OCT), טומוגרפיה פוטוקוסטית (PAT), שיטות היסטולוגיות המבוססות על חתכים היסטוריים, מיקרוסקופיה קונפוקלית וטומוגרפיה אלקטרונית 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10
טכניקה חדשה יחסית ליצירת נתונים, המייצרת נתונים דיגיטליים של דגימות קטנות ודגימות רקמות היסטולוגיות, היא שיטת ה- HREM, שפותחה בשיתוף פעולה הדוק עם טים מוהון 18 , 19 . זוהי טכניקה פשוטה המבוססת מיקרוסקופ, אשר מייצר נתונים נפח דיגיטלי של חומר מוטבע שרף כי הוא מחולק על microtome. הנתונים מאפשרים ניתוח מפורט של ארכיטקטורת רקמות והפצות התא, כמו גם ניתוח מטרי של תכונות קטנות על רמת מיקרוסקופית אור ביניים.
HREM מייצרת ערימות של תמונות דיגיטליות מיושרות מטבען המופיעות כאילו נלכדו מ- eאוסטין חלקים היסטולוגיים מוכתמים. ניגודיות רקמות ונתונים ברזולוציה ביחס שדה הראייה עולה על הנתונים של מיוצר עם μCT, μMRI, ו OPT, אבל הם נמוכים יותר מאשר זה אפשרי עם confocal, גיליון אור מיקרוסקופית אלקטרונים 20 . עם זאת, בניגוד האחרון, HREM מסוגל לדמיין דגימות עם נפח גדול יחסית של עד 5 x 5 x 7 מ"מ 3 באיכות היסטולוגית. מספר מחקרים שנעשו לאחרונה מספקים אפיונים מפורטים והשוואות בין היתרונות והחסרונות של טכניקות ההדמיה הבודדות, ולשם האובייקטיביות אנו מתייחסים לאלו הנוגעים למידע נוסף על מגבלותיהם ותחומי היישומים האפשריים 4 , 21 , 22 , 23 , 24
מחקר זה מתמקד בשיטת הדמיה של HREM ומטרתו לספקפרוטוקולים פשוטים מאוד להפקת נתונים HREM של קשת רחבה של חומרים אורגניים, כמו גם דוגמאות של היישום שלהם. זרימת העבודה ליצירת נתונים HREM הוא פשוט חל על כל החומרים שיכולים להטביע שרף methacrylate ( איור 1 ). עם זאת, ישנם הבדלים ספציפיים רקמות בהכנת המדגם, כי צריך להיחשב. לכן אנו מספקים שלושה פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת דוגמאות שונות. הטמעה והפקת נתונים פרוטוקול השלבים זהים עבור כולם.
Protocol
כל ההליכים בוצעו על פי הנחיות אתיות באוניברסיטה הרפואית של וינה.
1. הכנה לדוגמא
- הכנת עוברי ורקמות העובר (עד 5 x 5 x 5 מ"מ 3 )
- תקן את העוברים או חלקים של העוברים 4% PFA / PBS או מקבע של בואי ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 16 - 24 שעות תחת נדנדה מתמדת.
הערה: עוברים של כמה מינים ושלבים התפתחותיים שונים ניתן להשתמש, כגון דג הזברה 48 שעות, 19 ח 'חומוס שליו, וגם עוברי עכבר טרום לידתי, אשר שימשו כאן (ראה נציג תוצאות ). הדגימות נקצרו והועברו לתוך PBS בטמפרטורת החדר עבור הזמני, לפני שהם הוכנסו למקבע. במידת הצורך, לקצץ את הדגימות עם מיקרו מספריים או אזמלים לפני קיבוע כדי להשתלב תבניות embedding. - הסר את מקבע ולשטוף את רקמת העובר PBS ב 4 מעלות צלזיוס תחת סלע מתמידG עבור 24 שעות (2-3 שינויים).
- מייבשים את דגימות 70%, 80%, 90%, אתנול 96% ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 שעות כל אחד. מקום צינורות המכילים את דגימות על rotator.
הערה: עבור דוגמאות קטנות (<2 x 2 x 2 מ"מ 3 ), הזמן מדגם מוטלת בכל אתנול עשוי להיות מופחת ל 60 דקות. עבור דגימות גדולות (> 5 x 5 x 5 מ"מ 3 ), זה יכול להיות מורחבת עד 4 שעות. - בצע את השלבים חדירה מתחת למכסה המנוע קטר מגן כפפות מגן.
- הכן את הפתרון חדירת ידי הוספת 1.25 גרם benzoyl חמצן (זרז מפלסטיק) ו 0.4 גרם eosin ל 100 מ"ל של פתרון A (לפרטים נוספים, ראה טבלה של חומרים ). מערבבים את זה בכוס על צלחת מגש מגנטי על 4 מעלות צלזיוס עד eosin ו זרז נמסים לחלוטין (2 - 3 שעות).
- מניחים את דגימות עבור 12-24 שעות בפתרון חדירה. שמור את זה על 4 מעלות צלזיוס תחת נדנדה או סיבוב רציף. החלף פתרון חדירה עם פתרון טרי לאחר 3 ו -12ח.
הערה: הארך את זמן ההסתננות ל -48 שעות לעוברים גדולים (אורך 1 ס"מ לכתר / אורך).
- תקן את העוברים או חלקים של העוברים 4% PFA / PBS או מקבע של בואי ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 16 - 24 שעות תחת נדנדה מתמדת.
- הכנת דגימות רקמות למבוגרים (עד 5 x 5 x 7 מ"מ 3 )
- תקן את הרקמות 2% PFA / PBS המכיל 4% חומצה carbolic ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים לפחות.
הערה: מדגם רקמות הנובע מעור, כבד, לבלב, כליה, בלוטת התריס, לב, שרירים מופשטים, מוח, עצבים ודגמי גידול של כמה בני אדם, מכרסמים, חזירים, זבובי פירות ודגי זברה. ולאחר מכן מעובד עבור הדמיה HREM (אנו מדגימים את תיקון הדגימות, ראה נציג תוצאות ). הבלו את דגימות רקמות עם אזמלים, מספריים או אגרופים ביופסיה ישירות להעביר אותם מקבע. עבור קיבעון של רקמות עצבים להשתמש 4% PFA / PBS. - הסר את מקבע ולשטוף את הרקמה תחת מי ברז זורמת עבור 3-6 שעות.
- לייבש את הדגימות על ידי לאחר מכן placIng אותם 70%, 80%, 90%, 96% אתנול, מעורבב עם 0.4 גרם eosin לכל 100 מ"ל (2 - 3 שעות כל). שמור את הפתרונות עם דגימות על 4 מעלות צלזיוס תחת נדנדה מתמדת או על rotator.
הערה: עבור דוגמאות קטנות (<2 x 2 x 2 מ"מ 3 ), הזמן מדגם מוטלת בכל אתנול עשוי להיות מופחת ל 60 דקות. עבור דוגמאות גדולות (> 5 x 5 x 5 מ"מ 3 ), זה יכול להיות המורחבת ל 4-8 ח. - בצע את כל השלבים חדירה מתחת למכסה המנוע קטר מגן כפפות מגן.
- הכן את הפתרון חדירת ידי הוספת 1.25 גרם benzoyl חמצן (זרז מפלסטיק) ו 0.4 גרם eosin ל 100 מ"ל של פתרון A (לפרטים נוספים, ראה טבלה של חומרים ). מערבבים בכוס על צלחת מגש מגנטי ב 4 ° C עד eosin ו זרז נמסים לחלוטין (2 - 3 שעות).
- המקום דגימות בפתרון חדירה עבור 24 - 36 ח. שמור את זה על 4 מעלות צלזיוס תחת נדנדה או סיבוב רציף. החלף פתרון חדירה עם פתרון טרי לאחר 3 ו -12 ח.
הערה: עבור דוגמאות גדולות (> 5 x 5 x 5 מ"מ 3 ) להאריך את זמן ההסתננות ל 48 h.
- תקן את הרקמות 2% PFA / PBS המכיל 4% חומצה carbolic ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים לפחות.
- הכנת חומר אורגני אחר
הערה: חתוך את תחליפי העור ואת הנייר לגודל הרצוי במספריים רגילים. לא נדרשת קיבוע.- דלג על קיבוע, כביסה וייבוש צעדים.
- בצע את כל השלבים חדירה מתחת למכסה המנוע קטר מגן כפפות מגן.
- הכן את הפתרון חדירת ידי הוספת 1.25 גרם benzoyl חמצן (זרז מפלסטיק) ו 0.4 גרם eosin ל 100 מ"ל של פתרון A (לפרטים נוספים, ראה טבלה של חומרים ). מערבבים בכוס על 4 מעלות צלזיוס על צלחת מגנטית מגנטי עד eosin ו זרז נמסים לחלוטין (2 - 3 שעות).
- דגימות המקום פתרון חדירה עבור 3-12 שעות. שמור את זה על 4 מעלות צלזיוס תחת נדנדה או סיבוב רציף. החלף פתרון הסתננות עם פתרון טרי לאחר 1 ו - 2 ח.
2. הטבעה
הערה: בצע את כל השלבים תחת מכסה המנוע קטר מגן כפפות מגן.
- הכן פתרון חדירת טריים כמתואר לעיל (שלב 1.1.4.1). הוסף 4 מ"ל פתרון B (לפרטים, ראה טבלה של חומרים ) ל 100 פתרון חדירה מ"ל כדי להכין את הפתרון הטבעת.
הערה: אם הכיוון המדויק של הדגימה בתבניות הטבעה נדרש כדי לאפשר הטבעה של מספר דגימות במקביל, להאט את פילמור של פתרון המניות על ידי הצבת את הכוס לתוך הקרח. - השתמש במגשי ספירלה (לפרטים, ראה טבלה של חומרים ) עם תבניות שיש נפח שגרתי של 6 x 8 x 5 מ"מ 3 או 13 x 19 x 5 מ"מ 3 , או תבניות מותאמות אישית עם כרכים של עד 8 x 10 x 15 מ"מ 3 ( איור 2 ).
- ממלאים את התבניות עם פתרון embedding ולהעביר את המדגם לתוך עובש באמצעותכף. במהלך ההעברה להבטיח כי המדגם מכוסה במלואו עם פתרון הטבעה כדי למנוע השמנה האוויר.
הערה: ניתן לעשות זאת בטמפרטורת החדר, אם החל מיד לאחר איסוף הדגימות ופתרון הטבעת מהמקרר.- אוריינט המדגם בתוך עובש באמצעות מחטים או מלקחיים.
- ברגע פתרון הטבעה מתחיל להיות צמיג, במקום מחזיק בלוק (ראה טבלה של חומרים ) על גבי עובש ולהוסיף פתרון הטבעה דרך החור המרכזי של בעל הבלוק עד הבסיס של בעל בלוק מכוסה 1 - 2 מ"מ של פתרון הטבעה.
- חותם את מגש כוס דפוס על ידי כיסוי זה עם שעווה פרפין נוזלי לחכות עד זה התקשה. לחלופין במקום השני דפוס דפוס מגש הפוך על מגש כוס דפוס עם דגימות חותם אותו עם סרט דביק כדי הוכחה אוויר.
- אפשר בלוקים כדי לסיים את פילמור על ידי אחסון מגשים כוסות דפוס אטום עבור 1 -2 ימים בטמפרטורת החדר.
- לעיבוד לאחר פילמור, במקום מגשים כוס דפוס עם בלוקים ממוחזרים בתנור במעבדה רגילה ואופים ב 70 - 80 מעלות צלזיוס למשך מינימום של 1 - 2 ימים עד שהם הופכים אדום כהה. לאסוף את המגשים מהתנור ולהסיר את אבני מן התבנית.
הערה: אפייה יכולה להיעשות בתנאים סביבתיים רגילים. מגש כוס כיסוי דפוס, אשר מבטיח איטום אטום בשלב הראשון לאחר הטבעה, ניתן להסיר כדי לאפשר בדיקת צבע של שרף לאחר 10 שעות. מיד לאחר האפייה, שרף רך בלוקים ניתן להסיר בקלות מגש כוס דפוס. בתוך 2 - 3 שעות הם קשים ויכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.
3. יצירת נתונים
הערה: אב טיפוס HRM 18 , 25 המשמש כאן כולל את הפריטים הבאים: (i) microtome סיבובית עם בעל בלוקזה מפסיק אחרי כל חתך בנקודת המפנה העליונה שלה. (2) סכין מיקרוטומה לא סטנדרטית, מתכת קשה, פרופיל D (לפרטים ראה טבלת חומרים ). (Iii) ראש מיקרוסקופ פלואורסצנטי התרכובת עם אקדח מטרה קוביית GFP-Filter (עירור 470/40, מסנן פליטה 525/50) בציר האופטי שלה. הציר האופטי מסודר בניצב למשטח החתוך טרי של בלוק מותקן על המיקרוטום והוא מוחזק על ידי מכשיר המאפשר תנועה מעלה ומטה. (Iv) לוח צולב ממונע הנושא את המיקרוטום. ניתן להעביר את הטבלה לכיוון הציר האופטי ולרוחב. (V) מצלמת וידאו דיגיטלית המצורפת מיקרוסקופ פלורסנט המתחם. (Vi) מקור אור מונוכרום (470 ננומטר). (Vii) מחשב המחובר למצלמה, עם תוכנת יצירת נתונים (לפרטים ראה טבלת חומרים ).
- תהליך
- ציין את אזור העניין.
- השתמש Li רגיל במעבדהGHT מקור (ראה טבלה של חומרים ) עבור הפניית אור לבן בעקיפין על פני השטח לחסום.
- לזהות את קווי המתאר של החומר מוטבע כפי שהוא פרויקטים על פני השטח לחסום. ציין את האזור של עניין שדה מאוחר יותר של נוף על משטח לחסום באמצעות עט או סכין גילוח.
הערה: שלב זה הוא חובה להגדיר את היקף שדה הראייה לפני החתך.
- הגדר את שדה התצוגה.
- הר גוש שרף עם מדגם על microtome.
- העבר את בעל הבלוק למצב העוצר שלו (נקודת המפנה העליונה של טיול בעל הבלוק).
- הפעל את המצלמה הדיגיטלית ואת תוכנת הדור נתונים, ולרכוש תמונה חיה.
- בחר עדשה אובייקטיבית, עם הגדלה מתאימה כדי לכסות את האזור של עניין המצוין על פני השטח לחסום.
הערה: מטרות עם הגדלות 2.5X, 5X, 10X, 20X ו פתחים מספריים בין 0.07 ו 0.40 נפוץ. להזיז את האופטיקה מעלה ומטה ואת microtome רוחבית באמצעות שולחן הצלב ממונע עד אזור העניין תואם עם שדה התצוגה המוצגת על מסך המחשב.
- מוֹקֵד.
- בצע צעד אחר צעד ידני חתך עד המבנים הראשונים של המדגם להיות גלוי.
- מסדרים את משטח החסימה במישור המיקוד של האופטיקה, על ידי הזזת המיקרוטום לכיוון הציר האופטי.
- בחר עובי סעיף; עובי סעיף 0.5-0 מיקרומטר מומלץ.
- ציין את אזור העניין.
- ייצור ועיבוד נתונים
- הפעל את שגרת התוכנה כי תזמור חתך ותמונה לכידת. בצע את ההוראה המתועדת של תוכנת לכידת הדמיה.
- עצור שגרת תוכנה והכניס שקופית קנה מידה מול משטח לחסום ברגע המדגם מחולק לחלוטין.
- צלם תמונה באופן אינטראקטיבי עבור קליברה מאוחרת יותרTion.
הערה: זה חייב להיעשות בכל פעם אובייקט משמש להגדיר מסודרים החדש. - המר את סדרת התמונות ל 8 ביט אפור בקנה מידה תמונות בפורמט.
- טען סדרת תמונות לתוך תוכנת הדמיה 3D ולהתאים ניגודים.
הערה: ניתן לבצע המרת תמונות והדמיה תלת-ממדית עם חבילות תוכנה סטנדרטיות שונות או זמינות באופן חופשי, בהתאם להוראות התוכנה המתאימה.
Representative Results
HREM מייצר סדרה של תמונות מיושרות מיושר באופן טבעי עם ניגודים דומים לתמונות של hematoxylin / eosin קטעים היסטולוגית מוכתמים. בניגוד תמונות סעיף 2D, ערימות של תמונות HREM לאפשר הדמיה וניתוח של ארכיטקטורת רקמות, מורפולוגיה, טופולוגיה של מגוון רחב של חומרים אורגניים בתלת מימד. ניגודיות גבוהה לעתים קרובות מאפשר להדמיה מהירה ופשוטה 3D של נפח מודלים המחשב שניתנו ו ממצאי קונטור חצי אוטומטי עבור הדור של מודלים שניתנו על פני השטח.
הגודל של נתוני HREM משתנה בהתאם לגודל של המצלמה היעד, את מצב לכידת תמונות (8, 12, 16 ביט, גודל אפור, צבע) ואת מספר תמונות לחסום בודדים. ערכות נתונים קטנות יותר של 1,000 8-bit.jpg תמונות בקנה מידה אפור של 2,048 פיקסלים x 2,048 פיקסלים יש גודל של כ 900 MB. ערכות נתונים גדולים יותר של 3,000 8-bit.jpg תמונות בקנה מידה אפור של 4,096 p Ixel x 4,096 פיקסלים יש כרכים של כ 20 GB.
הפרוטוקולים הניתנים הם פשוט וחזק, ובמהלך העשור האחרון, הם הועסקו להפקת נתונים HREM של דגימות שונות. פרוטוקול סעיף 1.1 מותאם במיוחד לעיבוד עוברי שלם של אורגניזמים מודל ביו-רפואי עם אורך של עד 1 ס"מ דגימות רקמת עוברי עם מימד של עד 5 x 5 x 5 מ"מ 3 ; השתמשנו בשיטה זו להפקת נתוני HREM של העוברים הבאים: עכבר ( Mus musculus) , אפרוח ( Gallus gallus ), זברה דג ( Danio rerio ), שליו ( Coturnix coturnix) , צפרדע צפרדע אפריקה ( Xenopus laevis ), סוס ( Equus ferus caballus ), באג חלבון ( Oncopeltus fasciatus ), תנין ( Crocodylia ), תמנון ( אוקטופוס vulgaris ). הנתונים של כל המינים היו באיכות מעולה ( למשל , איור 3 )
= "פרוטוקול סעיף 1.2 היה מותאם במיוחד לעיבוד דגימות רקמות לנוער ומבוגרים עם מידות של עד 5 x 5 x 7 מ"מ 3 ו מועסקים לדמיין דגימות רקמות של העור, הכבד, הלבלב, הכליות, בלוטת התריס, הלב, שרירים מופשטים, מוח, עצבים ודגמי גידול שנלקחו מאדם ( הומו סאפיינס ), עכברים ( Mus musculus ), חולדות ( Rattus norvegicus ), חזירים ( Sus scrofa domestica ) Furo ), זבוב פירות ( תסיסנית melanogaster ), זברה דג ( Danio rerio ). בעוד שהתוצאות היו מצוינות עם רוב הדגימות ( למשל , איור 4 , הנפשה 1 ), החלקים המרכזיים של העור (עם האפידרמיס) ודגימות מוח גדולות מ -3 x 3 x 3 מ"מ 3 נותרו ללא תלות בשל חוסר חדירה מספיק של eosin אלה רקמות.
פרוטוקול sEction 1.3 היה מותאם במיוחד לעיבוד חומר סיבי אורגני מועסקים דמיינו את ארכיטקטורת סיבים של נייר מצופה, נייר uncoated, חומר תחליפי יליד ותאי גזע זרע חומר תחליף זרע. דגימות אלה היו קלים ומהירים לעבד. הנתונים של הנייר uncoated ואת רוב תחליפי העור היו באיכות טובה ( איור 5 , אנימציה 2 ). בעיות התרחשו בעיבוד נייר מצופה, כאשר החומר האורגני הפריע חדירה של eosin. בעיה נוספת התרחשה בעת עיבוד תחליפי העור על בסיס אגר כי הם נעשו חלקית על ידי פתרון חדירה.
איור 1: זרימת עבודה. השלבים המוצגים בתיבות האדומות מחייבים שינויים בהתאם למאפייני המדגם. צעדים בתיבות הירוק הם אלהדומים בכל הדגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תבניות מותאמות אישית. Moulds ניתן להתאים על ידי חיתוך חור לתוך התבנית המקורית, החדרת הנורה של pipet פסטר ואטימתו עם חומר הדוגמנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: עוברי דמיינו באופן זמני. (A, B) העובר עכבר שנקצרו ביום עובריים, E = 9.5. תמונת סעיף HRM מוצגת ב (א) (B) . (ג) קטע sagittal וירטואלי באמצעות נפח שניתנו מודל של הצוואר של העובר העכבר E15.5. (ד) חומוס חומוס ב המבורגר המילטון התפתחותי (HH) שלב 18. מודל השטח של לומינה של רכיבים קרדיווסקולריים בשילוב עם טיוח נפח של כל רקמות העובר. סולם ברים = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: דוגמאות דגימות רקמות למבוגרים בלבד. (א) חלק מקטע תמונה HREM דרך עצב אנושי. Inlay מראה קטע מהתמונה ביתר פירוט. (ב) חלק של תמונת סעיף HREM דרך כבד חזירי. הערה nאוקלי. (ג) חלק של תמונת סעיף HRM של רקמה אנושית הלימפה. (D, E) עור עבה של כרית אגודל אנושית. נפח שניתנו מודל 3D של הביופסיה כולה. (ד) משטח שניתנו מודלים של עורקים, ורידים, ועצבים מול כריתה וירטואלית באמצעות נתונים HREM (E) . (F) גידול ניסיוני ברקמת העכבר הבוגרת. נפח שניתנו מודל 3D מול שלושה סעיפים וירטואליים באמצעות נתונים HREM. שים לב לחלקים הנרוטיים (ראשי חץ). סולם ברים = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: חומר סיבי דמיינו. (A, B) תמונה HRM סעיף של נייר חום, ללא ציפוי. (ב) Trong> מראה קטע של (A) . הערה סיבים לומן שלהם. (C) סעיף HRM של נייר מצופה. שים לב כי סיבים להישאר בלא כתם. (ד) נפח שניתנו מודל של חומר תחליפי יליד. שימו לב לקליבר ולצורה השונים של הסיבים. סולם ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
אנימציה 1: נפח הנפוץ מודל של עור עבה של האדם Thumb Pad. גודלו של גוש הרקמה הוא כ 4.2 x 2.7 x 2.7 מ"מ 3 . גודל Voxel הוא 1.07 x 1.07 x 2 מיקרומטר 3 . לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).
Class = "jove_content" עבור: keep-together.within-page = "1"> 
אנימציה 2: נפח הנפוץ מודל של חומר תחליף דרמטי הילידים. גודל המדגם הוא כ 1.2 x 0.85 x 0.4 מ"מ 3 . גודל Voxel הוא 0.54 x 0.54 x 2 מיקרומטר 3 . לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).
Discussion
HRM היא שיטה מיקרוסקופית חזקה ביותר, אשר אידיאלית לחזות מגוון רחב של חומרים אורגניים המשמשים ביו-רפואה ותעשייה 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . זה יכול להיות מועסק כמודל הדמיה בלעדי, כפי המשמש כיום על ידי מנגנוני הפרעות התפתחותיות (DMDD) תוכנית 41 , 42
ניתן לתפקד במנגנון מלא של ייצור נתוני ה- HREM, המרכיבים את רכיבי המעבדה הקונבנציונאליים, וכולל מיקרו-טום ממונע, מיקרוסקופ, טבלת צלב ממונע, מחשב עם תוכנה מתאימה 25 . זה קריטי להשתמש microtome מצויד בעל בלוק כי reproducibly מפסיק לאחר כל קטע במיקום מוגדר קוביות GFP מסנן בתוך המסלול האופטי. עם זאת, מלא תפקוד כלול פתרונות ניתן לרכוש מחברות כגון אינדיגו מדעי.
HREM פונה למגבלות כמו כל טכניקות היסטולוגית, אלא כי אין חפצים מוצגים במהלך חתך או הרכבה החלק. עם זאת, ישנן מגבלות, הנובעות מן הצורך דגימות כתם לפני חתך ומן המאפיינים של חומר הטבעה. חדירה של eosin דרך הדגימה כולה נדרש לקבלת ניגודים רקמות מספיק; חומר צפוף מאוד, רקמות שומן וחומרים אנאורגניים מעכבים ביעילות חדירת חנקן, וכתוצאה מכך ברקמות לא מוכתמות במרכז האובייקטים. שימוש מיוחד fixatives מסייע כתמי העור הכתם, אבל עדיין אין שיטה נכונה להתגבר באופן מלא על הבעיה. מגבלה נוספת היא שרפים שחוסמים יותר מ -2 ס"מ נוטים לשבור במהלך החתך. זה יכול להיות נמנע בחלקו על ידי חיתוך דגימות ועיבוד חלקים בנפרד.
מיקום נכון של דגימות קטנות או דגימות עם משטחים לא סדירים בתבניות במהלך הטבעה הוא לעתים קרובות בעייתי. כיסוי דגימות עם agarose ועיבוד בלוקים agarose כמתואר בפרוטוקול בדרך כלל פותר בעיה זו 19 . גישה חלופית, אשר גם עוזר אם בלוקים לשבור במהלך כתותOning, היא להסיר את בלוק מוקשה כבר מן המחזיק שלה להטביע אותו מחדש, בעקבות הליך הטבעה המתואר.
מערך נתונים טיפוסי של HREM כולל 500 עד 3,000 תמונות בודדות. הרזולוציה המספרי שלה נקבעת על ידי המרחק בין הדימויים הרצופים ( כלומר , לפי עובי העומק), המאפיין של יעד המצלמה, ומאפייני האופטיקה המנוצלת. השתמשנו בסעיף עובי בין 1 מיקרומטר ו 5 מיקרומטר והשיג תוצאות טובות, למרות הפרוטוקולים המוצגים לא לגמרי לחסל נוצץ מן חפצים 20 , 46 . ממצאים אלה נגרמים על ידי רקמות מוכתמת עמוק הממוקם עמוק בתוך הבלוק, וכתוצאה מכך טשטוש של מידע רקמות על משטחים לחסום על ידי.
המצלמות היו מימדים היעד של 2,560 x 1,920 פיקסלים 2 , 2,048 x 2,048 פיקסלים 2 , ו 4,096 x 4,096 פיקסלים 2 ו היו combiעם עדשות 1.25X, 2.5X, 5X, 10X ו 20X. זה הביא גדלים פיקסלים מספריים בין 0.18 x 0.18 מיקרומטר 2 ו 5.92 x 5.92 מיקרומטר 2 , אשר הוכיח להיות מספיק לניתוח 3D של ארכיטקטורת רקמות וצורות התא, ואפילו עבור חזותי גרעינים. בהתחשב ברזולוציה נומרית גבוהה, אחרים organelles התא צריך להיות גלוי גם כן. בניגוד מספיק בשל מכתים eosin פשוט, ואת התכונות האופטיות של מטרות להפחית באופן דרמטי את האפשרות להפלות מבנים. רזולוציה מרחבית אמיתית מקסימלית של נתוני HREM, אשר לוקח בחשבון את הצמצם המספרי, הוא כ 1 x 1 x 1 מיקרומטר 3 , ולכן רק מאפשר אפליה יעילה של מבנים גדולים יותר מאשר על 3 x 3 x 3 מיקרומטר 3 .
בעיה נפוצה לכל טכניקות הדמיה דיגיטליות היא הפער בין גודל שדה הראייה, המגדיר את החלק של הדגימה שניתן להציגD על היעד המצלמה, ואת הרזולוציה המספרי של התמונה. ככל ששדה הראייה גדול יותר, כך הרזולוציה המרבית האפשרית המרבית 46 . הגדרת HRM המשמשת כאן מאפשרת את יצירת נתוני HREM עם שדה תצוגה בין 0.74 x 0.74 מ"מ 2 (המטרה 20X) המוצגים ברזולוציה נומרית של 0.18 x 0.18 מיקרומטר 2 ו 12.12 x 12.12 מ"מ 2 (1.25X אובייקטיבי) המוצגים ב רזולוציה נומרית של 2.96 x 2.96 מיקרומטר 2 . חלופות מסחריות חלופיות יכולות לספק שדות גדולים יותר של תצוגות, אך במחיר של רזולוציה אמיתית. עם זאת, הם מספקים תוצאות מצוינות, כפי שניתן לראות מן הנתונים המוצגים בדף הבית של תוכנית DMDD 47 .
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
המחברים מודים טים מוהון על תרומות שלו invalubale בפיתוח HREM ו פטרה חפר למתן דוגמאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JB-4 Plus Embedding Kit | Polysciences Europe GmbH | 18570-1 | includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B |
| Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177A-3 | |
| Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177C-3 | |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences Europe GmbH | 15899-50 | |
| Eosin | Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma | 1A-196 | |
| Microtec CUT 4060E | rotary microtome | ||
| Leica DM LM, fluorescence compound microscope | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
| GFP filter set | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | 11090937180000 | |
| Motorised cross table | Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG | KT5-LSMA | |
| Digital video camera SPOT-FLEX | Visitron Systems GmbH. | ||
| precisExcite High-Power LED | Visitron Systems GmbH. | light source | |
| VisiView 2.1.4 | Visitron Systems GmbH. | Image capturing software | |
| Hard metal knife (tungsten carbide), profile D | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
| KL 2500 LCD | Schott AG | light source |
References
- Murray, K. K., Seneviratne, C. A., Ghorai, S. High resolution laser mass spectrometry bioimaging. Methods. 104, 118-126 (2016).
- Holzlechner, M., et al. In Situ Characterization of Tissue-Resident Immune Cells by MALDI Mass Spectrometry Imaging. J Proteome Res. 16 (1), 65-76 (2017).
- Elsayad, K., et al. Spectrally coded optical nanosectioning (SpecON) with biocompatible metal-dielectric-coated substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20069-20074 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29 (12), 700-711 (2013).
- Schneider, J. E., et al. High-resolution imaging of normal anatomy, and neural and adrenal malformations in mouse embryos using magnetic resonance microscopy. J Anat. 202 (2), 239-247 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a new tool for studying embryo anatomy. J Anat. 202 (2), 175-181 (2003).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Dev Dyn. 238 (3), 632-640 (2009).
- Syed, S. H., Larin, K. V., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Optical coherence tomography for high-resolution imaging of mouse development in utero. J Biomed Opt. 16 (4), 046004 (2011).
- Zhang, E. Z., et al. Multimodal photoacoustic and optical coherence tomography scanner using an all optical detection scheme for 3D morphological skin imaging. Biomed Opt Express. 2 (8), 2202-2215 (2011).
- Singh, M., et al. Applicability, usability, and limitations of murine embryonic imaging with optical coherence tomography and optical projection tomography. Biomed Opt Express. 7 (6), 2295-2310 (2016).
- Weninger, W. J., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-D reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anat Embryol (Berl). 197 (5), 341-348 (1998).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat Genet. 30 (1), 59-65 (2002).
- Khairy, K., Keller, P. J. Reconstructing embryonic development. Genesis. 49 (7), 488-513 (2011).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Berrios-Otero, C. A., Wadghiri, Y. Z., Nieman, B. J., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Three-dimensional micro-MRI analysis of cerebral artery development in mouse embryos. Magn Reson Med. 62 (6), 1431-1439 (2009).
- Liu, M., et al. Dual modality optical coherence and whole-body photoacoustic tomography imaging of chick embryos in multiple development stages. Biomed Opt Express. 5 (9), 3150-3159 (2014).
- Mohun, T. J., Leong, L. M., Weninger, W. J., Sparrow, D. B. The morphology of heart development in Xenopus laevis. Dev Biol. 218 (1), 74-88 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211 (3), 213-221 (2006).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding Embryos for High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. 2012 (6), 678-680 (2012).
- Geyer, S. H., Mohun, T. J., Weninger, W. J. Visualizing vertebrate embryos with episcopic 3D imaging techniques. ScientificWorldJournal. 9, 1423-1437 (2009).
- Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
- Adams, D., et al. Bloomsbury report on mouse embryo phenotyping: recommendations from the IMPC workshop on embryonic lethal screening. Dis Model Mech. 6 (3), 571-579 (2013).
- Heddleston, J. M., Chew, T. L. Light sheet microscopes: Novel imaging toolbox for visualizing life's processes. Int J Biochem Cell Biol. 80, 119-123 (2016).
- Powell, K. A., Wilson, D. 3-dimensional imaging modalities for phenotyping genetically engineered mice. Vet Pathol. 49 (1), 106-115 (2012).
- Geyer, S. H., Mohun, T. J., Kamolz, L. P., Weninger, W. J. High resolution episcopic microscopy - current applications. Current Biotechnology. 1 (4), 281-286 (2012).
- Weninger, W. J., Maurer, B., Zendron, B., Dorfmeister, K., Geyer, S. H. Measurements of the diameters of the great arteries and semi-lunar valves of chick and mouse embryos. J Microsc. 234 (2), 173-190 (2009).
- Geyer, S. H., Maurer, B., Dirnbacher, K., Weninger, W. J. Dimensions of the great intrathoracic arteries of early mouse fetuses of the C57BL/6J strain. The Open Anatomy Journal. 4 (1), 1-6 (2012).
- Geyer, S. H., Maurer, B., Pötz, L., Singh, J., Weninger, W. J. High-Resolution Episcopic Microscopy Data-Based Measurements of the Arteries of Mouse Embryos: Evaluation of Significance and Reproducibility under Routine Conditions. Cells Tissues Organs. 195 (6), 524-534 (2012).
- Geyer, S. H., Weninger, W. J. Some Mice Feature 5th Pharyngeal Arch Arteries and Double-Lumen Aortic Arch Malformations. Cells Tissues Organs. 196 (1), 90-98 (2012).
- Kee, H. J., et al. Ret finger protein inhibits muscle differentiation by modulating serum response factor and enhancer of polycomb1. Cell Death Differ. 19 (1), 121-131 (2012).
- Geyer, S. H., Nohammer, M. M., Tinhofer, I. E., Weninger, W. J. The dermal arteries of the human thumb pad. J Anat. 223 (6), 603-609 (2013).
- Geyer, S. H., Weninger, W. J. Metric characterization of the aortic arch of early mouse fetuses and of a fetus featuring a double lumen aortic arch malformation. Ann Anat. 195 (2), 175-182 (2013).
- Maurer, B., Geyer, S. H., Weninger, W. J. A Chick Embryo With a yet Unclassified Type of Cephalothoracopagus Malformation and a Hypothesis for Explaining its Genesis. Anat Histol Embryol. 42 (3), 191-200 (2013).
- Geyer, S. H., et al. High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM): A Tool for Visualizing Skin Biopsies. Microsc Microanal. 20 (5), 1356-1364 (2014).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis Model Mech. 7 (10), 1143-1152 (2014).
- Geyer, S. H., et al. High-resolution episcopic microscopy (HREM): A useful technique for research in wound care. Ann Anat. 197, 3-10 (2015).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. 229 (2), 314-325 (2016).
- Wong, R., Geyer, S., Weninger, W., Guimberteau, J. C., Wong, J. K. The dynamic anatomy and patterning of skin. Exp Dermatol. 25 (2), 92-98 (2016).
- Jenner, F., et al. The embryogenesis of the equine femorotibial joint: The equine interzone. Equine Vet J. 47 (5), 620-622 (2015).
- Wiedner, M., et al. Simultaneous dermal matrix and autologous split-thickness skin graft transplantation in a porcine wound model: a three-dimensional histological analysis of revascularization. Wound Repair Regen. 22 (6), 749-754 (2014).
- Mohun, T., et al. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD): a new programme for phenotyping embryonic lethal mice. Dis Model Mech. 6 (3), 562-566 (2013).
- Wilson, R., et al. Highly variable penetrance of abnormal phenotypes in embryonic lethal knockout mice. Wellcome Open Res. 1, 1 (2016).
- Wilson, R., McGuire, C., Mohun, T. Deciphering the mechanisms of developmental disorders: phenotype analysis of embryos from mutant mouse lines. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D855-D861 (2016).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- Pieles, G., et al. microMRI-HREM pipeline for high-throughput, high-resolution phenotyping of murine embryos. J Anat. 211 (1), 132-137 (2007).
- Weninger, W. J., Geyer, S. H. Episcopic 3D Imaging Methods: Tools for Researching Gene Function. Curr Genomics. 9, 282-289 (2008).
- Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders: DMDD. , Available from: https://dmdd.org.uk/ (2017).
