Summary
우리는 고해상도 각막 현미경 검사법을 사용하여 디지털 볼륨 데이터 생성을 허용하기 위해 다양한 종의 생검 물질, 생체 모델 유기체의 태아 및 기타 유기 조직의 샘플을 처리하기위한 간단하고 견고한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
우리는 고해상도 경상 현미경 (HREM) 방법으로 디지털 볼륨 데이터를 생성하기위한 간단한 프로토콜을 제공합니다. HREM은 1 x 1 x 1과 5 x 5 x 5 μm 3 사이의 일반적인 숫자 해상도에서 최대 5 x 5 x 7 mm 3 까지의 볼륨을 갖는 유기 물질을 이미징 할 수 있습니다. 시편은 메타 크릴 수지에 매립되어 있으며 마이크로톰 (microtome)에 세분화되어있다. 각 섹션 후에 복합 현미경 헤드에 연결된 광 튜브에 위치한 디지털 비디오 카메라로 블록 표면의 이미지를 캡처합니다. 광축은 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터 큐브를 통과하고 각 섹션 이후에 홀더 홀더 암이 안착되는 위치로 정렬됩니다. 이러한 방식으로, 일련의 고유 한 정렬 된 디지털 이미지가 후속 블록 표면을 표시합니다. 이러한 이미지 시리즈를 3 차원 (3D) 시각화 소프트웨어에로드하면 디지털 볼륨 데이터로 즉시 변환 할 수있어 가상 데이터다양한 직각 및 경사면에서의 작업과 볼륨 및 표면 렌더링 컴퓨터 모델의 생성. 우리는 마우스, 병아리, 메추라기, 개구리 및 얼룩 무늬 물고기 배아, 인간 생검 물질, 코팅되지 않은 종이 및 피부 대체 물질을 포함하여 다양한 유기 표본을 처리하기위한 세 가지 간단한 조직 특이 적 프로토콜을 제시합니다.
Introduction
유기 및 무기 재료의 구조 분석은 물리적 특성 및 기능을 이해하는 첫 번째 단계입니다. 이러한 분석의 기초는 조직 구조, 세포 형태 및 토폴로지, 분자 구성 및 생체 역학적 특성의 세부 사항을 추출하는 다양한 간단하고 정교한 이미징 방법을 사용하여 조직학 섹션을 면밀히 관찰하여 얻은 2 차원 (2D) 정보입니다 . 2 , 3 . 그러나 2D 정보는 공간적으로 복잡한 배열을 연구하는 데 적합하지 않습니다. 따라서 지난 수십 년 동안 디지털 볼륨 데이터의 생성을 허용하는 생체 내 및 생체 외 방법의 수가 증가하고 있으며 더 많은 것들이 개발 중입니다.
대부분의 볼륨 데이터 생성 방법의 체계적인 원칙은 가상 스택 생성입니다객체의 가상 또는 물리적 단면으로 얻은 단면을 표시하는 디지털 이미지 섹션 이미지가 올바르게 정렬되면 가상 단면 평면에서 다시 섹션을 만들거나 3D 표면 및 볼륨 렌더링 모델을 만드는 데 사용되는 볼륨이 만들어집니다. 인간과 큰 생물학적 표본을 시각화하기위한 대중적 기술로는 MRT (magnetic resonance tomography), CT (computed tomography), PET (positron emission tomography) 및 SPECT (single-photon emission computed tomography)가 있습니다. 작은 시편은 보통 마이크로 자기 공명 영상 (μMRI), 광학 투영 단층 촬영 (OPT), 광학 단층 촬영 (OCT), 광 음향 단층 촬영 (PAT), 조직 단층 촬영 기반 방법, 공 초점 현미경 검사 및 전자 단층 촬영을 사용하여 시각화됩니다. , 7 , 8 , 9 , 10
작은 표본과 조직 조직 샘플의 디지털 데이터를 생성하는 상대적으로 새로운 볼륨 데이터 생성 기술은 Tim Mohun 18 , 19 와 긴밀히 협력하여 개발 된 HREM 방법입니다. 이것은 마이크로톰에 절편 된 수지 임베디드 재료로부터 디지털 볼륨 데이터를 생성하는 간단한 현미경 기반 기술입니다. 이 데이터는 조직 구조 및 세포 분포에 대한 상세한 분석은 물론 중간 단계의 광학 현미경 수준에서 작은 피쳐의 미터 분석을 용이하게합니다.
HREM은 전자에서 캡처 한 것처럼 보이는 본질적으로 정렬 된 디지털 이미지의 스택을 생성합니다.osin으로 염색 된 조직 절편. 시야에 대한 조직 대조 및 데이터 분석은 μCT, μMRI 및 OPT로 생성 된 데이터의 범위를 초과하지만 공 촛점, 빛 시트 및 전자 현미경으로 달성 할 수있는 것보다 낮습니다. 그러나 후자와 달리 HREM은 5 x 5 x 7 mm 3 의 상대적으로 큰 체적을 가진 표본을 조직 학적으로 시각화 할 수 있습니다. 최근의 여러 연구는 단일 영상 기법의 장점과 단점에 대한 세부적인 특성 분석과 비교를 제공하며, 객관성을 위해 이들의 한계와 응용 분야 4 , 21 , 22 , 23 , 24 .
이 연구는 HREM 이미징 방법에 중점을두고 있으며,광범위 한 유기 물질의 HREM 데이터를 생성하기위한 매우 간단한 프로토콜과 응용 프로그램의 예입니다. HREM 데이터 생성을위한 워크 플로우는 간단하며 메타 크릴 수지에 포함될 수있는 모든 재료에 적용됩니다 ( 그림 1 ). 그러나 시료 준비에는 조직 특이성 차이가 있으므로 고려해야합니다. 따라서 우리는 다양한 시료 준비를위한 세 가지 표준 프로토콜을 제공합니다. 임베딩 및 데이터 생성 프로토콜 단계는 모두 동일합니다.
Protocol
모든 절차는 비엔나 의대 (Medical University of Vienna)의 윤리 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 샘플 준비
- 배아 및 배아 조직 준비 (최대 5 x 5 x 5 mm 3 )
- 배아 또는 배아의 일부를 4 % PFA / PBS 또는 Bouin의 고정액 4 ° C에서 적어도 16 - 24 시간 동안 일정한 요동으로 고정하십시오.
참고 : 여기에 사용 된 48 시간 제브라 피쉬, 19 시간 병아리 및 메추라기, 태아 생쥐 배아와 같은 여러 가지 종 및 다양한 발달 단계의 태아를 사용할 수 있습니다 ( 대표 결과 참조). 표본을 수확하고 고정액에 넣기 전에 실온에서 PBS로 옮겨 담았다. 필요한 경우 고정 금형에 끼우기 전에 마이크로 가위 또는 메스로 시편을 잘라냅니다. - 고정액을 제거하고 PBS에서 배아 조직을 4 ° C로 씻으십시오.g에서 24 시간 동안 (2-3 회).
- 4 ° C에서 2 ~ 3 시간 동안 70 %, 80 %, 90 %, 96 % 에탄올에서 샘플을 탈수하십시오. 시료가 담긴 튜브를 회 전자에 놓으십시오.
참고 : 작은 샘플 (<2 x 2 x 2 mm 3 )의 경우 샘플이 각 에탄올에 머문 시간은 60 분으로 단축 될 수 있습니다. 큰 샘플 (> 5 x 5 x 5 mm 3 )의 경우 4 시간까지 연장 될 수 있습니다. - 보호 장갑을 착용하고 흄 후드 아래의 침투 단계를 수행하십시오.
- 1.25 g의 벤조일 퍼 옥사이드 (가소 화 된 촉매)와 0.4 g 에오신을 100 mL의 용액 A에 첨가하여 침투 용액을 준비하십시오 (자세한 내용은 표 참조). eosin과 촉매가 완전히 녹을 때까지 (2-3 시간) 4 ° C의 자기 교반 판 위에있는 비이커에서 이것을 저어 준다.
- 침투 용액에 시료를 12 ~ 24 시간 동안 두십시오. 4 ° C에서 계속 흔들거나 회전 시키십시오. 3과 12 후에 침투 용액을 새로운 용액으로 교체하십시오.h.
참고 : 큰 배아 (> 1cm 왕관 / 엉덩이 길이)에 대한 침투 시간을 48 시간으로 연장하십시오.
- 배아 또는 배아의 일부를 4 % PFA / PBS 또는 Bouin의 고정액 4 ° C에서 적어도 16 - 24 시간 동안 일정한 요동으로 고정하십시오.
- 성인 조직 샘플 준비 (최대 5 x 5 x 7 mm 3 )
- 적어도 3 일 동안 4 % C 콜린 산이 함유 된 2 % PFA / PBS로 조직을 고정하십시오.
참고 :이 솔루션에서는 피부, 간, 췌장, 신장, 갑상선, 심장, 줄무늬 근육, 뇌, 신경 및 여러 신생아 및 성인 인간, 설치류, 돼지, 초파리 및 얼룩말 어류의 종양 모델에서 유래 한 조직 샘플을 수정할 수 있습니다 HREM 이미징을 위해 처리됩니다 (샘플의 수정본을 보여줍니다, 대표 결과 참조). 메스, 가위 또는 생검 펀치로 조직 샘플을 절단하고 고정액으로 직접 옮깁니다. 신경 조직의 고정을 위해 4 % PFA / PBS를 사용하십시오. - 고정액을 제거하고 흐르는 수돗물에서 조직을 3 ~ 6 시간 동안 씻으십시오.
- 순차적으로 샘플을 탈수100 mL 당 0.4 g 에오신 (각 2-3 시간)과 혼합 된 70 %, 80 %, 90 %, 96 % 에탄올에 넣었다. 4 ° C에서 일정한 흔들림이나 회전 장치로 시료를 보관하십시오.
참고 : 작은 샘플 (<2 x 2 x 2 mm 3 )의 경우 샘플이 각 에탄올에 머문 시간은 60 분으로 단축 될 수 있습니다. 큰 샘플 (> 5 x 5 x 5 mm 3 )의 경우, 4 ~ 8 시간으로 연장 될 수 있습니다. - 보호 장갑을 착용하고 흄 후드 아래의 모든 침투 단계를 수행하십시오.
- 1.25 g의 벤조일 퍼 옥사이드 (가소 화 된 촉매)와 0.4 g 에오신을 100 mL의 Solution A에 첨가하여 침투 용액을 준비하십시오 (자세한 내용은 표 참조). eosin과 촉매가 완전히 녹을 때까지 (2-3 시간) 4 ° C의 자석 교반 판에서 비이커를 저어 준다.
- 24 - 36 시간 동안 침투 용액에 샘플을 놓습니다. 4 ° C에서 계속 흔들거나 회전 시키십시오. 3 일 후에 침투 용액을 새로운 용액으로 교체하십시오.12 시간.
참고 : 큰 시료 (> 5 x 5 x 5 mm 3 )의 경우 침투 시간을 48 시간으로 연장하십시오.
- 적어도 3 일 동안 4 % C 콜린 산이 함유 된 2 % PFA / PBS로 조직을 고정하십시오.
- 다른 유기 물질 준비
참고 : 피부 대용 물과 종이를 일반 가위로 원하는 크기로 자릅니다. 고정이 필요하지 않습니다.- 고정, 수세 및 탈수 단계를 건너 뜁니다.
- 보호 장갑을 착용하고 흄 후드 아래의 모든 침투 단계를 수행하십시오.
- 1.25 g의 벤조일 퍼 옥사이드 (가소 화 된 촉매)와 0.4 g 에오신을 100 mL의 Solution A에 첨가하여 침투 용액을 준비하십시오 (자세한 내용은 표 참조). eosin과 촉매가 완전히 녹을 때까지 (2-3 시간) 자석 교반 판 위에 4 ° C에서 비커를 저어 준다.
- 3 ~ 12 시간 동안 침투 용액에 시료를 놓으십시오. 4 ° C에서 계속 흔들거나 회전 시키십시오. 1과 2 - 4 시간 후에 침투 용액을 새로운 용액으로 교체하십시오.
2. 임베딩
참고 : 보호 장갑을 착용하고 흄 후드 아래에서 모든 단계를 수행하십시오.
- 위에서 설명한대로 신선한 침투 용액을 준비하십시오 (1.1.4.1 단계). 묻힌 솔루션을 준비하기 위해 100 ML 침투 솔루션 4 ML 솔루션 B (자세한 내용은, 테이블을 참조)를 추가합니다.
참고 : 삽입 몰드에서 시험편의 정확한 방향이 필요하고 여러 시료를 평행하게 삽입하려면 비이커를 얼음 욕조에 넣고 스톡 용액의 중합을 느리게하십시오. - 6 x 8 x 5 mm 3 또는 13 x 19 x 5 mm 3 의 일상 용적을 가진 몰드 또는 최대 8 x 10 x 15 mm 크기의 맞춤형 몰드로 성형 컵 트레이 (자세한 내용은 표를 참조하십시오)를 사용하십시오 3 ( 그림 2 ).
- 금형에 임베딩 용액을 채우고 금형에 시료를 옮긴다.숟가락. 이송 도중 시료가 공기 포집을 방지하기위한 임베딩 솔루션으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
참고 : 이것은 샘플을 채취 한 직후에 실온에서 냉장고에서 묻은 용액을 묻히면 시작할 수 있습니다.- 바늘이나 포셉을 사용하여 금형 내부에 샘플을 배치하십시오.
- 매몰 용액이 점성을 나타내 자마자 금형 상단에 블록 홀더 ( 재료 표 참조)를 놓고 블록 홀더의 밑면이 1 - 2로 덮일 때까지 블록 홀더의 중심 구멍을 통해 삽입 용액을 추가합니다 mm 임베딩 솔루션.
- 성형 컵 받침을 액체 파라핀 왁스로 덮어 밀봉하고 경화 될 때까지 기다리십시오. 또는 두 번째 몰딩 컵 트레이를 샘플이 들어있는 몰딩 컵 트레이에 거꾸로 놓고 방습 용 테이프로 밀봉하여 공기를 차단하십시오.
- 밀봉 된 몰딩 컵 트레이를 1 -실온에서 2 일.
- 후 중합 처리를 위해 표준 실험실 오븐에 중합 블록이있는 성형 컵 트레이를 놓고 70-80 ° C에서 최소 1-2 일 동안 베이크하여 진한 빨간색이 될 때까지 구우십시오. 오븐에서 쟁반을 수집하고 금형에서 블록을 제거하십시오.
참고 : 일반적인 환경 조건에서 베이킹을 수행 할 수 있습니다. 묻힌 후 첫 번째 단계에서 기밀 밀봉을 보장하는 덮개 몰딩 컵 트레이는 제거되어 10 시간 후에 수지 색상을 확인할 수 있습니다. 베이킹 직후, 수지는 부드럽고 블록은 성형 컵 트레이로부터 쉽게 제거 될 수있다. 2 ~ 3 시간 내에 그들은 단단하고 수개월 동안 실온에서 저장할 수 있습니다.
3. 데이터 생성
참고 : 여기에 사용 된 HREM 프로토 타입 18 , 25 는 다음 항목으로 구성됩니다. (i) 블록 홀더가있는 회전식 마이크로톰각 커팅 후에 상단 전환점에서 멈 춥니 다. (ii) 표준, 일회용이 아닌 일회용 마이크로톰 나이프, 초경합금, 프로파일 D (자세한 내용 은 재료 표 참조). (iii) 객관적인 리볼버와 GFP- 필터 큐브 (여기 470/40, 방출 필터 525/50)를 광축에 갖는 형광 복합 현미경 헤드. 광축은 마이크로톰에 장착 된 블록의 새롭게 절단 된 표면에 수직으로 배치되고 상하 운동을 허용하는 장치에 의해 고정됩니다. (iv) 마이크로톰을 운반하는 전동 크로스 테이블. 테이블은 광학 축 방향 및 측면 방향으로 이동할 수 있습니다. (v) 형광 현미경에 부착 된 디지털 비디오 카메라. (vi) 단색 광원 (470nm). (vii) 데이터 생성 소프트웨어가있는 카메라에 연결된 컴퓨터 (자세한 내용은 표 참조).
- 순서
- 관심 지역을 표시하십시오.
- 표준 실험실 리를 사용하십시오.백색광을 블록 표면에 비스듬히 향하게하기위한 소스 ( Table of Materials 참조).
- 블록 표면에 투영 될 때 임베디드 재료의 윤곽을 식별합니다. 펜 또는 면도날을 사용하여 관심 영역과 나중에 시야각을 블록 표면에 표시하십시오.
참고 :이 단계는 구분하기 전에 시야 범위를 정의하는 데 필수입니다.
- 시야를 정의하십시오.
- 마이크로톰에 시료가 들어있는 수지 블록을 장착하십시오.
- 블록 홀더를 정지 위치로 이동합니다 (블록 홀더 소풍의 위쪽 전환점).
- 디지털 카메라 및 데이터 생성 소프트웨어를 시작하고 라이브 이미지를 획득하십시오.
- 블록 표면에 표시된 관심 영역을 덮을 적절한 배율로 대물 렌즈를 선택하십시오.
참고 : 배율 2.5X, 5X, 10X, 20X 및 0.07에서 0.40 사이의 숫자 애 퍼처가 일반적으로 사용됩니다. 관심 영역이 컴퓨터 화면에 표시되는 시야와 일치 할 때까지 전동 십자형 테이블을 사용하여 시신경을 위아래로 그리고 마이크로톰을 옆으로 움직입니다.
- 초점.
- 시료의 첫 번째 구조가 보일 때까지 단계별 수동 절편을 수행하십시오.
- 광학 축의 방향으로 마이크로톰을 이동하여 광학 표면의 블록면을 광학 렌즈의 초점면에 정렬하십시오.
- 섹션 두께 선택; 섹션 두께는 0.5 ~ 5 μm가 권장됩니다.
- 관심 지역을 표시하십시오.
- 데이터 생성 및 처리
- 단면 및 이미지 캡처를 조정하는 소프트웨어 루틴을 시작합니다. 이미징 캡쳐 소프트웨어의 문서화 된 지침을 따르십시오.
- 소프트웨어 루틴을 중단하고 샘플이 완전히 구획되면 블록 표면 앞에 스케일 슬라이드를 놓습니다.
- 나중의 캘리브레이션을 위해 대화식으로 이미지 캡처.
참고 : 이는 새롭게 준비된 설정에서 목표가 사용될 때마다 수행되어야합니다. - 이미지 시리즈를 8 비트 그레이 스케일 이미지 in.jpg 형식으로 변환하십시오.
- 이미지 시리즈를 3D 시각화 소프트웨어에로드하고 대비를 조정합니다.
참고 : 이미지 변환 및 3D 시각화는 각 소프트웨어의 지침에 따라 상업적으로 또는 자유롭게 사용 가능한 다양한 표준 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
Representative Results
HREM은 hematoxylin / eosin으로 염색 된 조직 절편의 이미지와 비슷한 대조를 통해 본질적으로 정렬 된 일련의 디지털 이미지를 생성합니다. 2D 단면 이미지와는 달리 HREM 이미지 스택을 사용하면 3D에서 다양한 유기 재료의 조직 구조, 형태 및 토폴로지를 시각화하고 분석 할 수 있습니다. 고 대비는 종종 표면 렌더링 된 모델을 생성하기 위해 볼륨 렌더링 된 컴퓨터 모델 및 반자동 등고선 발견의 빠르고 간단한 3D 시각화를 용이하게합니다.
HREM 데이터의 크기는 카메라 대상의 크기, 이미지 캡처 모드 (8, 12, 16 비트, 그레이 스케일, 컬러) 및 단일 블록 얼굴 이미지의 수에 따라 다릅니다. 2,048 픽셀 x 2,048 픽셀의 1,000 8 비트 .jpg 그레이 스케일 이미지의 더 작은 데이터 세트는 약 900MB 크기입니다. 4,096 p의 3,000 8 비트 .jpg 그레이 스케일 이미지의 더 큰 데이터 세트ixel x 4,096 픽셀의 볼륨은 약 20GB입니다.
제공된 프로토콜은 간단하고 견고하며 지난 10 년 동안 여러 가지 표본의 HREM 데이터를 생성하는 데 사용되었습니다. 프로토콜 섹션 1.1은 최대 1cm의 길이를 갖는 생물 의학 모델 생물체의 전체 배아 및 5x5x5mm3의 크기를 갖는 배아 조직 샘플을 처리하기 위해 최적화되었다. 우리는 마우스 ( Mus musculus) , 병아리 ( Gallus gallus ), 얼룩말 물고기 ( Danio rerio ), 메추라기 ( Coturnix coturnix) , 아프리카 발톱 개구리 ( Xenopus laevis ), 말 에쿠우스 ferus caballus ), 유액 버그 ( Oncopeltus fasciatus ), 악어 ( Crocodylia ), 문어 ( Octopus vulgaris ). 모든 종의 자료는 우수한 품질 ( 예 : 그림 3 )
3 까지의 크기를 갖는 청소년 및 성인 조직 샘플 처리에 최적화되었으며, 조직 샘플을 시각화하기 위해 사용되었습니다. 인간 ( Homo sapiens ), 생쥐 ( Mus musculus ), 쥐 ( Rattus norvegicus ), 돼지 ( Sus scrofa domestica ) 흰 족제비 ( Mustela )에서 수확 한 피부, 간, 췌장, 신장, 갑상선, 심장, 줄무늬 근육, 뇌, furo ), 초파리 ( Drosophila melanogaster ) 및 제브라 피쉬 ( Danio rerio )가있다. 대부분의 표본 ( 예 : Figure 4 , Animation 1 )의 결과는 우수하지만 3 x 3 x 3 mm 3 보다 큰 피부의 표본 (표피 포함)과 뇌 표본은 종종 eosin의 불충분 한 침투로 인해 염색되지 않은 상태로 남아 있습니다 이 조직들.
프로토콜제 1.3 항은 섬유질 유기 물질을 처리하기 위해 최적화되었으며 코팅지, 코팅되지 않은 종이, 천연 진피 대체 물질 및 줄기 세포 시드 진피 대체 물질의 섬유 구조를 시각화하기 위해 사용되었습니다. 이 샘플들은 쉽고 빠르게 처리 할 수있었습니다. 코팅되지 않은 종이와 대부분의 피부 대용 물의 데이터는 양질이었습니다 ( 그림 5 , 애니메이션 2 ). 무기 물질이 에오신의 침투를 방해 할 때, 코팅 된 종이의 가공에 문제가 발생했다. 한천을 기준으로 피부를 처리 할 때 침투 용액에 의해 부분적으로 소화되기 때문에 또 다른 문제가 발생했습니다.
그림 1 : 워크 플로우. 빨간색 상자에 표시된 단계는 샘플 특성에 따라 수정해야합니다. 초록색 상자의 단계는모든 샘플에서 유사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 사용자 정의 된 금형. 금형은 원래 금형에 구멍을 뚫고 파스퇴르 (Pasteur) 피펫의 전구를 삽입하고 모델링 재료로 밀봉하여 조정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 예 : 시각화 된 태아. (A, B) 배아 일에 수확 한 마우스 배아, E = 9.5. HREM 섹션 이미지는 (A) (B)에 표시 됩니다. (C) E15.5 마우스 배아의 목의 볼륨 렌더링 모델을 통해 가상 sagittal 섹션. (D) 발달 햄버거 해밀턴 (HH) 단계 18. 병아리 배아 모든 배아 조직의 볼륨 렌더링과 결합 심장 혈관 구성 요소의 lumina의 표면 모델. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 예시 적으로 시각화 된 성인 조직 샘플. (A) 인간의 신경을 통해 HREM 섹션 이미지의 일부. 속지는 이미지의 한 부분을 더 자세히 보여줍니다. (B) 돼지 간을 통해 HREM 섹션 이미지의 일부. n을 주목하라.uclei. (C) 인간 림프 조직의 HREM 섹션 이미지의 일부. (D, E) 인간 엄지 패드의 두꺼운 피부. 볼륨은 전체 생검의 3D 모델을 렌더링했습니다. (D) HREM 데이터 (E)를 통한 가상 후방 교회 앞에있는 동맥, 정맥 및 신경의 표면 렌더링 모델. (F) 성숙 마우스 조직에서의 실험 종양. 볼륨은 HREM 데이터를 통해 세 개의 가상 섹션 앞에 렌더링 된 3D 모델입니다. 괴사 된 부분 (화살촉)에 유의하십시오. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 예시 적으로 시각화 된 섬유 소재. (A, B) HREM 섹션 이미지가 코팅되지 않은 갈색 종이입니다. (비) (A) 의 섹션을 보여줍니다. 섬유와 그 루멘을 주목하십시오. 코팅 용지의 (C) HREM 섹션. 섬유는 염색되지 않은 채 남아 있음을 유의하십시오. (D) 천연 피부 대체 물질의 양 렌더링 모델. 섬유의 다른 구경과 형태에 주목하십시오. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
애니메이션 1 : 인간 엄지 패드의 두꺼운 피부의 볼륨 렌더링 모델. 조직 블록의 크기는 약 4.2 x 2.7 x 2.7 mm 3 입니다. 보셀 크기는 1.07 x 1.07 x 2 μm 3 입니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 다운로드하십시오.)
애니메이션 2 : 네이티브 피부 대체 물질의 볼륨 렌더링 모델. 샘플의 크기는 약 1.2 x 0.85 x 0.4 mm 3 입니다. 복셀 크기는 0.54 x 0.54 x 2 μm 3 입니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 다운로드하십시오.)
Discussion
HREM은 생물 의약 및 산업 분야에서 사용되는 광범위한 유기 물질의 가시화에 이상적인 매우 견고한 현미경 검사법입니다. 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . 그것은 발달 장애의 메커니즘 (DMDD) 프로그램 41 , 42에 의해 현재 사용되는 독점적 인 이미징 양식으로 사용될 수있다.
완벽하게 기능하는 HREM 데이터 생성 장치는 기존의 실험실 구성 요소로부터 조립할 수 있으며 자동화 된 마이크로톰, 현미경, 전동 크로스 테이블 및 적절한 소프트웨어 25가 포함 된 컴퓨터로 구성됩니다. 정의 된 위치에서 각 섹션 및 광학 경로 내부의 GFP 필터 큐브를 재현성있게 차단하는 블록 홀더가 장착 된 마이크로톰을 사용하는 것이 중요합니다. 그러나 모든 기능을 갖춘 완벽한 솔루션은 Indigo Scientific과 같은 회사에서 구입할 수 있습니다.
HREM은 절편 또는 절편 장착 중에 인공물이 발생하지 않는다는 점을 제외하고는 모든 조직학 기법과 동일한 한계가 있습니다. 그러나 절편 화하기 전에 표본을 얼룩지게해야하는 필요성과매립 재료의 특성으로부터 충분한 조직 대조를 얻기 위해서는 전체 표본을 통한 에오신 침투가 필요합니다. 매우 조밀 한 물질, 지방 조직 및 무기물은 효과적으로 에오신 침투를 방해하며 이로 인해 사물의 중앙에 염색되지 않은 조직이 생성됩니다. 특별한 정착액을 사용하면 피부 표본을 얼룩지게하는데 도움이되지만 문제를 완전히 극복하기위한 적절한 방법은 아직 없습니다. 또 다른 한계는 2cm보다 높게 차단하는 수지가 절단 중에 부서지는 경향이 있다는 것입니다. 이것은 시편을 절단하고 가공 부품을 분리하여 부분적으로 피할 수 있습니다.
임베딩 중에 몰드에서 불규칙한 표면을 가진 작은 샘플 또는 샘플을 올바르게 배치하는 것은 종종 문제가됩니다. 샘플을 아가로 오스로 덮고 프로토콜에 설명 된대로 아가로 오스 블록을 처리하면 일반적으로이 문제가 해결됩니다 19 . 대체 접근법은 교단에서 블록이 깨지는 경우에도 도움이됩니다.oning은 홀더에서 이미 경화 된 블록을 제거하고 설명 된 임베딩 절차에 따라 새 블록을 다시 임베드하는 것입니다.
일반적인 HREM 데이터 세트는 500 ~ 3,000 개의 단일 이미지로 구성됩니다. 그것의 수치 해상도는 연속적인 이미지들 사이의 거리 ( 즉 , 섹션 두께에 의한), 카메라 타겟의 특성 및 활용 된 광학의 특성에 의해 결정됩니다. 제시된 프로토콜이 아티팩트 20 , 46 에서 빛을 완전히 제거하지는 않지만 1 μm와 5 μm 사이의 섹션 두께를 사용하여 좋은 결과를 얻었습니다. 이러한 인공물은 블록 안쪽 깊숙히 위치한 강하게 손상된 조직에 의해 야기되어 블록 표면의 조직 정보가 흐리게됩니다.
카메라의 타겟 크기는 2,560 x 1,920 픽셀 2 , 2,048 x 2,048 픽셀 2 , 4,096 x 4,096 픽셀 2 이며 combi1.25X, 2.5X, 5X, 10X 및 20X 대물 렌즈가 장착되어 있습니다. 이것은 0.18 x 0.18 μm 2 와 5.92 x 5.92 μm 2 사이의 숫자 픽셀 크기를 가져 왔으며, 이것은 조직 구조와 세포 형태의 3D 분석, 그리고 핵 시각화에 충분 함이 입증되었습니다. 높은 수치 해석을 감안할 때 다른 세포 기관도 볼 수 있어야합니다. 단순한 에오신 (eosin) 염색으로 인해 대비가 불충분하며 대상의 광학적 특성으로 인해 구조를 식별 할 가능성이 크게 낮아집니다. 숫자 애 퍼처를 고려한 HREM 데이터의 최대 실제 공간 해상도는 약 1 x 1 x 1 μm 3 이므로 대략 3 x 3 x 3 μm 3 보다 큰 구조를 효과적으로 식별 할 수 있습니다.
모든 디지털 이미징 기법에 공통적으로 발생하는 문제는 시야의 크기와 표시 할 수있는 표본의 부분을 정의하는 것카메라 타겟의 d와 이미지의 숫자 해상도. 시야가 넓을수록 가능한 최대 수치 해상도는 낮아집니다 46 . 여기에 사용 된 HREM 설정은 0.18 x 0.18 μm 2 및 12.12 x 12.12 mm 2 (1.25X 대물 렌즈)의 숫자 해상도로 표시되는 0.74 x 0.74 mm 2 (20X 대물 렌즈) 사이의 시야를 가진 HREM 데이터 생성을 허용합니다 2.96 x 2.96 μm 2 의 숫자 해상도. 대안으로 상업화 된 시설은 더 넓은 시야를 제공 할 수 있지만 실제 해상도를 희생합니다. 그럼에도 불구하고 그들은 DMDD 프로그램 홈페이지에 표시된 데이터에서 명백한 것처럼 훌륭한 결과를 제공합니다 47 .
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 샘플 제공을 위해 HREM 및 Petra Heffeter를 개발하는 데있어 invalubale 기여에 대한 Tim Mohun에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JB-4 Plus Embedding Kit | Polysciences Europe GmbH | 18570-1 | includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B |
| Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177A-3 | |
| Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177C-3 | |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences Europe GmbH | 15899-50 | |
| Eosin | Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma | 1A-196 | |
| Microtec CUT 4060E | rotary microtome | ||
| Leica DM LM, fluorescence compound microscope | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
| GFP filter set | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | 11090937180000 | |
| Motorised cross table | Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG | KT5-LSMA | |
| Digital video camera SPOT-FLEX | Visitron Systems GmbH. | ||
| precisExcite High-Power LED | Visitron Systems GmbH. | light source | |
| VisiView 2.1.4 | Visitron Systems GmbH. | Image capturing software | |
| Hard metal knife (tungsten carbide), profile D | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
| KL 2500 LCD | Schott AG | light source |
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