Summary
تشبه مستقبلات تول (تلر) يلعب دورا هاما في الفيزيولوجيا المرضية للكثير من الأمراض الالتهابية البشرية، وينظم تنظيم الاستجابة تلر من قبل النانوية النشطة بيولوجيا من المتوقع أن تكون مفيدة في العديد من الحالات الالتهابية. توفر خلايا المراسل المستندة إلى الخلايا من نوع ثب-1 منصة فحص متعددة الاستخدامات وقوية لتحديد مثبطات رواية إشارات تلر.
Abstract
تنظيم الدوائية من مستقبلات تشبه تول (تلر) ردود يحمل وعدا كبيرا في علاج العديد من الأمراض الالتهابية. ومع ذلك، كانت هناك مركبات محدودة المتاحة حتى الآن لتخفيف الإشارات تلر ولم يكن هناك مثبطات تلر المعتمدة سريريا (باستثناء هيدروكسيكلوروكين المخدرات المضادة للملاريا) في الاستخدام السريري. في ضوء التقدم السريع في تكنولوجيا النانو، والتلاعب الاستجابة المناعية باستخدام أجهزة النانو قد توفر استراتيجية جديدة لعلاج هذه الأمراض. هنا، نقدم طريقة فحص الإنتاجية العالية لتحديد بسرعة الجسيمات النانوية الحيوية النشطة التي تمنع إشارات تلر في الخلايا المناعية البلعمة. وقد بنيت هذه المنصة الفرز على خلايا مراسل الخلايا القائمة على ثب-1 مع المقايسات اللونية وسوسيفيراس. تم تصميم خلايا مراسل من خط الخلايا أحادية الخلية ثب-1 الإنسان عن طريق التكامل مستقرة من اثنين من يبني مراسل محرض. واحد يعبر عن الجينات الجنينية الفوسفاتيز الجنينية (سيب)تحت سيطرة المروج محرض من قبل عوامل النسخ نف-κB و أب-1، والآخر يعبر عن الجينات مراسل وسيفيراس يفرز تحت سيطرة المروجين تحرضها العوامل التنظيمية الإنترفيرون (إرفس) .Upon تلر التحفيز، وتنشيط خلايا مراسل عوامل النسخ ثم تنتج سيب و / أو لوسيفيراس، والتي يمكن الكشف عنها باستخدام الكواشف الركيزة المقابلة لها. باستخدام مكتبة من الجينات النانوية الببتيد الذهب (غنب) التي أنشئت في دراساتنا السابقة على سبيل المثال، حددنا واحد الببتيد-الناتج القومي الإجمالي الهجين التي يمكن أن تمنع بشكل فعال الذراعين لسلسلة إشارات TLR4 الناجمة عن يجند النموذجي، عديد السكاريد الشحمي (لس). تم التحقق من صحة النتائج من قبل التقنيات البيوكيميائية القياسية بما في ذلك إمونوبلوتينغ. وخلص تحليل آخر إلى أن هذا الهجين الرصاص له طيف مثبط واسع، يتصرف على مسارات متعددة تلر، بما في ذلك TLR2 و 3 و 4 و 5. ويسمح هذا النهج التجريبي بتقييم سريع(أو غيرها من المركبات العلاجية) يمكن أن تعدل إشارات محددة تلر في الخلايا المناعية البلعمة.
Introduction
مستقبلات تشبه تول (تلرس) هي واحدة من العناصر الرئيسية في الجهاز المناعي الفطري المساهمة في خط الدفاع الأول ضد العدوى. تلرس هي المسؤولة عن الاستشعار عن غزو مسببات الأمراض من خلال الاعتراف ذخيرة من الأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (أو بامبس) وتصاعد ردود الفعل الدفاعية من خلال سلسلة من التنبيه إشارة 1 ، 2 . هناك 10 تلرس الإنسان المحددة؛ باستثناء TLR10 التي تبقى فيها الليغاند غير واضحة، يمكن لكل تلر أن يعترف بمجموعة متميزة ومتحفظة من برامج تحليل الأداء. على سبيل المثال، TLR2 و TLR4، تقع أساسا على سطح الخلية، ويمكن الكشف عن البروتينات الدهنية والشحميات السكرية من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام، على التوالي. في حين أن TLR3 و TLR7 / 8 و TLR9، الموجودة أساسا في المقصورات إندوسومال، يمكن أن يشع رنا و دنا من الفيروسات والبكتيريا 3 . عندما تحفزها بامبس، تلرس تؤدي الاستجابات المناعية الأساسية عن طريق الإفراج المؤيدة لل إنفوسطاء تحريضية، وتجنيد وتفعيل الخلايا المناعية المستجيب، وتنسيق الأحداث المناعية التكيفية اللاحقة 4 .
ويمكن تصنيف تنبئ التشوير تلر ببساطة إلى مسارين رئيسيين 5 و 6 . واحد يعتمد على محول البروتين عامل التمايز النخاعي 88 (MyD88) - مسار تعتمد على MyD88. تستخدم جميع تلرس باستثناء TLR3 هذا المسار لتفعيل عامل كابا-ليت-شينر العامل النووي من الخلايا B المنشطة (نف-κB) و كيناسيس البروتين المرتبط بالميتوجين (مابس)، مما يؤدي إلى التعبير عن وسطاء مؤيد للالتهابات مثل TNF- α، إيل-6 و إيل-8. المسار الثاني يستخدم تير-دومين-كونتينينغ-إنفوسد إنترفيرون-β (تريف) - المسار المستقل الذي يعتمد على تريف أو MyD88 - لتفعيل العوامل التنظيمية للإنترفيرون (إفرس) و نف-κB، مما يؤدي إلى إنتاج اكتب I إفنس. إشارات تلر سليمةأمر بالغ الأهمية لحمايتنا اليومية من الالتهابات الميكروبية والفيروسية. يمكن أن تؤدي العيوب في مسارات إشارات تلر إلى نقص المناعة وغالبا ما تكون ضارة بصحة الإنسان. 7
ومع ذلك، الإشارات تلر هو "سيف ذو حدين" والتنشيط المفرط وغير المنضبط تلر ضارة. تساهم ردود الفعل تلر أكثر نشاطا في التسبب في العديد من الأمراض الالتهابية الحادة والمزمنة الإنسان 8 ، 9 . على سبيل المثال، تعفن الدم الذي يتميز التهاب الجهازية والإصابة بأعضاء متعددة، ويرجع ذلك أساسا إلى الاستجابات المناعية الحادة الساحقة نحو الالتهابات، مع TLR2 و TLR4 لعب دورا حاسما في الفيزيولوجيا المرضية الإنتان 10 ، 11 ، 12 . وبالإضافة إلى ذلك، تم العثور على TLR5 للمساهمة في التهاب الرئة المزمن من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي 13، 14 . وعالوة على ذلك، يرتبط ارتباط إشارات تلر إندوسومال) مثل TLR7 و TLR9 (بقوة مع تطور وتطور العديد من أمراض المناعة الذاتية بما في ذلك الذئبة الحمامية الجهازية والتهاب المفاصل الروماتويدي) را ( 15 ، 16 . هذه الخطوط المتقاربة من الأدلة تحدد إشارات تلر كهدف علاجي محتمل للعديد من الأمراض الالتهابية 17 .
على الرغم من أن تنظيم الدوائية من الردود تلر ومن المتوقع أن تكون مفيدة في العديد من الحالات الالتهابية، للأسف، هناك حاليا عدد قليل جدا من المركبات المتاحة سريريا لمنع إشارات تلر 9 ، 17 ، 18 . ويرجع ذلك جزئيا إلى تعقيد وتكرار مسارات تلر المشاركة في التوازن المناعي وأمراض الأمراض. لذلك، والبحث عن رواية، بوتينيمكن أن تساعد العوامل العلاجية لاستهداف مسارات إشارات متعددة تلر على سد فجوة أساسية، والتغلب على التحدي المتمثل في دفع مثبطات تلر إلى العيادة.
في ضوء التقدم السريع في مجال علم النانو وتكنولوجيا النانو، نانودفيسس آخذة في الظهور كما الجيل القادم من المحولات تلر نظرا لخصائص فريدة من نوعها 19 ، 20 ، 23 . حجم النانو يسمح لهذه النانو العلاجات أن يكون التوزيع الحيوي أفضل واستمرار تداول 24 ، 25 ، 26 . ويمكن أن تكون فونكتيوناليزد أكثر لتلبية المطلوب الدوائية والدوائية ملامح 27 ، 28 ، 29 . أكثر إثارة، والنشاط الحيوي من هذه نانوديفيسس الرواية ينشأ من الخصائص الجوهرية، والتي يمكن أن تكون مصممة لبدلا من مجرد التصرف كوسيلة تسليم لعامل علاجي. على سبيل المثال، تم تصميم بروتين شحمي عالي الكثافة (هدل) لتثبيط إشارات TLR4 عن طريق مسح جزيئات TLR4 لس 23 . وبالإضافة إلى ذلك، قمنا بتطوير نظام الهجين الجسيمات النانوية الببتيد الذهب، حيث الببتيدات مزينة يمكن أن تغير خصائص سطح الجسيمات النانوية الذهب، والسماح لهم أن يكون مختلف الأنشطة الحيوية 30 ، 31 ، 32 ، 33 . وهذا يجعلها فئة خاصة من المخدرات (أو "نانو المخدرات") كما الجيل القادم من العلاجات النانو.
في هذا البروتوكول، نقدم نهجا لتحديد فئة جديدة من الجسيمات النانوية الببتيد الذهب (الببتيد-غنب) التي يمكن أن تمنع بقوة مسارات الإشارات متعددة تلر في الخلايا المناعية البلعمة 32 ، 33 . ويستند هذا النهج على تجاريا المتاحة ثب-1 خطوط خلية مراسل. تتكون خلايا المراسل من اثنين من بنيات مراسل مستقر، محرض: واحد يحمل يفرز الجنينية الفوسفاتيز القلوية الجنينية (سيب) تحت سيطرة المروج محرض من قبل عوامل النسخ نف-κB والبروتين المنشط 1 (أب-1). والآخر يحتوي على جينات مراسل لوسيفيراس يفرز تحت سيطرة المروجين محرض من العوامل التنظيمية الإنترفيرون (إيرفس). عند التحفيز تلر، تنبئ إشارة يؤدي إلى تفعيل نف-κB / أب-1 و / أو إيرفس، الذي يتحول الجينات مراسل إلى سيب سرية و / أو لوسيفيراس. يمكن الكشف عن مثل هذه الأحداث بسهولة باستخدام الكواشف الركيزة المقابلة مع الطيفي أو لومينوميتر. وباستخدام هذا النهج لفحص المكتبة التي تم إنشاؤها سابقا من الهجين الببتيد-غنب، حددنا المرشحين المحتملين التي يمكن أن تمنع بقوة مسارات إشارات TLR4. النشاط المثبط للببتيد الرصاص -ثم تم التحقق من صحة الهجين الناتج القومي الإجمالي باستخدام نهج الكيمياء الحيوية آخر من إمونوبلوتينغ، وتقييمها على مسارات تلر أخرى. هذا النهج يسمح لفحص سريع وفعالة من العوامل الجديدة التي تستهدف مسارات إشارات تلر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد ثقافة الثقافة وسائل الإعلام والكواشف
- إعداد كاملة زراعة الخلايا المتوسطة R10 عن طريق إضافة ملاحق من 10٪ مصل بقري جنيني (فبس)، 2 ملي L- الجلوتامين و 1 ملي بايروفات الصوديوم في وسط رمي-1640.
- إعداد وسط ثقافة الاختيار R10-Z عن طريق إضافة المضادات الحيوية زيوسين (200 ميكروغرام / مل) إلى R10 للحفاظ على التعبير عن سيب تحت سيطرة نف-κB / أب-1 التنشيط. لتحديد للخلايا معربا عن كل من سيب وجينات مراسل لوسيفيراس، إضافة كل من زيوسين (100 ميكروغرام / مل) و بلاستيسيدين (10 ميكروغرام / مل) إلى R10 (كما R10-زب).
- إعداد الحل سيب الركيزة عن طريق إذابة كيس واحد من مسحوق الركيزة (ه . ، كوانتي-الأزرق) إلى 100 مل من النقاء العالي، الذيفان الداخلي الماء مجانا في نظيفة 125 مل الزجاج قارورة.
- دوامة الحل بلطف واحتضان ذلك في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لضمان حل كامل من ركائز. <لي> تصفية الحل باستخدام غشاء 0.2 ميكرون لضمان عقمها (اختياري)، وتخزينه في 4 درجات مئوية تصل إلى 2 أسابيع قبل الاستخدام.
- بعد حل مسحوق تماما، استخدم الحل فورا. بدلا من ذلك، تخزين الحل في 4 درجات مئوية (تصل إلى أسبوع) أو في -20 درجة مئوية (تصل إلى شهر) قبل الاستخدام.
تنبيه: كل من الحلول الركيزة حساسة للضوء، ويجب تجنب التعرض للضوء كلما كان ذلك ممكنا. دورات تجميد ذوبان متعددة من الحل يمكن أن يسبب عدم استقرار الركيزة وتقصير عمرها الافتراضي.
تنبيه: يجب أن يتم إعداد كاشف لاستخدامات الثقافة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، وينبغي تعقيم جميع الحاويات قبل استخدامها. يجب تجنب دورات تجميد الذوبان المتكررة من سلطة النقد الفلسطينية وحلول لس.
2. ثقافة ثب-1 مراسل الضامة المستمدة من الخلايا
- استخدام اثنين من خطوط الخلايا مراسل ثب-1: ثب-1-زبلو وخلايا ثب-1 المزدوجة. الأول لديه جين مراسل سيب التي تسيطر عليها نف-κB / أب-1، وهذا الأخير لديه نظام مزدوج الجينات مراسل، نفس سيب مراسل الجينات و إيرف تسيطر الجينات لوسيفيراس. الإر إجراءات متطابقة باستثناء وسائل الإعلام ثقافة الاختيار.
- ذوبان الجليد مخزون خلية العمل (~ 5 × 10 6 خلايا) في 10 مل من R10 المتوسطة، وتدور أسفل الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق. ريسوسبيند الخلايا في 10 مل من R10 المتوسطة، ونقلها إلى قارورة ثقافة T75. تبادل وسط الثقافة كل 2-3 أيام حتى تصل الخلايا إلى كثافة 1 × 10 6 خلايا / مل.
- عندما يصل نمو الخلايا إلى قدرته، وخلايا مرور للحد من كثافة الخلايا إلى في حدود 2-5 × 10 5 خلايا / مل، وبالتالي فإن الخلايا يمكن أن تستمر في النمو.
- بعد مرور واحد على الأقل، تبدأ في ثقافة الخلايا في وسط ثقافة الاختيار: R10-Z ل ثب-1-زبلو، و R10-زب ل ثب-1-ثنائي. بعد زراعة الخلايا مع وسط ثقافة الاختيار لمدة 1 على الأقل مرور، والخلايا جاهزة للتجربة.
تنبیھ: یمکن أن تؤدي عملیة زیادة الخلایا إلی موت خلوي کبیر. يجب الحفاظ على بقاء الخلية> 98٪. الاحتفاظ بسجل لعدد مرور كما سيللس قد تتصرف بشكل مختلف بعد العديد من الممرات (> 20 ممرات).
ملاحظة: قوارير ثقافة الخلية يمكن إعادة استخدامها عدة مرات لتوفير التكاليف. ومع ذلك، فإن هذه الممارسة قد تزيد من خطر التلوث العام والتلوث المتبادل بين قوارير مختلفة (إذا كان التعامل مع خطوط الخلايا المختلفة في نفس الوقت). خلال تبادل وسائل الإعلام ومرور الخلية، يتم تعيين الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- لإجراء فحص خلية مراسل، خلايا البذور إلى 96-جيدا لوحة مسطحة الخلية القاع ثقافة وتمييزها في الضامة. ويرد وصف الإجراءات في ما يلي.
- نقل الخلايا من قارورة إلى أنبوب الطرد المركزي، وتدور أسفل الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق، و ريسوسبيند لهم في وسط R10 بتركيز 1 × 10 6 خلايا / مل. إضافة أليكوتس من حل سلطة النقد الفلسطينية في تعليق خلية مع تركيز النهائي من 50 نانوغرام / مل.
- نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من 96-نحنليرة لبنانية لوحة باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية (في حاضنة ثقافة الخلية) لمدة 24 ساعة.
- بعد الحضانة، وإزالة بعناية وسط ثقافة باستخدام الشافطة فراغ (أو مع ماصة متعددة القنوات)، وغسل بلطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر / جيدا) مرتين. إضافة 100 ميكرولتر من المتوسطة R10 الطازجة في كل بئر. بقية الخلايا لمدة 2 أيام في حاضنة قبل إجراء الفحص المراسل.
تنبيه: خطوة يستريح مهم جدا للسماح للخلايا لتهدئة بعد التحفيز سلطة النقد الفلسطينية إلى وضعهم الهدوء الطبيعي. وهذا يمكن أن تقلل بشكل كبير من إشارات الخلفية للجينات مراسل تحت ظروف أونستيمولاتد.
ملاحظة: بعد 24 التحفيز مع سلطة النقد الفلسطينية، وتتميز الخلايا في النمط الظاهري مثل البلاعم، مع سمة من التصاق الخلايا في الجزء السفلي من البئر، وميزة المورفولوجية من كاذب.
3. فحص ل TLR4 المحتملة مثبطات نانو باستخدام خلايا مراسل ملاحظة: بما أن إشارات TLR4 تستخدم كلا من المسيرتين المعتمدتين على أساس MyD88 والمسارات المعتمدة على تريف، فإنها تحدد كهدف أساسي يشمل مجموعة واسعة من مسارات تشوير تلر. وتستخدم خلايا مراسل ثب-1-زبلو لدراسة أساسا تنشيط نف-κB / أب-1 في حين أن خلايا ثب-1-دوال هي لتفعيل إيرف من تنبيغ إشارة تعتمد على تريف.
- تحديد الجرعة الأمثل لس عن طريق توليد منحنى الجرعة والاستجابة قبل الفحص.
- تمييع حل لس العمل لتركيز النهائي من 0.01 - 100 نانوغرام / مل في وسط R10 (جعل التخفيف في مقياس log10). تخطيط تصميم لوحة وجعل التخفيف في 96-جيدا جولة-- أسفل لوحة الثقافة. تأكد من أن كل بئر لديه الحد الأدنى من 110 ميكرولتر من الحل بعد التخفيف.
- إزالة بلطف مستنبت من لوحة الخلية الخلوية (من 2.2.3) باستخدام الشافطة فراغ.
- نقل لس تحتوي على R10 المتوسطة أعدت في لوحة التخفيف (3.1.1) طنتو لوحة الثقافة وفقا لتخطيط العينات. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية (في حاضنة ثقافة الخلية) لمدة 24 ساعة.
- في 24 ساعة، ونقل بعناية سوبرناتانتس (80 ميكرولتر / جيدا) في لوحة جديدة 96-جيدا جولة القاع. إجراء قياس اللمعان اللونية و / أو لوسيفيراس على هذه الحلول على الفور أو تخزينها في 4 درجات مئوية (عدة ساعات) أو -20 درجة مئوية (أيام) قبل تطوير الفحص.
ملاحظة: يجب أن يكون تصميم تخطيط لوحة بسيطة وواضحة للتجربة وتحليل البيانات. ولكل حالة، ينبغي النظر في 2-4 مكررات. احرص دائما على تضمين مجموعة تحكم سلبية (لس نول). فمن المستحسن استخدام خلايا ثب-1-زبلو لتفعيل نف-κB / أب-1 كما الخلايا المزدوجة لديها خلفية عالية نسبيا من نف-κB / أب-1 تفعيل بعد أن متباينة في الضامة. ومع ذلك، فمن الممكن استخدام الخلايا المزدوجة للإبلاغ عن كل من نف-κB / أب-1 و إيرف تفعيل.
- تطوير اللونإيميتريك ل نف-κB / أب-1 تفعيل وسوسيفيراس التلألؤ الفحص لتفعيل إيرف.
- لتقييم نف-κB / أب-1 التنشيط، ونقل 20 ميكرولتر من طاف من كل عينة في لوحة جديدة مسطحة 96-لوحة مسطحة القاع. وإضافة 180 ميكرولتر من قبل تحسنت سيب حل الركيزة في كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 - 2 ساعة للسماح لتطوير اللون (الوردي إلى الأزرق الداكن). جمع امتصاص في 655 نانومتر على قارئ لوحة.
تنبيه: يمكن أن تختلف فترة حضانة على أساس تطوير اللون (30 دقيقة حتى الحضانة بين عشية وضحاها). فمن المستحسن أن تنتظر حتى تصل الكثافة البصرية (أود) من أحلك اللون فوق 1، مع تجنب تشبع تطور اللون (أود> 3). - لتحليل تفعيل إيرف، ونقل 10 ميكرولتر من طاف من كل عينة في لوحة بيضاء مسطحة 96-جيدا واضحة. إضافة حل لوسيفيراس (50 ميكرولتر) وعلى الفور جمع التلألؤ ثإل جيدا.
ملاحظة: ينصح بشدة لاستخدام قارئ لوحة التلألؤ مع وظيفة حقن السيارات لضمان الاتساق في قراءة التلألؤ من جيدا إلى جيدا ومن لوحة إلى لوحة. إذا تم حقن حلول الركيزة يدويا، يرجى التأكد من وقت حضانة متسقة وقراءة انشاء لكل بئر.
- لتقييم نف-κB / أب-1 التنشيط، ونقل 20 ميكرولتر من طاف من كل عينة في لوحة جديدة مسطحة 96-لوحة مسطحة القاع. وإضافة 180 ميكرولتر من قبل تحسنت سيب حل الركيزة في كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 - 2 ساعة للسماح لتطوير اللون (الوردي إلى الأزرق الداكن). جمع امتصاص في 655 نانومتر على قارئ لوحة.
- إجراء فحص الفرز على مختلف الهجين الببتيد-غنب مع 10 نانوغرام / مل التحفيز لس (على أساس 3.1). اتبع نفس الإجراء في 3.2 لمراسل تطوير مقايسة.
- تركيز الهجين الببتيد-غنب إلى 200 نانومتر في المتوسط R10 باستخدام طريقة الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي 20 مجلدا من الحل الهجين (10 نانومتر) في 18،000 x ج لمدة 30 دقيقة، وتجاهل بعناية سوبيرناتانتس. جمع الهجينة (في الجزء السفلي من الأنبوب) في أنبوب، وغسلها مع برنامج تلفزيوني مرتين، وإعادة تعليق الهجينة في حجم واحد من وسط R10.
- خلط كميات متساوية من الهجينة المركزة ولس (20 نانوغرام / مل) التي تحتوي على R10 المتوسطة أن يكون تركيز النهائي من الهجينة و لس لتكون 100 نانومتر و 10 نانوغرام / مل، على التوالي.
- إزالة وسط الثقافة من لوحة مثقف (2.2.3) وإضافة 100 ميكرولتر من محلول مختلطة في كل بئر (3 مكررات لكل حالة). وتشمل السيطرة السلبية (المتوسطة فقط) والتحكم لس (10 نانوغرام / مل لس دون الهجينة).
- بعد 24 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية، ونقل وسيلة من كل بئر في أنبوب وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 18،000 x ج، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. جمع سوبرناتانتس (50-80 ميكرولتر / أنبوب) في لوحة 96-جيدا جولة القاع، وأداء الفحص المراسل كما هو موضح في 3.2.
تنبيه: عند التخلص من سوبرناتانتس بعد الطرد المركزي، لا تحريك الهجينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
ملاحظة: الطرد المركزي في الخطوة 3.3.4 مهم جدا لإزالة الهجينة الجسيمات متناهية الصغر غير الداخلية من وسط الثقافة، ويمكن تجنب تدخل من الهجينة مع شركةلوريمتريك / التلألؤ القراءات. وذلك لأن الجسيمات النانوية الذهب يمكن أن تمتص موجات واسعة من الضوء اعتمادا على حجمها والتكتل.
4. التحقق من التأثير المثبط للمرشحين المحتملين
ملاحظة: لتأكيد تأثير مثبط للمرشحين المحتملين من الفرز، يتم استخدام نهجين. واحد هو لفحص ردود جرعة من المنشطات (لس) في تركيز هجين ثابت (أو العكس). والآخر هو أن ننظر مباشرة في تثبيط على إشارات نف-κB / أب-1 و IRF3 عن طريق إمونوبلوتينغ.
- في نهج واحد، إجراء فحص المراسل مع 100 نانومتر من الهجين الرصاص واثنين من تركيزات لس في 1 نانوغرام / مل و 10 نانوغرام / مل اتباع نفس الإجراءات الموصوفة في 3.3. تضمين هجين غير نشط (استنادا إلى نتائج الفرز) كسيطرة هجين للمقارنة.
- لنهج إمونوبلوتينغ، يرجى اتباع ه القياسيةالإجراءات التجريبية.
- خلايا ثب-1 الثقافة في المتوسطة R10، البذور الخلايا في لوحة الثقافة 12 جيدا (2 × 10 6 خلايا / جيدا)، وتمييزها في الضامة عن طريق علاج الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية 50 نانوغرام / مل ل 24 ساعة تليها الراحة لمدة 2 أيام.
- بعد تمايز الخلايا، وتحفيز الخلايا مع 10 نانوغرام / مل لس مع / بدون الهجينة (100 نانومتر) مع مرور الوقت (تصل إلى 4 ساعات). في نقاط زمنية مختلفة (0، 5، 15، 30، 60، 120 و 240 دقيقة)، وإعداد ليسيتس الخلية ل إمونوبلوتينغ. تضمين هجين غير نشط كعنصر تحكم.
- دقق إشارات IκBα، P65 فوسفهوريلاتد، و IRF3 فوسفهوريلاتد لفحص تأثير مثبط من الهجين الرصاص على تفعيل نف-κB و IRF3. دقق في إشارات β-أكتين وإجمالي IRF3 كضوابط داخلية.
ملاحظة: تنبيغ الإشارة غالبا ما يحدث أسرع بكثير (في بضع ساعات) ثم التعبير عن الانزيمات مراسل سيب و لوسيفيراس (24 ساعة). فمن المستحسن جدا ل بيرفور أيضااما اختبار الجدوى من الهجينة اختبار في 24 ساعة كطريقة أخرى للتحقق من الصحة.
5. تقييم خصوصية تلر
ملاحظة: للتحقيق في خصوصية تلر من الهجين الببتيد-غنب، يتم اختبار مسارات الإشارات الأخرى تلر، بما في ذلك TLR2 و TLR3 و TLR5. يتم استبعاد TLR7 و 8 و 9 لأن الضامة المستمدة من ثب-1 لا تستجيب بشكل جيد لتحفيز هذه تلرس نظرا لعدم وجود تعبير TLR7 و 8 و 9 في البلاعم 34 .
- اختبار تركيزات مختلفة (1 نانوغرام / مل إلى 25 ميكروغرام / مل) من بروابط محددة ل TLR2 (Pam3CSK4)، TLR3 (بولي I: C) و TLR5 (فلاجلين) على كل من خلايا مراسل المستمدة الضامة للحصول على التركيز الأمثل بعد نفس الإجراء في 3.1 و 3.2.
- علاج الخلايا مع مخاليط من الهجين الرصاص (100 نانومتر) وكل يجند تلر في تركيز تم الحصول عليها من 5.1 لتقييم خصوصية مثبطة من الرصاص hيبرد وفقا للإجراءات التجريبية الموصوفة في 3.3. تضمين هجين غير نشط كسيطرة للمقارنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويوضح الشكل 1 النهج التجريبي الشامل. وتستخدم خطوط الخلايا مراسل ثب-1 اثنين، ثب-1-زبلو و ثب-1-المزدوج لسرعة الشاشة الردود تلر من خلال التحقق من تفعيل نف-κB / أب-1 و إيرفس، على التوالي. يمكن الكشف عن تفعيل نف-κB / أب-1 من قبل مقايسة اللونية سيب، في حين يتم رصد تنشيط إيرف بواسطة التلألؤ لوسيفيراس. خلايا ثب-1 أحادي يمكن أن تكون مشتقة بسهولة في الضامة لعرض نانوديفيسس للنشاط المناعية على الخلايا المناعية البلعمة الفطرية. مع نظام مراسل، ويمكن إجراء الفرز في الأزياء الإنتاجية العالية. مثل هذا النهج هو تنوعا لاكتشاف ميمونوثيرابيوتيكش جديدة، تستهدف بشكل خاص على إشارات المناعة الفطرية مثل إشارات تلر.
يتم عرض إجراءات الفرز والنتائج التمثيلية في الشكل 2A و 2 باء ). يتم اختبار تركيزات مختلفة من بروابط تلر (TLR4 كمثال) لأول مرة للحصول على التركيز الأمثل للفحص الفعلي للهجين الببتيد-غنب. أدى التحفيز TLR4 بواسطة لس إلى تنشيط نف-κB / أب-1 وإنتاج خطة عمل الطاقة المستدامة. و سيب الافراج عن تحويل الركيزة وغيرت الخاصية فوتوفيسيكال لها، والتي يمكن رصدها عن طريق التحول في امتصاص الضوء، مما يؤدي إلى تغيير لون الحل ( الشكل 2C ). مثل هذا التغيير يتناسب مع كمية سيب صدر عند التحفيز، ويمكن قياسها من خلال قياس الامتصاصية في 655 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي ( الشكل 2D ). وبالمثل، فإن تنشيط إيرفس (التي تسببها لس) أدى إلى التعبير عن لوسيفيراسه، الذي حفز الركيزة لإنتاج التلألؤ ( الشكل 2E ). واستنادا إلى هذه الردود على الجرعة، تم استخدام تركيز الأمثل من لس (10 نانوغرام / مل) لفحص مكتبة صغيرة أنشئت سابقا من الهجينة الببتيد-غنب ( الجدول 1 ). تم وصف تصنيع الهجينة وخصائصها الفيزيائية في منشوراتنا السابقة 30 ، 31 ، 32 . من الفرز، تم تحديد مجموعة من الهجينة (P12 ومشتقاته) لنشاطها المثبط القوي على كل من نف-κB / أب-1 و إيرف تفعيله الناجم عن لس ( الشكل 2F ). ومن المثير للاهتمام، P13 الهجين، فقط مختلفة قليلا من P12 في الطلاء الببتيد، لم يكن لديك أي نشاط المثبطة، والتي يمكن أن تكون بمثابة السيطرة الهجين للمقارنة. وأظهرت المشتقات P13 درجة مختلفة من النشاط المثبط خفيفة اعتمادا على أوثr زينت الببتيد على السطح.
بعد تحديد الهجين الرصاص، فمن المهم للتحقق من صحة النشاط المثبطة. تم التأكيد على تثبيط أولا من خلال فحص النسب المختلفة للهجين إلى لس لاستبعاد النتائج الإيجابية الكاذبة المحتملة بسبب التحف الفنية. كما زاد تركيز لس، وأثر المثبطة للهجين (في تركيز ثابت) كما هو متوقع ( الشكل 3A و 3 باء ). لمزيد من التأكد من أن تثبيط لوحظ من المقايسات مراسل كان في الواقع نتيجة لانخفاض تنظيم إشارات نف-κB و إيرف من قبل الهجين الرصاص، وأجريت إمونوبلوتينغ لتقييم مباشرة تنبيغ إشارة البروتين مع مرور الوقت. تم فحص تفعيل نف-κB و IRF3 من خلال التحقيق في فسفرة الوحدة الفرعية نف-κB p65 وتدهور المانع نف-κB IκBα، والفوسفوريلاتيون من IRF3، على التوالي. كما هو مبين في الشكل 3C ، P12 الهجين الرصاص يمكن أن تقلل من الفسفرة p65، تمنع تدهور IκBα، وتأخر IRF3 الفسفرة، في حين أن P13 الهجين غير نشطة لا يمكن (لا تظهر البيانات). وأكدت جميع هذه النتائج أن الهجين الرصاص الذي تم تحديده كان قادرا على منع إشارات TLR4 بوساطة لس عن طريق تنظيم كل من نف-κB و IRF3.
بالإضافة إلى إشارات TLR4، تم تقييم النشاط المثبط للهجين الرئيسي على مسارات تلر الأخرى بما في ذلك TLR2 و TLR3 و TLR5 لمعالجة خصوصية تلر. وكما هو مبين في الشكل 4 ، تمكنت P12 الهجين الرئيسي من تقليل التشوير ب TLR2 و TLR5 بوساطة نف-κB / أب-1، فضلا عن تنشيط إيرف بوساطة TLR3؛ مرة أخرى، P13 الهجين غير نشطة لم تظهر أي نشاط مثبط. وتشير هذه النتائج إلى أن الهجين الرصاص المحدد له مثبط قوي النشاط ري على مسارات تلر متعددة.
الشكل 1: النهج التجريبي الشامل للفحص عالية الإنتاجية من مثبطات تلر باستخدام فحص خلية مراسل. يتم استخدام اثنين من خطوط خلية مراسل: ثب-1-زبلو و ثب-1 المزدوج. الأول لديه جينات مراسل سيب تحت سيطرة نف-κB / أب-1 تفعيل، في حين أن النظام المزدوج يحتوي على الجينات مراسل لوسيفيراس إضافية تحت سيطرة تنشيط إيرفس. هذه الخلايا يمكن أن تكون متباينة بسهولة في الضامة لفحص عالية الإنتاجية من الجسيمات النانوية التحويرية المناعية على الإشارات المناعية الفطرية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ftp_upload / 56075 / 56075fig2.jpg "/>
الشكل 2: فحص الإنتاجية العالية من مثبطات النانو على إشارات TLR4.
( أ ) مخطط الإجراءات التجريبية. ( B ) صورة مجهرية بصرية من الضامة متباينة (تكبير 200X). ( C ) صورة تمثيلية من تغيير لون الحل من مقايسة سيب مراسل. تحول لون محلول الركيزة إلى اللون الأرجواني أو الأزرق الداكن (من الوردي الأصلي) اعتمادا على التعبير سيب في الوسط الثقافي. ( D ) التحليل الكمي للامتصاص الركيزة سيب في 655 نانومتر ردا على التحفيز لس. ( E ) التلألؤ لوسيفيراس من نظام مراسل إيرف في نسبة إلى التحفيز لس. ( F ) فحص إنتاجية عالية يحدد الببتيد الرصاص - الناتج القومي الإجمالي الهجين P12 ومشتقاته في تثبيط كل من نف-κB / أب-1 ومسارات إيرف للتشوير TLR4؛ تركيز هجين = 100 نانومتر. و لستركيز = 10 نانوغرام / مل؛ يمثل شريط الوسط ± الانحراف المعياري. ن = 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحقق من النشاط المثبط للهجين الرصاص. تأكيد التأثير المثبط للهجين الرصاص مع تركيزات مختلفة من لس على حد سواء ( A ) سيب و ( B ) نظم مراسل لوسيفيراس. ( C ) تأكيد تثبيط الهجين الرصاص على نف-κB و IRF3 تشوير عبر إمونوبلوتينغ. تم استخدام P13 الهجينة غير النشطة كسيطرة هجين للمقارنة. تركيز الهجين = 100 نانومتر. تركيز لس = 10 نانوغرام / مل؛ يمثل شريط الوسط ± الانحراف المعياري. n = 3؛ * و *** تشير إلى p <0.05 أو p <0.001، على التوالي، باستخدام طريقة واحدة تحليل أنوفا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التأثير التثبيطي للهجين الرصاص على مسارات تشوير تلر الأخرى.
تثبيط نف-κB / أب-1 من قبل الهجين الرصاص بعد التحفيز TLR2 (بام 3CSK4 = 1 نانوغرام / مل) ( A ) و TL5 التحفيز (فلاجلين = 100 نانوغرام / مل) ( B ). ( C ) تخفيض كل من إشارات نف-κB / أب-1 و إيرف بواسطة الهجين الرئيسي بعد تحفيز TLR3 (بولي I: C = 25 ميكروغرام / مل). تركيز الهجين = 100 نانومتر. يمثل شريط الوسط ± الانحراف المعياري. n = 3؛ *، **، و *** تشير إلى p <0.05، p <0.01، و p <0.001، على التوالي، باستخدامطريقة تحليل أنوفا؛ نس: غير هام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: مكتبة صغيرة من الهجين الببتيد-الناتج القومي الإجمالي التي أنشئت في دراساتنا في وقت مبكر.
مصنوعة الهجين من جسيمات متناهية الصغر الذهب الأساسية (~ 13 نانومتر في القطر) ومختلف الطلاء هيكسابيبتيد على السطح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
منذ تلرس تشارك في التسبب في العديد من الأمراض الالتهابية، فقد برزت كأهداف علاجية لتشكيل الاستجابات المناعية والظروف الالتهابية. ومع ذلك، فإن التطور السريري من العلاجات لمنع مسارات إشارات تلر كان نجاح محدود حتى الآن. هيدروكسيكلوروكين المخدرات المضادة للملاريا الذي يثبط TLR7 و TLR9 في الاستخدام السريري 35 ، 36 . وبالمثل، لم يتقدم سوى عدد محدود من المركبات للتجارب السريرية بما في ذلك إريتوران، وهو مضاد TLR4، التي أظهرت آثار مثبطة قوية على الاستجابات الالتهابية بوس بوساطة في الدراسات ما قبل السريرية 37 ، 38 ، أظهرت نتائج إيجابية في المرحلة الأولى / إي السريرية التجارب 39 ، 40 ، 41 ، ولكن في نهاية المطاف فشل المرحلة الثالثة في خفض معدل الوفياتمن المرضى الذين يعانون من الإنتان الحاد 42 . هذا الفشل له العديد من الأسباب المحتملة، واحدة هي أن الاستجابات الالتهابية المرتبطة الإنتان غالبا ما يتم تشغيلها من خلال مسارات تلر متعددة، وبالتالي منع فقط TLR4 قد لا تكون كافية للحد من الالتهاب الساحق. لذلك، تطوير رواية، قوية مثبطات بولي-تلر يمكن التغلب على هذه التحديات السريرية وتصبح الجيل القادم العلاجات المضادة للالتهابات. ومن المتوقع أن تكون استراتيجية الفحص والبروتوكول الموصوفة هنا بمثابة أداة تجريبية فعالة في دراسة إشارات تلر، والأهم من ذلك كمنصة اكتشاف المخدرات لتسريع البحث عن مثبطات تلر الجيل القادم.
يوفر هذا النهج الفرز العديد من المزايا في البحث عن مثبطات تلر جديدة. أولا، لا يمكن أن يتحقق الفحص في إنتاجية عالية الإنتاجية باستخدام نظم خلية مراسل التي هي سريعة وحساسة وكمية. ثانيا، مع كلا خطوط خلية مراسل،يمكن إجراء الفرز لتغطية مجموعة واسعة من شلالات التشوير تلر، بما في ذلك مسير نف-κB / أب-1 ونمط إشارات الإنترفيرون من النوع I (عبر إرفس)؛ وبالتالي، فهي مثالية لفحص مسارات تلر متعددة. ثالثا، يتم هندسة هذه الخلايا مراسل وراثيا من خط الخلايا ثب-1 أحادي الإنسان، وهو نموذج نموذجي جيد لدراسة التدخلات التي تستهدف الاستجابة المناعية الفطرية. رابعا، يتم الحفاظ على خط الخلية بسهولة، وعلى وجه الخصوص، يمكن أن تكون متباينة في الضامة. وبما أن الضامة تلعب دورا رئيسيا في العديد من الحالات الالتهابية المرتبطة بالمرض، فإنها بمثابة الهدف المثالي لفحص العلاج المناعي الذي يستهدف إشارات تلر. خامسا، وحيدات والضامة لديها قدرة البلعمة مثيرة للإعجاب، والذي يسمح لامتصاص الخلوية عالية من الجسيمات النانوية، مما يجعلها مناسبة خاصة لدراسة العوامل العلاجية النانوية. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول الفرز للبحث ليس فقط نانو القائم عليهاالعوامل العلاجية، ولكن أيضا أنواع أخرى من المركبات الحيوية النشطة.
على الرغم من أن هذا النظام الفرز هو تنوعا جدا وقوية، يجب تطبيق بعض الحذر لتجنب الاكتشاف الكاذب. ويستند الفرز في المقام الأول على مقايسة مراسل، والتي تعتمد على التعبير عن الجين مراسل تحت سيطرة الأحداث الإشارات محددة. من الناحية المثالية، والتعبير الجيني مراسل (سيب و لوسيفيراس) يتناسب مع شدة مسار إشارة تنبيغ من الفائدة، وينعكس تأثير المرشحين المخدرات في قراءات الفحص. ومع ذلك، في الواقع، أي أحداث بيولوجية تحدث في اتجاه المنبع من التعبير الجيني مراسل يمكن أن تؤثر على النتيجة، مما يؤدي في بعض الأحيان إلى اكتشاف إيجابي كاذب. على سبيل المثال، انخفاض التعبير عن خطة عمل الطاقة المستدامة يمكن أن ينتج عن تثبيط عملية تخليق البروتين بدلا من تنظيم أسفل إشارات تلر 43 . لتجنب مثل هذا الاكتشاف الكاذب، النشاط المثبطة لل إيدنتيفييجب دائما التحقق من صحة المرشحين د، وطريقة الذهب المعيار هو أن ننظر مباشرة في مسارات الإشارات عن طريق إمونوبلوتينغ. جانب آخر مهم في فحص العوامل العلاجية المستندة إلى الجسيمات النانوية هو خصائص سطح هذه النانوديفيسيس. واستنادا إلى معدلات السطح، يمكن أن يكون للنانودات نشاط بيولوجي مختلف. ومع ذلك، فإنها قد يكون أيضا القدرة غير محددة ملزمة لبعض الجزيئات الحيوية. في حالة غير محددة ملزمة ل سيب أو لوسيفيراس، النشاط التحفيزي إلى ركائز يمكن أن تتعرض للخطر من خلال هذه نانودفيسس، مما يؤدي إلى اكتشاف كاذبة محتملة. بما في ذلك مجموعات التحكم إضافية (على سبيل المثال ، نانوديفيس فقط) في الفرز يقلل من خطر الاكتشاف الكاذب. أخيرا وليس آخرا، يجب فحص السمية الخلوية للمرشحين المحتملين الذين تم تحديدهم لاستبعاد السمية الخلوية كعامل مساهم في الاكتشاف الكاذب. ويمكن القيام بذلك في وقت واحد أثناء عملية الفرز باستخدام مقايسة البقاءوية القياسية (على سبيل المثال ،متس أو مت)، أو في تجربة منفصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم المقدم من برنامج أستاذ التعيين الخاص (الباحث الشرقي) في مؤسسات شنغهاي للتعليم العالي (هي)، وصندوق البداية من مستشفى الشعب الأول في شنغهاي (هي)، ودعم غاوفنغ الطب السريري منحة من شنغهاي جياوتونغ (هي)، والتمويل من مؤسسة كرون والتهاب القولون في كندا (سفك) (سيت و هي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
References
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
- Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
- Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
- Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
- Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461 (2014).
- Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
- Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
- Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
- O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
- Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
- Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
- Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
- Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
- Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
- Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265 (2014).
- Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
- Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
- Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
- Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
- Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
- Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
- Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
- Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
- He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
- Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
- Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374 (2011).
- Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
- Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
- Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
- Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
- Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
- Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
- Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
- Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
- Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
- Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
- Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).
