Summary
Maut-like Rezeptor (TLR) -Signalisierung spielt eine wichtige Rolle bei der Pathophysiologie vieler menschlicher entzündlicher Erkrankungen, und die Regulierung der TLR-Reaktionen durch bioaktive Nanopartikel wird in vielen entzündlichen Zuständen als vorteilhaft angesehen. THP-1 zellbasierte Reporterzellen bieten eine vielseitige und robuste Screening-Plattform zur Identifizierung neuer Inhibitoren der TLR-Signalisierung.
Abstract
Die pharmakologische Regulation von Toll-like Rezeptor (TLR) Reaktionen ist ein großes Versprechen bei der Behandlung von vielen entzündlichen Erkrankungen. Allerdings gab es bisher nur begrenzte Verbindungen, um die TLR-Signalisierung zu dämpfen, und es gab keine klinisch zugelassenen TLR-Inhibitoren (mit Ausnahme des Anti-Malaria-Arzneimittels Hydroxychloroquin) in der klinischen Anwendung. Angesichts der rasanten Fortschritte in der Nanotechnologie kann die Manipulation der Immunantwort unter Verwendung von Nano-Geräten eine neue Strategie zur Behandlung dieser Krankheiten darstellen. Hierin präsentieren wir eine Hochdurchsatz-Screening-Methode zur schnellen Identifizierung von neuartigen bioaktiven Nanopartikeln, die die TLR-Signalisierung in phagozytischen Immunzellen hemmen. Diese Screening-Plattform basiert auf THP-1 zellbasierten Reporterzellen mit Kolorimetrie- und Luciferase-Assays. Die Reporterzellen werden aus der humanen THP-1 monozytischen Zelllinie durch stabile Integration von zwei induzierbaren Reporterkonstrukten konstruiert. Man drückt ein sezerniertes embryonales alkalisches Phosphatase (SEAP) -Gen ausUnter der Kontrolle eines durch die Transkriptionsfaktoren NF- & kgr; B und AP-1 induzierbaren Promotors, und der andere exprimiert ein sezerniertes Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle von durch Interferon-regulatorische Faktoren (IRFs) induzierbaren Promotoren. Bei der TLR-Stimulation aktivieren die Reporterzellen Transkriptionsfaktoren und produzieren anschließend SEAP und / oder Luciferase, die mit ihren entsprechenden Substratreagenzien nachgewiesen werden können. Unter Verwendung einer Bibliothek von Peptid-Gold-Nanopartikel (GNP) Hybriden, die in unseren früheren Studien als Beispiel etabliert wurden, identifizierten wir ein Peptid-GNP-Hybrid, das die beiden Arme der TLR4-Signalkaskade, die durch seinen prototypischen Liganden, Lipopolysaccharid (LPS) ausgelöst wurde, wirksam hemmen könnte. Die Ergebnisse wurden durch Standard-biochemische Techniken einschließlich Immunoblotting validiert. Eine weitere Analyse ergab, dass dieser Blei-Hybrid ein breites inhibitorisches Spektrum hatte, das auf mehrere TLR-Wege, einschließlich TLR2, 3, 4 und 5, einwirkt. Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht eine rasche Bewertung vonNanopartikel (oder andere therapeutische Verbindungen) können spezifische TLR-Signalisierung in phagozytischen Immunzellen modulieren.
Introduction
Mautartige Rezeptoren (TLRs) sind eines der Schlüsselelemente des angeborenen Immunsystems, das zur ersten Verteidigungslinie gegen Infektionen beiträgt. TLRs sind verantwortlich für die Erfassung von eindringenden Pathogenen durch die Erkennung eines Repertoires von pathogen-assoziierten molekularen Mustern (oder PAMPs) und Montage von Verteidigungsreaktionen durch eine Kaskade der Signaltransduktion 1 , 2 . Es gibt 10 menschliche TLRs identifiziert; Außer TLR10, für die der Ligand (s) unklar bleibt, kann jeder TLR eine deutliche, konservierte Gruppe von PAMPs erkennen. Beispielsweise können TLR2 und TLR4, die sich primär auf der Zelloberfläche befinden, Lipoproteine und Glycolipide aus Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien nachweisen; Während TLR3, TLR7 / 8 und TLR9, die hauptsächlich in den endosomalen Kompartimenten vorhanden sind, RNA- und DNA-Produkte aus Viren und Bakterien spüren können 3 . Wenn sie durch PAMPs stimuliert werden, lösen TLRs wesentliche Immunantworten aus, indem sie pro-inf freisetzenLammatorische Mediatoren, Rekrutierung und Aktivierung von Effektor-Immunzellen und koordinieren nachfolgende adaptive Immunereignisse 4 .
Die TLR-Signalisierungstransduktion kann einfach in zwei Hauptwege 5 , 6 kategorisiert werden. Einer ist abhängig vom Adapterprotein myeloiden Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) - dem MyD88-abhängigen Weg. Alle TLRs mit Ausnahme von TLR3 nutzen diesen Weg zur Aktivierung des Kappa-Light-Ketten-Enhancers von aktivierten B-Zellen (NF- & kgr; B) und Mitogen-assoziierten Proteinkinasen (MAPKs), was zur Expression von proinflammatorischen Mediatoren wie TNF- Α, IL-6 und IL-8. Der zweite Weg nutzt TIR-Domain-haltige Adapter-induzierende Interferon-β (TRIF) - den TRIF-abhängigen oder MyD88-unabhängigen Weg -, um Interferon (IFN) regulatorische Faktoren (IRFs) und NF-κB zu aktivieren, was zur Produktion von führt Typ I IFNs. Intakte TLR-SignalisierungIst entscheidend für unseren täglichen Schutz vor mikrobiellen und viralen Infektionen; Defekte in TLR-Signalwegen können zu Immunschwäche führen und sind oft schädlich für die menschliche Gesundheit. 7
Allerdings ist die TLR-Signalisierung ein "zweischneidiges Schwert" und eine übermäßige, unkontrollierte TLR-Aktivierung ist schädlich. Überaktive TLR-Antworten tragen zur Pathogenese bei vielen akuten und chronischen menschlichen entzündlichen Erkrankungen bei 8 , 9 bei . Zum Beispiel ist die Sepsis, die durch systemische Entzündungen und Multiorganverletzungen gekennzeichnet ist, vor allem auf akute, überwältigende Immunreaktionen auf Infektionen zurückzuführen, wobei TLR2 und TLR4 eine entscheidende Rolle bei der Sepsis-Pathophysiologie spielen 10 , 11 , 12 . Darüber hinaus wurde gefunden, dass TLR5 zur chronischen Lungenentzündung von Patienten mit zystischer Fibrose beiträgt 13, 14 Darüber hinaus ist die dysregulierte endosomale TLR-Signalisierung (zB TLR7 und TLR9) stark mit der Entwicklung und dem Fortschreiten mehrerer Autoimmunerkrankungen verbunden, einschließlich systemischer Lupus erythematodes (SLE) und rheumatoider Arthritis (RA) 15 , 16 . Diese konvergierenden Beweislinien identifizieren die TLR-Signalisierung als potentielles therapeutisches Ziel für viele entzündliche Erkrankungen 17 .
Obwohl die pharmakologische Regulation von TLR-Reaktionen in vielen entzündlichen Zuständen vorteilhaft ist, gibt es derzeit nur sehr wenige Verbindungen, die klinisch verfügbar sind, um die TLR-Signalisierung 9 , 17 , 18 zu hemmen. Dies ist teilweise auf die Komplexität und Redundanz der TLR-Wege in der Immun-Homöostase und Krankheit Pathologie beteiligt. Also suche nach neuem, potenT therapeutische Mittel, um mehrere TLR-Signalwege zu erreichen, könnten eine fundamentale Lücke überbrücken und die Herausforderung überwinden, TLR-Inhibitoren in die Klinik voranzutreiben.
Angesichts der rasanten Fortschritte in der Nanowissenschaften und der Nanotechnologie tauchen Nanodevices aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften 19 , 20 , 23 als TLR-Modulatoren der nächsten Generation auf. Die nanoskalige Größe erlaubt diesen Nano-Therapeutika eine bessere Bioverteilung und nachhaltige Zirkulation 24 , 25 , 26 . Sie können weiter funktionalisiert werden, um die gewünschten pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Profile 27 , 28 , 29 zu erfüllen. Aufregenderen entsteht die Bioaktivität dieser neuartigen Nanodonen aus ihren intrinsischen Eigenschaften, auf die man sich anpassen lässtSpezifische medizinische Anwendungen, anstatt einfach als Lieferwagen für ein therapeutisches Mittel zu wirken. Zum Beispiel wurde ein hochdichtes Lipoprotein (HDL) -ähnliches Nanopartikel zur Hemmung der TLR4-Signalisierung durch Spülen des TLR4-Liganden LPS 23 entwickelt . Darüber hinaus haben wir ein Peptid-Gold-Nanopartikel-Hybridsystem entwickelt, bei dem die dekorierten Peptide die Oberflächeneigenschaften der Goldnanopartikel verändern und ihnen verschiedene Bioaktivitäten 30 , 31 , 32 , 33 ermöglichen können . Dies macht sie zu einer besonderen Klasse von Medikamenten (oder "Nano-Drogen") als die nächste Generation Nano-Therapeutika.
In diesem Protokoll präsentieren wir einen Ansatz zur Identifizierung einer neuartigen Klasse von Peptid-Gold-Nanopartikel (Peptid-GNP) -Hybriden, die mehrere TLR-Signalwege in phagozytischen Immunzellen 32 , 33 Der Ansatz basiert auf handelsüblichen THP-1-Reporterzelllinien. Die Reporterzellen bestehen aus zwei stabilen, induzierbaren Reporterkonstrukten: Man trägt ein sekretiertes embryonales alkalisches Phosphatase (SEAP) -Gen unter der Kontrolle eines durch die Transkriptionsfaktoren NF-κB und Aktivatorprotein 1 (AP-1) induzierbaren Promotors; Die andere enthält ein sezerniertes Luciferase-Reporter-Gen unter der Kontrolle von Promotoren, die durch Interferon-regulatorische Faktoren (IRFs) induzierbar sind. Bei der TLR-Stimulation führt die Signaltransduktion zur Aktivierung von NF- & kgr; B / AP-1 und / oder IRFs, die die Reportergene zu geheimem SEAP und / oder Luciferase einschalten; Solche Ereignisse können mit ihren entsprechenden Substratreagenzien mit einem Spektrophotometer oder Luminometer leicht nachgewiesen werden. Mit diesem Ansatz, um unsere bisher etablierte Bibliothek von Peptid-GNP-Hybriden zu screenen, identifizierten wir Lead-Kandidaten, die TLR4-Signalwege stark hemmen können. Die inhibitorische Aktivität der Blei-Peptid-GNP-Hybriden wurden dann mit einem anderen biochemischen Ansatz des Immunoblottings validiert und auf anderen TLR-Wegen bewertet. Dieser Ansatz ermöglicht ein schnelles, effektives Screening von neuartigen Agenten, die auf TLR-Signalwege abzielen.
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Protocol
1. Herstellung von Zellkulturmedien und Reagenzien
- Bereiten Sie das gesamte Zellkulturmedium R10 vor, indem Sie die Ergänzungen von 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat in das RPMI-1640-Medium hinzufügen.
- Bereiten Sie das Selektionskulturmedium R10-Z vor, indem Sie die Antibiotika Zeocin (200 μg / ml) zu R10 addieren, um die Expression von SEAP unter der Kontrolle der NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung aufrechtzuerhalten. Zur Auswahl von Zellen, die sowohl SEAP- als auch Luciferase-Reportergene exprimieren, fügen Sie sowohl Zeocin (100 μg / ml) als auch Blasticidin (10 μg / ml) zu R10 (als R10-ZB) hinzu.
- Die SEAP-Substratlösung durch Auflösen eines Beutels des Substratpulvers (z . B. QUANTI-Blue) in 100 ml hochreines, endotoxinfreies Wasser in einem sauberen 125 ml-Glaskolben vorbereiten.
- Die Lösung vorsichtig umdrehen und 1 Stunde bei 37 ° C inkubieren, um die vollständige Auflösung der Substrate zu gewährleisten. <Li> Die Lösung mit einer 0,2 μm Membran filtrieren, um ihre Sterilität (optional) zu gewährleisten und sie bei 4 ° C bis zu 2 Wochen vor Gebrauch zu lagern.
- Nach dem vollständigen Auflösen des Pulvers sofort die Lösung verwenden. Alternativ die Lösung bei 4 ° C (bis zu einer Woche) oder bei -20 ° C (bis zu einem Monat) vor Gebrauch aufbewahren.
ACHTUNG: Beide Substratlösungen sind lichtempfindlich und sollten bei gleichzeitiger Belichtung vermeiden. Mehrere Gefrier-Tau-Zyklen der Lösung können Instabilität des Substrats verursachen und seine Haltbarkeit verkürzen.
ACHTUNG: Die Reagenzzubereitung für Kulturzwecke sollte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden, und alle Behälter sollten vor der Verwendung sterilisiert werden. Wiederholte Frost-Tau-Zyklen von PMA- und LPS-Lösungen sollten vermieden werden.
2. Kultur von THP-1-Reporterzellen-abgeleiteten Makrophagen
- Verwenden Sie zwei THP-1 Reporterzelllinien: THP-1-XBlue und THP-1-Dual Zellen. Das erstere hat ein SEAP-Reportergen, das durch NF-κB / AP-1 gesteuert wird, und das letztere hat ein Dual-Reporter-Gensystem, das gleiche SEAP-Reportergen und ein IRF-kontrolliertes Luciferase-Gen. DasIr Kulturverfahren sind identisch mit Ausnahme der Auswahl Kulturmedien.
- Tauen Sie eine Arbeitszelle (~ 5 x 10 6 Zellen) in 10 ml R10-Medium auf, spinnen Sie die Zellen bei 300 xg für 5 min ab. Zellen in 10 ml R10-Medium resuspendieren und in einen T75-Kulturkolben überführen. Tauschen Sie das Kulturmedium alle 2-3 Tage , bis die Zellen mit einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml erreichen.
- Wenn das Zellwachstum seine Kapazität erreicht hat , Durchgangszellen , die Zelldichte im Bereich von 2-5 x 10 5 Zellen / ml, zu reduzieren , so können die Zellen weiter wachsen.
- Nach mindestens 1 Passage beginnen sie, die Zellen im Selektionskulturmedium zu kultivieren: R10-Z für THP-1-XBlue und R10-ZB für THP-1-Dual. Nach dem Kultivieren der Zellen mit Selektionskulturmedium für mindestens 1 Durchgang sind die Zellen für den Versuch bereit.
ACHTUNG: Zellüberwachsen kann zu signifikantem Zelltod führen Die Zelllebensfähigkeit sollte> 98% beibehalten. Halten Sie eine Aufzeichnung der Passage Nummer als celIch kann sich nach vielen Passagen (> 20 Passagen) anders verhalten.
ANMERKUNG: Zellkulturflaschen können mehrmals wiederverwendet werden, um Kosten zu sparen; Diese Praxis kann jedoch das Risiko einer allgemeinen Kontamination und Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Flaschen erhöhen (bei gleichzeitiger Handhabung unterschiedlicher Zelllinien). Während des Medienaustauschs und des Zelldurchgangs wird die Zentrifugation für 5 min auf 300 xg eingestellt.
- Um Reporter-Zell-Assay, Samen-Zellen in eine 96-Well-Flat-Bottom-Zell-Kultur-Platte und differenzieren sie in Makrophagen. Die Vorgehensweisen werden im Folgenden beschrieben.
- Die Zellen aus dem Kolben in ein Zentrifugenröhrchen geben, die Zellen bei 300 xg für 5 min abreiben und im R10-Medium in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren. Fügen Sie Aliquots der PMA-Lösung in die Zellsuspensionen mit einer Endkonzentration von 50 ng / ml hinzu.
- Übertragen Sie 100 μl der Zellsuspensionen in jede Vertiefung der 96-wirLl Platte mit einer Mehrkanalpipette. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C (in einem Zellkulturinkubator) für 24 h.
- Nach der Inkubation das Kulturmedium vorsichtig mit einem Vakuumsauger (oder mit einer Mehrkanalpipette) entfernen und die Zellen vorsichtig mit PBS (100 μl / Vertiefung) zweimal waschen; 100 μl frisches R10-Medium in jede Vertiefung geben. Rest die Zellen für 2 Tage in einem Inkubator vor der Durchführung der Reporter-Assay.
ACHTUNG: Der Ruheschritt ist sehr wichtig, damit sich die Zellen nach der PMA-Stimulation auf ihren normalen Ruhezustand beruhigen können. Dies kann die Hintergrundsignale der Reportergene unter unstimulierten Bedingungen signifikant reduzieren.
ANMERKUNG: Nach 24 Stimulation mit PMA werden die Zellen in den Makrophagen-ähnlichen Phänotyp unterschieden, mit einer Charakteristik der Zelladhäsion am Boden des Brunnens und einem morphologischen Merkmal von Pseudopodien.
3. Screening auf Potential TLR4 Nano-Inhibitoren mit den Reporterzellen HINWEIS: Da die TLR4-Signalisierung sowohl MyD88-abhängige als auch TRIF-abhängige Pfade verwendet, wird sie als primäres Ziel ausgewählt, um eine breite Palette von TLR-Signalwegen zu umfassen. THP-1-XBlue-Reporterzellen werden verwendet, um hauptsächlich die NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung zu untersuchen, während THP-1-Dual-Zellen für die IRF-Aktivierung aus der TRIF-abhängigen Signaltransduktion sind.
- Identifizieren Sie die optimale LPS-Dosis durch Erzeugen einer Dosis-Wirkungs-Kurve vor dem Screening.
- Verdünnen Sie die Arbeits-LPS-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,01 - 100 ng / ml in R10-Medium (Verdünnung in log10-Skala). Layout der Platten-Design und verdünnen in einer 96-Well-Runde-Boden-Kulturplatte. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung nach der Verdünnung mindestens 110 μl Lösung hat.
- Entfernen Sie vorsichtig das Kulturmedium aus der zellbetonten Platte (ab 2.2.3) mit einem Vakuumsauger.
- Übertragen Sie das LPS, das R10-Medium enthält, das in der Verdünnungsplatte (3.1.1) hergestellt wurdeNto der Kulturplatte nach dem Layout der Proben. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C (in einem Zellkulturinkubator) für 24 h.
- Nach 24 h die Überstände (80 μl / well) sorgfältig in eine neue 96-Well-Rundbodenplatte überführen. Den kolorimetrischen und / oder Luciferase-Lumineszenz-Assay sofort auf diese Lösungen durchführen oder bei 4 ° C (mehrere Stunden) oder -20 ° C (Tage) vor der Assay-Entwicklung aufbewahren.
HINWEIS: Die Gestaltung des Plattenlayouts sollte für Experimente und Datenanalysen einfach und klar sein. Für jede Bedingung sollten 2-4 Wiederholungen berücksichtigt werden. Immer eine negative Kontrollgruppe (LPS null) einschließen. Es wird empfohlen, THP-1-XBlue-Zellen für die NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung zu verwenden, da die Dualzellen einen relativ hohen Hintergrund der NF-κB / AP-1-Aktivierung aufweisen, nachdem sie in Makrophagen unterschieden wurden. Es ist jedoch möglich, die Dual-Zellen für die Meldung von NF-κB / AP-1 und IRF-Aktivierung zu verwenden.
- Entwickeln Sie die FarbeImetric Assay für die NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung und den Luciferase-Lumineszenz-Assay für die IRF-Aktivierung.
- Zur Beurteilung der NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung werden 20 & mgr; l des Überstandes jeder Probe in eine neue 96-Well-Flachboden-Kulturplatte übertragen; Und füge 180 μl vorgewärmte SEAP-Substratlösung in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 1 - 2 h, um die Farbentwicklung zu ermöglichen (rosa bis dunkelblau). Sammle die Absorption bei 655 nm auf einem Plattenleser.
ACHTUNG: Die Inkubationszeit kann auf Basis der Farbentwicklung (30 min bis zur Inkubation über Nacht) variiert werden. Es wird empfohlen, zu warten, bis die optische Dichte (OD) der dunkelsten Farbe über 1 reicht, während die Sättigung der Farbentwicklung (OD> 3) vermieden wird. - Für die Analyse der IRF-Aktivierung werden 10 & mgr; l des Überstandes jeder Probe in eine 96-Well-Clear-Flat-Bottom-Weißplatte gegeben. Füge die Luciferase-Lösung (50 μl) hinzu und sammle sofort die Lumineszenz wEll von gut
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, einen Lumineszenz-Plattenleser mit einer Auto-Injection-Funktion zu verwenden, um die Konsistenz in der Lumineszenzmessung von gut bis gut und von Platte zu Platte zu gewährleisten. Wenn die Substratlösungen manuell injiziert werden, stellen Sie bitte eine konsistente Inkubationszeit und Leseeinstellung für jede Vertiefung sicher.
- Zur Beurteilung der NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung werden 20 & mgr; l des Überstandes jeder Probe in eine neue 96-Well-Flachboden-Kulturplatte übertragen; Und füge 180 μl vorgewärmte SEAP-Substratlösung in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 1 - 2 h, um die Farbentwicklung zu ermöglichen (rosa bis dunkelblau). Sammle die Absorption bei 655 nm auf einem Plattenleser.
- Führen Sie den Screening-Assay auf verschiedene Peptid-GNP-Hybriden mit 10 ng / mL LPS-Stimulation (basierend auf 3.1) durch. Befolgen Sie das gleiche Verfahren in 3.2 für die Reporter-Assay-Entwicklung.
- Konzentrieren Sie die Peptid-GNP-Hybride auf 200 nM in R10-Medium unter Verwendung des Zentrifugationsverfahrens. 20 Volumina der Hybridlösung (10 nM) bei 18.000 xg für 30 min zentrifugieren und die Überstände sorgfältig verwerfen. Sammeln Sie die Hybriden (am Boden des Röhrchens) in ein Röhrchen, waschen Sie sie mit PBS zweimal und setzen Sie die Hybriden in einem Volumen des R10-Mediums wieder auf.
- Mischen Sie gleiche Volumina der konzentrierten Hybriden und derLPS (20 ng / ml), das R10-Medium enthält, um eine Endkonzentration der Hybride und LPS zu 100 nM bzw. 10 ng / ml zu haben.
- Das Kulturmedium aus der kultivierten Platte (2.2.3) entfernen und 100 μl der gemischten Lösung in jede Vertiefung geben (3 repliziert für jede Bedingung); Eine negative Kontrolle (nur Medium) und eine LPS-Kontrolle (10 ng / mL LPS ohne Hybriden).
- Nach 24 h Inkubation bei 37 ° C wird das Medium jeder Vertiefung in ein Röhrchen gegeben und die Röhrchen bei 18.000 xg, 4 ° C für 30 min zentrifugiert. Sammeln Sie die Überstände (50-80 μl / Tube) in eine 96-Well-Round-Bottom-Platte und führen Sie den Reporter-Assay wie in 3.2 beschrieben durch.
ACHTUNG: Beim Verwerfen der Überstände nach der Zentrifugation dürfen die Hybriden nicht an der Unterseite des Röhrchens gerührt werden.
HINWEIS: Die Zentrifugation im Schritt 3.3.4 ist sehr wichtig, um die nicht internalisierten Nanopartikel-Hybride aus dem Kulturmedium zu entfernen und die Interferenz der Hybriden mit dem Co zu vermeidenLorimetrische / lumineszenzwerte. Dies liegt daran, dass die Gold-Nanopartikel je nach Größe und Agglomeration breite Lichtwellenlängen aufnehmen können.
4. Validierung der Hemmwirkung der potentiellen Kandidaten
HINWEIS: Um die Hemmwirkung der potentiellen Kandidaten vom Screening zu bestätigen, werden zwei Ansätze angewendet. Man soll die Dosisreaktionen der Stimulanzien (LPS) bei einer festen Hybridkonzentration (oder umgekehrt) untersuchen; Die andere ist, die Hemmung der NF-κB / AP-1 und IRF3 Signale direkt über Immunoblotting zu betrachten.
- Im Ansatz 1, führen Sie den Reporter-Assay mit 100 nM der Blei-Hybriden und zwei LPS-Konzentrationen bei 1 ng / ml und 10 ng / mL nach den gleichen Verfahren wie in 3.3 beschrieben. Include ein inaktives Hybrid (basierend auf den Screening-Ergebnissen) als Hybrid-Kontrolle zum Vergleich.
- Für den Immunoblotting-Ansatz folgen Sie bitte dem Standard eXperimentales Verfahren.
- Kultur THP-1 - Zellen in R10 - Medium, Samen , die Zellen in eine 12-Well - Kulturplatte (2 x 10 6 Zellen / Vertiefung), und in Makrophagen differenzieren , indem die Zellen mit 50 ng / ml PMA Behandlung für 24 h , gefolgt von Ruhe 2 Tage lang.
- Nach der Zelldifferenzierung stimulieren die Zellen mit 10 ng / ml LPS mit / ohne Hybriden (100 nM) über die Zeit (bis zu 4 h). Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 5, 15, 30, 60, 120 und 240 min) bereiten die Zelllysate für das Immunoblotting vor. Füge einen inaktiven Hybrid als Kontrolle ein.
- Sonden die Signale von IκBα, phosphoryliertem p65 und phosphoryliertem IRF3, um die hemmende Wirkung der Blei-Hybride auf die Aktivierung von NF-κB und IRF3 zu untersuchen. Sonde die β-Aktin- und Total-IRF3-Signale als interne Kontrollen.
HINWEIS: Die Signaltransduktion tritt oft viel schneller auf (in wenigen Stunden), dann wird die Expression des Reporters SEAP und Luciferase (24 h). Es wird dringend empfohlen, auch perforMaisierbarkeitstest der getesteten Hybriden um 24 h als weitere Validierungsmethode.
5. Auswertung der TLR-Spezifität
HINWEIS: Um die TLR-Spezifität des Blei-Peptid-GNP-Hybrids zu untersuchen, werden andere TLR-Signalwege getestet, einschließlich TLR2, TLR3 und TLR5. TLR7, 8 und 9 sind ausgeschlossen, da die von THP-1 abgeleiteten Makrophagen aufgrund der fehlenden TLR7-, 8- und 9-Expression in Makrophagen 34 nicht gut auf die Stimulation dieser TLRs reagieren.
- Testen Sie verschiedene Konzentrationen (1 ng / ml bis 25 μg / ml) der für TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (Poly I: C) und TLR5 (Flagellin) spezifischen Liganden auf beiden Reporterzellen, die Makrophagen abgeleitet haben, um die optimale Konzentration nach demselben zu erhalten Verfahren in 3.1 und 3.2.
- Behandeln Sie die Zellen mit den Mischungen des Bleihybrids (100 nM) und jedes TLR-Liganden in der aus 5.1 erhaltenen Konzentration, um die inhibitorische Spezifität des Blei h zu bewertenYbrid nach dem in 3.3 beschriebenen experimentellen Verfahren. Füge den inaktiven Hybrid als Kontrolle zum Vergleich ein.
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Representative Results
Der gesamte experimentelle Ansatz ist in Abbildung 1 dargestellt . Die beiden THP-1-Reporterzelllinien THP-1-XBlue und THP-1-Dual werden verwendet, um die TLR-Antworten schnell zu screenen, indem sie die Aktivierung von NF-κB / AP-1 bzw. IRFs untersuchen. Die Aktivierung von NF-κB / AP-1 kann durch den SEAP-Kolorimetrie-Assay nachgewiesen werden, während die IRF-Aktivierung durch Luciferase-Lumineszenz überwacht wird. Die monozytischen THP-1-Zellen können leicht in Makrophagen abgeleitet werden, um die Nanodonen für ihre immunmodulatorische Aktivität auf die angeborenen phagozytischen Immunzellen zu screenen. Mit dem Reportersystem kann das Screening mit hoher Durchsatzleistung durchgeführt werden. Ein solcher Ansatz ist vielseitig einsetzbar für die Entdeckung neuer Immuntherapeutika, vor allem auf angeborene Immunsignale wie TLR-Signalisierung.
Die Screening-Prozedur und die repräsentativen Ergebnisse sind in Fig. 2A) Und 2B ). Verschiedene Konzentrationen der TLR-Liganden (TLR4 als Beispiel) werden zuerst getestet, um die optimale Konzentration für das eigentliche Screening der Peptid-GNP-Hybride zu erhalten. Die TLR4-Stimulation durch LPS führte zur Aktivierung von NF-κB / AP-1 und der Produktion von SEAP. Das freigesetzte SEAP wandelte das Substrat um und änderte seine photophysikalische Eigenschaft, die durch die Verschiebung in der Lichtabsorption überwacht werden konnte, was zur Lösungsfarbänderung führte ( Abbildung 2C ). Eine solche Änderung ist proportional zur Menge an SEAP, die bei der Stimulation freigesetzt wird, und kann durch Messen der Extinktion bei 655 nm auf einem Spektrophotometer quantifiziert werden ( 2D ). Ähnlich führte die Aktivierung von IRFs (ausgelöst durch LPS) zur Expression von LuciferasE, die das Substrat zur Erzeugung von Lumineszenz katalysierten ( Abbildung 2E ). Basierend auf diesen Dosisreaktionen wurde eine optimale Konzentration von LPS (10 ng / ml) verwendet, um eine kleine, zuvor etablierte Bibliothek von Peptid-GNP-Hybriden zu screenen ( Tabelle 1 ). Die Herstellung der Hybriden und ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften wurden in unseren früheren Publikationen 30 , 31 , 32 beschrieben . Aus dem Screening wurde eine Gruppe von Hybriden (P12 und seine Derivate) für ihre starke inhibitorische Aktivität sowohl bei der NF- & kgr ; B / AP-1 als auch der IRF-Aktivierung, die durch LPS ausgelöst wurde, identifiziert ( 2F ); Interessanterweise hatte das Hybrid-P13, das sich nur etwas von P12 in den Peptid-Beschichtungen unterscheidet, keine inhibitorische Aktivität, die als Hybridkontrolle zum Vergleich dienen könnte. Die P13-Derivate zeigten je nach othe verschiedene mild hemmende AktivitätR dekoriertes Peptid auf der Oberfläche.
Nach der Identifizierung des Bleihroms ist es wichtig, die inhibitorische Aktivität zu validieren. Die Hemmung wurde zuerst durch die Untersuchung der verschiedenen Verhältnisse des Hybrids zu LPS bestätigt, um potentielle falsch positive Ergebnisse aufgrund technischer Artefakte auszuschließen. Als die Konzentration von LPS anstieg, wurde die hemmende Wirkung des Hybrids (bei einer festen Konzentration) wie erwartet reduziert ( Abbildung 3A Und 3B ). Um sicherzustellen, dass die beobachtete Hemmung aus den Reporter-Assays tatsächlich ein Ergebnis der Abwärtsregulierung der NF- & kgr; B- und IRF-Signalisierung durch das Bleihrobrid war, wurde das Immunoblotting durchgeführt, um die Proteinsignaltransduktion über die Zeit direkt zu bestimmen. Die Aktivierung von NF-κB und IRF3 wurde untersucht, indem die Phosphorylierung der NF-κB-Untereinheit p65 und der Abbau des NF-κB-Inhibitors IκBα und des Phosphors untersucht wurdeYlation von IRF3. Wie in 3C gezeigt , könnte das Blei-Hybrid-P12 die p65-Phosphorylierung verringern, den IκBα-Abbau hemmen und die IRF3-Phosphorylierung verzögern, während das inaktive Hybrid-P13 nicht (Daten nicht gezeigt) konnte. Alle diese Ergebnisse bestätigten, dass das identifizierte Blei-Hybrid in der Lage war, die LPS-vermittelte TLR4-Signalisierung zu hemmen, indem sowohl NF- & kgr; B als auch IRF3-Aktivierung nach unten reguliert wurden.
Zusätzlich zur TLR4-Signalisierung wurde die inhibitorische Aktivität des Bleihrays weiter auf anderen TLR-Wegen einschließlich TLR2, TLR3 und TLR5 ausgewertet, um die TLR-Spezifität zu adressieren. Wie in Fig. 4 gezeigt , war das Blei-Hybrid-P12 in der Lage, die TLR2- und TLR5-vermittelte NF- & kgr; B / AP-1-Signalisierung sowie die TLR3-vermittelte IRF-Aktivierung zu reduzieren; Wieder zeigte der inaktive Hybrid P13 keine hemmende Wirkung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die identifizierten Blei-Hybrid eine starke Hemmung hat Ry Aktivität auf mehreren TLR-Pfaden.
Abbildung 1: Gesamter experimenteller Ansatz des Hochdurchsatz-Screenings von TLR-Inhibitoren unter Verwendung des Reporterzelltests. Es werden zwei Reporterzelllinien verwendet: THP-1-XBlue und THP-1-Dual. Ersteres hat ein SEAP-Reportergen unter der Kontrolle der NF- & kgr; B / AP-1-Aktivierung, während das Dual-System ein zusätzliches Luciferase-Reporter-Gen unter der Kontrolle der IRF-Aktivierung aufweist. Diese Zellen können leicht in Makrophagen für das Hochdurchsatz-Screening von immunmodulatorischen Nanopartikeln auf angeborene Immunsignalisierung unterschieden werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2: Hochdurchsatz-Screening von Nano-Inhibitoren auf TLR4-Signalisierung.
( A ) Ein Schema der experimentellen Verfahren. ( B ) Ein optisches mikroskopisches Bild von differenzierten Makrophagen (200fache Vergrößerung). ( C ) Ein repräsentatives Bild der Lösungsfarbänderung aus dem SEAP-Reporter-Assay; Die Farbe der Substratlösung wurde in lila oder dunkelblau (von original rosa) abhängig von der SEAP-Expression im Kulturmedium. ( D ) Quantitative Analyse der SEAP-Substratabsorption bei 655 nm als Reaktion auf die LPS-Stimulation. ( E ) Die Luciferase-Lumineszenz aus dem IRF-Reportersystem im Verhältnis zur LPS-Stimulation. ( F ) Hochdurchsatz-Screening, das das Blei-Peptid-GNP-Hybrid-P12 und seine Derivate identifiziert, um sowohl NF- & kgr; B / AP-1 als auch IRF-Wege der TLR4-Signalisierung zu hemmen; Die Hybridkonzentration = 100 nM; Das LPSKonzentration = 10 ng / ml; Der Balken bedeutet Mittelwert ± Standardabweichung; N = 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Validierung der inhibitorischen Aktivität des Bleihrobits Bestätigung der inhibitorischen Wirkung des Bleihroms mit verschiedenen Konzentrationen von LPS auf sowohl ( A ) SEAP als auch ( B ) Luciferase Reportersystemen. ( C ) Bestätigung der Hemmung des Bleihroms auf die NF- & kgr; B- und IRF3-Signalisierung durch Immunoblotting. Der inaktive Hybrid P13 wurde als Hybridsteuerung zum Vergleich verwendet. Die Hybridkonzentration = 100 nM; Die LPS-Konzentration = 10 ng / ml; Der Balken bedeutet Mittelwert ± Standardabweichung; N = 3; * Und *** bezeichnen p <0,05 aNd p <0,001, mit einer Einweg-ANOVA-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Inhibitorische Wirkung des Bleihybrids auf andere TLR-Signalwege.
Die Hemmung von NF-κB / AP-1 durch das Bleihrom nach der TLR2-Stimulation (Pam3CSK4 = 1 ng / ml) ( A ) und TL5-Stimulation (Flagellin = 100 ng / ml) ( B ). ( C ) Die Reduktion sowohl der NF- & kgr; B / AP-1 als auch der IRF-Signalisierung durch das Bleihybrid nach der TLR3-Stimulation (Poly I: C = 25 & mgr; g / ml). Die Hybridkonzentration = 100 nM; Der Balken bedeutet Mittelwert ± Standardabweichung; N = 3; *, ** und *** p <0,05, p <0,01 und p <0,001 bezeichnenEinweg-ANOVA-Analyse; Ns: nicht signifikant Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Eine kleine Bibliothek von Peptid-GNP-Hybriden in unseren frühen Studien.
Die Hybriden bestehen aus einem Gold-Nanopartikel-Kern (~ 13 nm Durchmesser) und verschiedenen Hexapeptid-Beschichtungen auf der Oberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Da TLRs an der Pathogenese vieler entzündlicher Erkrankungen beteiligt sind, haben sie sich als therapeutische Ziele für die Modulation von Immunantworten und entzündlichen Zuständen entwickelt. Allerdings hat die klinische Entwicklung von Therapeutika, um TLR-Signalwege zu hemmen, bisher nur begrenzten Erfolg. Das Antimalarialmedikament Hydroxychloroquin, das TLR7 und TLR9 hemmt, ist in der klinischen Anwendung 35 , 36 . Ähnlich ist nur eine begrenzte Anzahl von Verbindungen zu klinischen Studien einschließlich Eritoran, einem TLR4-Antagonisten, der starke hemmende Wirkungen auf LPS-vermittelte Entzündungsreaktionen in präklinischen Studien zeigte, 37 , 38 , zeigten positive Ergebnisse in der Phase I / II-Klinik Versuche 39 , 40 , 41 , aber letztlich die Phase-III-Studie nicht die Mortalität zu reduzierenVon Patienten mit schwerer Sepsis 42 . Dieser Misserfolg hat viele mögliche Gründe, wobei eine solche Sepsis-assoziierten Entzündungsreaktionen oftmals durch mehrere TLR-Wege ausgelöst werden und somit nur TLR4 blockiert, kann es nicht ausreichen, die überwältigende Entzündung zu reduzieren. Daher könnte die Entwicklung neuer, potenter Poly-TLR-Inhibitoren solche klinischen Herausforderungen überwinden und die entzündungshemmende Therapeutika der nächsten Generation werden. Die hier beschriebene Screening-Strategie und das beschriebene Protokoll sollen als effizientes Experimentierwerkzeug bei der Untersuchung der TLR-Signalisierung und vor allem als Arzneimittelforschungsplattform dienen, um die Suche nach den TLR-Inhibitoren der nächsten Generation zu beschleunigen.
Dieser Screening-Ansatz bietet mehrere Vorteile bei der Suche nach neuen TLR-Inhibitoren. Zuerst kann das Screening auf Hochdurchsatz-Weise mit den Reporterzellen-Systemen erreicht werden, die schnell, empfindlich und quantitativ sind. Zweitens, mit beiden Reporterzelllinien,Die Abschirmung kann durchgeführt werden, um eine breite Palette von TLR-Signalkaskaden abzudecken, einschließlich des NF-κB / AP-1-Weges und der Typ-I-Interferon-Signalisierung (über IRFs); So sind sie ideal für das Screening mehrerer TLR-Wege. Drittens sind diese Reporterzellen genetisch aus der humanen monozytischen THP-1-Zelllinie konstruiert, was ein gutes Modellsystem ist, um Interventionen zu untersuchen, die auf die angeborene Immunantwort abzielen. Viertens wird die Zelllinie leicht beibehalten und kann insbesondere in Makrophagen unterschieden werden; Und da Makrophagen bei vielen krankheitsassoziativen Erkrankungen eine Schlüsselrolle spielen, dienen sie als ideales Ziel für das Screening von Immuntherapeutika, die auf die TLR-Signalgebung abzielen. Fünftens haben Monozyten und Makrophagen eine beeindruckende phagozytische Kapazität, die eine hohe zelluläre Aufnahme der Nanopartikel ermöglicht und sie besonders für das Studium nanoskaliger Therapeutika geeignet macht. Darüber hinaus kann dieses Screening-Protokoll angewendet werden, um nicht nur die Nano-basierte zu suchenApeutische Mittel, aber auch andere Arten von bioaktiven Verbindungen.
Obwohl diese Screening-Plattform ist sehr vielseitig und robust, muss einige Vorsicht angewendet werden, um falsche Entdeckung zu vermeiden. Das Screening basiert in erster Linie auf dem Reporter-Assay, der auf der Expression des Reportergens unter der Kontrolle spezifischer Signalisierungsereignisse beruht. Idealerweise ist die Reportergenexpression (SEAP und Luciferase) proportional zur Intensität des Signaltransduktionswegs von Interesse, und der Einfluss der Arzneimittelkandidaten wird in den Assayauslesungen reflektiert. In Wirklichkeit können jedoch alle biologischen Ereignisse, die stromaufwärts der Reportergenexpression auftreten, das Ergebnis beeinflussen, was manchmal zu einer falsch positiven Entdeckung führt. Zum Beispiel könnte eine geringe Expression von SEAP aus der Hemmung des Proteinsyntheseprozesses und nicht aus der Abwärtsregulation der TLR-Signalisierung 43 resultieren. Um eine solche falsche Entdeckung zu vermeiden, ist die hemmende Aktivität der IdentitätD Kandidaten sollten immer validiert werden, und die Gold-Standard-Methode ist, um direkt auf die Signalwege über Immunoblotting. Ein weiterer wichtiger Aspekt beim Screening von Nanopartikel-basierten Therapeutika ist die Oberflächeneigenschaften dieser Nanodonen. Basierend auf den Oberflächenmodifikatoren können die Nanodonen verschiedene biologische Aktivitäten aufweisen. Allerdings können sie auch nicht spezifische Bindungsfähigkeit für bestimmte Biomoleküle haben. Im Falle der unspezifischen Bindung an SEAP oder Luciferase könnte die katalytische Aktivität auf die Substrate durch diese Nanomittel kompromittiert werden, was zu einer möglichen falschen Entdeckung führt. Einschließlich zusätzlichen Kontrollgruppen (zB Nanovorrichtung nur) in der Screening - das Risiko einer falschen Erkennung verringert. Last but not least ist die Zytotoxizität der identifizierten Lead-Kandidaten zu untersuchen, um die Zytotoxizität als einen Faktor für die falsche Entdeckung auszuschließen. Dies kann gleichzeitig während des Screening-Prozesses unter Verwendung eines Standard-Viability-Assays ( z .MTS oder MTT) oder in einem separaten Experiment.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Unterstützung des Programms für Professor für Sonderveranstaltung (Eastern Scholar) bei Shanghai Institutionen of Higher Learning (HY), dem Startfonds von Shanghai First People's Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant Unterstützung von Shanghai Jiaotong anerkennen University School of Medicine (HY), und die Finanzierung von der Crohn und Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET und HY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1-XBlue reporter cell | InvivoGen | thpx-sp | keep cell culture passage under 20 |
| THP-1-Dual repoter cell | InvivoGen | thpd-nfis | keep cell culture passage under 20 |
| RPMI-1640 (no L-glutamine) | GE Health Care | SH30096.02 | Warm up to 37 °C before use; add supplements to make a complete medium R10 |
| Fetal bovine serum (qualified) | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | Heat inactivated; 10% in RPMI-1640 |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | 2 mM in the complete medium R10 |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM in the complete medium R10 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium | GE Health Care | SH30028.02 | Use for cell washing and reagent preparation |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | SEAP substrate |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | rep-qlc2 | Luciferase substrate |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Blasticidin | InvivoGen | anti-bl-1 | Selection antibiotics for reporter cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | D8418-100ML | Use for reagent preparation |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology | Sigmal-Aldrich | P1585-1MG | Use for cell differentiation |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | TLR4 ligand |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | tlrl-pms | TLR2/1 ligand |
| Poly (I:C) HMW | InvivoGen | tlrl-pic | TLR3 ligand |
| Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure | InvivoGen | tlrl-epstfla | TLR5 ligand |
| SpectraMax Plus 384 microplate reader | Molecular Devices | N/A | Read colorimetric assay |
| Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors | Tecan | N/A | Read luminiscience |
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g) |
| Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use) |
| Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated | Corning Costar | 3903 | Used for luminiscence assay |
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