Summary
Vi tillhandahåller enkla och robusta protokoll för bearbetning av biopsiematerial av olika arter, embryon av biomedicinska modellorganismer och prover av andra organiska vävnader för att möjliggöra digital volymdatagenerering med den högupplösta episkopiska mikroskopi-metoden.
Abstract
Vi tillhandahåller enkla protokoll för att generera digitala volyldata med den högupplösande episkopiska mikroskopi-metoden (HREM). HREM kan bilda organiska material med volymer upp till 5 x 5 x 7 mm 3 i typiska numeriska upplösningar mellan 1 x 1 x 1 och 5 x 5 x 5 μm 3 . Proverna är inbäddade i metakrylatharts och snittas på en mikrotom. Efter varje sektion fångas en bild av blockytan med en digital videokamera som sitter på fotobunken ansluten till det sammansatta mikroskophuvudet. Den optiska axeln passerar genom en grön fluorescerande protein (GFP) filterkub och är inriktad på en position, vid vilken bockhållarmen kommer vila efter varje sektion. På så sätt produceras en rad naturligt anpassade digitala bilder som visar efterföljande blockytor. Att ladda en sådan bildserie i tredimensionell (3D) visualiseringsprogramvara underlättar omedelbar konvertering till digital volymdata, vilket möjliggör virtuella sEktionering i olika ortogonala och snedställda plan och skapandet av volym och ytframställda datormodeller. Vi presenterar tre enkla, vävnadsspecifika protokoll för behandling av olika grupper av organiska exemplar, inklusive mus, kyckling, vaktel, groda och zebrafiskembryon, humant biopsimaterial, obestruket papper och hudbytesmaterial.
Introduction
Strukturell analys av organiska och oorganiska material är det första steget i att förstå deras fysiska egenskaper och funktion. Grunden för en sådan analys är ofta tvådimensionell (2D) information som erhållits genom noggrann observation av histologiska sektioner, med en mängd enkla och sofistikerade avbildningsmetoder som extraherar detaljer om vävnadsarkitektur, cellmorfologi och topologi, molekylär sammansättning och biomekaniska egenskaper 1 , 2 , 3 . 2D-information är emellertid inte lämpad för att undersöka rumsligt komplexa arrangemang. Därför etablerades ett växande antal in vivo och ex vivo metoder som möjliggör generering av digitala volyldata under de senaste decennierna 4 och många fler är under utveckling.
Den metodiska principen för mest volymdatagenereringsmetoder är genereringen av virtuella staplarAv digitala bilder som visar sektioner som erhållits genom virtuell eller fysisk sektion av ett objekt. Om sektionsbilderna är rätt inriktade skapas en volym, som kan snittas om i virtuella sektionsplan eller används för att skapa 3D-ytor och volymåterställda modeller. Populära tekniker för visualisering av människor och större biologiska prover är magnetisk resonanstomografi (MRT), computertomografi (CT), positronutsläppstomografi (PET) och single-photon emission computed tomography (SPECT). Små exemplar visualiseras vanligtvis genom användning av mikromagnetisk resonansbildning (μMRI), optisk projektionstomografi (OPT), optisk koherensomografi (OCT), fotoakustisk tomografi (PAT), histologiska sektionsbaserade metoder, konfokalmikroskopi och elektrontomografi 5 , 6 7 , 8 , 9 , 10
En relativt ny volymdatagenereringsteknik som producerar digitala data för småprover och histologiska vävnadsprover är HREM-metoden, som utvecklades i nära samarbete med Tim Mohun 18 , 19 . Det är en enkel mikroskopbaserad teknik, som genererar digital volymdata från hartsinbäddat material som är snittat på en mikrotom. Uppgifterna underlättar detaljerad analys av vävnadsarkitektur och cellfördelningar såväl som metrisk analys av små funktioner på en mellanliggande ljusmikroskopisk nivå.
HREM producerar staplar av iboende justerade digitala bilder som visas som om de tagits från eOsinfärgade histologiska sektioner. Vävnadskontrast och dataupplösning i förhållande till synfältet överstiger den för data som produceras med μCT, μMRI och OPT, men är lägre än vad som kan uppnås med konfokal, ljusark och elektronmikroskopi 20 . I motsats till det senare kan HREM dock visualisera prover med relativt stora volymer upp till 5 x 5 x 7 mm 3 i histologisk kvalitet. Ett antal nyligen genomförda studier ger detaljerade karaktäriseringar och jämförelser av fördelar och nackdelar med de enkla bildteknikerna och, för saklighets skull, hänvisar vi till dem för ytterligare information om deras begränsningar och potentiella användningsområden 4 , 21 , 22 , 23 , 24 .
Denna studie fokuserar på HREM imaging-metoden och syftar till att tillhandahållaMycket enkla protokoll för att generera HREM data av ett brett spektrum av organiska material, liksom exempel på deras tillämpning. Arbetsflödet för att skapa HREM-data är enkelt och gäller alla material som kan bädda in i metakrylatharts ( Figur 1 ). Ändå finns det vävnadsspecifika skillnader i provberedning, som måste beaktas. Vi tillhandahåller därför tre standardprotokoll för att förbereda olika prover. Inbäddning och dataproduktion protokoll steg är identiska för dem alla.
Protocol
Alla procedurer utfördes i enlighet med etiska riktlinjer vid Medicinska Universiteten i Wien.
1. Provberedning
- Förberedelse av embryon och embryonvävnader (upp till 5 x 5 x 5 mm 3 )
- Festa embryon eller delar av embryon i 4% PFA / PBS eller Bouins fixativ vid 4 ° C under minst 16-24 timmar under konstant rockning.
ANMÄRKNING: Embryon av flera arter och olika utvecklingsstadier kan användas, såsom 48-h zebrafisk, 19-timmars chick och vaktel, och även prenatala musembryon, som användes här (se representativa resultat ). Proverna skördades och överfördes till PBS vid rumstemperatur för staging innan de sattes i fixativ. Om nödvändigt, trimma proverna med mikro-sax eller skalpeller före fixering för att passa in i inbäddningsformarna. - Ta bort fixativet och tvätta embryovävnaden i PBS vid 4 ° C under konstant rockinG i 24 h (2-3 ändringar).
- Dehydrera proverna i 70%, 80%, 90%, 96% etanol vid 4 ° C i 2-3 timmar vardera. Placera rör som innehåller proven på en rotator.
OBS! För små prov (<2 x 2 x 2 mm 3 ) kan tiden som ett prov vilar i varje etanol reduceras till 60 minuter. För stora prov (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) kan det förlängas till 4 h. - Utför följande infiltreringssteg under en avluftningsdragning med skyddshandskar.
- Förbered infiltreringslösningen genom att tillsätta 1,25 g bensoylperoxid (mjukad katalysator) och 0,4 g eosin till 100 ml lösning A (för mer detaljer, se tabell över material ). Rör om detta i en bägare på en magnetisk omröringsplatta vid 4 ° C tills eosin och katalysator är helt upplösta (2 - 3 h).
- Placera proverna i 12 - 24 timmar i infiltreringslösningen. Håll det vid 4 ° C under kontinuerlig gungning eller rotation. Byt infiltreringslösning med ny lösning efter 3 och 12h.
OBS: Förläng infiltrationstiden till 48 timmar för stora embryon (> 1 cm krona / rump längd).
- Festa embryon eller delar av embryon i 4% PFA / PBS eller Bouins fixativ vid 4 ° C under minst 16-24 timmar under konstant rockning.
- Förberedelse av vuxna vävnadsprover (upp till 5 x 5 x 7 mm 3 )
- Fixa vävnaderna i 2% PFA / PBS innehållande 4% karbonsyra vid 4 ° C under minst 3 dagar.
ANMÄRKNING: Vävnadsprovet som härrör från hud-, lever-, bukspottkörtel-, njure-, sköldkörtel-, hjärt-, ryggradsmuskeln, hjärnan, nerverna och tumörmodellerna hos flera neonatala och vuxna människor, gnagare, grisar, fruktflugor och zebrafiskar kan lösas i denna lösning Och sedan bearbetas för HREM-bildbehandling (vi demonstrerar fixeringen av proven, se representativa resultat ). Punkta vävnadsproverna med skalpeller, saxar eller biopsi-slag och direkt överföra dem till fixativ. För fixering av nervvävnad använd 4% PFA / PBS. - Ta bort fixativet och tvätta vävnaden under rinnande kranvatten i 3-6 h.
- Dehydrera proverna med senare placeringIngående i 70%, 80%, 90%, 96% etanol, blandad med 0,4 g eosin per 100 ml (2-3 timmar vardera). Håll lösningarna med prov vid 4 ° C under konstant rockning eller på rotatorn.
OBS! För små prov (<2 x 2 x 2 mm 3 ) kan tiden som ett prov vilar i varje etanol reduceras till 60 minuter. För stora prov (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) kan det förlängas till 4-8 h. - Utför alla följande infiltreringssteg under en avluftningsdragning med skyddshandskar.
- Förbered infiltreringslösningen genom att tillsätta 1,25 g bensoylperoxid (mjukad katalysator) och 0,4 g eosin till 100 ml lösning A (för mer detaljer, se tabell över material ). Rör i en bägare på en magnetisk omröringsplatta vid 4 ° C tills eosinet och katalysatorn är helt upplösta (2-3 timmar).
- Placera prov i infiltrationslösningen i 24 - 36 h. Håll det vid 4 ° C under kontinuerlig gungning eller rotation. Byt infiltreringslösning med ny lösning efter 3 och12 h.
OBS! För stora prov (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) förläng infiltrationstiden till 48 h.
- Fixa vävnaderna i 2% PFA / PBS innehållande 4% karbonsyra vid 4 ° C under minst 3 dagar.
- Förbereder annat organiskt material
OBS! Trim hudbyten och papper till önskad storlek med vanlig sax. Ingen fixering behövs.- Hoppa över fixerings-, tvätt- och uttorkningssteg.
- Utför alla följande infiltreringssteg under en avluftningsdragning med skyddshandskar.
- Förbered infiltreringslösningen genom att tillsätta 1,25 g bensoylperoxid (mjukad katalysator) och 0,4 g eosin till 100 ml lösning A (för mer detaljer, se tabell över material ). Rör i en bägare vid 4 ° C på en magnetisk omröringsplatta tills eosin och katalysator är helt upplösta (2 - 3 h).
- Placera prov i infiltrationslösningen i 3 - 12 h. Håll det vid 4 ° C under kontinuerlig gungning eller rotation. Byt infiltreringslösning med ny lösning efter 1 och 2 - 4 timmar.
2. Inbäddning
OBS! Utför alla steg under en avluftningsdragning med skyddshandskar.
- Förbered ny infiltreringslösning enligt beskrivningen ovan (steg 1.1.4.1). Tillsätt 4 ml lösning B (för detaljer, se tabell över material ) till 100 ml infiltreringslösning för att förbereda inbäddningslösningen.
OBS! Om det behövs exakt orientering av provet i inbäddningsformarna och för att möjliggöra inbäddning av flera prover parallellt, sakta ner polymerisationen av stamlösningen genom att sätta bägaren i ett isbad. - Använd formgjutningsbunkar (för detaljer, se Materialblock ) med formar som har en rutinvolym på 6 x 8 x 5 mm 3 eller 13 x 19 x 5 mm 3 eller skräddarsydda formar med volymer upp till 8 x 10 x 15 mm 3 ( figur 2 ).
- Fyll i formarna med inbäddningslösning och överför provet till formen meden sked. Under överföringen säkerställs att provet är helt täckt med inbäddningslösning för att undvika luftfångning.
OBS! Detta kan göras vid rumstemperatur, om det påbörjas omedelbart efter samling av proven och inbäddningslösningen från kylskåpet.- Rikta provet inuti formen med hjälp av nålar eller tångar.
- Så snart inbäddningslösningen börjar bli viskös, placera en blockhållare (se tabell över material ) ovanpå formen och tillsätt inbäddningslösning genom blockhållarens centrala hål tills blockhållarens botten är täckt med 1 - 2 Mm av inbäddningslösning.
- Täta gjutskålen genom att täcka den med flytande paraffinvax och vänta tills det har härdat. Alternativt placera ett andra formskålskål upp och ner på gjutskålfacket med prov och täta det med tejp till lufttäthet.
- Tillåt blockering att slutföra polymerisationen genom att lagra de förseglade gjutskålen för 1 -2 dagar vid rumstemperatur.
- För efterpolymeriseringsbehandling placerar du formningsskålen med polymeriserade block i en standard laboratorieugn och baka i 70 - 80 ° C i minst 1 till 2 dagar tills de blir mörktröda. Samla brickorna ur ugnen och ta bort blocken från formen.
OBS: Bakning kan ske under normala miljöförhållanden. Den täckande formningsbägaren, som säkerställer lufttät tätning i den första fasen efter inbäddning, kan avlägsnas för att möjliggöra kontroll av hartsfärgen efter 10 h. Omedelbart efter bakning är hartset mjukt och blocken kan lätt avlägsnas från formningsbägaren. Inom 2-3 timmar är de svåra och kan förvaras vid rumstemperatur i flera månader.
3. Data Generation
OBS! HREM-prototypen 18 , 25 som används här innefattar följande punkter: (i) Rotationsmikrotom med en blockhållareSom stannar efter varje snitt vid sin övre vändpunkt. (Ii) Standard, icke-disponibel mikrotomkniv, hårdmetall, profil D (för detaljer, se Materialförteckning ). (Iii) Huvud av fluorescensföreningsmikroskop med objektivrevolver och en GFP-filterkub (excitation 470/40; emissionsfilter 525/50) i sin optiska axel. Den optiska axeln är anordnad vinkelrätt mot den nyklippta ytan av ett block monterat på mikrotomen och hålls av en anordning som tillåter upp- och nedåtgående rörelse. (Iv) Motoriserat korsbord som bär mikrotomen. Bordet kan flyttas i den optiska axelns riktning och i sidled. (V) Digital videokamera ansluten till fluorescerande föreningsmikroskopet. (Vi) Monokrom ljuskälla (470 nm). (Vii) Dator ansluten till kameran, med datalagringsprogramvara (för detaljer, se Materialtabell ).
- Procedur
- Ange intresseområdet.
- Använd standard laboratorium liGht källa (se Materialblock ) för att rikta vitt ljus snett mot blockytan.
- Identifiera konturerna av det inbäddade materialet som det projekterar till blockytan. Ange intresseområdet och senare synfält på blockytan med hjälp av en penna eller rakblad.
OBS! Det här steget är obligatoriskt för att definiera omfattningen av synfältet före sektionen.
- Definiera visningsfältet.
- Montera hartsblocket med prov på mikrotomen.
- Flytta blockhållaren till sitt stoppläge (övre vändpunkt för blockhållareutflykt).
- Starta digitalkameran och datagenereringsprogrammet och skaffa en levande bild.
- Välj en objektivlins, med en lämplig förstoring för att täcka det intresseområde som anges på blockytan.
Obs! Objekt med förstoringar 2.5X, 5X, 10X, 20X och numeriska öppningar mellan 0,07 och 0,40 används vanligen. Flytta optiken uppåt och nedåt och mikrotomen lateralt med hjälp av det motoriserade korsbordet tills intressanta regionen matchar visningsfältet som visas på datorskärmen.
- Fokus.
- Utför stegvis manuell snittning tills de första strukturerna i provet blir synliga.
- Ordna blockytan i optikets fokusplan genom att flytta mikrotomen i den optiska axelns riktning.
- Välj sektion tjocklek; Sektionstjocklekar från 0,5 till 5 μm rekommenderas.
- Ange intresseområdet.
- Datagenerering och bearbetning
- Starta programvaru rutin som orkestrerar snittning och bildinspelning. Följ den dokumenterade instruktionen för bildhanteringsprogrammet.
- Stoppa programvaru rutin och sätt ett skaleringsglas framför blockytan så snart provet är helt snittat.
- Fånga en bild interaktivt för senare kalibreringtion.
ANMÄRKNING: Detta måste göras varje gång ett mål används i en nyligen ordnad uppsättning. - Konvertera bildserien till 8 bitars gråskaliga bilder in.jpg-format.
- Ladda bildserien i 3D-visualiseringsprogram och justera kontraster.
OBS! Bildkonvertering och 3D-visualisering kan göras med olika kommersiellt eller fritt tillgängliga standardprogramvarupaket, enligt instruktionerna för respektive programvara.
Representative Results
HREM genererar serie av iboende justerade digitala bilder med kontraster som liknar bilder av hematoxylin / eosinfärgade histologiska sektioner. Till skillnad från 2D-sektionsbilder möjliggör staplar av HREM-bilder visualisering och analys av vävnadsarkitekturen, morfologin och topologin av ett brett utbud av organiska material i 3D. Den höga kontrasten underlättar ofta snabb och enkel 3D-visualisering av volymåterställda datormodeller och semiautomatiska konturfyndigheter för generering av ytframställda modeller.
HREM-dataens storlek varierar beroende på storleken på kameramålet, läget för bildinspelning (8, 12, 16 bit, gråskala, färg) och antalet enskilda blockbilder. Mindre datamängder med 1000 8-bit.jpg gråskaliga bilder på 2.048 pixlar x 2.048 pixlar har en storlek på cirka 900 MB. Större dataset med 3 000 8-bit.jpg gråskala bilder på 4.096 pIxel x 4.096 pixlar har volymer på ungefär 20 GB.
De angivna protokollen är enkla och robusta, och under det senaste decenniet var de anställda för att generera HREM-data från många olika prover. Protokoll avsnitt 1.1 optimerades för behandling av hela embryon av biomedicinska modellorganismer med en längd på upp till 1 cm och embryonvävnadsprover med en dimension upp till 5 x 5 x 5 mm 3 ; Vi använde denna metod för att producera HREM-data av embryon av följande arter: mus ( Mus musculus) , kyckling ( Gallus gallus ), zebrafisk ( Danio rerio ), vaktel ( Coturnix coturnix) , afrikansk klodda groda ( Xenopus laevis ), häst Equus ferus caballus ), mjölkbullar ( Oncopeltus fasciatus ), krokodil ( Crocodylia ) och bläckfisk ( Octopus vulgaris ). Uppgifterna för alla arter var av utmärkt kvalitet ( t.ex. Figur 3 )
3 och användes för att visualisera vävnadsprover av Hud, lever, bukspottkörtel, njure, sköldkörtel, hjärta, strimmig muskel, hjärnan, nerver och tumörmodeller skördade från människor ( Homo sapiens ), mus ( Mus musculus ), råttor ( Rattus norvegicus ), svin ( Sus scrofa domestica ) Furo ), fruktfluga ( Drosophila melanogaster ) och zebrafisk ( Danio rerio ). Resultatet var utmärkt med de flesta exemplar ( t.ex. Figur 4 , Animation 1 ), men de mycket centrala delarna av huden (med epidermis) och hjärnproverna större än 3 x 3 x 3 mm 3 förblev ofta ofärgade på grund av otillräcklig penetration av eosin genom Dessa vävnader.
Protokoll sEktion 1.3 optimerades för behandling av fibröst organiskt material och användes för att visualisera fiberarkitekturen hos bestruket papper, obestruket papper, nativt dermal substitutmaterial och stamcellsfrödat dermal substitutmaterial. Dessa prover var enkla och snabba att bearbeta. Uppgifterna i det obelagda pappret och de flesta hudutbyten var av god kvalitet ( Figur 5 , Animation 2 ). Problem uppstod vid bearbetning av det belagda papperet, när det oorganiska materialet hindrade penetration av eosin. En annan fråga uppstod vid bearbetning av hudutbytena på basis av agar eftersom de delades delvist av infiltreringslösningen.
Figur 1: Arbetsflöde. Steg som visas i de röda rutorna kräver ändringar enligt provkännetecken. Steg i de gröna lådorna är de somÄr likartade i alla prover. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Anpassade formar. Mögel kan anpassas genom att skära ett hål i originalformen, sätta in en Pasteur-pipetts glödlampa och täta den med modelleringsmaterial. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempelvis visuella embryon. (A, B) Musembryo skördat vid embryonisk dag, E = 9,5. HREM sektionsbilden visas i (A) (B) . (C) Virtuell sagittal sektion genom en volym gjord modell av halsen på ett E15.5 mus embryo. (D) Chick embryo vid utveckling Hamburger Hamilton (HH) steg 18. Surface modell av armaturen hos de kardiovaskulära komponenterna kombinerat med volymen återgivning av alla embryonvävnader. Skalstänger = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempelvis visuella vuxnavävnadsprover. (A) Del av en HREM sektionsbild genom en mänsklig nerv. Inlägg visar en del av bilden mer detaljerat. (B) Del av en HREM sektionsbild genom grislever. Notera nuclei. (C) Del av en HREM-sektionsbild av mänsklig lymfatisk vävnad. (D, E) Tjock hud på en mänsklig tummuddosa. Volym gjord 3D-modell av hela biopsi. (D) Ytgjorda modeller av artärer, vener och nerver framför en virtuell resektion genom HREM-data (E) . (F) Experimentell tumör i vuxen musvävnad. Volym gjord 3D-modell framför tre virtuella sektioner genom HREM-data. Notera de nekrotiska delarna (arrowheads). Skalstänger = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Exempelvis visualiserat fibermaterial. (A, B) HREM sektionsbild av obelagt, brunt papper. (B) (A) . Notera fibrerna och deras lumen. (C) HREM-sektionen av belagt papper. Observera att fibrerna är ofärgade. (D) Volym gjord modell av nativt dermal substitutmaterial. Notera de olika kaliberna och formen av fibrerna. Skalstänger = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Animation 1: Volym Rendered Modell av tjock hud av en mänsklig tummap. Storleken på vävnadsblocket är ungefär 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . Voxel-storleken är 1,07 x 1,07 x 2 um 3 . Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Animation 2: Volym Rendered Modell av Native Dermal Substitute Material. Storleken på provet är ungefär 1,2 x 0,85 x 0,4 mm 3 . Voxel-storleken är 0,54 x 0,54 x 2 | im 3 . Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Discussion
HREM är en mycket robust mikroskopisk metod som är idealisk för visualisering av ett brett spektrum av organiska material som används inom biomedicin och industri 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . Det kan användas som en exklusiv bildhanteringsmodalitet, som för närvarande används av programmen för utvecklingsstörningar (DMDD) 41 , 42
En fullt fungerande HREM-datagenereringsapparat kan monteras från konventionella laboratoriekomponenter och innefattar ett motoriserat mikrotom, mikroskop, motoriserat korsbord och en dator med lämplig mjukvara 25 . Det är kritiskt att använda en mikrotom utrustad med en blockhållare som reproducerbart stannar efter varje sektion vid en bestämd position och GFP-filterbitar i den optiska vägen. Dock kan helt fungerande allomfattande lösningar köpas från företag som Indigo Scientific.
HREM står inför samma begränsningar som alla histologiska tekniker, förutom att inga artefakter införs under sektion eller sektionsmontering. Det finns emellertid begränsningar som beror på nödvändigheten att fläcka prover före snittning ochFrån inbyggnadsmaterialets egenskaper. Penetration av eosin genom hela provet krävs för att erhålla tillräckliga vävnadskontraster; Väldigt tätt material, fettvävnader och oorganiska ämnen hindrar effektivt penetration av eosin och detta resulterar i obestämda vävnader i mitten av föremålen. Att använda speciella fixeringsmedel hjälper fläckhalsprover, men det finns fortfarande ingen riktig metod för att fullt ut övervinna problemet. En annan begränsning är att hartser som blockerar mer än 2 cm tenderar att bryta under snittning. Detta kan delvis undvikas genom att klippa prov och bearbeta delar separat.
Korrekt placering av små prov eller prov med oregelbundna ytor i formarna under inbäddning är ofta problematisk. Omproverna med agaros och bearbetning av agarosblocket som beskrivs i protokollet löser vanligtvis detta problem 19 . Ett alternativt tillvägagångssätt, som också hjälper till om blocken bryts under sektionenPå att ta bort det redan härdade blocket från hållaren och bädda in det igen, efter det beskrivna inbäddningsproceduren.
En typisk HREM dataset omfattar 500 till 3 000 enstaka bilder. Dess numeriska upplösning bestäms av avståndet mellan de efterföljande bilderna ( dvs. av sektionstjocklek), karaktäristiken för kameramålet och egenskaperna hos den använda optiken. Vi använde snittjocklekar mellan 1 μm och 5 μm och uppnådde bra resultat, även om de presenterade protokollen inte helt eliminerar sken från artefakterna 20 , 46 . Dessa artefakter orsakas av intensivt färgade vävnader belägna djupt inuti blocket, vilket resulterar i suddning av vävnadsinformation på blockytorna med.
Kamerorna hade måldimensioner på 2.560 x 1.920 pixlar 2 , 2.048 x 2.048 pixlar 2 och 4.096 x 4.096 pixlar 2 och var combiNed med objektiv linser med 1.25X, 2.5X, 5X, 10X och 20X. Detta resulterade i numeriska pixelstorlekar mellan 0,18 x 0,18 μm 2 och 5,92 x 5,92 μm 2 , vilket visade sig vara tillräckliga för 3D-analys av vävnadsarkitektur och cellformer, och även för visualisering av kärnor. Med tanke på den höga numeriska upplösningen bör andra cellorganeller också vara synliga. Otillräckliga kontraster på grund av enkel eosinfärgning, och de optiska egenskaperna hos målen minskar dramatiskt möjligheten att diskriminera strukturer. Den maximala sanna rymdupplösningen för HREM-data, som tar hänsyn till den numeriska bländaren, är ungefär 1 x 1 x 1 μm 3 , och tillåter därför en effektiv diskriminering av strukturer större än ungefär 3 x 3 x 3 μm 3 .
Ett vanligt problem för alla digitala bildtekniker är avvägningen mellan storleken på synfältet, som definierar den del av provet som kan visasD på kameramålet och den numeriska upplösningen av bilden. Ju större synfältet är, desto lägre är den maximala möjliga numeriska upplösningen 46 . Den här HREM-inställningen möjliggör generering av HREM-data med ett synfält mellan 0,74 x 0,74 mm 2 (20X objektiv) som visas i en numerisk upplösning av 0,18 x 0,18 μm 2 och 12,12 x 12,12 mm 2 (1,25X objektiv) som visas i En numerisk upplösning på 2,96 x 2,96 μm 2 . Alternativa, kommersialiserade set-ups kan ge större synfält men på bekostnad av sann upplösning. Ändå ger de utmärkt resultat, så uppenbart från de data som visas på DMDD-programmets hemsida 47 .
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Tim Mohun för sina invalubala bidrag till att utveckla HREM och Petra Heffeter för att ge prov.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JB-4 Plus Embedding Kit | Polysciences Europe GmbH | 18570-1 | includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B |
| Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177A-3 | |
| Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177C-3 | |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences Europe GmbH | 15899-50 | |
| Eosin | Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma | 1A-196 | |
| Microtec CUT 4060E | rotary microtome | ||
| Leica DM LM, fluorescence compound microscope | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
| GFP filter set | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | 11090937180000 | |
| Motorised cross table | Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG | KT5-LSMA | |
| Digital video camera SPOT-FLEX | Visitron Systems GmbH. | ||
| precisExcite High-Power LED | Visitron Systems GmbH. | light source | |
| VisiView 2.1.4 | Visitron Systems GmbH. | Image capturing software | |
| Hard metal knife (tungsten carbide), profile D | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
| KL 2500 LCD | Schott AG | light source |
References
- Murray, K. K., Seneviratne, C. A., Ghorai, S. High resolution laser mass spectrometry bioimaging. Methods. 104, 118-126 (2016).
- Holzlechner, M., et al. In Situ Characterization of Tissue-Resident Immune Cells by MALDI Mass Spectrometry Imaging. J Proteome Res. 16 (1), 65-76 (2017).
- Elsayad, K., et al. Spectrally coded optical nanosectioning (SpecON) with biocompatible metal-dielectric-coated substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20069-20074 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29 (12), 700-711 (2013).
- Schneider, J. E., et al. High-resolution imaging of normal anatomy, and neural and adrenal malformations in mouse embryos using magnetic resonance microscopy. J Anat. 202 (2), 239-247 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a new tool for studying embryo anatomy. J Anat. 202 (2), 175-181 (2003).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Dev Dyn. 238 (3), 632-640 (2009).
- Syed, S. H., Larin, K. V., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Optical coherence tomography for high-resolution imaging of mouse development in utero. J Biomed Opt. 16 (4), 046004 (2011).
- Zhang, E. Z., et al. Multimodal photoacoustic and optical coherence tomography scanner using an all optical detection scheme for 3D morphological skin imaging. Biomed Opt Express. 2 (8), 2202-2215 (2011).
- Singh, M., et al. Applicability, usability, and limitations of murine embryonic imaging with optical coherence tomography and optical projection tomography. Biomed Opt Express. 7 (6), 2295-2310 (2016).
- Weninger, W. J., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-D reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anat Embryol (Berl). 197 (5), 341-348 (1998).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat Genet. 30 (1), 59-65 (2002).
- Khairy, K., Keller, P. J. Reconstructing embryonic development. Genesis. 49 (7), 488-513 (2011).
- Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Berrios-Otero, C. A., Wadghiri, Y. Z., Nieman, B. J., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Three-dimensional micro-MRI analysis of cerebral artery development in mouse embryos. Magn Reson Med. 62 (6), 1431-1439 (2009).
- Liu, M., et al. Dual modality optical coherence and whole-body photoacoustic tomography imaging of chick embryos in multiple development stages. Biomed Opt Express. 5 (9), 3150-3159 (2014).
- Mohun, T. J., Leong, L. M., Weninger, W. J., Sparrow, D. B. The morphology of heart development in Xenopus laevis. Dev Biol. 218 (1), 74-88 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211 (3), 213-221 (2006).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding Embryos for High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. 2012 (6), 678-680 (2012).
- Geyer, S. H., Mohun, T. J., Weninger, W. J. Visualizing vertebrate embryos with episcopic 3D imaging techniques. ScientificWorldJournal. 9, 1423-1437 (2009).
- Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
- Adams, D., et al. Bloomsbury report on mouse embryo phenotyping: recommendations from the IMPC workshop on embryonic lethal screening. Dis Model Mech. 6 (3), 571-579 (2013).
- Heddleston, J. M., Chew, T. L. Light sheet microscopes: Novel imaging toolbox for visualizing life's processes. Int J Biochem Cell Biol. 80, 119-123 (2016).
- Powell, K. A., Wilson, D. 3-dimensional imaging modalities for phenotyping genetically engineered mice. Vet Pathol. 49 (1), 106-115 (2012).
- Geyer, S. H., Mohun, T. J., Kamolz, L. P., Weninger, W. J. High resolution episcopic microscopy - current applications. Current Biotechnology. 1 (4), 281-286 (2012).
- Weninger, W. J., Maurer, B., Zendron, B., Dorfmeister, K., Geyer, S. H. Measurements of the diameters of the great arteries and semi-lunar valves of chick and mouse embryos. J Microsc. 234 (2), 173-190 (2009).
- Geyer, S. H., Maurer, B., Dirnbacher, K., Weninger, W. J. Dimensions of the great intrathoracic arteries of early mouse fetuses of the C57BL/6J strain. The Open Anatomy Journal. 4 (1), 1-6 (2012).
- Geyer, S. H., Maurer, B., Pötz, L., Singh, J., Weninger, W. J. High-Resolution Episcopic Microscopy Data-Based Measurements of the Arteries of Mouse Embryos: Evaluation of Significance and Reproducibility under Routine Conditions. Cells Tissues Organs. 195 (6), 524-534 (2012).
- Geyer, S. H., Weninger, W. J. Some Mice Feature 5th Pharyngeal Arch Arteries and Double-Lumen Aortic Arch Malformations. Cells Tissues Organs. 196 (1), 90-98 (2012).
- Kee, H. J., et al. Ret finger protein inhibits muscle differentiation by modulating serum response factor and enhancer of polycomb1. Cell Death Differ. 19 (1), 121-131 (2012).
- Geyer, S. H., Nohammer, M. M., Tinhofer, I. E., Weninger, W. J. The dermal arteries of the human thumb pad. J Anat. 223 (6), 603-609 (2013).
- Geyer, S. H., Weninger, W. J. Metric characterization of the aortic arch of early mouse fetuses and of a fetus featuring a double lumen aortic arch malformation. Ann Anat. 195 (2), 175-182 (2013).
- Maurer, B., Geyer, S. H., Weninger, W. J. A Chick Embryo With a yet Unclassified Type of Cephalothoracopagus Malformation and a Hypothesis for Explaining its Genesis. Anat Histol Embryol. 42 (3), 191-200 (2013).
- Geyer, S. H., et al. High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM): A Tool for Visualizing Skin Biopsies. Microsc Microanal. 20 (5), 1356-1364 (2014).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis Model Mech. 7 (10), 1143-1152 (2014).
- Geyer, S. H., et al. High-resolution episcopic microscopy (HREM): A useful technique for research in wound care. Ann Anat. 197, 3-10 (2015).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. 229 (2), 314-325 (2016).
- Wong, R., Geyer, S., Weninger, W., Guimberteau, J. C., Wong, J. K. The dynamic anatomy and patterning of skin. Exp Dermatol. 25 (2), 92-98 (2016).
- Jenner, F., et al. The embryogenesis of the equine femorotibial joint: The equine interzone. Equine Vet J. 47 (5), 620-622 (2015).
- Wiedner, M., et al. Simultaneous dermal matrix and autologous split-thickness skin graft transplantation in a porcine wound model: a three-dimensional histological analysis of revascularization. Wound Repair Regen. 22 (6), 749-754 (2014).
- Mohun, T., et al. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD): a new programme for phenotyping embryonic lethal mice. Dis Model Mech. 6 (3), 562-566 (2013).
- Wilson, R., et al. Highly variable penetrance of abnormal phenotypes in embryonic lethal knockout mice. Wellcome Open Res. 1, 1 (2016).
- Wilson, R., McGuire, C., Mohun, T. Deciphering the mechanisms of developmental disorders: phenotype analysis of embryos from mutant mouse lines. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D855-D861 (2016).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- Pieles, G., et al. microMRI-HREM pipeline for high-throughput, high-resolution phenotyping of murine embryos. J Anat. 211 (1), 132-137 (2007).
- Weninger, W. J., Geyer, S. H. Episcopic 3D Imaging Methods: Tools for Researching Gene Function. Curr Genomics. 9, 282-289 (2008).
- Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders: DMDD. , Available from: https://dmdd.org.uk/ (2017).
