Summary
A sinalização do receptor Toll-like (TLR) desempenha um papel importante na fisiopatologia de muitas doenças inflamatórias humanas, e a regulação das respostas de TLR por nanopartículas bioativas é antecipada para ser benéfica em muitas condições inflamatórias. As células repórter baseadas em células THP-1 fornecem uma plataforma de triagem versátil e robusta para identificar novos inibidores da sinalização TLR.
Abstract
A regulação farmacológica das respostas do receptor Toll-like (TLR) é de grande promessa no tratamento de muitas doenças inflamatórias. No entanto, tem havido compostos limitados disponíveis até agora para atenuar a sinalização de TLR e não houve nenhum inibidor de TLR clinicamente aprovado (exceto o medicamento antipalúdico hidroxicloroquina) em uso clínico. À luz dos avanços rápidos na nanotecnologia, a manipulação da capacidade de resposta imune usando nano-dispositivos pode fornecer uma nova estratégia para tratar essas doenças. Aqui, apresentamos um método de rastreio de alto rendimento para identificar rapidamente novas nanopartículas bioativas que inibem a sinalização TLR em células imunes fagocíticas. Esta plataforma de triagem é construída em células repórter baseadas em células THP-1 com ensaios colorimétricos e de luciferase. As células repórter são manipuladas a partir da linha celular monocítica THP-1 humana por integração estável de duas construções repórter induzíveis. Um deles expressa um gene secretado de fosfatase alcalina embrionária (SEAP)Sob o controle de um promotor induzível pelos fatores de transcrição NF-κB e AP-1 e o outro expressa um gene repórter de luciferase segregado sob o controle de promotores induzíveis por fatores reguladores de interferão (IRFs). Na estimulação de TLR, as células repórter ativam Fatores de transcrição e subseqüentemente produz SEAP e / ou luciferase, que podem ser detectados usando seus reagentes de substrato correspondentes. Usando uma biblioteca de nanopartículas de nanopartículas peptídicas-ouro (GNP) estabelecidas em nossos estudos anteriores como exemplo, identificamos um híbrido peptídico-GNP que poderia efetivamente inibir os dois braços da cascata de sinalização TLR4 desencadeada pelo seu ligando protótipo, lipopolissacarídeo (LPS). Os resultados foram validados por técnicas bioquímicas padrão, incluindo imunotransferência. Uma análise posterior estabeleceu que esse híbrido principal tinha um amplo espectro inibitório, atuando em múltiplas vias TLR, incluindo TLR2, 3, 4 e 5. Esta abordagem experimental permite uma avaliação rápida deA nanopartícula (ou outros compostos terapêuticos) pode modular a sinalização TLR específica em células imunes fagocíticas.
Introduction
Os receptores Toll-like (TLRs) são um dos elementos-chave no sistema imune inato que contribuem para a primeira linha de defesa contra infecções. Os TLRs são responsáveis por detectar invasores patógenos, reconhecendo um repertório de padrões moleculares associados a patógenos (ou PAMPs) e a montagem de reações de defesa através de uma cascata de transdução de sinal 1 , 2 . Existem 10 TLR humanos identificados; Exceto TLR10 para o qual o (s) ligando (s) permanecem obscuros, cada TLR pode reconhecer um grupo distinto e conservado de PAMPs. Por exemplo, TLR2 e TLR4, localizados principalmente na superfície celular, podem detectar lipoproteínas e glicolípidos de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, respectivamente; Enquanto TLR3, TLR7 / 8 e TLR9, principalmente presentes nos compartimentos endossômicos, podem detectar produtos de ARN e DNA de vírus e bactérias 3 . Quando estimulados por PAMPs, os TLRs desencadeiam respostas imunes essenciais ao libertar pro-infMediadores lacônicos, recrutando e ativando células imunes efectoras e coordenando eventos imunes adaptativos subseqüentes 4 .
A transdução de sinalização TLR pode ser simplesmente categorizada em duas vias principais 5 , 6 . Um é dependente do fator de diferenciação mielóide da proteína adaptadora 88 (MyD88) - a via dependente de MyD88. Todos os TLRs, com exceção do TLR3, utilizam esta via para ativar o fator nuclear kappa-cadeia leve-intensificador de células B ativadas (NF-kB) e proteína quinases associadas a mitógenos (MAPKs), levando à expressão de mediadores pró-inflamatórios, como TNF- Α, IL-6 e IL-8. A segunda via utiliza o interferão-β indutor de adaptador contendo TIR (TRIF) - o caminho dependente de TRIF ou independente de MyD88 - para ativar fatores reguladores de interferão (IFN) e NF-κ B, resultando na produção de IFN tipo I. Sinalização TLR intactaÉ fundamental para a nossa proteção diária contra infecções microbianas e virais; Defeitos nas vias de sinalização TLR podem levar à imunodeficiência e muitas vezes prejudicam a saúde humana. 7
No entanto, a sinalização TLR é uma "espada de dois gumes" e a ativação excessiva e descontrolada do TLR é prejudicial. As respostas TLR hiperativas contribuem para a patogênese em muitas doenças inflamatórias humanas agudas e crônicas 8 , 9 . Por exemplo, a sepsis caracterizada por inflamação sistêmica e lesão multiorgânica é principalmente devido a respostas imunes agudas e esmagadoras em relação a infecções, com TLR2 e TLR4 desempenhando um papel crucial na fisiopatologia da sepse 10 , 11 , 12 . Além disso, TLR5 foi encontrado para contribuir para a inflamação pulmonar crônica de pacientes com fibrose cística 13, 14 . Além disso, a sinalização TLR endossomal desregulada (por exemplo, TLR7 e TLR9) está fortemente associada ao desenvolvimento e progressão de várias doenças auto-imunes, incluindo lúpus eritematoso sistêmico (LES) e artrite reumatóide (RA) 15 , 16 . Essas linhas convergentes de evidência identificam a sinalização TLR como um potencial alvo terapêutico para muitas doenças inflamatórias 17 .
Embora a regulação farmacológica das respostas de TLR seja antecipada a ser benéfica em muitas condições inflamatórias, infelizmente, atualmente existem poucos compostos clinicamente disponíveis para inibir a sinalização TLR 9 , 17 , 18 . Isto é em parte devido à complexidade e redundância das vias TLR envolvidas na homeostase imune e na patologia da doença. Portanto, procurando por romance, PotenT agentes terapêuticos para direcionar múltiplas vias de sinalização de TLR podem preencher um fosso fundamental e superar o desafio de avançar os inibidores de TLR na clínica.
À luz dos rápidos avanços em nanociências e nanotecnologias, os nanodispositivos estão emergindo como os moduladores de TLR de próxima geração devido às suas propriedades únicas 19 , 20 , 23 . O tamanho da nanoescala permite que estes nano-terapêuticos tenham melhor distribuição biológica e circulação sustentada 24 , 25 , 26 . Eles podem ser ainda funcionalizados para atender aos perfis farmacodinâmicos e farmacocinéticos desejados 27 , 28 , 29 . Mais emocionante, a bio-atividade desses novos nanodispositivos surge de suas propriedades intrínsecas, que podem ser adaptadas paraAplicações médicas específicas, em vez de simplesmente atuar como um veículo de entrega para um agente terapêutico. Por exemplo, uma nanopartícula parecida com a lipoproteína de alta densidade (HDL) foi projetada para inibir a sinalização TLR4, eliminando o ligando TLR4 LPS 23 . Além disso, desenvolvemos um sistema híbrido de nanopartículas de péptido-ouro, onde os péptidos decorados podem alterar as propriedades superficiais das nanopartículas de ouro e permitir-lhes ter várias atividades biológicas 30 , 31 , 32 , 33 . Isso os torna uma classe especial de drogas (ou "nano-drogas") como a nova geração de nano-terapêutica.
Neste protocolo, apresentamos uma abordagem para identificar uma nova classe de híbridos de nanopartículas de péptido-ouro (péptido-PNP) que podem inibir potentemente múltiplas vias de sinalização de TLR em células imunes fagocíticas 32 , 33 . A abordagem é baseada em linhas celulares repórter THP-1 comercialmente disponíveis. As células repórter consistem em duas construções repórter estáveis e induzíveis: uma carrega um gene secretado de fosfatase alcalina embrionária (SEAP) sob o controlo de um promotor induzível pelos factores de transcrição NF-κB e proteína activadora 1 (AP-1); O outro contém um gene repórter de luciferase segregado sob o controle de promotores indutíveis por fatores reguladores de interferão (IRFs). Após a estimulação de TLR, a transdução de sinal leva à ativação de NF-κB / AP-1 e / ou IRFs, que liga os genes repórter ao SEAP secreto e / ou à luciferase; Tais eventos podem ser facilmente detectados usando seus reagentes de substrato correspondentes com um espectrofotômetro ou um luminômetro. Usando essa abordagem para pesquisar nossa biblioteca previamente estabelecida de híbridos peptídicos-PNP, identificamos candidatos líderes que podem inibir potentemente as vias de sinalização TLR4. A atividade inibitória do péptido principal -Os híbridos PNP foram então validados usando outra abordagem bioquímica de imunotransferência e avaliados em outras vias TLR. Esta abordagem permite o rastreio rápido e eficaz de novos agentes que visam as vias de sinalização TLR.
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Protocol
1. Preparação de meios de cultura celular e reagentes
- Prepare o meio de cultura celular R10 completo adicionando os suplementos de 10% de soro bovino fetal (FBS), L-glutamina 2 mM e piruvato de sódio 1 mM no meio RPMI-1640.
- Prepare o meio de cultura de seleção R10-Z adicionando os antibióticos Zeocin (200 μg / mL) a R10 para manter a expressão de SEAP sob o controle de NF-κ B / AP-1 ativação. Para selecionar células que expressam os genes repórter SEAP e luciferase, adicione Zeocin (100 μg / mL) e blasticidina (10 μg / mL) a R10 (como R10-ZB).
- Prepare a solução de substrato SEAP dissolvendo uma bolsa do substrato em pó (por exemplo , QUANTI-Blue) em 100 mL de água livre de endotoxina ultrapura em um balão de vidro limpo de 125 mL.
- Reduzir a solução suavemente e incubar a 37 ° C durante 1 h para garantir a dissolução completa dos substratos. <Li> Filtra a solução usando uma membrana de 0,2 μm para garantir a sua esterilidade (opcional) e armazená-la a 4 ° C até 2 semanas antes da utilização.
- Depois de dissolver completamente o pó, use a solução imediatamente. Alternativamente, armazene a solução a 4 ° C (até uma semana) ou a -20 ° C (até um mês) antes da utilização.
CUIDADO: Ambas as soluções de substrato são sensíveis à luz e devem evitar a exposição à luz sempre que possível. Vários ciclos de congelamento-descongelamento da solução podem causar instabilidade do substrato e encurtar sua vida útil.
CUIDADO: A preparação de reagente para uso em cultura deve ser realizada em um gabinete de biossegurança e todos os recipientes devem ser esterilizados antes da utilização. Devem ser evitados os ciclos repetidos de congelamento-descongelamento das soluções PMA e LPS.
2. Cultura de macrófagos derivados de células de repórter de THP-1
- Use duas linhas celulares repórter THP-1: células THP-1-XBlue e THP-1-Dual. O primeiro possui um gene repórter SEAP controlado por NF-κB / AP-1 e este possui um sistema de repórter duplo, o mesmo gene repórter SEAP e um gene de luciferase controlado por IRF. oOs procedimentos de cultura são idênticos, exceto os meios de cultura de seleção.
- Descongelar um estoque de células de trabalho (~ 5 x 10 6 células) em 10 mL de meio R10, centrifugar as células a 300 xg durante 5 min. Ressuspender células em 10 mL de meio R10 e transferi-las para um balão de cultura T75. Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias até que as células atinjam uma densidade de 1 x 10 6 células / mL.
- Quando o crescimento celular atinge sua capacidade, células de passagem para reduzir a densidade celular na faixa de 2-5 x 10 5 células / mL, para que as células possam continuar a crescer.
- Após pelo menos 1 passagem, comece a cultivar as células no meio de cultura de seleção: R10-Z para THP-1-XBlue e R10-ZB para THP-1-Dual. Depois de cultivar as células com meio de cultura de seleção para pelo menos 1 passagem, as células estão prontas para a experiência.
CUIDADO: o crescimento excessivo das células pode levar à morte celular significativa; A viabilidade celular deve manter> 98%. Mantenha um registro do número da passagem como o celPode comportar-se de forma diferente após várias passagens (> 20 passagens).
NOTA: Os frascos de cultura celular podem ser reutilizados várias vezes para economizar custos; No entanto, esta prática pode aumentar o risco de contaminação geral e contaminação cruzada entre frascos diferentes (se manipula diferentes linhas celulares ao mesmo tempo). Durante a troca de mídia e a passagem da célula, a centrifugação é ajustada em 300 xg durante 5 min.
- Para realizar o ensaio de células repórter, as células de sementes em uma placa de cultura de células de fundo plano de 96 poços e diferenciá-las em macrófagos. Os procedimentos são descritos a seguir.
- Transferir as células do balão para um tubo de centrífuga, centrifugar as células a 300 xg durante 5 min e ressuspendê-las no meio R10 a uma concentração de 1 x 10 6 células / mL. Adicione alíquotas da solução de PMA nas suspensões celulares com uma concentração final de 50 ng / mL.
- Transfira 100 μL das suspensões celulares em cada poço dos 96-nósAplique usando uma pipeta multicanal. Incubar a placa a 37 ° C (numa incubadora de cultura de células) durante 24 h.
- Após a incubação, remova cuidadosamente o meio de cultura usando um aspirador de vácuo (ou com uma pipeta multicanal) e lave suavemente as células com PBS (100 μL / poço) duas vezes; Adicione 100 μL de meio R10 fresco em cada poço. Descanse as células por 2 dias em uma incubadora antes de realizar o ensaio repórter.
CUIDADO: O passo de repouso é muito importante para permitir que as células se acalmem após a estimulação de PMA em seu estado de silêncio normal. Isso pode reduzir significativamente os sinais de fundo dos genes repórter em condições não estimadas.
NOTA: Após 24 estimulações com PMA, as células são diferenciadas em fenótipo tipo macrófago, com uma característica de adesão celular no fundo do poço e uma característica morfológica de pseudopoda.
3. Triagem para Nano-inibidores TLR4 potenciais usando as células Reporter NOTA: Uma vez que a sinalização TLR4 utiliza caminhos dependentes de MyD88 e dependentes de TRIF, ele é selecionado como o alvo principal para abranger uma ampla gama de caminhos de sinalização TLR. As células repórter de THP-1-XBlue são usadas para examinar principalmente a ativação NF-κB / AP-1 enquanto as células THP-1-Dual são para ativação de IRF a partir da transdução de sinal dependente de TRIF.
- Identifique a dose ideal de LPS gerando uma curva dose-resposta antes da triagem.
- Diluir a solução LPS em funcionamento para uma concentração final de 0,01 a 100 ng / mL em meio R10 (fazer a diluição na escala log10). Layout do desenho da placa e faça a diluição em uma placa de cultura de 96 poços de fundo redondo. Certifique-se de que cada poço tenha um mínimo de 110 μL de solução após a diluição.
- Remova cuidadosamente o meio de cultura da placa sem semente celular (a partir de 2.2.3) usando um aspirador de vácuo.
- Transferir o meio R10 contendo LPS preparado na placa de diluição (3.1.1) iNa placa de cultura de acordo com o layout das amostras. Incubar a placa a 37 ° C (numa incubadora de cultura de células) durante 24 h.
- Às 24 h, transfira cuidadosamente os sobrenadantes (80 μL / poço) para uma nova placa de fundo redondo de 96 poços. Realize o ensaio de luminescência colorimétrica e / ou luciferase nestas soluções imediatamente ou guarde-as a 4 ° C (várias horas) ou -20 ° C (dias) antes do desenvolvimento do ensaio.
NOTA: O design do layout da placa deve ser simples e claro para experiências e análise de dados. Para cada condição, 2-4 repetições devem ser consideradas. Sempre inclua um grupo de controle negativo (LPS nulo). Recomenda-se a utilização de células THP-1-XBlue para a ativação NF-κB / AP-1, uma vez que as células duplas têm um fundo relativamente alto de NF-κ B / AP-1 ativação após serem diferenciadas em macrófagos. No entanto, é viável usar as células duplas para relatar a ativação NF-κB / AP-1 e IRF.
- Desenvolva a corEnsaio imetrico para a ativação de NF-κB / AP-1 e o ensaio de luminescência de luciferase para ativação de IRF.
- Para avaliar a ativação NF-κB / AP-1, transfira 20 μL de sobrenadante de cada amostra para uma nova placa de cultura de 96 poços de fundo plano; E adicione 180 μL de solução pré-aquecida de substrato SEAP em cada poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 1 - 2 h para permitir o desenvolvimento da cor (rosa a azul escuro). Recolher a absorção a 655 nm em um leitor de placas.
CUIDADO: O tempo de incubação pode ser variado com base no desenvolvimento da cor (30 minutos até a incubação durante a noite). Recomenda-se que aguarde até que a densidade óptica (OD) da cor mais escura chegue acima de 1, evitando a saturação do desenvolvimento de cor (OD> 3). - Para a análise da ativação de IRF, transfira 10 μL de sobrenadante de cada amostra para dentro de uma placa branca de fundo transparente de 96 poços. Adicione a solução de luciferase (50 μL) e colete imediatamente a luminescência wEllo pelo poço.
NOTA: Recomenda-se o uso de um leitor de placas de luminescência com uma função de auto-injeção para garantir a consistência na leitura da luminescência do poço ao poço e da placa à placa. Se as soluções de substrato forem injetadas manualmente, assegure-se de um tempo consistente de incubação e configuração de leitura para cada poço.
- Para avaliar a ativação NF-κB / AP-1, transfira 20 μL de sobrenadante de cada amostra para uma nova placa de cultura de 96 poços de fundo plano; E adicione 180 μL de solução pré-aquecida de substrato SEAP em cada poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 1 - 2 h para permitir o desenvolvimento da cor (rosa a azul escuro). Recolher a absorção a 655 nm em um leitor de placas.
- Conduza o ensaio de rastreio em vários híbridos peptídicos-GNP com estimulação LPS de 10 ng / mL (com base em 3.1). Siga o mesmo procedimento em 3.2 para o desenvolvimento do ensaio repórter.
- Concentre os híbridos peptídicos-PNP a 200 nM em meio R10 usando o método de centrifugação. Centrifugar 20 volumes da solução híbrida (10 nM) a 18.000 xg durante 30 min, e descartar cuidadosamente os sobrenadantes. Recolher os híbridos (na parte inferior do tubo) em um tubo, lavá-los com PBS duas vezes e re-suspender os híbridos em um volume do meio R10.
- Misture volumes iguais dos híbridos concentrados eLPS (20 ng / mL) contendo meio R10 para ter uma concentração final dos híbridos e LPS para ser 100 nM e 10 ng / mL, respectivamente.
- Remova o meio de cultura da placa cultivada (2.2.3) e adicione 100 μL da solução mista em cada poço (3 repetições para cada condição); Incluem um controle negativo (somente no meio) e um controle de LPS (LPS de 10 ng / mL sem híbridos).
- Após 24 h de incubação a 37 ° C, transfira o meio de cada poço para dentro de um tubo e centrifugue os tubos a 18.000 xg, 4 ° C durante 30 min. Recolher os sobrenadantes (50-80 μL / tubo) para uma placa de fundo redondo de 96 poços e realizar o ensaio repórter como descrito em 3.2.
CUIDADO: Ao descartar os sobrenadantes após a centrifugação, não agite os híbridos na parte inferior do tubo.
NOTA: A centrifugação no passo 3.3.4 é muito importante para remover os híbridos de nanopartículas não internalizadas do meio de cultura e pode evitar a interferência dos híbridos com o coLeituras lorimétricas / luminescentes. Isso ocorre porque as nanopartículas de ouro podem absorver amplos comprimentos de onda de luz, dependendo do tamanho e da aglomeração.
4. Validando o efeito inibitório dos candidatos potenciais
NOTA: Para confirmar o efeito inibitório dos potenciais candidatos a partir da triagem, são utilizadas duas abordagens. Uma é examinar as respostas de dose dos estimulantes (LPS) a uma concentração híbrida fixa (ou ao contrário); O outro é observar diretamente a inibição nos sinais NF-κB / AP-1 e IRF3 via imunotransferência.
- Na aproximação um, execute o ensaio repórter com 100 nM dos híbridos de chumbo e duas concentrações de LPS a 1 ng / mL e 10 ng / mL seguindo os mesmos procedimentos descritos em 3.3. Inclua um híbrido inativo (com base nos resultados de triagem) como um controle híbrido para comparação.
- Para a abordagem de imunotransferência, siga o padrão eProcedimentos experimentais.
- Cicatrizar células THP-1 em meio R10, semear as células em uma placa de cultura de 12 poços (2 x 10 6 células / poço), e diferenciá-las em macrófagos, tratando as células com 50 μg / mL de PMA por 24 horas, seguidas de repouso por 2 dias.
- Após a diferenciação celular, estimule células com LPS de 10 ng / mL com / sem híbridos (100 nM) ao longo do tempo (até 4 h). Em vários pontos de tempo (0, 5, 15, 30, 60, 120 e 240 min), prepare os lisados celulares para imunotransferência. Inclua um híbrido inativo como controle.
- Sonda os sinais de IκBα, p65 fosforilado e IRF3 fosforilado para examinar o efeito inibitório dos híbridos de chumbo na ativação de NF-κB e IRF3. Sonda os sinais de β-actina e IRF3 totais como controles internos.
NOTA: A transdução do sinal geralmente ocorre muito mais rápido (em algumas horas), em seguida, a expressão das enzimas repórter SEAP e luciferase (24 h). É altamente recomendável também realizarEnsaio de viabilidade dos híbridos testados às 24 h como outro método de validação.
5. Avaliando a especificidade TLR
NOTA: Para investigar a especificidade TLR do péptido principal-GNP híbrido, outras vias de sinalização TLR são testadas, incluindo TLR2, TLR3 e TLR5. TLR7, 8 e 9 são excluídos porque os macrófagos derivados de THP-1 não respondem bem à estimulação desses TLRs devido à falta de expressão de TLR7, 8 e 9 em macrófagos 34 .
- Teste várias concentrações (1 ng / mL a 25 μg / mL) dos ligandos específicos para TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I: C) e TLR5 (flagelina) em ambos os macrófagos derivados de células repórter para obter a concentração ideal seguindo o mesmo Procedimento em 3.1 e 3.2.
- Tratar as células com as misturas do híbrido chumbo (100 nM) e cada ligando de TLR na concentração obtida de 5,1 para avaliar a especificidade inibitória do chumbo hDe acordo com o procedimento experimental descrito em 3.3. Inclua o híbrido inativo como controle de comparação.
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Representative Results
A abordagem experimental global está ilustrada na Figura 1 . As duas linhas de células repórter THP-1, THP-1-XBlue e THP-1-Dual, são utilizadas para visualizar rapidamente as respostas TLR, avaliando a ativação de NF-κB / AP-1 e IRFs, respectivamente. A ativação de NF-κB / AP-1 pode ser detectada pelo ensaio colorimétrico SEAP, enquanto que a ativação IRF é monitorada por luminescência de luciferase. As células monocíticas de THP-1 podem ser facilmente derivadas em macrófagos para pesquisar os nanodispositivos para sua atividade imunomoduladora nas células imunes fagocíticas inatas. Com o sistema repórter, o rastreio pode ser conduzido de forma muito alta; Essa abordagem é versátil para a descoberta de novas imunoterapêuticas, particularmente buscando a sinalização imune inata, como a sinalização TLR.
O procedimento de triagem e os resultados representativos são mostrados em Figura 2A E 2B ). Diferentes concentrações dos ligandos TLR (TLR4 como exemplo) são primeiro testadas para obter a concentração ideal para o rastreio real dos híbridos peptídicos-PNP. A estimulação de TLR4 por LPS resultou na ativação de NF-κB / AP-1 e na produção de SEAP. O SEAP lançado converteu o substrato e mudou sua propriedade fotofísica, que poderia ser monitorada pelo deslocamento na absorção de luz, levando à mudança de cor da solução ( Figura 2C ). Tal alteração é proporcional à quantidade de SEAP liberada após estimulação e pode ser quantificada medindo a absorvância a 655 nm em um espectrofotômetro ( Figura 2D ). Da mesma forma, a ativação de IRFs (desencadeada por LPS) levou à expressão de luciferasE, que catalisou o substrato para produzir luminescência ( Figura 2E ). Com base nestas respostas de dose, foi utilizada uma concentração ótima de LPS (10 ng / mL) para rastrear uma pequena biblioteca previamente estabelecida de híbridos peptídicos-PNP ( Tabela 1 ). A fabricação dos híbridos e suas características físico-químicas foram descritas em nossas publicações anteriores 30 , 31 , 32 . A partir da triagem, um grupo de híbridos (P12 e seus derivados) foram identificados por sua potente atividade inibitória na NF-κB / AP-1 e na ativação do IRF desencadeada pelo LPS ( Figura 2F ); Curiosamente, o P13 híbrido, apenas um pouco diferente de P12 nos revestimentos de péptidos, não teve nenhuma atividade inibitória, o que poderia ser servido como um controle híbrido para comparação. Os derivados de P13 mostraram vários níveis de atividade inibitória leve, dependendo da oaR péptido decorado na superfície.
Depois de identificar o híbrido principal, é importante validar a atividade inibitória. A inibição foi confirmada pela primeira vez, examinando os diferentes índices do híbrido ao LPS para excluir potenciais resultados falso-positivos devido a artefatos técnicos. À medida que a concentração de LPS aumentava, o efeito inibitório do híbrido (a uma concentração fixa) diminuiu conforme esperado ( Figura 3A E 3B ). Para assegurar ainda que a inibição observada dos ensaios repórter foi, na verdade, o resultado de uma regulação negativa da sinalização NF-κB e IRF pelo híbrido principal, a imunotransferência foi conduzida para avaliar diretamente a transdução do sinal protéico ao longo do tempo. A ativação de NF-κB e IRF3 foi examinada examinando a fosforilação da subunidade NF-kB p65 e a degradação do inibidor NF-κB IκBα e o fósforoDe IRF3, respectivamente. Conforme mostrado na Figura 3C , o híbrido híbrido P12 poderia reduzir a fosforilação de p65, inibir a degradação de IκBα e a fosforilação IRF3 atrasada, enquanto o híbrido P13 inativo não poderia (dados não mostrados). Todos esses resultados confirmaram que o híbrido derivado identificado foi capaz de inibir a sinalização TLR4 mediada por LPS por regulação negativa tanto da ativação de NF-κ B quanto de IRF3.
Além da sinalização TLR4, a atividade inibitória do híbrido principal foi ainda avaliada em outras vias TLR incluindo TLR2, TLR3 e TLR5 para abordar a especificidade TLR. Conforme mostrado na Figura 4 , o híbrido híbrido P12 conseguiu reduzir a sinalização NF-κB / AP-1 mediada por TLR2 e TLR5, bem como a ativação IRF mediada por TLR3; Novamente, o P13 híbrido inativo não mostrou nenhuma atividade inibitória. Esses resultados sugeriram que o híbrido de chumbo identificado possui um inibidor potente Ry atividade em várias vias de TLR.
Figura 1: abordagem experimental global do rastreio de alto rendimento de inibidores de TLR usando o teste de célula repórter. São utilizadas duas linhas de células repórter: THP-1-XBlue e THP-1-Dual. O primeiro possui um gene repórter SEAP sob o controle da ativação de NF-kB / AP-1, enquanto que o sistema Dual possui um gene repórter de luciferase adicional sob o controle da ativação de IRFs. Essas células podem ser facilmente diferenciadas em macrófagos para rastreamento de alto rendimento de nanopartículas imune-moduladoras na sinalização imune inata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2: rastreio de alto nítido de inibidores na sinalização TLR4.
( A ) Um esquema de procedimentos experimentais. ( B ) Imagem microscópica óptica de macrófagos diferenciados (ampliação 200x). ( C ) Uma imagem representativa da mudança de cor da solução do ensaio do repórter SEAP; A cor da solução do substrato transformou-se em roxo ou azul escuro (de rosa original), dependendo da expressão SEAP no meio de cultura. ( D ) Análise quantitativa da absorção do substrato SEAP a 655 nm em resposta à estimulação LPS. ( E ) A luminescência da luciferase do sistema repórter IRF proporcionalmente à estimulação LPS. ( F ) rastreio de alto rendimento identificando o péptido principal-PNP híbrido P12 e seus derivados na inibição de ambos os caminhos NF-κB / AP-1 e IRF da sinalização TLR4; A concentração híbrida = 100 nM; O LPSConcentração = 10 ng / mL; A barra representa média ± desvio padrão; N = 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Validação da atividade inibitória do híbrido-chumbo. Confirmação do efeito inibitório do híbrido de chumbo com várias concentrações de LPS em ambos os sistemas repórter de luciferase ( A ) SEAP e ( B ). ( C ) Confirmando a inibição do híbrido principal na sinalização NF-κB e IRF3 via imunotransferência. O híbrido inativo P13 foi usado como um controle híbrido para comparação. A concentração híbrida = 100 nM; A concentração de LPS = 10 ng / mL; A barra representa média ± desvio padrão; N = 3; * E *** denotam p <0,05 aNd p <0,001, respectivamente, utilizando análise de ANOVA de sentido único. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: efeito inibidor do híbrido principal em outras vias de sinalização TLR.
A inibição de NF-κB / AP-1 pelo híbrido principal após a estimulação de TLR2 (Pam3CSK4 = 1 ng / mL) ( A ) e estimulação de TL5 (flagelina = 100 ng / mL) ( B ). ( C ) A redução da sinalização NF-κB / AP-1 e IRF pelo híbrido principal após a estimulação TLR3 (poli I: C = 25 μg / mL). A concentração híbrida = 100 nM; A barra representa média ± desvio padrão; N = 3; *, ** e *** indicam p <0,05, p <0,01 e p <0,001, respectivamente, usandoAnálise ANOVA de sentido único; Ns: não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Uma pequena biblioteca de híbridos peptídicos-PNP estabelecidos em nossos primeiros estudos.
Os híbridos são feitos de um núcleo de nanopartículas de ouro (~ 13 nm de diâmetro) e vários revestimentos hexapéptidos na superfície. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Uma vez que os TLRs estão envolvidos na patogênese de muitas doenças inflamatórias, eles emergiram como alvos terapêuticos para a modulação de respostas imunes e condições inflamatórias. No entanto, o desenvolvimento clínico de terapêuticas para inibir as vias de sinalização TLR teve sucesso limitado até à data. O fármaco antipalúdico hidroxicloroquina que inibe TLR7 e TLR9 está em uso clínico 35 , 36 . Da mesma forma, apenas um número limitado de compostos evoluiu para ensaios clínicos, incluindo eritoran, um antagonista de TLR4, que exibiu potentes efeitos inibitórios nas respostas inflamatórias mediadas por LPS em estudos pré-clínicos 37 , 38 , apresentaram resultados positivos na fase I / II clínica Ensaios 39 , 40 , 41 , mas, em última instância, o teste de fase III não conseguiu reduzir a mortalidadeDos pacientes com sepse grave 42 . Esta falha tem muitas razões possíveis, sendo uma delas que as respostas inflamatórias associadas à sepse são muitas vezes desencadeadas através de múltiplas vias de TLR e, portanto, bloquear apenas TLR4 pode não ser suficiente para reduzir a inflamação esmagadora. Portanto, o desenvolvimento de novos e potentes inibidores de poli-TLR poderia superar tais desafios clínicos e se tornar a próxima geração de terapêutica anti-inflamatória. A estratégia de triagem e o protocolo descritos aqui devem servir como uma ferramenta experimental eficiente no estudo da sinalização TLR e, mais importante, como uma plataforma de descoberta de drogas para acelerar a busca dos inibidores de TLR de próxima geração.
Esta abordagem de triagem oferece várias vantagens na busca por novos inibidores de TLR. Primeiro, o rastreio pode ser alcançado de uma forma de alto rendimento usando os sistemas de células repórter que são rápidos, sensíveis e quantitativos. Em segundo lugar, com ambas as linhas celulares repórter,O rastreio pode ser feito para cobrir uma ampla gama de cascatas de sinalização TLR, incluindo a via NF-κB / AP-1 e a sinalização de interferão tipo I (via IRFs); Assim, eles são ideais para a triagem de múltiplos caminhos de TLR. Em terceiro lugar, essas células repórter são geneticamente modificadas a partir da linhagem celular monocítica THP-1 humana, que é um bom sistema modelo para estudar intervenções visando a resposta imune inata. Em quarto lugar, a linha celular é facilmente mantida e, em particular, pode ser diferenciada em macrófagos; E uma vez que os macrófagos desempenham um papel fundamental em muitas condições inflamatórias associadas à doença, eles servem como alvo ideal para a triagem de imunoterapêuticos visando a sinalização TLR. Em quinto lugar, os monócitos e os macrófagos têm uma capacidade fagocítica impressionante, o que permite uma elevada absorção celular das nanopartículas, tornando-os especialmente adequados para o estudo de agentes terapêuticos a nanoescala. Além disso, este protocolo de triagem pode ser aplicado para pesquisar não apenas o nano-based therAgentes terapêuticos, mas também outros tipos de compostos bioativos.
Embora esta plataforma de triagem seja muito versátil e robusta, é preciso ter uma cautela para evitar descobertas falsas. A triagem baseia-se principalmente no ensaio repórter, que depende da expressão do gene repórter sob o controle de eventos específicos de sinalização. Idealmente, a expressão do gene repórter (SEAP e luciferase) é proporcional à intensidade da via de transdução de sinal de interesse, e o impacto dos candidatos de drogas é refletido nas leituras de ensaio. No entanto, na realidade, quaisquer eventos biológicos que ocorram a montante da expressão do gene repórter podem afetar o resultado, levando às vezes a uma descoberta falso positiva. Por exemplo, a baixa expressão de SEAP pode resultar da inibição do processo de síntese protéica, em vez da redução da sinalização TLR 43 . Para evitar uma descoberta tão falsa, a atividade inibitória da identificaçãoOs candidatos devem ser sempre validados, e o método do padrão-ouro deve examinar diretamente as vias de sinalização via imunotransferência. Outro aspecto importante no rastreio de agentes terapêuticos baseados em nanopartículas são as propriedades superficiais desses nanodispositivos. Com base nos modificadores de superfície, os nanodispositivos podem ter várias atividades biológicas. No entanto, eles também podem ter capacidade de ligação não específica para certas biomoléculas. No caso de ligação não específica ao SEAP ou à luciferase, a atividade catalítica para os substratos pode ser comprometida por esses nanodispositivos, levando a potencial descoberta falsa. Incluir grupos de controle extra ( por exemplo , apenas nanodevice) na triagem reduz o risco de descoberta falsa. Por último, mas não menos importante, a citotoxicidade dos candidatos principais identificados deve ser examinada para excluir a citotoxicidade como fator contribuinte para a descoberta falsa. Isso pode ser feito simultaneamente durante o processo de triagem usando um ensaio de viabilidade padrão ( por exemplo ,MTS ou MTT), ou em uma experiência separada.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer o apoio do Programa para Professor de Nomeação Especial (Eastern Scholar) nas Instituições de Aprendizagem Superior de Shanghai (HY), o fundo de partida do Hospital das Primeiras Pessoas de Xangai (HY), o apoio da Grant Gaudeng Clinical Medicine Grant de Shanghai Jiaotong Faculdade de Medicina da Universidade (HY) e o financiamento da Fundação Crohn e Colite do Canadá (CCFC) (SET e HY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
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