Summary
Denne artikkelen beskriver en prosess for å justere størrelse og crosslinking tettheten av covalently krysskoblet nanopartikler fra lineær polyesters som inneholder anheng funksjonalitet. Ved å skreddersy syntese parametere (polymer molekylvekt, anheng funksjonalitet innlemmelse og crosslinker ekvivalenter), kan en ønsket hydrogenion størrelse og crosslinking tetthet oppnås for stoffet levering programmer.
Abstract
Vi beskriver en protokoll for syntese av lineær polyesters som inneholder anheng epoxide funksjonalitet og inn i en nanosponge med kontrollert dimensjoner. Denne tilnærmingen begynner med syntesen av en functionalized lactone som er nøkkelen til anheng functionalization av den resulterende polymer. Valerolactone (VL) og allyl-valerolactone (AVL) er så copolymerized med ring-åpning polymerisasjon. Etter polymerisasjon endring brukes deretter til å installere en epoxide moiety på noen eller alle anheng allyl gruppene. Epoxy-Amin kjemi ansatt til skjemaet nanopartikler i en fortynnet løsning både polymer og små molekyl diamine crosslinker basert på ønsket nanosponge størrelse og crosslinking tetthet. Nanosponge størrelser kan være preget av overføring elektronmikroskop (TEM) imaging for å bestemme dimensjon og distribusjon. Denne metoden gir en sti som svært tunable polyesters kan opprette tunable nanopartikler, som kan brukes for små molekyl narkotika innkapsling. På grunn av ryggraden er disse partiklene hydrolytically og enzymatisk nedbrytbart en kontrollert utgivelsen av en rekke hydrofobe små molekyler.
Introduction
Nøyaktig innstilling størrelse og crosslinking tettheten av nanopartikler basert på intermolekylære crosslinking er av stor betydning for innflytelse og guide narkotika utgivelsen profilen til disse nanosystems1. Designe nanosponge tunability, dvs., forberede partikler av forskjellige tettheter, er basert på funksjonen anheng av forløperen polymer og ekvivalenter av den hydrofile crosslinker innlemmet. I denne er konsentrasjonen av forløperen og crosslinker i løsemiddelet viktig å skjemaet nanopartikler en diskret størrelse i stedet for en bulk gel. Bruk kvantitativ kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (NRM) som en karakteristikk teknikk gir nøyaktig bestemmelse av innarbeidet anheng funksjonalitet og polymer molekylvekt. Når nanopartikler er dannet, kan være konsentrert og solubilized i organiske uten karakter av en nanogel.
Nyere arbeid i hydrogenion narkotika-leveranser har fokusert på bruk av poly (lactic-co-glykolsyre) (PLGA) selv samlet nanopartikler,2,,3,,4,,5,,6. PLGA har nedbrytbart ester sammenhengene som gjør det egnet for stoffet levering programmer og er ofte kombinert med poly(ethylene glycol) (PEG) på grunn av sin stealth egenskaper7. Imidlertid på grunn selv montert PLGA partikkel-formasjonen, kan ikke partikler være solubilized i organiske for ytterligere functionalization. I motsetning til PLGA nanopartikler gir den foreslåtte metoden kovalente crosslinking danner en hydrogenion med definerte størrelser og morfologi, som er stabile i organiske og svekke i vandige løsninger1. Fordelene med denne tilnærmingen er muligheten til å ytterligere kjemisk functionalize overflaten av nanosponge8, og dens stabilitet i organiske løsemidler kan brukes etter lasting av partikler med farmasøytiske stoffer1,9. Med denne metoden kan innkapsling av hydrofobe små molekyler oppnås ved nedbør i vandige media. Hydrophobicity av polyester ryggraden med hydrofile kort crosslinker gir disse partiklene tegnet amorfe kroppstemperatur. Videre stoffet lasting, kan partikkelen danne fine suspensjoner i vandige media å være lett injisert i vivo. Det er vårt mål i dette arbeidet å vurdere parameterne for syntese av disse polyester nanosponges og finne ut de som er avgjørende for design og størrelse og morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å evaluere forholdet mellom parameterne syntese av nanosponge og resulterende størrelsen, er konsentrasjon og anheng funksjonaliteten til hver polymer forløper viktig. I figur 1utføres en successfulsynthetic ordningen av nanosponges under reflux forhold etter å innlemme både forløper polymer og diamine crosslinker i DCM 12 h. Konsentrasjonen av epoksider i løsningen er også kritisk forming diskrete partikler. Når nanosponges ble syntetisert, ble TEM imaging brukt til å angi nøyaktige dimensjoner av partikler. I figur 2, ble en samling av forskjellige nanosponge eksperimenter analysert basert på deres polymer forløper molekylvekt og anheng funksjonalitet inkorporering å avgjøre hvis en relasjon mellom to kan ha en effekt på nanosponge størrelse. I figur 2sett en trend med økende partikkelstørrelse som molekylvekt økes for både en 6% og 8% EVL innlemmelse med en diamine crosslinker per epoxide (2 aminer per epoxide).
Figur 3 viser at øke både epoxide prosent og crosslinker ekvivalenter ville ha en lignende effekt samtidig opprettholde en lignende molekylvekt mellom nanosponge sett. Igjen, en trend i å øke nanosponge størrelse mens du endrer disse parameterne er sett. Det er viktig å forstå hvordan syntesen av polymer forløpere kan spille en viktig rolle i resulterende hydrogenion størrelsen nøyaktig stille nanosponges for forskjellige programmer. Det er også viktig å opprettholde en reproduserbar og pålitelig metode for nanosponge syntese som har lite avvik mellom individuelle partikkelstørrelse, som vist av Figur 4. Ved å benytte disse parameterne, en rekke størrelser og en formel for pålitelig reprodusere en nanosponge for en bestemt størrelse kan utvikles for et gitt program eller ønsket mål, beviser dette er en allsidig og praktiske nanosponge kjemi.
Figur 1: reaksjon ordningen for Nanosponge syntese. En lineær polyester kopolymer inneholder anheng allyl og epoxide funksjonelle grupper er reagerte med en diamine crosslinker til diskret nanopartikler med dimensjonene på ca 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: analyse av Nanosponge Tunability basert på molekylvekt og anheng funksjonalitet. Ved å evaluere endringen i nanosponge størrelse basert på molekylvekt av forløperen polymer samtidig funksjonen relative anheng, en økning i partikkelstørrelse som molekylvekt øker kan vises for både 6% og 8% EVL polymerer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyse av Nanosponge Tunability av Crosslinker og anheng funksjonaliteten Equivalencies. Ved å holde crosslinker tilsvarende stabil, en høyere anheng funksjonalitet vil resultere i høyere crosslinker innlemmelse. I dette tallet ble fire aminer per epoxide (to diamine crosslinker ekvivalenter per epoxide) lagt til både en 6% og 10% EVL polymer. Flere crosslinker er inkorporert i nanosponge på grunn av flere epoksider per polymer og høyere crosslinker-ekvivalenter, øker størrelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: TEM bilde av Nanosponges. En TEM bilde av covalently koblet nanopartikler dannet under syntese. Angitt størrelse 79 ± 12 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innhenting av reproduserbar nanosponge størrelser er avgjørende i stoffet levering programmer. Flere parametere i polymerisasjon og nanosponge syntese påvirke størrelse og krysskobling tettheten av resulterende partikkel. Tre viktige parametere ble identifisert i vår analyse: polymer molekylvekt, epoxide anheng funksjonalitet og crosslinker ekvivalenter. For å produsere en rekke molekylvekt og epoxide funksjonaliteten for nanosponge syntese, må støkiometri av den VL -co -AVL copolymer endres. Konsentrasjonen av funksjonell allylgruppen under epoxidation av copolymer kan brukes til å epoxidize enten en ønsket prosentandel av allyls eller alle. Hvis et overskudd av oksiderende agent brukes, kan det oppstå nedbrytning av polymer kjeden; men kan dette løses ved å redusere mengden av oksiderende agent. Når alle allyls er epoxidized, er det ikke anheng allyls på overflaten av nanosponge for ytterligere functionalization. Det er også viktig for nanosponge syntese som konsentrasjonen av epoxide i løsning nanosponge syntese 0.0054 M.
Nanosponge reaksjonen er evaluert tidligere for å bestemme en optimal konsentrasjon for ønsket nanosponge størrelse områder13. Denne konsentrasjonen beregnes basert på Gjenta enhetsverdien for epoxide funksjonaliteten i polymer. Gjenta enheten er vekten av polymer per en reaktiv enhet, som brukes til å beregne muldvarpene reaktive enheter i en polymer. For eksempel, som vist nedenfor er hvis en polymer med en molekylvekt av 2000 g/mol inneholder 10 reaktive monomerenheter (RMU) bærer anheng funksjonaliteten, bestemt av kvantitative NMR, reaktive enheten polymer 200 g/mol RMU. Bruker denne verdien, kan muldvarpene reaktive enheter beregnes fra polymer vekten for å bestemme crosslinker equivalencies for nanosponge syntese.
Som en generell trend bidratt øke både polymer molekylvekt og epoxide funksjonalitet til en økt nanosponge størrelse uavhengig. En smal polydispersity oppnår en smal nanosponge størrelsesDistribusjon (~ 10% standardavvik) og forbedrer reproduserbarhet for nanosponge syntese.
Presentert tilnærming oppnår en smal polymer dispersity ved bruk av en tin triflate katalysator14. Crosslinking equivalencies beregnes basert på Amin per epoxide ekvivalenter, og en økning i crosslinker ekvivalenter er vist å øke nanosponge størrelse. Det er imidlertid viktig på grunn av målet av forbruker alle tilgjengelige epoksider å bruke et overskudd av crosslinker. Gjenværende Amin funksjonalitet på nanosponge overflaten kan brukes for ytterligere functionalization av partikkel overflaten.
Sammenlignet med konvensjonelle metoder for hydrogenion forberedelse, er fordeler i denne tilnærmingen flere parametere som nøyaktig størrelse og tetthet kontroll kan oppnås, muligheten til å ytterligere functionalize overflaten av nanosponge og løselighet i organiske for hydrofobe narkotika innkapsling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
LK er takknemlig for finansiering fra National Science Foundation Graduate forskning Fellowship Program (DGE-1445197) og Vanderbilt University kjemi avdeling. LK og EH gjerne takke midler til Osiris TEM apparatet (NSF EPS 1004083).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-(Ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506-100ML | |
| 3-methyl-1-butanol | Sigma-Aldrich | 309435-100ML | anhydrous, ≥99% |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-4L | |
| Allyl bromide | Sigma-Aldrich | A29585-5G | ≥99% |
| Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | saturated solution in DI water |
| Cell culture water | Sigma-Aldrich | W3500-500ML | Filtered through 0.45 μm syringe filter |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-100ML | anhydrous, ≥99%, contains 40 - 150 ppm amylene as stabilizer |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145SK-4 | |
| EZFlow 0.2 μm Syringe Filter | Foxx Life Sciences | 386-2116-OEM | Hydrophillic PTFE, 13 mm |
| EZFlow 0.45 μm Syringe Filter | Foxx Life Sciences | 386-3126-OEM | Hydrophillic PTFE, 25 mm |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Test Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-31 | |
| Fisherbrand Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-666-318 | 1.5 mL |
| Hamilton Microliter Syringe, 100 μL | Hamilton Company | 80600 | Model 710 N SYR, Cemented NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Hexamethylphosphoramide | Sigma-Aldrich | H11602-100G | ≥99%, contains ≤1,000 ppm propylene oxide as stabilizer |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | |
| Magnesium sulfate anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Meta-chloroperoxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031-100G | Purified to ≥99% by buffer wash |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | anhydrous, ≥99% |
| N-butyllithium solution | Sigma-Aldrich | 230707-100ML | 2.5 M in hexanes |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma-Aldrich | 550043-500ML | ≥99% |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| PELCO Pro Reverse (Self-Closing) Tweezers | Ted Pella, Inc. | 5375-NM | |
| Phosphotungstic acid hydrate | Alfa Aesar | 40116 | |
| Q55 Sonicator | Qsonica | Q55-110 | 55 Watts, 20 kHz |
| SiliaMetS Cysteine | Silicycle | R80530B-10g | |
| SnakeSkin Dialysis Clips | Thermo Scientific | 68011 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | 5233-500 | saturated solution in DI water |
| TEM grid | Ted Pella, Inc. | 01822-F | Ultrathin Carbon Type-A, 400 mesh, Copper, approx. grid hole size: 42 µm |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Anhydrous, ≥99.9%, inhibitor-free |
| Tin(II) trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 388122-1G | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Whatman Filter Paper, Grade 1 | Fisher Scientific | 09-805H | Circles, 185 mm |
| δ-valerolactone | Sigma-Aldrich | 389579-100ML | Purified by vacuum distillation |
References
- van der Ende, A. E., Sathiyakumar, V., Diaz, R., Hallahan, D. E., Harth, E. Linear release nanoparticle devices for advanced targeted cancer therapies with increased efficacy. Polym Chem. 1 (1), 93 (2010).
- Sharma, S., Parmar, A., Kori, S., Sandhir, R. PLGA-based nanoparticles: A new paradigm in biomedical applications. Trends Anal Chem. 80, 30-40 (2016).
- Cao, L. B., Zeng, S., Zhao, W. Highly Stable PEGylated Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) Nanoparticles for the Effective Delivery of Docetaxel in Prostate Cancers. Nanoscale Res Lett. 11 (1), 305 (2016).
- Chelopo, M. P., Kalombo, L., Wesley-Smith, J., Grobler, A., Hayeshi, R. The fabrication and characterization of a PLGA nanoparticle-Pheroid® combined drug delivery system. J Mater Sci. 52 (6), 3133-3145 (2016).
- Guan, Q., et al. Preparation, in vitro and in vivo evaluation of mPEG-PLGA nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol. J Mater Sci Mater Med. 27 (2), 24 (2016).
- Cannava, C., et al. Nanospheres based on PLGA/amphiphilic cyclodextrin assemblies as potential enhancers of Methylene Blue neuroprotective effect. RSC Adv. 6, 16720-16729 (2016).
- Locatelli, E., Franchini, M. C. Biodegradable PLGA-b-PEG polymeric nanoparticles: synthesis, properties, and nanomedical applications as drug delivery system. J Nanopart Res. 14 (12), (2012).
- van der Ende, A. E., Croce, T., Hamilton, S., Sathiyakumar, V., Harth, E. M. Tailored polyester nanoparticles: post-modification with dendritic transporter and targeting units via reductive amination and thiol-ene chemistry. Soft Matter. 5 (7), 1417 (2009).
- Lockhart, J. N., Stevens, D. M., Beezer, D. B., Kravitz, A., Harth, E. M. Dual drug delivery of tamoxifen and quercetin: Regulated metabolism for anticancer treatment with nanosponges. J Control Release. 220 (Pt. B), 751-757 (2015).
- Shriner, R. L., Hermann, C. K. F., Morrill, T. C., Curtin, D. Y., Fuson, R. C. The Systematic Identification of Organic Compounds. , 8th ed, Wiley. (2004).
- Derome, A. E. Modern NMR Techniques for Chemistry Research. , Pergamon Press. (1987).
- Williams, D. B., Barry Carter, C. Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science. , 2nd ed, Springer. (2009).
- van der Ende, A. E., Kravitz, E. J., Harth, E. M. Approach to Formation of Multifunctional Polyester Particles in Controlled Nanoscopic Dimensions. J Am Chem. Soc. 130 (27), 8706-8713 (2008).
- Stevens, D. M., Watson, H. A., LeBlanc, M. A., Wang, R. Y., Chou, J., Bauer, W. S., Harth, E. M. Practical polymerization of functionalized lactones and carbonates with Sn(OTf)2 in metal catalysed ring- opening polymerization methods. Polym Chem. 4, 2470-2474 (2013).
