Summary
Denne artikel beskriver en proces for tuning størrelse og crosslinking tætheden af kovalent crosslinked nanopartikler fra lineær polyestere indeholdende vedhæng funktionalitet. Ved at skræddersy syntese parametre (polymer molekylvægt, vedhæng funktionalitet indarbejdelse og crosslinker ækvivalenter), opnås en ønskede nanopartikel størrelse og crosslinking tæthed for drug delivery applikationer.
Abstract
Vi beskriver en protokol til syntese af lineære polyestere indeholdende vedhæng epoxyharpiks funktionalitet og deres inkorporering i en nanosponge med kontrolleret dimensioner. Denne tilgang begynder med syntese af en functionalized lacton, som er nøglen til vedhæng functionalization af den resulterende polymer. Valerolactone (VL) og allylisothiocyanat-valerolactone (AVL) er derefter copolymeriseret ved hjælp af ring-åbning polymerisering. Efter polymerisering ændring bruges derefter til at installere en epoxyharpiks gruppe på nogle eller alle vedhæng allylisothiocyanat grupper. Epoxy-Amin kemi er ansat til form nanopartikler i en fortyndet opløsning af både polymer og lille molekyle diamin crosslinker baseret på den ønskede nanosponge størrelse og crosslinking tæthed. Nanosponge størrelser kan være kendetegnet ved transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) imaging for at bestemme dimension og distribution. Denne metode giver en vej, hvor meget afstemmelige polyestere kan skabe afstemmelige nanopartikler, som kan bruges til små molekyle drug indkapsling. På grund af karakteren af rygraden er disse partikler hydrolytically og enzymatisk nedbrydeligt for en kontrolleret frigivelse af en bred vifte af hydrofobe små molekyler.
Introduction
Netop tuning størrelse og crosslinking tætheden af nanopartikler baseret på intermolekylære crosslinking er af stor betydning for indflydelse og guide drug release profil af disse nanosystemer1. Designing nanosponge tunability, dvs., forberede partikler af forskellige netværk tætheder, er afhængig af vedhæng funktionalitet forløber polymer og ækvivalenter af de hydrofile crosslinker indarbejdet. I denne tilgang er koncentrationen af forløber og crosslinker i opløsningsmidlet vigtig at formen nanopartikler i en diskret størrelse snarere end en bulk gel. Udnytte kvantitative Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (NMR) som en karakterisering teknik giver mulighed for præcis bestemmelse af indarbejdet vedhæng funktionalitet og polymer molekylvægt. Når nanopartikler er dannet, kan de være koncentreret og oploeses i organics uden at have karakter af en nanogel.
Seneste arbejde i nanopartikel medicinafgivelse har fokuseret på brugen af poly (mælkesyre-co-glykolsyre) (PLGA) selv samlet nanopartikler2,3,4,5,6. PLGA har nedbrydeligt ester forbindelser, hvilket gør det velegnet til drug delivery applikationer og er ofte kombineret med poly(ethylene glycol) (PEG) på grund af dens stealth egenskaber7. Men på grund af PLGA partikel dannelse selvsamlede karakter partikler kan ikke være oploeses i organics for yderligere functionalization. I modsætning til PLGA nanopartikler giver den foreslåede metode kovalente crosslinking danner en nanopartikel med definerede størrelser og morfologi, der er stabile i organics og nedbrydes i vandige opløsninger1. Fordelene ved denne fremgangsmåde er evnen til at yderligere kemisk functionalize overfladen af nanosponge8, og dens stabilitet i organiske opløsningsmidler kan bruges til efter lastning af partikler med lægemiddelsammensætninger1,9. Med denne metode, kan indkapsling af hydrofobe små molekyler opnås ved nedbør i vandige medier. Hydrophobicity af polyester rygraden sammen med den hydrofile kort crosslinker giver disse partikler en amorf karakter ved kropstemperatur. Derudover efter narkotika lastning, kan partikel danne fine suspensioner i vandige medier til at være let injiceres in vivo. Det er vores mål i dette arbejde til at vurdere parametre for syntesen af disse polyester nanosponges og bestemme dem, som er af vital betydning for design og kontrol med størrelse og morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vurdere forholdet mellem parametrene syntese af nanosponge og dens resulterende størrelse, er koncentration og vedhæng funktionaliteten af hver polymer forløber vigtigt. I figur 1udføres en successfulsynthetic ordning af nanosponges på refluks betingelser efter indarbejde begge forløber polymer og diamin crosslinker i DCM i 12 timer. Koncentrationen af Epoxider i løsningen er også afgørende for danner diskrete partikler. Når nanosponges blev syntetiseret, blev TEM imaging brugt til at bestemme de nøjagtige dimensioner af et sæt af partikler. I figur 2, blev en samling af forskellige nanosponge eksperimenter analyseret baseret på deres polymer forløber molekylvægt og vedhæng funktionalitet vedtægter at afgøre, om et forhold mellem to kunne har en effekt på nanosponge størrelse. I figur 2ses en tendens til stigende partikelstørrelse som Molekylær vægt øges til både en 6% og 8% EVL indbygning med én diamin crosslinker pr. epoxyharpiks (2 aminer pr. epoxyharpiks).
Figur 3 viser, at øge både epoxyharpiks procentdel og crosslinker ækvivalenter ville have en lignende virkning samtidig opretholde en lignende molekylvægt mellem nanosponge sæt. Igen, en tendens til at øge nanosponge størrelse, mens ændre disse parametre er set. Det er vigtigt at forstå, hvordan syntesen af polymeren prækursorer kan spille en afgørende rolle i den resulterende nanopartikel størrelse til netop tune nanosponges til forskellige applikationer. Det er også vigtigt at opretholde en reproducerbar og pålidelig metode til nanosponge syntese, som har små afvigelser blandt enkelte partikelstørrelse, som det fremgår af figur 4. Ved at udnytte disse parametre, en vifte af størrelser og en formel for pålideligt gengive en nanosponge af en bestemt størrelse kan udvikles til en given ansøgning eller ønsket mål, at bevise dette at være en alsidig og praktisk nanosponge kemi.
Figur 1: reaktion ordningen for Nanosponge syntese. En lineær polyester copolymer indeholdende vedhæng allylisothiocyanat og epoxyharpiks funktionelle grupper er reagerede med en diamin crosslinker at danne diskrete nanopartikler med størrelsesdimensioner på cirka 100 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: analyse af Nanosponge Tunability baseret på Molekylær vægt og vedhæng funktionalitet. Ved at vurdere ændringerne i nanosponge størrelse baseret på molekylvægt forløber polymer samtidigt med at holder relative vedhæng funktionaliteten det samme, en stigning i partikelstørrelse som molekylvægt stigninger kan blive vist for både 6 og 8% EVL polymerer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af Nanosponge Tunability af Crosslinker og vedhæng funktionalitet ækvivalenserne. Ved at holde crosslinker tilsvarende steady, en højere vedhæng funktionalitet vil resultere i højere crosslinker vedtægter. I denne figur, blev fire aminer pr. epoxyharpiks (to diamin crosslinker ækvivalenter pr. epoxyharpiks) føjet til både en 6% og 10% EVL polymer. Som flere crosslinker er indarbejdet i nanosponge på grund af flere Epoxider pr. polymer og højere crosslinker ækvivalenter, øger størrelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: TEM billede af Nanosponges. En TEM billede af kovalent sammenkædede nanopartikler dannet under syntese. Angivet størrelse 79 ± 12 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
At opnå reproducerbare nanosponge størrelser er afgørende for drug delivery applikationer. Flere parametre i polymerisation og nanosponge syntese påvirker den resulterende partikel størrelse og bitmapgenkendelse massefylde. Tre vigtige parametre blev identificeret i vores analyse: polymer molekylvægt, epoxyharpiks vedhæng funktionalitet og crosslinker ækvivalenter. For at producere en række molekylvægte, inden for og epoxyharpiks funktionaliteter for nanosponge syntese, skal støkiometrisk af VL -co -AVL copolymer ændres. Kan være af en koncentration af allylisothiocyanat funktionel gruppe under epoxidation af copolymer anvendes til epoxidize, enten en ønskede procentdel af allyls, eller dem alle. Hvis et overskud af oxiderende agent bruges, kan nedbrydning af polymer kæde forekomme; Dette kan dog afhjælpes ved at reducere mængden af oxidationsmiddel. Når alle allyls er epoxidized, er der ingen vedhæng allyls på overfladen af nanosponge for yderligere functionalization. Det er også vigtigt for nanosponge syntese, at koncentrationen af epoxyharpiks i løsning nanosponge syntese er 0.0054 M.
Nanosponge reaktion er tidligere blevet evalueret for at fastlægge en optimal koncentration for ønskede nanosponge størrelse varierer13. Denne koncentration er beregnes baseret på Gentag enhedsværdien for epoxyharpiks funktionalitet i polymeren. Gentag enheden er vægten af polymer pr. en reaktiv enhed, som bruges til at beregne modermærker reaktive enheder i en polymer. For eksempel, som vist nedenfor, hvis en polymer med en 2.000 g/mol molekylvægt indeholder 10 reaktive monomere enheder (RMU) forsynet med vedhæng funktionalitet, bestemmes af kvantitative NMR, reaktiv enheden af polymeren er 200 g/mol RMU. Brug denne værdi, kan muldvarpe reaktive enheder beregnes fra polymer vægt for at bestemme crosslinker ækvivalenserne for nanosponge syntese.
Som en generel tendens bidrog øge både polymer molekylvægt og epoxyharpiks funktionalitet til en øget nanosponge størrelse uafhængigt. En smal polydispersity opnår en smal nanosponge størrelse distribution (~ 10% standardafvigelse) og forbedrer reproducerbarhed af nanosponge syntese.
Den præsenterede tilgang opnår en smal polymer dispersity ved brug af en tin triflate katalysator14. Crosslinking ækvivalenserne er beregnet på baggrund af amin pr. epoxyharpiks ækvivalenter, og en stigning i crosslinker ækvivalenter er vist at øge nanosponge størrelse. Det er imidlertid vigtigt på grund af målet med indtager alle tilgængelige Epoxider ved hjælp af et overskud af crosslinker. Resterende Amin funktionalitet på nanosponge overflade kan bruges til yderligere functionalization af partikel overflade.
Sammenlignet med konventionelle metoder til nanopartikel forberedelse, er fordelene ved denne fremgangsmåde de flere parametre af hvilke præcise størrelse og tæthed kan styres, evnen til at yderligere functionalize overfladen af nanosponge og Opløselighed i organics for hydrofobe drug indkapsling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
LK er taknemmelige for finansiering fra National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (DGE-1445197) og Vanderbilt University kemi Institut. LK og EH gerne takke finansiering for Osiris TEM instrument (NSF EPS-1004083).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-(Ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506-100ML | |
| 3-methyl-1-butanol | Sigma-Aldrich | 309435-100ML | anhydrous, ≥99% |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-4L | |
| Allyl bromide | Sigma-Aldrich | A29585-5G | ≥99% |
| Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | saturated solution in DI water |
| Cell culture water | Sigma-Aldrich | W3500-500ML | Filtered through 0.45 μm syringe filter |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-100ML | anhydrous, ≥99%, contains 40 - 150 ppm amylene as stabilizer |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145SK-4 | |
| EZFlow 0.2 μm Syringe Filter | Foxx Life Sciences | 386-2116-OEM | Hydrophillic PTFE, 13 mm |
| EZFlow 0.45 μm Syringe Filter | Foxx Life Sciences | 386-3126-OEM | Hydrophillic PTFE, 25 mm |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Test Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-31 | |
| Fisherbrand Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-666-318 | 1.5 mL |
| Hamilton Microliter Syringe, 100 μL | Hamilton Company | 80600 | Model 710 N SYR, Cemented NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Hexamethylphosphoramide | Sigma-Aldrich | H11602-100G | ≥99%, contains ≤1,000 ppm propylene oxide as stabilizer |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | |
| Magnesium sulfate anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Meta-chloroperoxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031-100G | Purified to ≥99% by buffer wash |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | anhydrous, ≥99% |
| N-butyllithium solution | Sigma-Aldrich | 230707-100ML | 2.5 M in hexanes |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma-Aldrich | 550043-500ML | ≥99% |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| PELCO Pro Reverse (Self-Closing) Tweezers | Ted Pella, Inc. | 5375-NM | |
| Phosphotungstic acid hydrate | Alfa Aesar | 40116 | |
| Q55 Sonicator | Qsonica | Q55-110 | 55 Watts, 20 kHz |
| SiliaMetS Cysteine | Silicycle | R80530B-10g | |
| SnakeSkin Dialysis Clips | Thermo Scientific | 68011 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | 5233-500 | saturated solution in DI water |
| TEM grid | Ted Pella, Inc. | 01822-F | Ultrathin Carbon Type-A, 400 mesh, Copper, approx. grid hole size: 42 µm |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Anhydrous, ≥99.9%, inhibitor-free |
| Tin(II) trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 388122-1G | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Whatman Filter Paper, Grade 1 | Fisher Scientific | 09-805H | Circles, 185 mm |
| δ-valerolactone | Sigma-Aldrich | 389579-100ML | Purified by vacuum distillation |
References
- van der Ende, A. E., Sathiyakumar, V., Diaz, R., Hallahan, D. E., Harth, E. Linear release nanoparticle devices for advanced targeted cancer therapies with increased efficacy. Polym Chem. 1 (1), 93 (2010).
- Sharma, S., Parmar, A., Kori, S., Sandhir, R. PLGA-based nanoparticles: A new paradigm in biomedical applications. Trends Anal Chem. 80, 30-40 (2016).
- Cao, L. B., Zeng, S., Zhao, W. Highly Stable PEGylated Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) Nanoparticles for the Effective Delivery of Docetaxel in Prostate Cancers. Nanoscale Res Lett. 11 (1), 305 (2016).
- Chelopo, M. P., Kalombo, L., Wesley-Smith, J., Grobler, A., Hayeshi, R. The fabrication and characterization of a PLGA nanoparticle-Pheroid® combined drug delivery system. J Mater Sci. 52 (6), 3133-3145 (2016).
- Guan, Q., et al. Preparation, in vitro and in vivo evaluation of mPEG-PLGA nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol. J Mater Sci Mater Med. 27 (2), 24 (2016).
- Cannava, C., et al. Nanospheres based on PLGA/amphiphilic cyclodextrin assemblies as potential enhancers of Methylene Blue neuroprotective effect. RSC Adv. 6, 16720-16729 (2016).
- Locatelli, E., Franchini, M. C. Biodegradable PLGA-b-PEG polymeric nanoparticles: synthesis, properties, and nanomedical applications as drug delivery system. J Nanopart Res. 14 (12), (2012).
- van der Ende, A. E., Croce, T., Hamilton, S., Sathiyakumar, V., Harth, E. M. Tailored polyester nanoparticles: post-modification with dendritic transporter and targeting units via reductive amination and thiol-ene chemistry. Soft Matter. 5 (7), 1417 (2009).
- Lockhart, J. N., Stevens, D. M., Beezer, D. B., Kravitz, A., Harth, E. M. Dual drug delivery of tamoxifen and quercetin: Regulated metabolism for anticancer treatment with nanosponges. J Control Release. 220 (Pt. B), 751-757 (2015).
- Shriner, R. L., Hermann, C. K. F., Morrill, T. C., Curtin, D. Y., Fuson, R. C. The Systematic Identification of Organic Compounds. , 8th ed, Wiley. (2004).
- Derome, A. E. Modern NMR Techniques for Chemistry Research. , Pergamon Press. (1987).
- Williams, D. B., Barry Carter, C. Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science. , 2nd ed, Springer. (2009).
- van der Ende, A. E., Kravitz, E. J., Harth, E. M. Approach to Formation of Multifunctional Polyester Particles in Controlled Nanoscopic Dimensions. J Am Chem. Soc. 130 (27), 8706-8713 (2008).
- Stevens, D. M., Watson, H. A., LeBlanc, M. A., Wang, R. Y., Chou, J., Bauer, W. S., Harth, E. M. Practical polymerization of functionalized lactones and carbonates with Sn(OTf)2 in metal catalysed ring- opening polymerization methods. Polym Chem. 4, 2470-2474 (2013).
