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Developmental Biology

Microscopía Episcopal de Alta Resolución (HREM) - Protocolos simples y robustos para procesar y visualizar materiales orgánicos

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC, Medical University of Vienna

Summary

Proporcionamos protocolos simples y robustos para procesar material de biopsia de varias especies, embriones de organismos modelo biomédicos y muestras de otros tejidos orgánicos para permitir la generación de datos de volumen digital con el método de microscopía episcopal de alta resolución.

Abstract

Proporcionamos protocolos simples para generar datos de volumen digital con el método de alta resolución de microscopía episcopal (HREM). HREM es capaz de visualizar materiales orgánicos con volúmenes de hasta 5 x 5 x 7 mm 3 en resoluciones numéricas típicas entre 1 x 1 x 1 y 5 x 5 x 5 μm 3 . Los especímenes están embebidos en resina de metacrilato y seccionados en un microtomo. Después de cada sección se captura una imagen de la superficie del bloque con una cámara de video digital que se asienta sobre el fototubo conectado al cabezal del microscopio compuesto. El eje óptico pasa a través de un cubo de filtro de proteína fluorescente verde (GFP) y está alineado con una posición, en la que el brazo de soporte de bock se apoya después de cada sección. De este modo, se producen una serie de imágenes digitales inherentemente alineadas, mostrando subsiguientes superficies de bloques. Cargar una serie de imágenes en un software de visualización tridimensional (3D) facilita la conversión inmediata a datos de volumen digital, lo que permiteEn varios planos ortogonales y oblicuos y la creación de modelos computarizados de volumen y superficie. Presentamos tres sencillos protocolos específicos de tejidos para el procesamiento de diversos grupos de especímenes orgánicos, incluyendo embriones de ratón, pollo, codorniz, rana y cebra, biopsia humana, papel sin recubrir y material de reemplazo de piel.

Introduction

El análisis estructural de materiales orgánicos y anorgánicos es el primer paso para comprender sus propiedades físicas y su función. La base de este análisis suele ser la información bidimensional (2D) obtenida mediante la observación cuidadosa de las secciones histológicas, con una variedad de métodos de imagen sencillos y sofisticados que extraen detalles de la arquitectura tisular, la morfología celular y la topología, la composición molecular y las propiedades biomecánicas 1 , 2 , 3 . Sin embargo, la información 2D no es adecuada para investigar arreglos espacialmente complejos. Por lo tanto, un número creciente de métodos in vivo y ex vivo que permiten la generación de datos de volumen digital se establecieron en las últimas décadas 4 y muchos más están en desarrollo.

El principio metódico de la mayoría de los métodos de generación de datos de volumen es la generación de pilas virtualesDe imágenes digitales que muestran secciones ganadas por la sección virtual o física de un objeto. Si las imágenes de la sección están alineadas correctamente, se crea un volumen, que puede seccionarse en planos de sección virtual o utilizado para crear modelos de superficie y volumen 3D renderizados. Las técnicas más populares para la visualización de humanos y especímenes biológicos más grandes son la tomografía por resonancia magnética (RMT), la tomografía computarizada (CT), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT). Los especímenes pequeños se visualizan generalmente mediante imágenes de resonancia micro-magnética (RMM), tomografía de proyección óptica (OPT), tomografía de coherencia óptica (OCT), tomografía fotoacústica (PAT), métodos de corte histológico, microscopía confocal y tomografía electrónica 5,6 . , 7 , 8 , 9 , 10 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Una técnica de generación de datos de volumen relativamente nueva, que produce datos digitales de pequeños especímenes y muestras histológicas de tejidos es el método HREM, que se desarrolló en estrecha cooperación con Tim Mohun 18 , 19 . Es una técnica basada en un microscopio simple, que genera datos de volumen digital de material embebido en resina que se secciona en un microtomo. Los datos facilitan el análisis detallado de la arquitectura del tejido y las distribuciones de células, así como el análisis métrico de pequeñas características a un nivel microscópico de luz intermedia.

HREM produce pilas de imágenes digitales inherentemente alineadas que aparecen como capturadas de eOsin manchado secciones histológicas. El contraste de los tejidos y la resolución de los datos con respecto al campo de visión superan a los datos producidos con μCT, μMRI y OPT, pero son inferiores a los obtenibles con microscopía confocal, de láminas y microscopía electrónica 20 . Sin embargo, a diferencia de este último, HREM es capaz de visualizar especímenes con volúmenes relativamente grandes de hasta 5 x 5 x 7 mm 3 en calidad histológica. Una serie de estudios recientes proporcionan caracterizaciones detalladas y comparaciones de ventajas y desventajas de las técnicas de imagen única y, en aras de la objetividad, nos referimos a ellas para obtener más información con respecto a sus limitaciones y campos potenciales de aplicaciones 4 , 21 , 22 , 23 , 24 .

Este estudio se centra en el método de imagen HREM y tiene como objetivo proporcionarProtocolos muy simples para generar datos HREM de un amplio espectro de materiales orgánicos, así como ejemplos de su aplicación. El flujo de trabajo para crear datos HREM es simple y se aplica a todos los materiales que pueden incrustarse en resina de metacrilato ( Figura 1 ). Sin embargo, existen diferencias específicas en los tejidos en la preparación de la muestra, que deben tenerse en cuenta. Por lo tanto, proporcionamos tres protocolos estándar para preparar varias muestras. Los pasos del protocolo de incorporación y generación de datos son idénticos para todos ellos.

Protocol

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices éticas de la Universidad Médica de Viena.

1. Preparación de la muestra

  1. Preparación de embriones y tejidos embrionarios (hasta 5 x 5 x 5 mm 3 )
    1. Fijar los embriones o partes de los embriones en 4% de PFA / PBS o fijador de Bouin a 4 ° C durante al menos 16 - 24 h bajo balanceo constante.
      NOTA: Pueden utilizarse embriones de varias especies y de diversas etapas de desarrollo, como el pez cebra de 48 h, el pollo y la codorniz de 19 h, y también los embriones de ratón prenatal, que se usaron aquí (ver Resultados Representativos ). Los especímenes se cosecharon y se transfirieron a PBS a temperatura ambiente para la estadificación, antes de que se pusieran en fijador. Si es necesario, recortar los especímenes con micro-tijeras o escalpelos antes de la fijación para encajar en los moldes de incrustación.
    2. Quitar el fijador y lavar el tejido del embrión en PBS a 4 ° C bajo rockin constanteG durante 24 h (2-3 cambios).
    3. Deshidratar las muestras en etanol al 70%, 80%, 90% y 96% a 4 ° C durante 2 - 3 h cada una. Coloque los tubos que contienen las muestras en un rotador.
      NOTA: Para muestras pequeñas (<2 x 2 x 2 mm 3 ), el tiempo de reposo de una muestra en cada etanol puede reducirse a 60 min. Para muestras grandes (> 5 x 5 x 5 mm 3 ), puede extenderse hasta 4 h.
    4. Realice los siguientes pasos de infiltración debajo de una campana extractora con guantes protectores.
      1. Preparar la solución de infiltración añadiendo 1,25 g de peróxido de benzoilo (catalizador plastificado) y 0,4 g de eosina a 100 ml de solución A (para más detalles ver Tabla de Materiales ). Se agita esto en un vaso de precipitados sobre una placa de agitación magnética a 4 ° C hasta que la eosina y el catalizador se disuelven completamente (2 - 3 h).
      2. Colocar las muestras durante 12 - 24 h en la solución de infiltración. Manténgalo a 4 ° C bajo balanceo continuo o rotación. Reemplazar la solución de infiltración con solución fresca después de 3 y 12marido.
        NOTA: Extienda el tiempo de infiltración a 48 h para embriones grandes (> 1 cm de corona / longitud de nalga).
  2. Preparación de muestras de tejidos adultos (hasta 5 x 5 x 7 mm 3 )
    1. Fijar los tejidos en PFA al 2% / PBS que contiene 4% de ácido carbólico a 4 ° C durante al menos 3 días.
      En esta solución se puede fijar una muestra de tejido procedente de piel, hígado, páncreas, riñón, tiroides, corazón, músculo estriado, cerebro, nervios y modelos tumorales de varios humanos neonatales y adultos, roedores, cerdos, moscas de la fruta y peces cebra Y luego se procesan para la imagen HREM (demostramos la fijación de las muestras, ver Resultados Representativos ). Excise las muestras de tejido con bisturíes, tijeras o punzones de biopsia y transferirlos directamente en fijador. Para la fijación del tejido nervioso se utiliza PFA al 4% / PBS.
    2. Retire el fijador y lave el tejido con agua corriente del grifo durante 3-6 h.
    3. Deshidrate las muestras posteriormenteEn etanol al 70%, 80%, 90% y 96%, mezclado con 0,4 g de eosina por 100 ml (2 - 3 h cada uno). Mantener las soluciones con muestras a 4 ° C bajo balanceo constante o en un rotador.
      NOTA: Para muestras pequeñas (<2 x 2 x 2 mm 3 ), el tiempo de reposo de una muestra en cada etanol puede reducirse a 60 min. Para muestras grandes (> 5 x 5 x 5 mm 3 ), se puede extender a 4-8 h.
    4. Realizar todos los siguientes pasos de infiltración bajo una campana de humos con guantes protectores.
      1. Preparar la solución de infiltración añadiendo 1,25 g de peróxido de benzoilo (catalizador plastificado) y 0,4 g de eosina a 100 ml de Solución A (para más detalles ver Tabla de Materiales ). Se agita en un vaso de precipitados sobre una placa de agitación magnética a 4 ° C hasta que la eosina y el catalizador se disuelven completamente (2 - 3 h).
      2. Colocar las muestras en solución de infiltración durante 24 - 36 h. Manténgalo a 4 ° C bajo balanceo continuo o rotación. Reemplazar la solución de infiltración con solución fresca después de 3 y12 h.
        NOTA: Para muestras grandes (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) prolongar el tiempo de infiltración a 48 h.
  3. Preparación de otros materiales orgánicos
    NOTA: Recorte los sustitutos de la piel y el papel con el tamaño deseado con tijeras ordinarias. No se requiere fijación.
    1. Pasar los pasos de fijación, lavado y deshidratación.
    2. Realizar todos los siguientes pasos de infiltración bajo una campana de humos con guantes protectores.
      1. Preparar la solución de infiltración añadiendo 1,25 g de peróxido de benzoilo (catalizador plastificado) y 0,4 g de eosina a 100 ml de Solución A (para más detalles ver Tabla de Materiales ). Se agita en un vaso de precipitados a 4ºC en una placa de agitación magnética hasta que la eosina y el catalizador se disuelven completamente (2 - 3 h).
      2. Colocar las muestras en solución de infiltración durante 3 - 12 h. Manténgalo a 4 ° C bajo balanceo continuo o rotación. Reemplazar la solución de infiltración con solución fresca después de 1 y 2 - 4 h.
      <Li

2. Incorporación

NOTA: Realice todos los pasos bajo una campana extractora de humos usando guantes protectores.

  1. Preparar solución de infiltración fresca como se ha descrito anteriormente (paso 1.1.4.1). Añadir 4 mL de Solución B (para más detalles, ver Tabla de Materiales ) a 100 mL de solución de infiltración para preparar la solución de incrustación.
    NOTA: Si se requiere una orientación precisa de la muestra en los moldes de empotramiento y para permitir la incrustación de varias muestras en paralelo, ralentizar la polimerización de la solución madre poniendo el vaso en un baño de hielo.
  2. Utilice bandejas para molduras (para detalles, véase la Tabla de Materiales ) con moldes que tengan un volumen rutinario de 6 x 8 x 5 mm 3 o 13 x 19 x 5 mm 3 , o moldes personalizados con volúmenes de hasta 8 x 10 x 15 mm 3 ( Figura 2 ).
  3. Llenar los moldes con solución de incrustación y transferir la muestra al molde usandouna cuchara. Durante la transferencia asegúrese de que la muestra esté completamente cubierta con solución de incrustación para evitar el atrapamiento de aire.
    NOTA: Esto se puede hacer a temperatura ambiente, si se inicia inmediatamente después de recoger las muestras y la solución de incrustación del refrigerador.
    1. Oriente la muestra dentro del molde usando agujas o fórceps.
    2. Tan pronto como la solución de empotramiento empieza a volverse viscoso, coloque un soporte de bloque (véase la Tabla de Materiales ) encima del molde y añada la solución de incrustación a través del orificio central del soporte del bloque hasta que la base del soporte del bloque esté cubierta con 1 - 2 Mm de solución de incrustación.
    3. Selle la bandeja de la taza de moldeo cubriéndola con cera de parafina líquida y espere hasta que se haya endurecido. Alternativamente, coloque una segunda bandeja de la taza de moldeo al revés en la bandeja de la taza de moldeo con muestras y séllela con cinta adhesiva a prueba de aire.
  4. Permita que los bloques terminen la polimerización almacenando las bandejas selladas de la taza del moldeado para 1 -2 días a temperatura ambiente.
  5. Para el procesamiento posterior a la polimerización, coloque las bandejas de molduras con los bloques polimerizados en un horno de laboratorio estándar y hornee a 70-80 ° C durante un mínimo de 1 a 2 días hasta que se vuelvan de color rojo oscuro. Recoger las bandejas del horno y quitar los bloques del molde.
    NOTA: El horneado se puede hacer bajo condiciones ambientales normales. La bandeja de cubeta de moldeo que asegura el sellado hermético en la primera fase después del empotramiento, se puede retirar para permitir la comprobación del color de la resina después de 10 h. Inmediatamente después de hornear, la resina es blanda y los bloques se pueden quitar fácilmente de la bandeja de la taza de moldeo. Dentro de 2 - 3 h son duros y se pueden almacenar a temperatura ambiente durante varios meses.

3. Generación de datos

NOTA: El prototipo HREM 18 , 25 utilizado aquí comprende los siguientes elementos: (i) Microtomo rotatorio con un soporte de bloqueQue se detiene después de cada corte en su punto de giro superior. (Ii) Cuchillo de microtomo estándar, no desechable, metal duro, perfil D (para detalles, ver Tabla de Materiales ). (Iii) Cabeza de microscopio compuesto fluorescente con revólver objetivo y un cubo de filtro GFP (excitación 470/40, filtro de emisión 525/50) en su eje óptico. El eje óptico está dispuesto perpendicular a la superficie recién cortada de un bloque montado en el microtomo y está sujeto por un dispositivo que permite el movimiento hacia arriba y hacia abajo. (Iv) Mesa transversal motorizada que lleva el microtomo. La mesa puede desplazarse en la dirección del eje óptico y lateralmente. (V) Cámara de video digital conectada al microscopio compuesto fluorescente. (Vi) Fuente de luz monocromática (470 nm). Vii) Ordenador conectado a la cámara, con software de generación de datos (para más detalles, véase Tabla de materiales ).

  1. Procedimiento
    1. Indique la región de interés.
      1. Utilizar laboratorio de laboratorio estándarGht (véase la Tabla de materiales ) para dirigir la luz blanca oblicuamente a la superficie del bloque.
      2. Identificar los contornos del material incrustado a medida que se proyecta a la superficie del bloque. Indique la región de interés y el campo de visión posterior sobre la superficie del bloque utilizando una pluma o una hoja de afeitar.
        NOTA: Este paso es obligatorio para definir el alcance del campo de visión antes de seccionar.
    2. Defina el campo de visión.
      1. Monte el bloque de resina con la muestra en el micrótomo.
      2. Mueva el soporte del bloque a su posición de parada (punto de giro superior de la excursión del soporte del bloque).
      3. Inicie la cámara digital y el software de generación de datos, y adquiera una imagen en vivo.
      4. Elija una lente objetivo, con una ampliación adecuada para cubrir la región de interés indicada en la superficie del bloque.
        NOTA: Los objetivos con ampliaciones 2.5X, 5X, 10X, 20X y aberturas numéricas entre 0.07 y 0.40 se utilizan comúnmente. Mueva la óptica hacia arriba y hacia abajo y el microtomo lateralmente usando la mesa cruzada motorizada hasta que la región de interés coincida con el campo de visión que se muestra en la pantalla del ordenador.
    3. Atención.
      1. Realizar el corte manual paso a paso hasta que las primeras estructuras de la muestra sean visibles.
      2. Coloque la superficie del bloque en el plano de enfoque de la óptica, moviendo el micrótomo en la dirección del eje óptico.
      3. Elija el grosor de la sección; Se recomiendan espesores de sección de 0,5 a 5 μm.
  2. Generación y procesamiento de datos
    1. Inicie la rutina de software que orquesta secciones y captura de imágenes. Siga las instrucciones documentadas del software de captura de imágenes.
    2. Detenga la rutina de software y coloque una diapositiva de escalado delante de la superficie del bloque tan pronto como la muestra esté completamente seccionada.
    3. Capturar una imagen de forma interactiva para calibración posteriorCión.
      NOTA: Esto debe hacerse cada vez que se utiliza un objetivo en una configuración recién configurada.
    4. Convierta la serie de imágenes en imágenes de escala de grises de 8 bits en formato .jpg.
    5. Cargue las series de imágenes en el software de visualización 3D y ajuste los contrastes.
      NOTA: La conversión de imágenes y la visualización en 3D pueden realizarse con varios paquetes de software estándar comercialmente o libremente disponibles, siguiendo las instrucciones del software respectivo.

Representative Results

HREM genera series de imágenes digitales inherentemente alineadas con contrastes similares a imágenes de secciones histológicas teñidas con hematoxilina / eosina. A diferencia de las imágenes de la sección 2D, las pilas de imágenes HREM permiten la visualización y el análisis de la arquitectura del tejido, la morfología y la topología de una amplia variedad de materiales orgánicos en 3D. El alto contraste facilita a menudo la visualización 3D rápida y simple de los modelos de computadora rendidos del volumen y de los resultados semiautomáticos del contorno para la generación de modelos rendidos de la superficie.

El tamaño de los datos HREM varía según el tamaño del objetivo de la cámara, el modo de captura de imágenes (8, 12, 16 bits, escala de grises, color) y el número de imágenes de una sola cara de bloque. Los conjuntos de datos más pequeños de 1.000 8-bit.jpg imágenes de escala de grises de 2.048 píxeles x 2.048 píxeles tienen un tamaño de alrededor de 900 MB. Grandes conjuntos de datos de 3.000 8-bit.jpg imágenes en escala de grises de 4.096 pIxel x 4.096 píxeles tienen volúmenes de aproximadamente 20 GB.

Los protocolos proporcionados son simples y robustos, y durante la última década, se emplearon para generar datos HREM de muchos especímenes diferentes. La sección 1.1 del protocolo se optimizó para procesar embriones enteros de organismos modelo biomédicos con una longitud de hasta 1 cm y muestras de tejido embrionario con una dimensión de hasta 5 x 5 x 5 mm 3 ; Se utilizó este método para producir datos HREM de embriones de las siguientes especies: ratón ( Mus musculus) , gallina gallus , pez cebra ( Danio rerio ), codorniz ( Coturnix coturnix) , rana con garras africanas ( Xenopus laevis ), caballo Equus ferus caballus ), insecto de la algaroba ( Oncopeltus fasciatus ), cocodrilo ( Crocodylia ) y pulpo ( Octopus vulgaris ). Los datos de todas las especies fueron de excelente calidad ( por ejemplo , la Figura 3 )

3 y se empleó para visualizar muestras de tejido de la muestra ( Homo sapiens ), ratones ( Mus musculus ), ratas ( Rattus norvegicus ), cerdos ( Sus scrofa domestica ) hurón ( Mustela ( Mustela )), de la piel, hígado, páncreas, riñón, tiroides, corazón, músculo estriado, Furo ), mosca de la fruta ( Drosophila melanogaster ) y peces cebra ( Danio rerio ). Si bien los resultados fueron excelentes con la mayoría de los especímenes ( p . Ej. , Figura 4 , Animación 1 ), las partes muy centrales de la piel (con epidermis) y especímenes cerebrales mayores de 3 x 3 x 3 mm 3 a menudo permanecían sin manchas debido a la penetración insuficiente de eosina a través de Estos tejidos.

Protocolo mLa ecuación 1.3 fue optimizada para procesar material orgánico fibroso y empleada para visualizar la arquitectura de fibra de papel revestido, papel no revestido, material sustitutivo dérmico nativo y material sustitutivo dérmico sembrado de células madre. Estas muestras fueron fáciles y rápidas de procesar. Los datos del papel sin recubrir y la mayoría de los sustitutos de la piel fueron de buena calidad ( Figura 5 , Animación 2 ). Se produjeron problemas en el procesamiento del papel revestido, cuando el material anorgánico impedía la penetración de la eosina. Otro problema ocurrió al procesar los sustitutos de la piel a base de agar porque se convirtieron en parte digeridos por la solución de infiltración.

Figura 1
Figura 1: Flujo de trabajo. Los pasos mostrados en las casillas rojas requieren modificaciones de acuerdo con las características de la muestra. Los pasos en las casillas verdes son los queSon similares en todas las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Moldes personalizados. Los moldes se pueden adaptar cortando un agujero en el molde original, insertando el bulbo de una pipeta de Pasteur y sellándolo con el material de modelado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Embriones ejemplarizados. (A, B) Embrión de ratón cosechado en el día embrionario, E = 9,5. La imagen de la sección HREM se muestra en (A) (B) . (C) Sección sagital virtual a través de un modelo de volumen volcado del cuello de un embrión de ratón E15.5. (D) Embrión de pollo en desarrollo Hamburger Hamilton (HH) etapa 18. Modelo de superficie de la lumina de los componentes cardiovasculares combinado con la producción de volumen de todos los tejidos del embrión. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Muestras de tejidos adultos visualizados de forma ejemplar. (A) Parte de una imagen de sección HREM a través de un nervio humano. El recuadro muestra una sección de la imagen con más detalle. (B) Parte de una imagen de la sección HREM a través del hígado porcino. Observe el nUclei (C) Parte de una imagen de sección HREM de tejido linfático humano. (D, E) Piel gruesa de una almohadilla humana del pulgar. Volumen renderizado modelo 3D de toda la biopsia. (D) Modelos rendidos superficiales de arterias, venas y nervios frente a una resección virtual a través de datos HREM (E) . (F) Tumor experimental en tejido de ratón adulto. Volumen renderizado modelo 3D delante de tres secciones virtuales a través de datos HREM. Observe las partes necróticas (puntas de flecha). Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Material fibroso visualizado de forma ejemplar. (A, B) Imagen de sección HREM de papel marrón sin recubrir. (SEGUNDO) (A) . Observe las fibras y su luz. (C) sección HREM de papel revestido. Observe que las fibras permanecen sin manchas. (D) Modelo volcado en volumen de material sustitutivo dérmico nativo. Observe el calibre diferente y la forma de las fibras. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1
Animación 1: Volume Rendered Modelo de la piel gruesa de una almohadilla del pulgar humano. El tamaño del bloque de tejido es de aproximadamente 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . El tamaño de Voxel es 1,07 x 1,07 x 2 mu m 3 . Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)


Animación 2: Modelo de Rendimiento de Volumen de Material Dermal Substituto Nativo. El tamaño de la muestra es de aproximadamente 1,2 x 0,85 x 0,4 mm3. El tamaño de Voxel es 0,54 x 0,54 x 2 mu m 3 . Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)

Discussion

HREM es un método microscópico muy robusto que es ideal para visualizar un amplio espectro de materiales orgánicos utilizados en la biomedicina y la industria ( 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37). , 38 , 39 , 40 . Puede emplearse como una modalidad de imagen exclusiva, tal como se utiliza actualmente en el programa de Mecanismos de los Trastornos del Desarrollo (DMDD) 41 , 42 43 , 44 , o como una parte integradora de tuberías de imágenes multimodales [ 45] .

Un aparato de generación de datos HREM completamente funcional puede ser ensamblado a partir de componentes de laboratorio convencionales y comprende un microtomo motorizado, un microscopio, una tabla cruzada motorizada y un ordenador con un software apropiado 25 . Es crítico utilizar un microtomo equipado con un soporte de bloque que se detiene reproduciblemente después de cada sección en una posición definida y cubos de filtro GFP dentro de la vía óptica. Sin embargo, las soluciones integrales que funcionan plenamente se pueden adquirir en compañías como Indigo Scientific.

HREM se enfrenta a las mismas limitaciones que todas las técnicas histológicas, excepto que no se introducen artefactos durante la sección o la sección de montaje. Sin embargo, existen limitaciones, que resultan de la necesidad de teñir los especímenes antes de seccionar yA partir de las características del material de incrustación. La penetración de eosina a través de todo el espécimen se requiere para obtener suficientes contrastes de tejido; El material muy denso, los tejidos adiposos y las sustancias anorgales obstaculizan eficazmente la penetración de eosina y esto da lugar a tejidos no teñidos en el centro de los objetos. El uso de fijadores especiales ayuda a manchar las muestras de piel, pero todavía no hay un método adecuado para superar el problema. Otra limitación es que las resinas que bloquean más de 2 cm tienden a romperse durante la sección. Esto se puede evitar parcialmente cortando los especímenes y las piezas de procesamiento por separado.

La colocación correcta de pequeñas muestras o muestras con superficies irregulares en los moldes durante la incorporación es a menudo problemática. Cubrir las muestras con agarosa y procesar los bloques de agarosa como se describe en el protocolo por lo general resuelve este problema [ 19] . Un enfoque alternativo, que también ayuda si los bloques se rompen durante la sectiEs quitar el bloque ya endurecido de su soporte e insertarlo de nuevo, siguiendo el procedimiento de incrustación descrito.

Un conjunto de datos HREM típico comprende de 500 a 3.000 imágenes individuales. Su resolución numérica está determinada por la distancia entre las imágenes sucesivas ( es decir , por el grosor de la sección), la característica del objetivo de la cámara y las propiedades de la óptica utilizada. Utilizamos espesores de sección entre 1 μm y 5 μm y obtuvimos buenos resultados, aunque los protocolos presentados no eliminan totalmente el brillo de los artefactos 20 , 46 . Estos artefactos son causados ​​por los tejidos intensamente teñidos localizados profundamente dentro del bloque, dando por resultado la borrosidad de la información del tejido en las superficies del bloque cerca.

Las cámaras tenían dimensiones de objetivo de 2,560 x 1,920 píxeles 2 , 2,048 x 2,048 píxeles 2 , y 4,096 x 4,096 píxeles 2 y eran combiNizado con lentes objetivos 1.25X, 2.5X, 5X, 10X y 20X. Esto resultó en tamaños de píxeles numéricos entre 0,18 x 0,18 μm 2 y 5,92 x 5,92 μm 2 , que resultó ser suficiente para el análisis 3D de la arquitectura de los tejidos y las formas celulares, e incluso para visualizar núcleos. Dada la alta resolución numérica, otros organelos celulares también deben ser visibles. Los contrastes insuficientes debidos a la simple tinción con eosina y las propiedades ópticas de los objetivos disminuyen drásticamente la posibilidad de discriminar las estructuras. La máxima resolución espacial real de los datos HREM, que tiene en cuenta la apertura numérica, es de aproximadamente 1 x 1 x 1 μm 3 , y por lo tanto sólo permite una discriminación efectiva de estructuras mayores que aproximadamente 3 x 3 x 3 μm 3 .

Un problema común a todas las técnicas de imagen digital es el intercambio entre el tamaño del campo de visión, que define la parte del espécimen que puede ser displayeD en el objetivo de la cámara y la resolución numérica de la imagen. Cuanto mayor sea el campo visual, menor será la resolución numérica máxima posible 46 . La configuración HREM utilizada aquí permite la generación de datos HREM con un campo de visión entre 0,74 x 0,74 mm 2 (objetivo 20X), visualizado en una resolución numérica de 0,18 x 0,18 μm 2 y 12,12 x 12,12 mm 2 (objetivo 1,25X) Una resolución numérica de 2,96 x 2,96 μm 2 . Los montajes alternativos y comercializados pueden proporcionar campos de visión más amplios, pero a costa de una verdadera resolución. Sin embargo, proporcionan excelentes resultados, como es evidente a partir de los datos mostrados en la página principal del programa DMDD 47 .

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Tim Mohun por su invalubale contribuciones en el desarrollo de HREM y Petra Heffeter para proporcionar muestras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JB-4 Plus Embedding Kit Polysciences Europe GmbH 18570-1 includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B
Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177A-3
Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177C-3
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences Europe GmbH 15899-50
Eosin Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma 1A-196
Microtec CUT 4060E rotary microtome
Leica DM LM, fluorescence compound microscope Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
GFP filter set Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H 11090937180000
Motorised cross table Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG KT5-LSMA
Digital video camera SPOT-FLEX Visitron Systems GmbH.
precisExcite High-Power LED Visitron Systems GmbH. light source
VisiView 2.1.4 Visitron Systems GmbH. Image capturing software
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCD Schott AG light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B., Reissig, L. F., Weninger, W. J. High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials. J. Vis. Exp. (125), e56071, doi:10.3791/56071 (2017).

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