Summary
כמו קולטן קולטן (TLR) איתות משחק תפקיד חשוב פתופיזיולוגיה של מחלות דלקתיות רבות של האדם, ואת הסדרת תגובות TLR על ידי חלקיקי ביו צפוי להיות מועיל בתנאים דלקתיים רבים. תאי ה- THP-1 מבוססי תאים מספקים פלטפורמה סינון רב-תכליתי וחזק לזיהוי מעכבים חדשים של איתות TLR.
Abstract
תקנה פרמקולוגית של קולטן תשובות קול (TLR) תגובות מבטיח הבטחה גדולה לטיפול במחלות דלקתיות רבות. עם זאת, היו תרכובות מוגבלות זמין עד כה כדי להחליש איתות TLR ולא היו מעכבי TLR אושרה קלינית (למעט תרופות נגד מלריה hydroxychloroquine) בשימוש קליני. לאור ההתקדמות המהירה בננוטכנולוגיה, מניפולציה של היענות חיסונית באמצעות ננו-מכשירים עשויה לספק אסטרטגיה חדשה לטיפול במחלות אלו. כאן, אנו מציגים שיטת תפוקה גבוהה התפוקה לזיהוי במהירות חלקיקים ביואקטיביים חדשים המעכבים איתות TLR בתאי החיסון phagocytic. זו פלטפורמת ההקרנה בנויה על THP-1 תאים תאים מבוססי תא עם מבחני colorimetric ו בלוציפראז. תאים הכתב מהונדסים האדם THP-1 קו התא monocytic ידי שילוב יציב של שני בונה כתב inducible. אחד מהם מבטא גנים מופרדים של פוספטז אלקליין (SEAP)תחת שליטה של יזם inducible על ידי גורמי שעתוק NF-κB ו- AP-1, והשני מבטא גן לוציפראז מופרש הגן תחת שליטה של יזמים המושרה על ידי גורמים אינטרפרון רגולטורית (IRF). לאחר גירוי TLR, תאים כתב גורמי שעתוק ולאחר מכן לייצר SEAP ו / או בלוציפראז, אשר ניתן לזהות באמצעות ריאגנטים המצע המתאימים שלהם. בעזרת ספריה של כלאיים של ננו-חלקיקים (GNP) של פפטיד-זהב, שהוקמו במחקרינו הקודמים כדוגמה, זיהינו פפטיד אחד-גנפ היברידי שיכול לעכב באופן יעיל את שתי הזרועות של TLR4 איתות אשד מופעלות על ידי ליגנד, lipandyscharide (LPS) שלה. הממצאים אושרו על ידי טכניקות ביוכימיות סטנדרטיות כולל immunoblotting. ניתוח נוסף קבע כי זה היברידית להוביל היה ספקטרום מעכב רחב, הפועל על מסלולי TLR מרובים, כולל TLR2, 3, 4, ו 5. גישה זו ניסיוני מאפשר הערכה מהירה של whetheRa nanoparticle (או תרכובות טיפוליות אחרות) יכול לווסת ספציפי איתות TLR בתאי החיסון phagocytic.
Introduction
קולטנים דמויי חיוג (TLR) הם אחד המרכיבים העיקריים במערכת החיסון המולדת התורמת לקו ההגנה הראשון מפני זיהומים. TLRs אחראים לחישה של פתוגנים פולשים על ידי זיהוי רפרטואר של דפוסי מולקולרית הקשורים פתוגן (או PAMPs) והגברת התגובות הביטחון באמצעות מפל של התמרה האות 1 , 2 . ישנם 10 TLRs האדם מזוהים; למעט TLR10 שעבורם הליגנד (ים) עדיין לא ברור, כל TLR יכול לזהות קבוצה ייחודית, משומרת של PAMPs. לדוגמה, TLR2 ו- TLR4, הממוקמים בעיקר על פני התא, יכולים לזהות ליפופרוטאינים וגליקוליפידים מחיידקים חיוביים של גראם וחיידק גראם, בהתאמה; בעוד TLR3, TLR7 / 8 ו TLR9, בעיקר נוכח תאים endosomal, יכול לחוש RNA ו- DNA מוצרים מווירוסים וחיידקים 3 . כאשר מגורה על ידי PAMPs, TLRs להפעיל חיסון תגובות חיוניות על ידי שחרור pro-infמתווכי lammatory, גיוס והפעלת מפעיל תאים חיסוניים, ותיאום אירועים חיסוניים אדפטיבית עוקבים 4.
את האותות TLR איתות יכול להיות פשוט מסווג לשני מסלולים עיקריים 5 , 6 . האחת תלויה בחלוקה למינון חלבון מיאלואיסטי 88 (MyD88) - מסלול תלוי ב- MyD88. כל TLRs למעט TLR3 לנצל את המסלול הזה כדי להפעיל גורם גרעיני kappa-light-chain משפר של תאים B פעיל (NF-κB) ו מיטוגן הקשורים חלבון קינאזות (MAPKs), המוביל הביטוי של מתווכים פרו דלקתיים כגון TNF- Α, IL-6 ו- IL-8. המסלול השני משתמש ב- TIF-domain המכיל מתאם-אינטרפרון אינטרפרון-β (TRIF) - מסלול תלוי-תלות ב- TRIF או MyD88 - כדי להפעיל גורמים רגולטוריים של IFF (IRF) ו- NF-κB, וכתוצאה מכך ייצור הקלד I IFNs. איתות TLR שלםהוא קריטי להגנה היומי שלנו מפני זיהומים מיקרוביאליים ויראליים; ליקויים במסלולי איתות TLR יכולים להוביל לחוסר חיסונים ולעתים קרובות מזיקים לבריאות האדם. 7
עם זאת, איתות TLR הוא "חרב פיפיות" והפעלת מופרזת, בלתי מבוקרת של TLR מזיקה. תגובת יתר TLR תגובות לתרום הפתוגנזה במחלות רבות דלקתיות אנושיות כרוניות כרוניות 8 , 9 . לדוגמא, אלח דם המאופיין בדלקת מערכתית ובפציעה מרובה איברים, נובעת בעיקר מתגובות חיסוניות חריפות כלפי זיהומים, כאשר TLR2 ו- TLR4 ממלאים תפקיד מכריע בפתופיזיולוגיה של 10 , 11 , 12 . בנוסף, TLR5 נמצא לתרום דלקת ריאות כרונית של חולים עם סיסטיק פיברוזיס 13, 14 יתר על כן, dysregulated endosomal TLR איתות (למשל, TLR7 ו TLR9) קשורה קשר הדוק עם התפתחות והתקדמות של מחלות אוטואימוניות מספר כולל זאבת מערכתית erythematosus (SLE) ו דלקת מפרקים שגרונית (RA) 15 , 16 . קווים אלה מתכנסים של עדויות לזהות איתות TLR כיעד פוטנציאלי פוטנציאלי עבור מחלות דלקתיות רבות 17 .
למרות התרופות הפרמקולוגיות של תגובות TLR צפוי להיות מועיל בתנאים דלקתיים רבים, למרבה הצער, יש כיום מעט מאוד compounds זמין קלינית כדי לעכב TLR איתות 9 , 17 , 18 . זה בחלקו בשל המורכבות ואת יתירות של מסלולי TLR מעורב בהומיאוסטזיס החיסונית המחלה פתולוגיה. לכן, מחפש רומן, potenT סוכני טיפול למקד מסלולי איתות מרובים TLR יכול לגשר על הפער הבסיסי, ולהתגבר על האתגר של קידום מעכבי TLR לתוך המרפאה.
לאור ההתקדמות המהירה nanoscience ו ננוטכנולוגיה, nanodevices מתעוררים כמו מודולים TLR הדור הבא בשל תכונות ייחודיות שלהם 19 , 20 , 23 . גודל ננו מאפשר אלה nano-therapeutics יש ביו הפצה טוב יותר במחזור מתמשך 24 , 25 , 26 . הם יכולים להיות פונקציונליים נוספת לפגוש את הרצוי פרמקודינמי פרופילים פרמקוקינטי 27 , 28 , 29 . יותר מרגש, הפעילות ביו של אלה nanodevices הרומן נובעת התכונות הפנימיות שלהם, אשר יכול להיות מותאם עבוריישומים רפואיים ספציפיים, ולא רק מתנהג כמו רכב מסירה עבור סוכן טיפולי. לדוגמה, צפיפות גבוהה ליפופרוטאין (HDL) כמו nanoparticle נועד לעכב איתות TLR4 על ידי scavenging ליגנד TLR4 LPS 23 . בנוסף, פיתחנו פפטידי זהב nanoparticle מערכת היברידית, שבו פפטידים מעוטרים יכולים לשנות את תכונות פני השטח של חלקיקי זהב, ולאפשר להם יש שונים ביו פעילויות 30 , 31 , 32 , 33 . זה עושה להם סוג מיוחד של סמים (או "ננו סמים") כמו הדור הבא ננו-תרפויטים.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה לזהות סוג חדש של פפטיד זהב זהב nanoparticle (פפטיד, GNP) היברידים שיכולים לעכב מספר רב של מסלולי איתות TLR ב phagocytic תאים החיסון 32 , '33 . הגישה מבוססת על זמינות מסחרית THP-1 שורות תאים כתב. תאי הכתב מורכבים משני מבנים יציבים, בלתי ניתנים להזרקה: אחד נושא גנים מופרדים של אלקליין פוספטאז (SEAP) עוברי (SEAP) תחת שליטה של יזם המושרה על ידי גורמי שעתוק NF-κB ו activator חלבון 1 (AP-1); השני מכיל גן לוציפראז מופרש הגן תחת שליטה של היזמים המושרה על ידי גורמים אינטרפרון הרגולציה (IRFs). על גירוי TLR, התמרה האות מוביל ההפעלה של NF-κB / AP-1 ו / או IRFs, אשר הופכת את גנים כתב לסוד SEAP ו / או בלוציפראז; אירועים כאלה ניתן לזהות בקלות באמצעות ריאגנטים המצע המתאים שלהם עם ספקטרופוטומטר או luminometer. באמצעות גישה זו המסך המסך שהוקם בעבר שלנו של כלאיים פפטיד- GNP, זיהינו מועמדים להוביל שיכולים לעכב נתיבים איתות TLR4. הפעילות המעכבת של הפפטיד המוביל -Hyperids GNP אושר לאחר מכן באמצעות גישה ביוכימית אחרת של immunoblotting, והעריכו על מסלולי TLR אחרים. גישה זו מאפשרת סינון מהיר ויעיל של סוכנים חדשים הממקדים מסלולי איתות TLR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תרבות תאים מדיה ריאגנטים
- הכינו את התרבות כולה תא בינוני R10 על ידי הוספת תוספי 10% בסרום שור עוברית (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין ו 1 מ"מ נתרן pyruvate לתוך המדיום RPMI-1640.
- הכן את המדיום הבחירה בינוני R10-Z על ידי הוספת אנטיביוטיקה Zeocin (200 מיקרוגרם / מ"ל) כדי R10 לשמירה על הביטוי של SEAP תחת שליטה של NF-κB / AP-1 ההפעלה. כדי לבחור תאים המבטאים הן SEAP ו גנים לוציפראז כתב, להוסיף גם זאוצין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו blasticidin (10 מיקרוגרם / מ"ל) כדי R10 (כמו R10-ZB).
- הכן את פתרון המצע SEAP ידי המסת שקיק אחד של אבקת המצע (ה .g., Quanti-כחול) לתוך 100 מ"ל ultrapure, מים חינם רעלן פנימי בבקבוק 125 מ"ל זכוכית נקייה.
- מערבולת הפתרון בעדינות דגירה אותו על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות כדי להבטיח את הפירוק המלא של מצעים. <Li> לסנן את הפתרון באמצעות קרום 0.2 מיקרומטר כדי להבטיח את העוקץ שלה (אופציונלי), ולאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות לפני השימוש.
- לאחר המסת אבקה לחלוטין, להשתמש מיד פתרון. לחלופין, לאחסן את הפתרון ב 4 ° C (עד שבוע) או ב -20 ° C (עד חודש) לפני השימוש.
זהירות: שני פתרונות המצע הם רגישים לאור, ויש להימנע מחשיפה לאור בכל עת. מספר מחזורי הקפאת ההפשרה של הפתרון עלול לגרום לחוסר יציבות של המצע ולקצר את חיי המדף שלו.
זהירות: הכנה מגיב לשימוש תרבותי צריך להתבצע בארון biosafety, וכל המכלים צריך להיות מעוקרים לפני השימוש. הקפאה חוזרת ונשנית של מחזורי הפשרה של PMA ופתרונות LPS יש להימנע.
2. תרבות של THP-1 כתב תא מקרופאגים הנגזרים
- השתמש בשני שורות תאים THP-1 כתב: THP-1-XBlue ו THP-1-Dual תאים. לשעבר יש גן הכתב SEAP נשלט על ידי NF-κB / AP-1, והאחרת יש מערכת גן כפול כתב, אותו הגן הכתב SEAP ו IRF נשלט בלוציפראז הגן. הIR נהלים תרבותיים זהים למעט התקשורת תרבות הבחירה.
- ההפשרה מלאי תא עובד (~ 5 x 10 6 תאים) ב 10 מ"ל של המדיום R10, לסובב את התאים ב XG 300 במשך 5 דקות. תאים Resuspend ב 10 מ"ל של המדיום R10, ולהעביר אותם לתוך בקבוק T75 תרבות. שערי המדיום תרבות כל 2-3 ימים עד תאים להגיע צפיפות של 1 x 10 6 תאים / מ"ל.
- כאשר צמיחת תאים מגיע יכולתו, תאים המעבר כדי להפחית את צפיפות התאים בטווח של 2-5 x 10 5 תאים / מ"ל, כך התאים יכולים להמשיך לגדול.
- לאחר לפחות מעבר אחד, להתחיל תרבות התאים במדיום הבחירה בינוני: R10-Z עבור THP-1-XBlue, ו R10-ZB עבור THP-1-Dual. לאחר culturing התאים עם בינוני תרבות הבחירה עבור מעבר אחד לפחות, תאים מוכנים הניסוי.
זהירות: גידול יתר של תאים עלול לגרום למוות משמעותי של תאים; את הכדאיות התא צריך לשמור> 98%. שמור תיעוד של מספר המעבר כמו celאני יכול להתנהג אחרת אחרי קטעים רבים (20 מעברים).
הערה: צלוחיות תרבות תאים ניתן לעשות בה שימוש חוזר מספר פעמים כדי לחסוך בעלויות; עם זאת, בפועל זה עשוי להגביר את הסיכון של זיהום כללי זיהום צולבות בין צלוחיות שונות (אם טיפול שורות תאים שונים בו זמנית). במהלך חילופי התקשורת המעבר התא, צנטריפוגה מוגדר 300 xg במשך 5 דקות.
- כדי לבצע assay תא הכתב, תאים זרע לתוך 96-היטב שטוחה בתחתית תרבות התא התא ולהבדיל אותם מקרופאגים. הנהלים מתוארים להלן.
- מעבירים את התאים מן הבקבוק כדי צינור צנטריפוגות, לסובב את התאים ב XG 300 במשך 5 דקות, resuspend אותם במדיום R10 בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מ"ל. הוסף aliquots של פתרון PMA לתוך המתלים התא עם ריכוז סופי של 50 ng / מ"ל.
- העברת 100 μL של המתלים התא לתוך כל טוב של 96-WeLl באמצעות פיפטה מרובת ערוצים. לדגור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס (בתא תרבות חממה) במשך 24 שעות.
- לאחר הדגירה, להסיר בזהירות את המדיום תרבות באמצעות aspirator ואקום (או עם פיפטה רב ערוצי), ולשטוף בעדינות את התאים עם PBS (100 μL / טוב) פעמיים; להוסיף 100 μL של מדיום R10 טריים היטב כל אחד. הנח את התאים במשך 2 ימים בחממה לפני ביצוע assay הכתב.
זהירות: הצעד מנוחה חשוב מאוד לאפשר לתאים להירגע לאחר גירוי PMA למצב השקט הרגיל שלהם. זה יכול להפחית באופן משמעותי את אותות הרקע של גנים הכתב בתנאים unstimulated.
הערה: לאחר 24 גירוי עם PMA, התאים נבדלים פנוטיפ דמויי מקרופאג, עם מאפיין של הידבקות התא בתחתית הבאר, וכן תכונה מורפולוגית של pseudopodia.
3. הקרנה עבור פוטנציאליים TLR4 Nano מעכבי באמצעות תאים כתב הערה: מאז איתות TLR4 מנצל שני מסלולים תלויי MyD88 ו- TRIF, הוא נבחר כיעד העיקרי להקיף מגוון רחב של מסלולי איתות TLR. THP-1-XBlue תאים כתב משמשים בעיקר לבחון את ההפעלה NF-κB / AP-1 בעוד THP-1-Dual תאים הם עבור הפעלת IRF מן התמרת האות תלוי TRIF.
- זיהוי מינון LPS אופטימלי על ידי יצירת עקומת מינון התגובה לפני ההקרנה.
- לדלל את פתרון LPS עובד לריכוז סופי של 0.01 - 100 ng / mL במדיום R10 (לעשות דילול בסולם log10). פריסת צלחת עיצוב ולעשות דילול של 96-היטב עגול תרבות בתחתית. ודא כי כל טוב יש מינימום של 110 μL של פתרון לאחר דילול.
- הסר בעדינות את המדיום תרבות מהצלחת seeded (מ 2.2.3) באמצעות אספירטור ואקום.
- העברת LPS המכיל בינוני R10 מוכן בצלחת דילול (3.1.1) iאל צלחת התרבות על פי הפריסה של הדגימות. לדגור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס (בתא תרבות חממה) במשך 24 שעות.
- בשעה 24 שעות, בזהירות להעביר את supernatants (80 μL / טוב) לתוך צלחת 96-היטב חדש בתחתית. בצע את assay colorimetric ו / או בלוציפראז הארה על פתרונות אלה באופן מיידי או לאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס (כמה שעות) או -20 מעלות צלזיוס (ימים) לפני הפיתוח assay.
הערה: העיצוב של פריסת צלחת צריך להיות פשוט וברור לניסוי וניתוח נתונים. עבור כל תנאי, 2-4 משכפל צריך להיחשב. כלול תמיד קבוצת בקרה שלילית (LPS null). מומלץ להשתמש בתאי THP-1-XBlue להפעלת NF-κB / AP-1, שכן התאים הכפולים בעלי רקע גבוה יחסית של הפעלת NF-κB / AP-1 לאחר הפיכתם למקרופאגים. עם זאת, זה אפשרי להשתמש בתאים כפולה לדיווח הן NF-κB / AP-1 ו IRF ההפעלה.
- לפתח את הצבעAssay imetric עבור NF-κB / AP-1 ההפעלה ואת assay הארה בלוציפראז עבור הפעלת IRF.
- כדי להעריך את ההפעלה NF-κB / AP-1, העברת 20 μL של supernatant של כל דגימה לתוך צלחת חדשה 96-היטב בתחתית שטוחה; ולהוסיף 180 μL של מראש חימם SEAP פתרון המצע לתוך כל טוב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 - 2 שעות כדי לאפשר את פיתוח צבע (ורוד כחול כהה). לאסוף את הקליטה ב 655 ננומטר על קורא צלחת.
זהירות: זמן הדגירה יכול להיות מגוונות על בסיס התפתחות צבע (30 דקות עד הדגירה לילה). מומלץ לחכות עד צפיפות אופטית (OD) של הצבע הכהה מגיע מעל 1, תוך הימנעות הרוויה של התפתחות צבע (OD> 3). - לניתוח של הפעלת IRF, להעביר 10 μL של supernatant של כל דגימה לתוך צלחת שטוחה שטוחה 96 שטוח גם לבן. מוסיפים את הפתרון בלוציפראז (50 μL) ומיד לאסוף את w הארה wזה בסדר.
הערה: מומלץ מאוד להשתמש הקורא צלחת הארה עם פונקציה הזרקת אוטומטי כדי להבטיח את עקביות הקרינה האור מ היטב גם מהצלחת לצלחת. אם פתרונות המצע מוזרקים באופן ידני, אנא הקפידו על זמן דגירה עקבי וקביעת הגדרות עבור כל אחד מהם.
- כדי להעריך את ההפעלה NF-κB / AP-1, העברת 20 μL של supernatant של כל דגימה לתוך צלחת חדשה 96-היטב בתחתית שטוחה; ולהוסיף 180 μL של מראש חימם SEAP פתרון המצע לתוך כל טוב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 - 2 שעות כדי לאפשר את פיתוח צבע (ורוד כחול כהה). לאסוף את הקליטה ב 655 ננומטר על קורא צלחת.
- ביצוע assay ההקרנה על כלאיים שונים ppide-GNP עם 10 ng / מ"ל LPS גירוי (מבוסס על 3.1). בצע את ההליך אותו 3.2 עבור פיתוח assay כתב.
- לרכז את כלאיים פפטיד-GNP ל 200 ננומטר במדיום R10 באמצעות שיטת צנטריפוגה. צנטריפוגה 20 כרכים של הפתרון היברידי (10 ננומטר) ב XG 18,000 במשך 30 דקות, בזהירות להשליך supernatants. לאסוף את כלאיים (בחלק התחתון של הצינור) לתוך צינור, לשטוף אותם עם PBS פעמיים, ולהשעות מחדש את הכלאיים בנפח אחד של המדיום R10.
- מערבבים כרכים שווים של היברידים מרוכזיםLPS (20 ng / mL) המכיל R10 בינוני יש ריכוז סופי של היברידים LPS להיות 100 ננומטר 10 ng / מ"ל, בהתאמה.
- הסר את המדיום תרבות מהצלחת תרבותי (2.2.3) ולהוסיף 100 μL של הפתרון המעורב לתוך כל טוב (3 משכפל עבור כל תנאי); לכלול שליטה שלילית (בינוני בלבד) ו LPS שליטה (10 ng / mL LPS ללא כלאיים).
- לאחר הדגירה 24 שעה על 37 מעלות צלזיוס, להעביר את המדיום של כל טוב לתוך צינור צנטריפוגה צינורות ב XG 18,000, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. איסוף supernatants (50-80 μL / צינור) לתוך צלחת 96-גם בתחתית, ולבצע assay הכתב כמתואר 3.2.
זהירות: בעת השלכת supernatants לאחר צנטריפוגה, לא לסחוט את ההיברידיות בתחתית הצינור.
הערה: צנטריפוגה בשלב 3.3.4 חשוב מאוד להסיר את כלאיים nanoparticle מופנם מן המדיום התרבות, והוא יכול למנוע את ההפרעה של כלאיים עם שיתוףלורימטרי / הקרינה הארה. הסיבה לכך היא חלקיקים זהב יכול לספוג אורכי גל רחב של אור בהתאם לגודל שלהם ו agglomeration.
4. אימות ההשפעה המעכבת של המועמדים הפוטנציאליים
הערה: כדי לאשר את ההשפעה המעכבת של המועמדים הפוטנציאליים מהמיון, מועסקים שתי גישות. אחת מהן היא לבחון את תגובות המינון של הממריצים (LPS) בריכוז היברידי קבוע (או להיפך); השני הוא ישירות להסתכל על עיכוב על NF-κB / AP-1 ו IRF3 אותות באמצעות immunoblotting.
- בגישה 1, לבצע assay הכתב עם 100 ננומטר של היברידיות עופרת ושני ריכוזי LPS ב 1 ng / mL ו 10 ng / mL הבאים אותם הליכים המתוארים 3.3. כלול היברידית לא פעילה (בהתבסס על תוצאות ההקרנה) כביקורת היברידית לשם השוואה.
- עבור הגישה immunoblotting, אנא פעל לפי תקן eנהלים קלים.
- תרבות THP-1 תאים במדיום R10, זרע התאים לתוך צלחת 12 גם תרבות (2 x 10 6 תאים / טוב), ולהבדיל אותם מקרופאגים על ידי טיפול בתאים עם 50 ng / mL PMA עבור 24 שעות ואחריו מנוחה עבור 2 ימים.
- לאחר התמיינות תאים, לעורר תאים עם 10 ng / mL LPS עם / ללא היברידיות (100 ננומטר) לאורך זמן (עד 4 שעות). בנקודות זמן שונות (0, 5, 15, 30, 60, 120 ו 240 דקות), להכין את lysates התא עבור immunoblotting. כלול היברידי לא פעיל כביקורת.
- בדוק את האותות של IκBα, posphorylated p65, ו phosphorylated IRF3 לבחון את ההשפעה המעכבת של היברידיות עופרת על ההפעלה של NF-κB ו IRF3. בדוק את β- אקטין ו IRF3 סך האותות כמו בקרות פנימיות.
הערה: התמרה האות לעתים קרובות מתרחשת מהר יותר (בעוד כמה שעות) ואז את הביטוי של האנזים עיתונאי SEAP ו בלוציפראז (24 שעות). מומלץ מאוד גם perforAssay הכדאיות של היברידים נבדק ב 24 שעות כמו שיטת אימות נוספת.
5. הערכת ייחוד ה- TLR
הערה: כדי לחקור את סגוליות ה- TLR של הפפטיד-GNP ההיברידי, נבדקים מסלולי איתות TLR אחרים, כולל TLR2, TLR3 ו- TLR5. TLR7, 8 ו 9 אינם נכללים כי מקרופאגים הנגזרים THP-1 לא מגיבים היטב לגירוי של אלה TLRs בשל היעדר TLR7, 8 ו 9 ביטוי מקרופאגים 34 .
- מבחן ריכוזים שונים (1 ng / mL ל 25 מיקרוגרם / מ"ל) של ligands ספציפיים TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (פולי אני: C) ו TLR5 (flagellin) על שני תאים כתב הנגזרים מקרופאגים להשיג את הריכוז האופטימלי הבא הליך 3.1 ו -3.2.
- טפל בתאים עם תערובות של היברידית עופרת (100 ננומטר) וכל ליגנד TLR בריכוז המתקבל 5.1 כדי להעריך את הספציפיות המעכבת של h להובילYbrid על פי הנוהל הניסוי המתואר 3.3. כלול את היברידית לא פעילה כבקרה להשוואה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגישה הניסויית הכוללת מתוארת באיור 1 . שני שורות תא הכתב THP-1, THP-1-XBlue ו- THP-1-Dual, משמשים לתצוגה מהירה של תגובות ה- TLR על-ידי בחינת ההפעלה של NF-κB / AP-1 ו- IRF, בהתאמה. ההפעלה של NF-κB / AP-1 יכול להיות מזוהה על ידי assay colorimetric SEAP, בעוד ההפעלה IRF הוא פיקוח על ידי הארה בלוציפראז. מונוציטי THP-1 תאים ניתן להפיק בקלות מקרופאגים כדי המסך nanodevices לפעילות immunomodulatory שלהם על תאים מולדים phagocytic החיסון. עם מערכת הכתב, ההקרנה יכולה להתבצע בצורה תפוקה גבוהה; גישה כזו היא תכליתי לגילוי של immunotherapeutics חדש, במיוחד המיקוד על איתות החיסון המולדת כגון איתות TLR.
הליך ההקרנה והתוצאות נציג מוצגים ב איור 2 א ו 2 ב ). ריכוזים שונים של ligands TLR (TLR4 כדוגמה) נבדקים לראשונה כדי להשיג את הריכוז האופטימלי עבור ההקרנה בפועל של כלאיים פפטיד- GNP. גירוי TLR4 על ידי LPS הביא ההפעלה של NF-κB / AP-1 ואת הייצור של SEAP. SEAP שוחרר להמיר את המצע ושינה המאפיין photophysical שלה, אשר יכול להיות פיקוח על ידי הסטה של ספיגת האור, המוביל שינוי צבע פתרון ( איור 2 ג ). שינוי כזה הוא יחסי לכמות SEAP שפורסמו על גירוי, והוא יכול לכמת על ידי מדידת ספיגת ב 655 ננומטר על ספקטרופוטומטר ( איור 2 ד ). באופן דומה, ההפעלה של IRFs (מופעלות על ידי LPS) הובילה הביטוי של luciferasE, אשר catalyzed את המצע לייצר הארה ( איור 2E ). בהתבסס על תגובות מינון אלה, ריכוז אופטימלי של LPS (10 ng / mL) שימש למסך ספרייה קטנה שהוקמה בעבר של כלאיים פפטידים-GNP ( טבלה 1 ). ייצור המצרכים ההיברידיים והמאפיינים הפיסיקוכימיים שלהם תוארו בפרסומים הקודמים שלנו 30 , 31 , 32 . מתוך ההקרנה, קבוצה של כלאיים (P12 ונגזרותיה) זוהו על פעילותם המעכבת החזקה בפעולת NF-κB / AP-1 ו- IRF שהפעילה LPS ( איור 2F ); מעניין, P13 היברידית, רק שונה במקצת מ P12 בציפויים פפטיד, לא היה שום פעילות מעכבת, אשר יכול לשמש כבקרה היברידית להשוואה. נגזרות P13 הראו מידה שונה של פעילות מעכבת קלה בהתאם לאוטהR מעוטר פפטיד על פני השטח.
לאחר זיהוי היברידית עופרת, חשוב לאמת את הפעילות מעכב. העיכוב אושר לראשונה על ידי בחינת היחסים השונים של היברידית LPS כדי להוציא תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליים בשל חפצים טכניים. כמו הריכוז של LPS גדל, ההשפעה המעכבת של היברידית (בריכוז קבוע) מופחת כצפוי ( איור 3 א ו 3 ב ). כדי להבטיח עוד כי עיכוב שנצפה מבחני הכתב היה אכן תוצאה של down- המסדיר את NF-κB ו IRF איתות על ידי היברידית להוביל, immunoblotting נערך כדי להעריך באופן ישיר את התמרה חלבון האות לאורך זמן. ההפעלה של NF-κB ו IRF3 נבדקה על ידי בחינת זרחון של P65 NF-κB subunit ואת השפלה של מעכב NF-κB IκBα, וזרחןYlation של IRF3, בהתאמה. כפי שמוצג בתרשים 3C , להוביל את P12 היברידי יכול להפחית posphorylation p65, לעכב השפלה IκBα, ו firorylation IRF3 מתעכב, בעוד P13 לא פעיל היברידית לא יכול (נתונים לא מוצג). כל התוצאות הללו אישרו כי היברידית עופרת זיהה היה מסוגל לעכב LPS בתיווך TLR4 איתות על ידי למטה ויסות הן NF-κB ו IRF3 ההפעלה.
בנוסף איתות TLR4, הפעילות המעכבת של היברידית להוביל הוערך נוסף על מסלולי TLR אחרים, כולל TLR2, TLR3 ו TLR5 כדי לענות על סגוליות TLR. כפי שמוצג בתרשים 4 , P12 היברידי להוביל היה מסוגל להפחית TLR2- ו TLR5 בתיווך NF-κB / AP-1 איתות, כמו גם TLR3 בתיווך IRF ההפעלה; שוב, P13 היברידי לא פעיל לא הראה כל פעילות מעכבת. תוצאות אלו הראו כי היברידית עופרת זיהה יש מעכב חזק Ry פעילות על מסלולי TLR מרובים.
איור 1: הגישה הניסויית הכוללת של תפוקה גבוהה ההקרנה של מעכבי TLR באמצעות assay תא הכתב. שני שורות תאים כתב משמשים: THP-1-XBlue ו THP-1-Dual. לשעבר יש גן הכתב SEAP תחת שליטה של NF-κB / AP-1 ההפעלה, ואילו מערכת כפולה יש גן לוציפראז נוספים תחת שליטה של הפעלת IRF. תאים אלה יכולים להיות מובחנים בקלות מקרופאגים עבור תפוקה גבוהה הקרנה של חלקיקים modulatory החיסונית על איתות החיסון המולדת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
"/> /
איור 2: תפוקה גבוהה של מעכבי ננו על אותות TLR4.
( א ) תוכנית של הליכים ניסיוניים. ( ב ) תמונה מיקרוסקופית אופטי של מקרופאגים מובחנים (הגדלה 200x). ( ג ) תמונה נציג של פתרון צבע שינוי מן assay כתב SEAP; את הצבע של פתרון המצע הפך סגול או כחול כהה (מ ורוד המקורי) בהתאם הביטוי SEAP במדיום התרבות. ( D ) ניתוח כמותי של ספיגת המצע SEAP ב 655 ננומטר בתגובה לגירוי LPS. ( ה ) הארה בלוציפראז מן המערכת כתב IRF ביחס פרופורציה LPS. ( F ) תפוקה בתפוקה גבוהה המזהה את הפפטיד-GNP היברידי P12 ונגזרותיו בעיכוב נתיבי NF-κB / AP-1 ו- IRF של איתות TLR4; הריכוז ההיברידי = 100 ננומטר; LPSריכוז = 10 ng / mL; הבר מייצג ממוצע ± סטיית תקן; N = 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אימות של פעילות מעכב של היברידית עופרת. אישור של ההשפעה המעכבת של היברידית עופרת עם ריכוזים שונים של LPS על שני ( A ) SEAP ( ב ) מערכות כתב בלוציפראז. ( ג ) המאשר את עיכוב של היברידית עופרת על NF-κB ו IRF3 איתות דרך immunoblotting. P13 היברידי לא פעיל שימש כבקרה היברידית להשוואה. הריכוז ההיברידי = 100 ננומטר; ריכוז LPS = 10 ng / mL; הבר מייצג ממוצע ± סטיית תקן; N = 3; * ו- *** מציינים p <0.05 aP <0.001, בהתאמה, באמצעות ניתוח ANOVA דרך אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: אפקט מעכב של עופרת היברידית על מסלולי איתות TLR אחרים.
עיכוב של NF-κB / AP-1 על ידי היברידית להוביל בעקבות גירוי TLR2 (Pam3CSK4 = 1 ng / mL) ( A ) ו TL5 גירוי (flagellin = 100 ng / mL) ( B ). ( ג ) הפחתה של שניהם NF-κB / AP-1 ו IRF איתות על ידי היברידית להוביל בעקבות גירוי TLR3 (פולי אני: C = 25 מיקרוגרם / מ"ל). הריכוז ההיברידי = 100 ננומטר; הבר מייצג ממוצע ± סטיית תקן; N = 3; *, **, *** מציינים p <0.05, p <0.01, p <0.001, בהתאמה, באמצעותניתוח ANOVA חד כיווני; Ns: לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1: ספריה קטנה של כלאיים פפטידים-GNP הוקמה במחקר המוקדם שלנו.
היברידים עשויים זהב הליבה nanoparticle (~ 13 ננומטר בקוטר) וציפויים hexopptide שונים על פני השטח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאז TLRs מעורבים הפתוגנזה של מחלות דלקתיות רבות, הם צמחו כמטרות טיפוליות עבור אפנון של תגובות החיסון ותנאי דלקת. עם זאת, הפיתוח הקליני של טיפולים כדי לעכב מסלולי איתות TLR יש הצלחה מוגבלת עד כה. התרופה antimalarial hydroxychloroquine אשר מעכב TLR7 ו TLR9 הוא בשימוש קליני 35 , 36 . באופן דומה, רק מספר מצומצם של תרכובות התקדמו לניסויים קליניים, כולל אריתוראן, אנטגוניסט של TLR4, שהראה השפעות מעכבות רבות על תגובות דלקתיות של LPS בתיווך פרה-קליני 37 , 38 , הראה תוצאות חיוביות בשלב הקליני בשלב I / II ניסויים 39 , 40 , 41 , אבל בסופו של דבר את שלב III המשפט לא הצליחו להפחית את התמותהמהחולים עם אלח דם חמור 42 . לכישלון זה יש סיבות רבות, האחד הוא שתגובות דלקתיות הקשורות ל אלח דם נגרמות לעיתים קרובות באמצעות מסלולי TLR מרובים, ולכן חסימת רק TLR4 לא יכולה להספיק כדי להפחית את הדלקת המדהימה. לכן, פיתוח מעכבי פולי-TLR חדשים וחדשניים יכולים להתגבר על אתגרים קליניים אלה ולהפוך לדור הבא של תרופות אנטי-דלקתיות. אסטרטגיית ההקרנה והפרוטוקול המתוארים כאן צפויים לשמש כלי ניסוי יעיל בחקר איתות TLR, וחשוב יותר כפלטפורמת גילוי סמים כדי להאיץ את החיפוש אחר מעכבי TLR של הדור הבא.
גישה זו ההקרנה מספקת מספר יתרונות בחיפוש אחר מעכבי TLR חדשים. ראשית, ההקרנה יכולה להיות מושגת בצורה תפוקה גבוהה באמצעות מערכות תאים כתב כי הם מהירים, רגישים וכמותיים. שנית, עם שני שורות תאים כתב,את ההקרנה ניתן לעשות כדי לכסות מגוון רחב של מפל איתות איתות TLR, כולל נתיב NF-κB / AP-1 ואת סוג אני אינטרפרון איתות (באמצעות IRFs); ולכן, הם אידיאליים עבור הקרנה של מסלולי TLR מרובים. שלישית, תאים אלה כתב הם מהונדסים גנטית מ monocytic האדם THP-1 שורת תאים, שהיא מערכת מודל טוב ללמוד התערבויות מיקוד התגובה החיסונית המולדת. רביעית, קו התא נשמר בקלות, ובמיוחד, ניתן להבדיל מקרופאגים; ומאחר ומקרופאגים ממלאים תפקיד מפתח בתופעות דלקתיות רבות הקשורות למחלות, הם משמשים כמטרה אידיאלית להקרנה של אימונוטרפטיקה המכוונת לאיתות TLR. החמישית, מונוציטים מקרופאגים יש יכולת phagocytic מרשים, אשר מאפשר ספיגה גבוהה של הסלולר של חלקיקים, מה שהופך אותם מתאים במיוחד לחקר סוכני טיפול ננומטרי. יתר על כן, זה פרוטוקול ההקרנה ניתן ליישם לחיפוש לא רק את ננו מבוסססוכנים apeutic, אלא גם סוגים אחרים של תרכובות ביו אקטיביות.
למרות פלטפורמת ההקרנה היא מאוד תכליתי וחזק, יש לנקוט כמה זהירות כדי למנוע גילוי שווא. ההקרנה מבוססת בעיקר על assay הכתב, אשר מסתמך על הביטוי של הגן הכתב תחת שליטה של אירועים איתות ספציפיים. באופן אידיאלי, ביטוי גנים כתב (SEAP ו בלוציפראז) הוא יחסי לעוצמת מסלול התמרה האות של עניין, ואת ההשפעה של המועמדים סמים משתקף assay assay. עם זאת, במציאות, כל האירועים הביולוגיים המתרחשים במעלה הביטוי הגנטי של הכתב עלולים להשפיע על התוצאה, ולעתים אף לגרום לגילוי חיובי כוזב. לדוגמה, ביטוי נמוך של SEAP יכול לנבוע מעכבות תהליך סינתזת החלבון, ולא מהורדה למטה של איתות TLR 43 . כדי להימנע מגילוי כוזב כזה, הפעילות המעכבת של הזיהויD מועמדים תמיד צריך להיות מאומת, ואת שיטת תקן הזהב היא להסתכל ישירות על נתיבי איתות דרך immunoblotting. היבט חשוב נוסף בהקרנה nanoparticle מבוססי סוכני טיפולית היא תכונות פני השטח של אלה nanodevices. בהתבסס על מכפילי השטח, nanodevices יכול להיות פעילות ביולוגית שונים. עם זאת, הם עשויים גם לא ספציפית מחייב יכולת biomolecules מסוימים. במקרה של מחייב לא ספציפי SEAP או בלוציפראז, הפעילות הקטליטית על מצעים יכול להיות בסכנה על ידי אלה nanodevices, המוביל גילוי שווא פוטנציאלי. כולל קבוצות בקרה נוספות ( למשל , nanodevice בלבד) בהקרנה מפחיתה את הסיכון של גילוי שווא. לבסוף, אך לא פחות, את cytotoxicity של המועמדים להוביל זיהו יש לבחון כדי להוציא cytotoxicity כגורם תורם גילוי שגוי. זה יכול להיעשות בו זמנית במהלך תהליך ההקרנה באמצעות assay הכדאיות תקן ( למשל ,MTS או MTT), או בניסוי נפרד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות בתמיכת התוכנית של פרופסור למינוי מיוחד (Scholar) במוסדות להשכלה גבוהה בשנחאי (HY), קרן החל מהבית החולים העממי הראשון בשנחאי (HY), גאופנג קליני רפואה גראנט מגנטאי ג'יאוטונג בית הספר לרפואה של האוניברסיטה (HY), ואת המימון של קרוהן ו קוליטיס קרן של קנדה (CCFC) (SET ו HY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
References
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
- Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
- Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
- Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
- Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
- Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
- Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
- Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
- O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
- Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
- Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
- Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
- Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
- Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
- Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
- Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
- Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
- Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
- Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
- Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
- Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
- Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
- Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
- He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
- Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
- Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).
- Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
- Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
- Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
- Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
- Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
- Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
- Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
- Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
- Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
- Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
- Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).
