Summary
Vidéomicroscopie systèmes sont utilisés pour étudier les propriétés fonctionnelles des artérioles isolée du tissu adipeux en réponse à des stimuli physiologiques et pharmacologiques. Cette technique permet d’examiner des phénotypes microvasculaires dans des domaines différents du tissu adipeux chez les humains obèses.
Abstract
Alors que l’obésité est étroitement liée au développement de maladies cardiovasculaires et métaboliques, on en sait peu sur les mécanismes qui régissent ces processus. On fait l’hypothèse que pro-athérogènes médiateurs libérés des tissus adipeux en particulier en liaison avec l’adiposité viscérale/centrale pourraient favoriser des changements vasculaires pathogènes localement et systémique, et la notion que les maladies cardiovasculaires peuvent être le conséquence d’un dysfonctionnement du tissu adipeux ne cesse d’évoluer. Nous décrivons ici une méthode unique de vidéomicroscopie qui implique une analyse des réponses de vasodilatateur et vasoconstricteur d’intacts petites artérioles humains retirés du dépôt adipeux des sujets humains vivants. Vidéomicroscopie est utilisé pour examiner les propriétés fonctionnelles des microvaisseaux isolés en réponse à des stimuli pharmacologiques ou physiologiques en utilisant un système sous pression qui imite des conditions in vivo . La technique est une approche utile pour comprendre la physiopathologie et les mécanismes moléculaires qui contribuent à une dysfonction vasculaire localement dans le milieu du tissu adipeux. Par ailleurs, les anomalies de la microcirculation sous-cutanée ont également été liés avec les maladies systémiques. Nous avons appliqué cette technique pour examiner le dépôt des réponses vasculaires chez les obèses. Nous avons évalué la vasodilatation endothélium-dépendante à la fois augmentation du flux et l’acétylcholine en artérioles adipeuses (50-350 µm de diamètre interne, 2-3 mm de long), isolé de deux dépôts adipeux différents au cours de la chirurgie bariatrique de l’individu même. Nous avons démontré que les artérioles de la graisse viscérale montrent avec facultés affaiblies vasodilatation endothélium-dépendante par rapport aux vaisseaux isolés du dépôt sous-cutané. Les résultats suggèrent que le microenvironnement viscéral est associé à la dysfonction endothéliale vasculaire qui peut-être être pertinente à l’observation clinique qui relie l’adiposité viscérale accrue aux mécanismes de la maladie systémique. La technique de vidéomicroscopie peut servir à examiner les phénotypes vasculaires de différents dépôts de graisse mais aussi de comparer les résultats entre les individus avec différents degrés d’obésité et de troubles métaboliques. La méthode peut également être utilisée afin d’examiner les réponses vasculaires longitudinalement en réponse aux interventions cliniques.
Introduction
Vidéomicroscopie est une technique utile utilisée pour examiner la fonction vasomotrice des petites artérioles retirés des sujets humains vivants ex vivo. Notre laboratoire a mis l’accent sur la dissection des microvaisseaux minuscules des compartiments différents tissus adipeux pour caractériser les effets des divers microenvironnements adipeuses sur la microcirculation. Un avantage majeur de cette technique est que les vaisseaux sanguins éliminé de l’organisme humain restent fonctionnels et peuvent être examinés facilement dans les minutes à heures qui suivent la biopsie. Conditions physiologiques sont imitées et stabiliser la pression transmurale maintenue dans l’espace intraluminal via des canules micro-verre qui récapitule beaucoup de caractéristiques en vivo . 1 , 2 en outre, un set-up de vidéomicroscopie fiable avec logiciel de détection de bord automatisé permet pour une évaluation qualitative et quantitative de capacité de vasodilatateur et vasoconstricteur indépendante et dépendante de l’endothélium des isolés disposition des vaisseaux en temps réel, permettant une évaluation rapide physiologique en réponse à des stimuli physiques et pharmacologiques. 3 autres techniques microvasculaires sont également disponibles comme des fils myographie qui tend à être beaucoup moins de temps et de mesurer des tensions réponses à divers agonistes par un capteur de force.
Notre laboratoire a demandé vidéomicroscopie afin d’examiner la relation entre l’obésité et la dysfonction vasculaire, mettant l’accent sur les effets de différents tissus adipeux domaines sur le système vasculaire. Adiposité centrale avec une accumulation de graisse viscérale intra-abdominaux a été plus étroitement liée à la production adipocytokine, dysfonction métabolique et risque cardiométabolique. Il a été postulé que le dysfonctionnement du tissu adipeux avec surproduction de dysrégulation de cytokines et adipokine pro-athérogènes sont fortement impliquées dans ces processus, mais les molécules régulatrices spécifiques et des objectifs de traitement restent largement Undiscovered. 4 par ailleurs, au niveau local le tissu adipeux, raréfaction capillaire et perfusion altérée ont été liés à la pseudohypoxia du tissu adipeux et le dérèglement métabolique. L’hypothèse que les maladies cardiovasculaires peuvent être la conséquence d’un dysfonctionnement du tissu adipeux est en évolution. Pro-athérogènes médiateurs libérés des matières grasses, en particulier en liaison avec adiposité viscérale/centrale, probablement promouvoir la dysfonction endothéliale et pathogènes changements vasculaires qui peuvent être manifestent localement dans la vascularisation du tissu adipeuse et détectés en utilisant le a décrit dans la présente méthodologie. 5
L’évaluation fonctionnelle des artérioles isolée du tissu adipeux est une approche utile pour comprendre la physiopathologie et les mécanismes moléculaires qui contribuent à la dysfonction vasculaire dans l’obésité humaine. Pour étudier les mécanismes qui contribuent à la graisse dysfonction de dépôt spécifiques, nous avons développé des méthodes pour examiner l’endothélium-dépendante et - des réponses vasodilatatrices indépendantes de la microcirculation, évalue l’expression de diverses réglementaires candidats en paires viscérales et sous-cutanée (SC) du tissu adipeux spécimens provenant de sujets obèses au moment de la chirurgie bariatrique.
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Protocol
le protocole et les exemples décrits ici ont été approuvés par Boston University School de médecine Institutional Review Board (IRB, protocole #H-25644) et ont été menées conformément à la déclaration d’Helsinki. Tous les sujets fournis consentement éclairé avant participation.
1. préparation des Solutions et des canules Micro-verre
- Préparez la solution saline acide 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic (HEPES). Pour 1 L, dissoudre 8,059 g de NaCl, 0,298 g KCl, g 0,296 MgSO 4 • 7 H 2 O, g 0,235 CaCl 2 • 2 H 2 O, 0,16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1,081 g D-Glucose et 2,383 g d’acide HEPES dans 950 mL d’eau désionisée eau. Porter au volume à 1 L avec de l’eau désionisée. Ajuster le pH à 7.4 à l’aide de NaOH. Un tampon HEPES peut être conservé jusqu'à 7 jours à 4 ° C.
- Préparer les 20 x Stock tampon salin. Pour 1 litre, ajouter 143,8 g de NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 g MgSO 4 et 7,4 g CaCl 2 • 2 H 2 O dans 900 mL d’eau distillée. Composent de volume à 1 L avec de l’eau désionisée. Conserver la solution-mère à 4 ° C.
- Préparer les 20 x Stock régulateur. Pour 1 litre, ajouter 26,8 NaHCO 3 et 0,2 g EDTA·2H 2 O dans 900 mL d’eau désionisée. Composent de volume à 1 L avec de l’eau désionisée. Conserver la solution-mère à 4 ° C.
- Prépare la Solution de KREBS à utiliser pendant les expériences physiologiques. Pour 1 litre, ajouter 50 mL 20 x Stock tampon, 900 mL d’eau désionisée, 50 mL de 20 x tampon salin, 0,99 g D-Glucose et 0,16 g KH 2 PO 4. Ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Pour maintenir le pH du tampon, remuez constamment et couvrir avec de la paraffine ou bouillonner continuellement.
- Vérifier le pH chaque 20 min. faire la solution de KREBS fraîches par jour.
- Faire des canules micro-verre d’un diamètre intérieur de 40 à 240 µm à l’aide d’un extracteur d’aiguille/pipette disponible dans le commerce. La taille des canules de verre est déterminée par la taille du diamètre interne des vaisseaux sanguins isolés (50-350 µm). Vous pouvez également acheter des canules micro-verre de la taille prédéterminée.
2. Préparation des réactifs
- Prepare l’acétylcholine (Ach, 10 -2 M, la solution-mère). Dissoudre 18,29 g dans 10 mL d’eau désionisée. Stocker 1 ml de solution mère (10 -2 M) à-80 ° C. Le jour de l’expérience en série diluée pour obtenir les concentrations suivantes de travail : 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 10 -9 M.
- Préparer la papavérine (2 x 10 -2 M, solution-mère). Dissoudre 0,07517 g dans 10 mL d’eau désionisée. Préparer 10 µL d’extraits de solution-mère et les conserver à -80 ° c en série diluer pour obtenir 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M le jour de l’expérience.
- Préparer l’endothéline-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, solution-mère). Dissoudre 50 µg de l’endothéline-1 dans 1 mL de 1 % BSA/PBS. Stocker 1 ml de solution mère (2 x 10 -5 M) à-80 ° C. Le jour de l’expérience diluée pour obtenir une concentration de travail de 10 -10 M le jour de l’expérience.
- Conserver les réactifs en langage-20 ° C ou jusqu'à-80 ° C selon le type de congélateur disponible, mais pas plus de 6 mois.
3. Collection de tissus adipeux et préparation de bateau
- recrue hommes obèses et les femmes (indice de masse corporelle (IMC) ≥ 35 kg/m², l’âge ≥ de 18 ans) inscrits au programme de chirurgie bariatrique à Boston Medical Center (BMC). Un total de 40 sujets ont participé à ces expériences.
- Recueillir des échantillons de tissu adipeux sous-cutané et viscéral lors de chirurgies bariatriques prévues par le chirurgien effectue l’opération.
- Récolte la sous-cutanée le tissu adipeux viscéral et de la paroi abdominale inférieure de graisse de l’épiploon grandes, respectivement. Taille de l’échantillon de tissu graisseux typique varie de 3 à 10 mg de tissu. Tissus de
- lieu immédiatement au froid HEPES tampon solution avec un pH de 7,4 et conserver à 4 ° C pendant 24 h jusqu'à
NOTE : En outre, artérioles adipeuses peuvent provenir de personnes maigres aussi bien au cours d’autres types d’interventions chirurgicales telles que la réparation d’hernie ou de chirurgie plastique et peut également être biopsiés du dépôt sous-cutané par biopsie cutanée trans coussinets adipeux abdominal < sup Class = « xref » > 6.
- à l’aide d’un microscope de dissection tissulaire, les micro-ciseaux et les micro-pinces, retirez soigneusement environnantes de graisse et de tissu conjonctif des petites artérioles adipeuses (50-350 µm de diamètre ENDOLUMINAL, 2-3 mm de long).
- Tie toutes les branches sur les artérioles à l’aide de minuscule nylon ou soie sutures avant canulant sur les pipettes capillaires de verre. Décortiquer soigneusement les artérioles puisque même légers dommages de la paroi de l’artériole provoque des changements fonctionnels importants.
- Minimize navire exposition à la lumière et la chaleur qu’elle peut provoquer une vasodilatation. Puisqu’il peut être parfois difficile à distinguer des artérioles de veinules, identifier le ton taille et des muscles lisses des vaisseaux par mordiller les bouts des vaisseaux. Artérioles sont généralement plus petits et démontrer ton supérieur par rapport aux veinules.
- Préparer la chambre de l’orgue. Remplir lentement les pipettes capillaires de verre et tubes en caoutchouc avec une solution de KREBS à l’aide d’une seringue de 10 mL.
- Une fois que les tubes en caoutchouc est rempli et pipettes capillaires de verre sont immergés dans une solution de KREBS dans la salle d’orgue, canule dans les artérioles solidement sur les pipettes sécurisés et attacher les deux extrémités de l’artériole avec du nylon ou nœuds de suture en soie soigneusement.
- Remplir la chambre d’orgue avec une solution de KREBS à 2 mL.
- Fixer la chambre d’orgue sur une scène avec le microscope inversé (objectif de grossissement 10 X / 0.25) et caméra vidéo.
- Tourner sur le logiciel de détection de bord qui est diffusé en temps réel à une fréquence d’échantillonnage de 1 kHz (1 image/s).
- Branchez un côté du tuyau sous pression à la solution de KREBS réservoirs remplis de pression libre de microbulles, que bulles peuvent présenter des erreurs expérimentales. Connectez l’autre extrémité du tuyau sous pression de la chambre d’orgue.
- Relier les réservoirs de pression KREBS solution remplie vers le transducteur de pression avec la tuyauterie propre.
- Contrôle les flux intra-luminale en réglant la hauteur de ces deux réservoirs ; par conséquent, lorsque les réservoirs sont placés à la même hauteur, aucun flux intra-luminal se produira.
- Une fois que tous ces processus sont terminés, allumez le chauffage bloc et logiciel programme pour maintenir la température à 37 ° c en continu perfuse le bateau avec une solution de KREBS et aérer avec un mélange de gaz de 5 % de CO 2, 21 % O 2 et 74 % N 2 7 ,, 8, pendant toute la procédure expérimentale.
- Pour atteindre la pression désirée inside la lumière des vaisseaux isolés augmenter graduellement la pression intraluminale (5 mmHg, toutes les 5 min) par l’intermédiaire de l’unité de commande de pression dans le panneau de myo-interface, faisant lentement pour éviter d’endommager la couche endothéliale.
Remarque : Lorsque la pression atteint 60 mmHg, une période d’équilibration de 20 à 30 min est nécessaire pour stabiliser le navire. Toutes les études de la fonction vasculaire sont effectuées à 60 mmHg et 37 ° C à un pH de 7,4. 7
4. Évaluation de la fonction microvasculaire adipeuse
Remarque : en général, la vasodilatation endothélium-dépendante arteriole adipeuse peut être déclenchée en réponse à physiologiques (induite par le flux) et des stimuli pharmacologiques (induite par l’Ach).
- De la vasodilatation induite par l’écoulement, dépendant de l’endothélium pressurisation, enregistré le diamètre de l’artériole adipeuse au repos (Di). Ceci est dénommé le diamètre de base au repos.
- Pré constriction des vaisseaux sanguins de ~ 55 % du diamètre de base au repos (Dp) en ajoutant 1 µL de l’endothéline-1 (ET-1, 10 − 10 M) directement à la salle de bain et attendre 5 min pour effet. Répétez ce processus jusqu'à ce qu’atteignant les désiré ~ 55 % resserrée pré État.
- Suite pré constriction, induisent un flux continu dans l’espace intraluminale des artérioles de tissu adipeux, en égalité et en directions opposées afin qu’une différence de pression peut être développée à travers le navire sans altérer la pression intraluminale moyenne de 60 mmHg.
NOTE : par exemple, si un seul réservoir se déplace vers le haut de 10 cm de hauteur, celle-ci doit être déplacé vers le bas de 10 cm à altérer les gradients de pression et ainsi changer le débit intraluminale. Si des mesures de taux de flux plus précises sont nécessaires, un système de débitmètre quantitative peut être appliqué pour le montage expérimental. - Mesurer la dilatation médiée par les flux 3-5 min après le début de l’induction de l’écoulement. Les niveaux de flux intraluminal (gradients de pression) peuvent être de l’ordre de 0 - 100 cmH 2 O. augmenter chaque incrément de gradient de pression de Δ10 cmH 2 O toutes les 5-6 min, jusqu'à un maximum de 100 cmH 2 O.
NOTE : Afin d’inciter à flux laminaire stable dans la lumière, les deux diamètres de verre micro canule ont besoin d’être très proche de diamètre intérieur des artérioles ; dans le cas contraire, il produira un écoulement turbulent à l’intérieur de lumen et induire des erreurs de mesure non désirées. - Suite à l’évaluation des flux-médiée par dilatation, réservoirs de pression de retour à la même hauteur (60 mmHg).
- Puis, laver l’artériole et chambre en retirant immédiatement solution chambre et remplacer par une solution fraîche de KREBS. Cela se fait avec prudence pour ne pas perturber l’artériole suspendu au sein de la chambre de.
- Répéter cette opération 3 ou 4 fois pendant 20-30 min, ou jusqu'à ce que le navire isolé renvoie au repos diamètre base.
- La vasodilatation induite par l’acétylcholine, dépendant de l’endothélium,
- lorsque l’artériole adipeuse est revenue au diamètre de base au repos, avant de se contracter navire ~ 55 % par l’administration de l’endothéline-1 (ET-1, 10 − 10 M) directement à la salle de bain, comme décrit ci-dessus dans la section 4.1.2.
- Suite pré constriction, séquentiellement administrer des doses croissantes (2 µL) de l’acétylcholine qui est un agoniste médiée par les récepteurs, l’oxyde nitrique (Ach, 10 -9 à 10 -5 M) directement dans le bain. Enregistrer le changement de diamètre artériolaire 5 min après l’administration de chaque dose.
- Une fois que le navire a atteint un plateau après l’administration de la dernière dose de Ach, laver le bateau de 3 - 4 fois avec une solution de KREBS. Laisser 20 à 30 min de bateau récupérer et retourner au diamètre de la base de repos. Afin de maintenir le pH dans la cambrure de l’orgue, changer une solution de KREBS chaque 15 min.
- Incuber l’artériole avec N w - nitro - l-arginine méthyl ester (L-NAME, 10 -4 M), un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase pendant 30 min et puis répétez 4.2.1 et 4.2.2 pour caractériser la contribution relative des l’oxyde nitrique pour la vasodilatation induite par l’Ach.
- Évaluer la vasodilatation indépendante de l’endothélium (fonction de muscle lisse vasculaire) et la viabilité de navire par une administration séquentielle des doses croissantes de la papavérine (10 -8 à 10 -4 M) directement dans le bain. Si le diamètre du vaisseau n’a pas revenir, ou dépasser le diamètre de base (Di) au repos en réponse à la papavérine (c.-à-d. la vasodilatation approprié), examiner le navire non viables et jeter les points de données.
5. Analyse des données et calcul
- calculer la réactivité vasculaire. Vasodilatation pourcentage pour l’expression de données permet de tenir compte des différences de niveau de référence au diamètre du vaisseau et de calculer à l’aide de l’équation suivante :
% vasodilatation = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
où DT est le diamètre enregistré à un moment donné (au maximum diamètre), le Dp est le diamètre enregistré après l’addition de l’agent de la vasoconstriction (i.e. ET-1 induite par le diamètre de constriction), et Di est le diamètre enregistré juste avant l’ajout de l’agent de la vasoconstriction (diamètre de base au repos). 9 - définir la sensibilité de la vasodilatation et la vasoconstriction (dose-réponse) à un agoniste comme la concentration de l’Ach, papavérine ou ET-1 qui obtient 50 % de la réponse maximale (EC 50) qui peut être définies par un paramètre sigmoïde et tracés, comme décrit plus haut. 10
Remarque : les études de reproductibilité inter observateur de vasodilatation des microvaisseaux adipeuses a un coefficient de corrélation élevé (CC) de 0,99 (n = 10 expériences de navire) dans notre laboratoire.
6. analyse statistique
- Express continue de mesures en moyenne ± SEM Ceux-ci tendent à être normalement distribué. Analyser la réactivité vasculaire en artérioles adipeuses par mesures répétées ANOVA bidirectionnelle.
- Sinon, comparer l’aire sous la courbe (AUC) de la courbe cumulative vasodilatation dose-réponse entre les groupes de traitement. Dans tous les cas, envisager de P < 0,05 statistiquement significative.
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Representative Results
Notre laboratoire a utilisé la vidéomicroscopie à examiner l’endothélium-dépendante et - vasodilatation indépendante, ainsi que vasocontractile fonction des artérioles de tissu adipeux isolé de gras sous-cutané et viscéral de l’homme obèse. Le montage expérimental caractéristique est affiché dans la Figure 1 a. Le tissu adipeux artérioles sont suspendus entre deux pipettes capillaires de verre et maintenus en place avec des sutures dans la salle d’orgue comme illustré dans la Figure 1 b. Comme décrit ci-dessus au point 5.1, artériolaires réponses peuvent ensuite être évaluées en examinant le navire au départ (Figure 2 a), suivie par constriction avant avec ET-1 ~ 55 % du diamètre de la base (Figure 2 b) et puis induites par des agonistes la vasodilatation et la relaxation de la lumière vasculaire, comme affiché dans la Figure 2.
Nous et autres avons pu observer que les réponses de vasodilatation endothélium-dépendante à débit accru (cisaillement)11 et12 de la Ach ont été significativement affaiblies dans viscérale par rapport aux artérioles adipeuses sous-cutanée (Figure 3 a, 3 b ) dans l’obésité humaine. Cependant, vasodilatation indépendante de l’endothélium en réponse à la papavérine n’a pas été modifiée de façon différentielle entre deux dépôts (Figure 3). Ensemble, ces résultats suggèrent que la dysfonction vasculaire dans les domaines viscérales est en grande partie le résultat d’un dysfonctionnement au niveau de l’endothélium, au moins dans les premiers stades de la maladie. Cette technique permet l’analyse systématique des réponses vasodilatatrices d’intacts petites artérioles humaines et peut également être appliquée à d’autres régions accessibles du système vasculaire humain. Le système vivo ex peut être manipulé à l’aide des nombreuses méthodes pharmacologiques tels que les réactions à l’insuline comme indice de vasculaires endothéliales insulino résistance6ou les études dose-réponse à la nitroglycérine pour tester le muscle lisse vasculaire fonction de la couche. 12 méthodes biologiques tels que faire taire les RNA peuvent également être introduits13 à potentiellement développer des cadres mécanistes pour comprendre les régulateurs critiques qui confèrent une dysfonction vasculaire dans des conditions spécifiques de la maladie.
Figure 1 : installation de vidéomicroscopie. (A) Image d’illustrant les composants de la chambre d’orgue de vidéomicroscopie. (B) Image d’une artériole tissu adipeux humain monté entre deux pipettes capillaires de verre dans la chambre de l’orgue. Le diamètre du vaisseau change en réponse à des stimuli physiologiques et pharmacologiques pouvant être examinés et quantifiées à l’aide spécialisée logiciel d’analyse et un attachement de caméra inversé dans le système. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Illustration de vasodilatation microvasculaire, à l’aide de pression vidéomicroscopie. (A) diamètre artériolaire au repos de la ligne de base (diamètre après pressurisation, aucun agoniste ou stimulation : Di) (B) diamètre préalablement rétrécie (après ET-1 induit resserrée diamètre : Dp), (C) induite par l’agoniste vasodilaté diamètre (après Ach a été ajouté : DT). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : vasodilatation endothélium-dépendante, indépendante et en sous-cutanée vs les artérioles adipeuses viscérales chez les humains obèses. Vasodilatation endothélium-dépendante a été considérablement atténuée chez viscérale par rapport à du tissu adipeux sous-cutané artérioles lorsqu’évalué par (A) a augmenté le débit (jumelé des vaisseaux sous-cutanés et viscéraux, n = 20), ou (B) réponse de dose de l’acétylcholine avec/sans L-NAME (jumelé des vaisseaux sous-cutanés et viscéraux, n = 16). Indépendante de l’endothélium (C) vasodilatation n’a pas été altérée différemment entre les artérioles viscérales et sous-cutanés lorsqu’évalué par dose réponse de papavérine (jumelé des vaisseaux sous-cutanés et viscéraux, n = 8). Désigne les différences de groupe entre entrepôts ; †Denotes dépôt des différences entre l’acétylcholine avec L-NAME par rapport à l’acétylcholine seul ; NS : non significatif. Données sont présentées sous forme de mean± SEM, p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La dissection et l’isolement des artérioles adipeuses des tissus environnants peuvent être un processus long et fastidieux avec une attention particulière aux détails et le protocole technique. La procédure de microdissection nécessite compétences méticuleux et ustensiles de dissection spécialisées pour prévenir les dommages potentiels pour le muscle lisse ou endothéliale de cellules couches de la microcirculation. Même minuscules piqûres accidentelles dans la paroi artériolaire peuvent empêcher intraluminal pressurisation et les résultats dans une expérience infructueuse. En outre, canulation des artérioles utilisant des sutures est cruciale pour garantir les artérioles entre les pointes de pipette capillaire de verre à chaque extrémité du navire.
Microvaisseaux isolés humaines peuvent se développer tonus myogène spontané après 30-40 min de pressurisation à 60 mmHg. Cependant, nous avons constaté que les artérioles de tissu adipeux humains de taille généralement 50-350 µm de diamètre luminal interne sont relativement petites et fragmentées couches de muscle lisse vasculaire et tendent à ne pas développer le tonus myogénique significatif, par rapport aux artérioles de muscle squelettique. Nous induisent donc pré constriction des ces petites artérioles à l’aide de ET-1 avant l’exposition à des vasodilatateurs. Nous trouvons que ET-1 exerce une réponse vasoconstrictrice plus prévisible, alors que dans certains cas il peut y avoir la variabilité dans les réponses aux agonistes des récepteurs alpha comme la phényléphrine. Il est impératif de choisir les agonistes appropriés pour induire une constriction désiré de pre ~ 55 % ; Toutefois, il est également essentiel pour choisir la quantité correcte d’agent pré contraignant pour éviter de trop la posologie et les lésions toxiques au navire. Nous y parviendrons en commençant par la plus faible dose de gamme et haut avec titration d’effectuer comme décrit dans la section 4.1.2.
Artérioles dans le tissu adipeux sont sensibles aux changements de pH et de température ; 14 par conséquent, il est crucial de surveiller et de contrôler le pH approprié (7,4) et la température (37 ° C) pendant le processus expérimental. Vidéomicroscopie est un système étroitement réglementé à température contrôlée, il est impératif de surveiller le pH de la solution de KREBS tout au long de l’expérience afin d’éviter les décalages qui peuvent biaiser les résultats. Bouillonnement continu de la solution de KREBS et le remplacement de la solution toutes les 15 min pendant la pressurisation et le lavage des étapes permettra de réduire les variations de pH au fil du temps.
Vidéomicroscopie est une technique utile pour examiner les propriétés fonctionnelles des microvaisseaux, la technique a une courbe d’apprentissage importante et peut-être main-d'oeuvre particulièrement pendant le processus d’isolement vasculaire. Selon le type de tissu qui est biopsié, notre expérience avec le tissu adipeux des microvaisseaux a démontré que le procédé de canulation peut prendre beaucoup de temps et de patience. En outre, il y a des délais inhérents, sensibilité aux expériences que les navires en dehors du corps ont tendance à perdre leurs propriétés physiologiques et fonctionnelles au fil du temps. Ainsi, les expériences doivent être effectuées dans la fenêtre viable des vaisseaux de minutes à heures après biopsie chirurgicale avant la désintégration du tissu éventuelle.
La pertinence clinique et la raison d’être de ce modèle expérimental utilisant la vidéomicroscopie pour étudier des artérioles est pris en charge par notre capacité à sonder directement physiopathologique dans des pans entiers intacts des vaisseaux humains retirés des sujets vivants, qui ne peuvent pas être répliqués par imagerie non invasive. En fait, notre capacité à directement accéder et examiner les vaisseaux sanguins humains dysfonctionnels dans, par exemple un corps obèse, peut nous fournir des occasions de mieux comprendre les voies qui sont altérées différemment dans les états pathologiques et découvrir le roman cibles thérapeutiques. De plus, notre laboratoire et d’autres données publiées montrent cette appréciation ex vivo des corrélats fonction artériolaire adipeuse avec in vivo réponses systémiques de la fonction endothéliale dans autres lits vasculaires chez un individu et associé avec des facteurs de risque cardiovasculaires dont l’hypertension, le tabagisme, diabète et l’inflammation. 12 , 15 , 16 nous avons également publié des données démontrant une corrélation significative entre les résultats immunohistochimiques pertinentes à la biologie de l’oxyde nitrique dans les cellules endothéliales adipeuses viscérales et la vasodilatation artérielle induite par le flux brachiale suggérant anomalies parallèles dans les tissus adipeux et circulations systémique. 17 compte tenu de la nature systémique de la dysfonction endothéliale, nous pensons que cette technique représente une approche pragmatique pour étudier des tissus vasculaires non seulement humain, mais aussi potentiellement utiliser cette méthode chez les animaux et les études longitudinales cliniques pour examiner les effets du traitement. Autres techniques pour examiner la microcirculation sont également disponibles comme des fils myographie, qui tend à être moins techniquement difficile à réaliser et permet des mesures de tension isométrique de vaisseaux isolés aux divers agonistes à l’aide d’un capteur de force. Bien que cette méthode fournit également des informations sur les propriétés physiologiques des microvaisseaux, la mise en place n’utilise pas un système de pression intra-luminale qui peut invalider le moins enclins à récapituler des conditions in vivo . Un avantage de vidéomicroscopie est la capacité d’induire une minimisant les changements du cisaillement dans la lumière de la pression intraluminale relativement constante. La méthode peut être appliquée à des microvaisseaux de tailles similaires chez les humains et les animaux. 9 , 12 , 18 Enfin, il convient de noter qu’un certain nombre de systèmes de vidéomicroscopie disponibles dans le commerce est disponible pour achat et installation ; Cependant, les concepts physiologiques dans l’ensemble sont assez uniformes sur toutes les plateformes. 2 , 6 , 18
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Disclosures
Auteurs n’ont pas des divulgations ou les conflits d’intérêts au rapport.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les bénévoles pour leur participation à ces études et le personnel chirurgical au centre médical de Boston pour la fourniture des biopsies de tissu adipeux. Dr. Gokce est pris en charge par les instituts nationaux de santé (NIH) subventions HL081587, HL114675 et HL126141. Dr. Farb est pris en charge par les NIH accorder K23 HL135394.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
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