Summary
Den här artikeln beskrivs en process för tuning storlek och crosslinking tätheten av kovalent tvärbunden nanopartiklar från linjär polyester innehållande hänge funktionalitet. Genom att skräddarsy syntes parametrar (polymer molekylvikt, hänge funktionalitet införlivande och crosslinker medel), kan en önskad nanopartiklar storlek och crosslinking täthet uppnås för leverans läkemedelsansökningar.
Abstract
Vi beskriver ett protokoll för syntesen av linjär polyester innehållande hänge epoxihartser funktionalitet och deras införlivande i en nanosponge med kontrollerad dimensioner. Denna strategi börjar med syntesen av en functionalized lakton som är nyckeln till hänge funktionalisering av resulterande polymeren. Valerolactone (VL) och allyl-valerolactone (AVL) är sedan copolymerized med ringa-öppning polymerisation. Efter polymerisation modifiering används för att installera en Epoxid biexponentiellt på några eller alla hänge allyl grupper. Epoxi-Amin kemi är anställd för formuläret nanopartiklar i en utspädd lösning av både polymer- och småmolekylära diamine crosslinker baserat på önskad nanosponge storlek och crosslinking tätheten. Nanosponge storlekar kan karakteriseras av överföring elektronmikroskopi (TEM) imaging för att bestämma dimensionen och fördelning. Denna metod ger en väg som mycket avstämbara polyestrar kan skapa avstämbara nanopartiklar, som kan användas för småmolekylära läkemedel inkapsling. På grund av ryggraden är dessa partiklar hydrolytically och enzymatiskt nedbrytbara för en kontrollerad frisättning av ett brett utbud av hydrofoba små molekyler.
Introduction
Just tuning storlek och crosslinking tätheten av nanopartiklar utifrån intermolekylära crosslinking är av stor betydelse att påverka och styra drogen frige profilen för dessa nanosystem1. Designa nanosponge tunability, dvsförbereder sig partiklar av olika nätverk tätheter, är beroende av funktionen hänge av föregångare polymeren och motsvarigheterna av den hydrofila crosslinker införlivas. I denna strategi är koncentrationen av föregångare och crosslinker i lösningsmedlet viktigt att formuläret nanopartiklar av en diskret storlek snarare än en bulk-gel. Utnyttja kvantitativa kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) som en karakterisering teknik möjliggör exakt bestämning av bolagiserade hänge funktionalitet och polymer molekylvikt. När nanopartiklar bildas, kan de vara koncentrerad och solubilized i organics utan har karaktären av en nanogel.
Senaste arbete i nanopartiklar drogen leverans har fokuserat på användningen av poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLGA) själv monterade nanopartiklar2,3,4,5,6. PLGA har nedbrytbara ester kopplingar som gör den lämplig för drug delivery applikationer och kombineras ofta med poly(ethylene glycol) (PEG) på grund av dess stealth egenskaper7. Dock själv monterade pågrund av PLGA partikelbildning, kan inte partiklarna vara solubilized i organics för ytterligare funktionalisering. I motsats till PLGA nanopartiklar ger föreslagna metoden kovalent crosslinking bildar en nanopartikel med definierade storlekar och morfologi, som är stabil i organics och försämra i vattenlösningar1. Fördelarna med denna metod är möjligheten att ytterligare kemiskt functionalize ytan av den nanosponge8, och dess stabilitet i organiska lösningsmedel kan användas för efter lastning av partiklarna med läkemedelssubstanser1,9. Med den här metoden kan inkapsling av hydrofoba små molekyler uppnås genom utfällning i vattenhaltigt medium. Den vattenavvisande egenskaper polyester stamnätets tillsammans med den hydrofila kort crosslinker ger dessa partiklar en amorf karaktär vid kroppstemperatur. Dessutom efter drogen lastning, kan partikeln bilda fina suspensioner i vattenmedium vara lätt injiceras i vivo. Det är vårt mål i detta arbete att utvärdera parametrar för syntesen av dessa polyester nanosponges och bestämma de som är livsviktiga för konstruktion och kontroll av storlek och morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera förhållandet mellan syntes parametrarna för nanosponge och dess resulterande storlek, är koncentration och hänge funktionaliteten i varje polymer föregångare viktigt. I figur 1utförs en successfulsynthetic ordning med nanosponges reflux villkor efter införliva både föregångare polymer och diamine crosslinker i DCM för 12 h. Koncentrationen av epoxider i lösningen är också kritisk till bildar diskreta partiklar. När nanosponges var syntetiseras, användes TEM imaging att avgöra de exakta dimensionerna av en uppsättning partiklar. I figur 2analyserades en samling av olika nanosponge experiment utifrån deras polymer föregångare molekylvikt och hänge funktionalitet införlivande att avgöra om en relation mellan två kunde har en effekt på nanosponge storlek. I figur 2ses en trend med ökande partikelstorlek som molekylär vikt ökas för både en 6% och 8% EVL inkorporeringen med en diamine crosslinker per epoxihartser (2 aminer per epoxihartser).
Figur 3 visar att öka både epoxihartser procentsats och crosslinker medel skulle ha en liknande effekt samtidigt som en liknande molekylvikt mellan nanosponge uppsättningar. Igen, en trend för att öka nanosponge storlek medan ändra dessa parametrar ses. Det är viktigt att förstå hur syntesen av polymer prekursorer kan spela en viktig roll i den resulterande nanopartiklar storleken till just tune nanosponges för olika applikationer. Det är också viktigt att upprätthålla en reproducerbar och pålitlig metod för nanosponge syntes som har små avvikelser bland enskilda partikelstorlek, som framgår av figur 4. Genom att utnyttja dessa parametrar, en rad storlekar och en formel för att på ett tillförlitligt sätt återge en nanosponge av en viss storlek kan utvecklas för ett visst program eller önskat mål, bevisar att det är en mångsidig och praktisk nanosponge kemi.
Figur 1: reaktionsformel för Nanosponge syntes. En linjär polyester sampolymerer som innehåller hänge allyl och epoxihartser funktionella grupper är reagerade med en diamine crosslinker att bilda diskret nanopartiklar med storlek mått ca 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: analys av Nanosponge Tunability baserat på molekylvikt och hänge funktionalitet. Genom att utvärdera förändringar i nanosponge storlek baserat på föregångaren polymerens molekylvikt samtidigt funktionen relativa hänge samma, en ökning av partikelstorlek som molekylär vikt ökar kan visas för både 6 och 8% EVL polymerer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analys av Nanosponge Tunability av Crosslinker och hänge funktionalitet skalan. Genom att hålla crosslinker motsvarande steady, en högre hänge-funktionalitet kommer att resultera i högre crosslinker inkorporering. I denna figur, har fyra aminer per epoxihartser (två diamine crosslinker ekvivalenter per epoxihartser) lagts till både en 6% och 10% EVL polymer. Som mer crosslinker inkorporeras i nanosponge på grund av mer epoxider per polymer och högre crosslinker medel, ökar storleken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: TEM bild av Nanosponges. En TEM bild av kovalent länkade nanopartiklar bildas under syntes. Anges storleken på 79 ± 12 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att erhålla reproducerbara nanosponge storlekar är mycket viktigt leverans läkemedelsansökningar. Flera parametrar i polymerisation och nanosponge syntes påverkar den resulterande partikeln storlek och crosslink densitet. Tre viktiga parametrar identifierades i vår analys: polymer molekylvikt, epoxihartser hänge funktionalitet och crosslinker medel. För att producera en rad molekylvikter och epoxihartser funktioner för nanosponge syntes, måste stökiometri av den VL -co -AVL sampolymer ändras. Koncentrationen av gruppen allyl under epoxidering av sampolymer kan vara brukade epoxidize antingen en önskad procentandel av allyls eller dem alla. Om ett överskott av oxiderande agent används, kan det uppstå nedbrytning av polymeren kedjan; Detta kan dock avhjälpas genom att minska mängden oxidationsmedel. När alla allyls är epoxidized, finns det ingen hängande allyls på ytan av nanosponge för ytterligare funktionalisering. Det är också viktigt för nanosponge syntes som koncentrationen av epoxihartser i lösning nanosponge syntes är 0.0054 M.
Nanosponge reaktionen har tidigare utvärderats för att fastställa en optimal koncentration för önskad nanosponge storlek spänner13. Denna koncentration beräknas baserat på Upprepa enhetsvärdet för epoxihartser funktionalitet i polymeren. Upprepa enheten är vikten av polymer per en reaktiv enhet, som används för att beräkna mullvadar reaktiva enheter i en polymer. Till exempel som visas nedan mäts om en polymer med en molekylvikt av 2 000 g/mol innehåller 10 reaktiva monomerenheter (RMU) med hänge funktionalitet, bestäms av kvantitativ NMR, reaktiva polymer i 200 g/mol RMU. Använder detta värde, kan mullvadar reaktiva enheter beräknas från polymer vikt för att avgöra crosslinker skalan för nanosponge syntes.
Som en allmän trend bidragit ökar både polymer molekylvikt och epoxihartser funktionalitet till en ökad nanosponge storlek självständigt. En smal polydispertion uppnår en smal nanosponge storlek distribution (~ 10% standardavvikelse) och förbättrar reproducerbarhet av nanosponge syntes.
Den presenterade metoden uppnår en smala polymer systemdispertionen genom användning av en tin triflate katalysator14. De crosslinking skalan beräknas baserat på aminen per epoxihartser medel, och en ökning av crosslinker medel visas att öka storleken på nanosponge. Det är dock viktigt på grund av målet att konsumera alla tillgängliga epoxider med ett överskott av crosslinker. Återstående amine funktionalitet på nanosponge yta kan användas för ytterligare funktionalisering av partikeln ytbehandlar.
Jämfört med konventionella metoder för nanopartiklar förberedelse, är fördelarna med detta tillvägagångssätt flera parametrar som exakt storlek och täthet kontroll kan uppnås, möjligheten att ytterligare functionalize ytan av nanosponge och löslighet i organics för hydrofoba drog inkapsling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
LK är tacksam för finansiering från National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (DGE-1445197) och Vanderbilt University kemi Institutionen. LK och EH vill tacka finansieringen för Osiris TEM instrumentet (NSF EPS 1004083).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-(Ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506-100ML | |
| 3-methyl-1-butanol | Sigma-Aldrich | 309435-100ML | anhydrous, ≥99% |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-4L | |
| Allyl bromide | Sigma-Aldrich | A29585-5G | ≥99% |
| Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | saturated solution in DI water |
| Cell culture water | Sigma-Aldrich | W3500-500ML | Filtered through 0.45 μm syringe filter |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-100ML | anhydrous, ≥99%, contains 40 - 150 ppm amylene as stabilizer |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145SK-4 | |
| EZFlow 0.2 μm Syringe Filter | Foxx Life Sciences | 386-2116-OEM | Hydrophillic PTFE, 13 mm |
| EZFlow 0.45 μm Syringe Filter | Foxx Life Sciences | 386-3126-OEM | Hydrophillic PTFE, 25 mm |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Test Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-31 | |
| Fisherbrand Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-666-318 | 1.5 mL |
| Hamilton Microliter Syringe, 100 μL | Hamilton Company | 80600 | Model 710 N SYR, Cemented NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Hexamethylphosphoramide | Sigma-Aldrich | H11602-100G | ≥99%, contains ≤1,000 ppm propylene oxide as stabilizer |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | |
| Magnesium sulfate anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Meta-chloroperoxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031-100G | Purified to ≥99% by buffer wash |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | anhydrous, ≥99% |
| N-butyllithium solution | Sigma-Aldrich | 230707-100ML | 2.5 M in hexanes |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma-Aldrich | 550043-500ML | ≥99% |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| PELCO Pro Reverse (Self-Closing) Tweezers | Ted Pella, Inc. | 5375-NM | |
| Phosphotungstic acid hydrate | Alfa Aesar | 40116 | |
| Q55 Sonicator | Qsonica | Q55-110 | 55 Watts, 20 kHz |
| SiliaMetS Cysteine | Silicycle | R80530B-10g | |
| SnakeSkin Dialysis Clips | Thermo Scientific | 68011 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | 5233-500 | saturated solution in DI water |
| TEM grid | Ted Pella, Inc. | 01822-F | Ultrathin Carbon Type-A, 400 mesh, Copper, approx. grid hole size: 42 µm |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Anhydrous, ≥99.9%, inhibitor-free |
| Tin(II) trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 388122-1G | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Whatman Filter Paper, Grade 1 | Fisher Scientific | 09-805H | Circles, 185 mm |
| δ-valerolactone | Sigma-Aldrich | 389579-100ML | Purified by vacuum distillation |
References
- van der Ende, A. E., Sathiyakumar, V., Diaz, R., Hallahan, D. E., Harth, E. Linear release nanoparticle devices for advanced targeted cancer therapies with increased efficacy. Polym Chem. 1 (1), 93 (2010).
- Sharma, S., Parmar, A., Kori, S., Sandhir, R. PLGA-based nanoparticles: A new paradigm in biomedical applications. Trends Anal Chem. 80, 30-40 (2016).
- Cao, L. B., Zeng, S., Zhao, W. Highly Stable PEGylated Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) Nanoparticles for the Effective Delivery of Docetaxel in Prostate Cancers. Nanoscale Res Lett. 11 (1), 305 (2016).
- Chelopo, M. P., Kalombo, L., Wesley-Smith, J., Grobler, A., Hayeshi, R. The fabrication and characterization of a PLGA nanoparticle-Pheroid® combined drug delivery system. J Mater Sci. 52 (6), 3133-3145 (2016).
- Guan, Q., et al. Preparation, in vitro and in vivo evaluation of mPEG-PLGA nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol. J Mater Sci Mater Med. 27 (2), 24 (2016).
- Cannava, C., et al. Nanospheres based on PLGA/amphiphilic cyclodextrin assemblies as potential enhancers of Methylene Blue neuroprotective effect. RSC Adv. 6, 16720-16729 (2016).
- Locatelli, E., Franchini, M. C. Biodegradable PLGA-b-PEG polymeric nanoparticles: synthesis, properties, and nanomedical applications as drug delivery system. J Nanopart Res. 14 (12), (2012).
- van der Ende, A. E., Croce, T., Hamilton, S., Sathiyakumar, V., Harth, E. M. Tailored polyester nanoparticles: post-modification with dendritic transporter and targeting units via reductive amination and thiol-ene chemistry. Soft Matter. 5 (7), 1417 (2009).
- Lockhart, J. N., Stevens, D. M., Beezer, D. B., Kravitz, A., Harth, E. M. Dual drug delivery of tamoxifen and quercetin: Regulated metabolism for anticancer treatment with nanosponges. J Control Release. 220 (Pt. B), 751-757 (2015).
- Shriner, R. L., Hermann, C. K. F., Morrill, T. C., Curtin, D. Y., Fuson, R. C. The Systematic Identification of Organic Compounds. , 8th ed, Wiley. (2004).
- Derome, A. E. Modern NMR Techniques for Chemistry Research. , Pergamon Press. (1987).
- Williams, D. B., Barry Carter, C. Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science. , 2nd ed, Springer. (2009).
- van der Ende, A. E., Kravitz, E. J., Harth, E. M. Approach to Formation of Multifunctional Polyester Particles in Controlled Nanoscopic Dimensions. J Am Chem. Soc. 130 (27), 8706-8713 (2008).
- Stevens, D. M., Watson, H. A., LeBlanc, M. A., Wang, R. Y., Chou, J., Bauer, W. S., Harth, E. M. Practical polymerization of functionalized lactones and carbonates with Sn(OTf)2 in metal catalysed ring- opening polymerization methods. Polym Chem. 4, 2470-2474 (2013).
