Summary
Videomicroscopy Systeme werden verwendet, um die funktionelle Eigenschaften der isolierten Fettgewebe Arteriolen in Reaktion auf physiologische und pharmakologische Stimuli zu untersuchen. Diese Technik kann verwendet werden, zu prüfen, mikrovaskuläre Phänotypen in verschiedenen Fettgewebe Domänen bei übergewichtigen Menschen.
Abstract
Während Fettleibigkeit zur Entwicklung von Stoffwechsel- und Herz-Kreislauf-Krankheit eng verknüpft ist, ist wenig bekannt über Mechanismen, die diese Prozesse steuern. Es wird vermutet, dass Pro-atherogenen Mediatoren aus dem Fettgewebe vor allem in Verbindung mit Mittel-/viszerale Adipositas entlassen Pathogene Gefäßveränderungen, lokal und systemisch fördern können, und die Vorstellung, dass Herz-Kreislauf-Krankheit möglicherweise die Folge der Fettgewebe Dysfunktion entwickelt sich ständig weiter. Hier beschreiben wir eine einzigartige Methode der Videomicroscopy, die Analyse der gefäßerweiternde und Vasokonstriktor Antworten von intakten kleinen menschlichen Arteriolen entfernt aus dem Fettgewebe Depot des lebenden menschlichen Themen beinhaltet. Videomicroscopy wird verwendet, um die funktionelle Eigenschaften der isolierten Mikrogefäßen in Reaktion auf physiologische oder pharmakologische Stimuli mit einem unter Druck stehenden System, die in Vivo -Bedingungen imitiert zu untersuchen. Die Technik ist ein sinnvoller Ansatz zum Verständnis der Pathophysiologie und molekularen Mechanismen, die vaskuläre Dysfunktion lokal in das Fettgewebe Milieu beitragen. Anomalien im Fettgewebe Microvasculature sind darüber hinaus auch mit systemischen Erkrankungen verbunden worden. Wir wandte diese Technik um Depot-spezifische vaskuläre Reaktionen bei übergewichtigen Probanden zu untersuchen. Wir beurteilen die Endothel-abhängige Vasodilatation, erhöhte Fließfähigkeit und Acetylcholin im Fettgewebe Arteriolen (50-350 µm Innendurchmesser, Länge von ca. 2-3 mm) isoliert aus zwei verschiedenen adipose Depots während der bariatrischen Chirurgie von der gleichen Person. Wir bewiesen, dass Arteriolen von viszeralem Fett beeinträchtigt Endothel-abhängige Vasodilatation im Vergleich zu isoliert aus dem subkutanen Depot Schiffe aufweisen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die viszerale Mikroumgebung vaskulären endothelialen Dysfunktion zugeordnet ist möglicherweise relevante klinische Beobachtung Systemerkrankung Mechanismen erhöhte viszerale Adipositas verlinken. Die Videomicroscopy-Technik lässt sich prüfen, vaskuläre Phänotypen aus verschiedenen Fettdepots sowie Erkenntnisse über Personen mit verschiedenen Graden von Übergewicht und Stoffwechselstörungen zu vergleichen. Die Methode kann auch verwendet werden, vaskuläre Reaktionen längs in Reaktion auf klinischer Interventionen zu untersuchen.
Introduction
Videomicroscopy ist eine nützliche Technik genutzt, um die vasomotorische Funktion der kleinen Arteriolen entfernt lebenden menschlichen Probanden ex Vivozu untersuchen. Unser Labor konzentriert sich auf sezieren, winzige Mikrogefäßen aus verschiedenen Fettgewebe Fächer, die Auswirkungen der verschiedenen adipösen Mikroumgebungen auf den Microvasculature zu charakterisieren. Ein großer Vorteil dieser Technik ist, dass Blutgefäße aus dem menschlichen Körper entfernt funktionsfähig bleiben und können leicht innerhalb von Minuten bis Stunden nach der Biopsie untersucht werden. Physiologische Bedingungen werden nachgeahmt und stetig Transmural Druck beibehalten im Bereich Intraluminal über Mikro-Glas-Kanülen, die viele in Vivo Eigenschaften zu rekapitulieren. 1 , 2 ermöglicht darüber hinaus eine zuverlässige Videomicroscopy Einrichtung mit automatisierten Rand Erkennungssoftware für qualitative und quantitative Beurteilung der Endothel-abhängigen und -unabhängige gefäßerweiternde und Vasokonstriktor Kapazität von isolierten Schiffe in Echtzeit, Genehmigungsverfahren physiologischen Schnellbewertung in Reaktion auf physikalische und pharmakologische Stimuli. 3 andere mikrovaskulären Techniken zur Verfügung stehen wie Draht Myographie, die tendenziell weniger zeitaufwendig sein und Spannung Antworten auf verschiedene Agonisten durch ein Kraftaufnehmer messen.
Unser Labor bewirbt sich Videomicroscopy um die Beziehung zwischen Adipositas und vaskuläre Dysfunktion, mit Schwerpunkt auf die Auswirkungen der verschiedenen Fettgewebe Domänen auf das Gefäßsystem zu untersuchen. Zentrale Adipositas mit Anhäufung von intra-abdominalen viszeralen Fett hat am ehesten Adipocytokine Produktion, Stoffwechselstörungen und kardiometabolischen Risiko verbunden. Es hat postuliert worden, dass Fettgewebe Dysfunktion mit Überproduktion von Pro-atherogenen Zytokine und Adipokine Dysregulation sind stark in diese Prozesse involviert, aber bestimmte regulatorische Moleküle und Behandlungsziele weitgehend bleiben unentdeckt. 4 im übrigen auf die lokale Fettgewebe Ebene Kapillare Verdünnung und beeinträchtigte Durchblutung haben Fettgewebe Pseudohypoxia und metabolische Dysregulation in Verbindung gebracht worden. Die Hypothese, dass Herz-Kreislauf-Krankheit möglicherweise die Folge von Fettgewebe Dysfunktion entwickelt. Pro-atherogenen Mediatoren aus Fett, besonders in Verbindung mit Mittel-/viszerale Adipositas, wahrscheinlich entlassen fördern endothelialen Dysfunktion und Pathogene Gefäßveränderungen, die sein können vor Ort in das Fettgewebe Gefäßsystem manifestieren und Erkennung anhand der hier beschriebenen Methodik. 5
Die funktionale Bewertung von isolierten Fettgewebe Arteriolen ist ein sinnvoller Ansatz zum Verständnis der Pathophysiologie und molekularen Mechanismen, die vaskuläre Dysfunktion in menschlichen Adipositas beitragen. Um Mechanismen zu untersuchen, die zu Fett Depot-spezifische Dysfunktion beitragen, haben wir Methoden zur Prüfung der Endothel-abhängigen und - unabhängige gefäßerweiternde Antworten von den Microvasculature und Werten den Ausdruck der verschiedenen regulatorischen Kandidaten in gekoppelten viszeralen und subkutanen (SC) Fettgewebe Proben von übergewichtigen Probanden zum Zeitpunkt der bariatrischen Chirurgie erhalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
das Protokoll und die hier beschriebenen Beispiele wurden von Boston Universität Schule von Medizin Institutional Review Board (IRB, Protokoll #H-25644) genehmigt und wurden im Einklang mit der Deklaration von Helsinki. Alle Themen zur Verfügung gestellt schriftliche Einwilligungserklärung vor Teilnahme.
1. Vorbereitung der Lösungen und Mikro-Glas Kanülen
- Vorbereitung der 4-2-Hydrosyethyl-1-Piperazineethanesulfonic sauer (HEPES) Kochsalzlösung. Für 1 L auflösen 8,059 g NaCl, 0,298 g KCl, 0,296 g MgSO 4 • 7 H 2 O, 0,235 g CaCl 2 • 2 H 2 O, 0,16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1,081 g D-Glucose und 2,383 g HEPES Säure in 950 mL entionisiertem Wasser. Stellen Sie die Lautstärke bis 1 L mit entionisiertem Wasser. Einstellen Sie pH auf 7,4 mit NaOH. HEPES-Puffer kann bis zu 7 Tage im 4 gelagert werden ° C.
- Bereiten die 20 x Salz Ausgleichslager. Für 1 L, Hinzufügen von 143,8 g NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 g MgSO 4 und 7,4 g CaCl 2 • 2 H 2 O in 900 mL destilliertem Wasser. Volumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser bilden. Speichern-Stammlösung bei 4 ° c
- Bereiten die 20 x Ausgleichslager. Fügen Sie für 1 L 26,8 g Nahco3 3 und 0,2 g EDTA·2H 2 O in 900 mL entionisiertem Wasser hinzu. Volumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser bilden. Speichern-Stammlösung bei 4 ° c
- Bereiten Sie die KREBS-Lösung während der physiologischen Experimente verwendet werden. Fügen Sie für 1 L 900 mL entionisiertem Wasser, 50 mL 20 x Ausgleichslager und 50 mL 20 x Salz Pufferlösung, 0,99 g D-Glucose und 0,16 g KH 2 PO 4 hinzu. Stellen Sie pH auf 7,4 mit HCl. Um pH des Puffers zu erhalten, ständig rühren und bedecken Sie mit Paraffin oder Blase kontinuierlich.
- Check der pH-Wert alle 20 min. die KREBS-Lösung machen täglich frisch.
- Mikro-Glas Kanülen mit einem Innendurchmesser von 40-240 µm mit einem handelsüblichen Nadel/Pipette Abzieher zu machen. Die Größe der Glas-Kanülen richtet sich nach der Größe des Innendurchmessers der isolierten Blutgefäße (50-350 µm). Alternativ kaufen Mikro-Glas Kanülen von der vorgegebenen Größe.
2. Vorbereitung der Reagenzien
- bereiten das Acetylcholin (Ach, 10 -2 M, Stammlösung). 18,29 g in 10 mL entionisiertem Wasser auflösen. Speichern Sie Aliquote 1 mL der Stammlösung (10 -2 M) bei-80 ° C. Am Tag des Experiments seriell verdünnt, um die folgenden Arbeiten-Konzentrationen zu erhalten: 10 -5, 10 -9 10 -6, 10 -7, 10 -8 M.
- Bereiten die Papaverine (2 x 10 -2 M, Stammlösung). 0,07517 g in 10 mL entionisiertem Wasser auflösen. Vorbereitung 10 µL-Aliquots der Stammlösung und bei-80 ° c seriell zu verdünnen, um 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7 10 -8 M am Tag des Experiments zu erhalten.
- Vorbereitung der Endothelin-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, Stammlösung). Auflösen von 50 µg Endothelin-1 in 1 mL 1 % BSA/PBS. Speichern Sie Aliquote 1 mL der Stammlösung (2 x 10 -5 M) bei-80 ° C. Am Tag des Experiments verdünnen, eine arbeiten-Konzentration von 10 -10 M am Tag des Experiments zu erhalten.
- Speichern von Reagenzien in entweder-20 ° C oder bis-80 ° C je nach Art der Gefrierschrank zur Verfügung, aber nicht länger als 6 Monate.
3. Fettgewebe Sammlung und Schiff Vorbereitung
- Recruit übergewichtige Männer und Frauen (Body-mass-Index (BMI) ≥ 35 kg/m ², Alter ≥ 18 Jahre) in der Adipositaschirurgie Programm Boston Medical Center (BMC) eingeschrieben. Insgesamt 40 Personen nahmen an diesen Experimenten.
- Subkutane und viszeralen Fettgewebe Proben während der geplanten bariatrischen Operationen durch den Chirurgen die Operation sammeln.
- Ernte das subkutane Fettgewebe von der unteren Bauchwand und viszerale Fett aus den großen Omentum, beziehungsweise. Typische fettes Gewebe-Stichprobenumfang variiert von 3 bis 10 mg Gewebe.
- Ort-Gewebe sofort in kaltes HEPES-Puffer Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 und Store bei 4 ° C für bis zu 24 h
Hinweis: Darüber hinaus adipöse Arteriolen erhalten Sie bei schlanken Personen als auch bei anderen Arten von Operationen wie Leistenbruch Reparaturen oder plastische Chirurgie, und kann auch aus dem subkutanen Depot via Trans-kutanen Abdominal-Fettlappen Biopsie biopsiert werden < sup Klasse = "Xref" > 6.
- Mit einem Gewebe Dissektion Mikroskop, Mikro-Schere und Mikro-Pinzetten, vorsichtig umgebenden Fett- und Bindegewebe aus der kleinen adipösen Arteriolen (50-350 µm Intraluminal Durchmesser, Länge ca. 2-3 mm).
- Tie alle Äste auf der Arteriolen mit winzigen Nylon oder Seide Nähte, bevor auf die Kapillare Glaspipetten Metallspirale. Sorgfältig die Arteriolen zu sezieren, da auch kleinere Schäden der Arteriola Wand erhebliche Funktionsänderungen verursacht.
- Minimieren Schiff Einwirkung von Licht und Wärme als es kann Vasodilatation führen. Da es manchmal schwer, Arteriolen Venolen unterscheiden lässt, identifizieren Sie die Größe und glatten Muskulatur Ton der Schiffe durch Schneiden die Spitzen der Schiffe. Arteriolen sind in der Regel kleiner und zeigen mehr Ton im Vergleich zu Venolen.
- Bereiten die Orgel-Kammer. Füllen Sie langsam die Kapillare Glaspipetten und Gummischlauch mit KREBS Lösung mit einer 10 mL Spritze.
- Gummischlauch wird befüllt und Kapillare Glaspipetten in KREBS-Lösung innerhalb der Organ-Kammer eingetaucht sind, cannulate die Arteriolen sicher auf der gesicherten Pipetten und binden Sie beide Enden der Arteriola mit Nylon oder Seide Naht Knoten sorgfältig.
- Füllen Sie die Orgel-Kammer mit KREBS-Lösung bis zu 2 mL.
- Sichern die Orgel Kammer auf eine Bühne mit der inversen Mikroskop (Vergrößerung 10 X / 0,25 Ziel) und Videokamera.
- Schalten Sie die Rand-Erkennungssoftware, die in gestreamt wird in Echtzeit auf einer Sampling-Rate von 1 kHz (1 Frame/s).
- Verbinden einseitig des unter Druck stehenden Schläuche zur KREBS-Lösung gefüllten Druck Stauseen von Mikroblasen, frei wie Luftblasen experimentellen Fehler einführen können. Schließen Sie jenseits des unter Druck stehenden Leitungen an der Orgel Kammer.
- Die KREBS Lösung gefüllt Druck Stauseen an der Drucksensor mit sauberen Schlauch anschließen.
- Steuern, Intra-luminalen fließen durch die Regelung der Höhe dieser beiden Lagerstätten; also wenn Stauseen auf der gleichen Höhe platziert sind Intra-luminalen Stromstille erfolgt.
- Nach Abschluss all dieser Prozesse, schalten Sie Block und Software Heizprogramm, Temperatur bei 37 ° c kontinuierlich Durchspülen des Schiffes mit KREBS-Lösung und belüften mit einem Gasgemisch von 5 % CO 2, 21 % O 2 und 74 % N 2 7 , 8 während des gesamten experimentellen Verfahrens.
- Zum gewünschten Druck Insi zu erreichende das Lumen der isolierten Behälter schrittweise Erhöhung den Intraluminal Druck (5 MmHg, alle 5 min.) über die Druck-Steuerung im Bedienfeld "Myo-Schnittstelle" dabei mit einer niedrigen Übertragungsrate endotheliale Schicht beschädigen.
Hinweis: Sobald der Druck 60 MmHg erreicht, ist höchstens 20-30 min Gleichgewichtherstellung erforderlich, um das Schiff zu stabilisieren. Alle Gefäßfunktion Studien sind bei 60 MmHg und 37 ° C bei pH 7.4 durchgeführt. 7
4. Bewertung der adipösen mikrovaskuläre Funktion
Hinweis: im Allgemeinen kann adipöse Arteriola Endothel-abhängige Vasodilatation in Reaktion auf physiologische (strömungsinduzierte) hervorgerufen werden und pharmakologische Stimuli (Ach-induzierten).
- Flow-vermittelten, Endothel-abhängige Vasodilatation
- nach Druckbeaufschlagung, aufzeichnen den Durchmesser der adipösen Arteriola im Ruhezustand (Di). Dies nennt man den ruhenden Grundlinie Durchmesser.
- Pre verengen sich die Blutgefäße, ~ 55 % des ruhenden Grundlinie Durchmessers (Dp) durch Zugabe von 1 µL des Endothelin-1 (ET-1, 10 − 10 M) direkt an der Badewanne und 5 min warten Effekt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis erreichen der gewünschten ~ 55 % Zustand Pre eingeschnürt.
- Nach Pre-Verengung, induzieren kontinuierlichen Fluss in den Intraluminal Raum des Fettgewebes Arteriolen, in gleiche und entgegengesetzte Richtungen, damit eine Druckdifferenz über das Schiff entwickelt werden kann, ohne Veränderung des mittleren Intraluminal Drucks von 60 MmHg.
Hinweis: zum Beispiel wenn ein Behälter von 10 cm in der Höhe nach oben bewegt, muss dem andern nach unten verschoben werden, um 10 cm verändern Druckgradienten und damit Intraluminal Durchflussmenge ändern. Wenn genauere Durchflussmessungen Tarif gewünscht werden, kann eine quantitative Durchflussmesser-System auf den Versuchsaufbau angewendet werden. - Messen Fluss-vermittelte Dilatation 3-5 min nach der Einleitung der Fluss Induktion. Die Niveaus des Intraluminal Strömung (Druckgradienten) sein können im Bereich von 0 - 100 CmH 2 O. erhöhen jedes Inkrement des Druckgradienten durch Δ10 CmH 2 O alle 5-6 Minuten, bis zu einem Maximum von 100 CmH 2 O.
Hinweis: Um stabile laminare Strömung in das Lumen zu induzieren, müssen beide micro Glas Kanüle Tipp Größen, ganz nah an Innendurchmesser der Arteriolen; Andernfalls wird turbulente Strömung innerhalb des Lumen zu produzieren und verursachen unerwünschte Messfehlern. - Anschluss an den Fluss-vermittelte Dilatation Bewertung zurück Druck Stauseen auf die gleiche Höhe (60 MmHg).
- Dann Arteriola und Kammer zu waschen, indem Sie sofort Lösung aus Kammer und mit frischen KREBS-Lösung zu ersetzen. Dies geschieht mit Vorsicht hinsichtlich der abgehängten Arteriola innerhalb der Kammer nicht zu stören.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-4 Mal für 20-30 Minuten, oder bis der ruhenden Grundlinie Durchmesser der isolierte Behälter wieder.
- Acetylcholin-vermittelte, Endothel-abhängige, Vasodilatation
- Wenn die adipösen Arteriola dem ruhenden Grundlinie Durchmesser zurückgekehrt ist, vorab zu verengen Schiff ~ 55 % durch die Gabe von Endothelin-1 (ET-1, 10 − 10 M) direkt an der Badewanne, wie oben beschrieben in Abschnitt 4.1.2.
- Nach Pre-Verengung, sequenziell verwalten steigenden Dosen (2 µL) von Acetylcholin ist ein Rezeptor-vermittelte, Stickoxid-Agonist (Ach, 10 -9 bis 10 -5 M) direkt zum Bad. Notieren Sie die Änderung in Arteriolen Durchmesser 5 min nach Verabreichung einer einzelnen Dosis.
- Das Schiff angekommen ein Plateau nach Verabreichung der letzten Dosis Ach, waschen das Schiff 3-4 Mal mit KREBS-Lösung. Lassen Sie 20-30 min für Schiff zu erholen und zurück zur Grundlinie Durchmesser ruhen. Wechseln Sie zur Aufrechterhaltung der pH-Wert in der Orgel-Sturz KREBS Lösung alle 15 min.
- Inkubieren der Arteriola mit N w - Nitro - l-Arginin-Methylester (L-NAME, 10 -4 M), ein Inhibitor der Stickoxid-Synthase für 30 min, und dann wiederholen 4.2.1 und 4.2.2 zur Charakterisierung der relative Anteil der Stickstoffmonoxid, Ach-vermittelten Vasodilatation.
- Bewerten Endothel-unabhängige Vasodilatation (vaskuläre Glattmuskel-Funktion) und Schiff Lebensfähigkeit durch eine sequentielle Gabe von steigenden Dosen von Papaverine (10 -8 bis 10 -4 M) direkt zum Bad. Wenn die Gefäß-Durchmesser nicht wieder auf, oder den ruhenden Grundlinie (Di) Durchmesser als Reaktion auf Papaverine (d.h. entsprechende Vasodilatation überschreiten), betrachten das Schiff nicht lebensfähig und verwerfen Datenpunkte.
5. Datenanalyse und Berechnung
- berechnen die vaskuläre Reaktivität. Verwenden Sie Prozent Vasodilatation für Datenausdruck Grundlinie Unterschiede Schiffs Durchmesser berücksichtigen und unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnen:
% Vasodilatation (DT-Dp/Di-Dp) × 100 =
wo DT ist der aufgezeichneten Durchmesser zu einem bestimmten Zeitpunkt (maximal Durchmesser), Dp ist der Durchmesser aufgezeichnet nach der Zugabe der Vasokonstriktion Agent (i.e. ET-1 verursachte Verengung Durchmesser), und Di ist der Durchmesser, die unmittelbar vor der Zugabe des Agenten Vasokonstriktion (ruhende Grundlinie Durchmesser) aufgezeichnet. 9 - definieren Vasodilatation und Vasokonstriktion Empfindlichkeit (Dosis-Wirkungs-) um ein Agonist als die Konzentration von Ach, Papaverine oder ET-1, die 50 % der maximalen Antwort (EG 50) entlockt definiert durch eine sigmoidale Parameter und geplottet, wie zuvor beschrieben. 10
Hinweis: die Inter Beobachter Reproduzierbarkeit Studien der Vasodilatation der adipösen Mikrogefäßen hat einen hohe Korrelationskoeffizienten (CC) von 0,99 (n = 10 Schiff Experimente) in unserem Labor.
6. statistische Analyse
- Express kontinuierliche Messungen als ± SEM bedeuten Diese tendenziell normalverteilt sind. Vaskuläre Reaktivität in adipösen Arteriolen durch wiederholte Maßnahmen zwei-Wege-ANOVA analysieren.
- Vergleichen alternativ die Fläche unter der Kurve (AUC) der Handlung für kumulative Vasodilatation zu Dosis-Reaktionen zwischen den Behandlungsgruppen. In allen Fällen erwägen, P < 0,05 statistisch signifikante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Unser Labor hat Videomicroscopy verwendet, um die Endothel-abhängige zu prüfen und - unabhängige Vasodilatation sowie Vasocontractile Funktion des Fettgewebes Arteriolen von subkutanen und viszeralen Fettgewebe von übergewichtigen Menschen isoliert. Die charakteristischen Versuchsanordnung ist in Abbildung 1Aangezeigt. Fettgewebe Arteriolen sind zwischen zwei Kapillare Glaspipetten ausgesetzt und gesichert mit Fäden innerhalb der Organ-Kammer, wie in Abbildung 1 bgezeigt. Wie oben in Abschnitt 5.1 beschrieben, können Arteriolen Antworten dann beurteilt werden durch die Untersuchung des Schiffes zu Studienbeginn (Abbildung 2A), gefolgt von Pre-Verengung mit ET-1 ~ 55 % der Grundlinie Durchmesser (Abb. 2 b) und dann Agonist-induzierte Vasodilatation und Entspannung von der vaskulären Lumen wie in Abbildung 2dargestellt.
Wir und andere haben festgestellt, dass die Endothel-abhängige Vasodilatation Antworten zu erhöhtem Durchfluss (Schubspannung)11 und Ach12 deutlich in viszeralen abgestumpft wurden im Vergleich zur subkutanen Fettgewebe Arteriolen (Abbildung 3A, 3 b ) in menschliche Fettleibigkeit. Endothel-unabhängige Vasodilatation als Reaktion auf Papaverine änderte jedoch nicht differentiell zwischen zwei Depots (Abbildung 3). Zusammen, diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass vaskuläre Dysfunktion in viszeralen Domänen ist weitgehend eine Folge der Dysfunktion auf der Ebene des Endothels, zumindest in frühen Stadien der Erkrankung. Diese Technik ermöglicht die systematische Analyse von gefäßerweiternden Reaktionen der intakten kleinen menschlichen Arteriolen und kann auch auf anderen zugänglichen Regionen des menschlichen Gefäßsystems angewendet werden. Der ex-Vivo -System kann manipuliert werden, mit zahlreichen pharmakologischen Methoden wie Reaktionen auf Insulin als Index der vaskulären endothelialen Insulin Resistenz6oder Dosis-Antworten Studien zur Nitroglycerin, vaskulären glatten Muskelzellen zu testen Layer-Funktion. 12 biologischen Methoden wie RNA silencing eingeführten13 kann auch potenziell entwickeln mechanistische Rahmenbedingungen für das Verständnis wichtiger Regulators, die vaskuläre Dysfunktion unter spezifischer Erkrankungen zu verleihen.
Abbildung 1: Aufbau der Videomicroscopy. (A) Bild der Darstellung der Komponenten der Videomicroscopy Orgel Kammer. (B) Bild von einem menschlichen Fettgewebe Arteriola zwischen zwei Glaspipetten Kapillare in der Orgel-Kammer montiert. Schiffs Durchmesser ändert sich in Reaktion auf physiologische und pharmakologische Stimuli, die untersucht werden können und quantifizierte mit Analyse-Software und eine invertierte Kamera-Anlage im System spezialisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Darstellung der mikrovaskuläre Vasodilatation mit Druck-Videomicroscopy. (A) ruhenden Grundlinie Arteriolen Durchmesser (Post-Druckbeaufschlagung Durchmesser, kein Agonist oder Stimulation: Di) (B) bereits verengte Durchmesser (nach ET-1 verengte Durchmesser induzierte: Dp), (C) Agonist-induzierte verringern Durchmesser (nach Ach wurde hinzugefügt: DT). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Endothel-abhängigen und -unabhängige Vasodilatation im subkutanen vs. viszeralen Fettgewebe Arteriolen bei übergewichtigen Menschen. Endothel-abhängige Vasodilatation war deutlich gedämpft in viszeralen verglichen mit subkutanem Fettgewebe Arteriolen durch (A) Beurteilung erhöht Durchfluss (gepaart subkutane und viszerale Gefäße, n = 20), oder (B) Acetylcholin-Dosis-Antwort mit/ohne L-NAME (gepaart subkutane und viszerale Gefäße, n = 16). (C) Endothel-unabhängige Vasodilatation änderte nicht differentiell zwischen viszeralen und subkutanen Arteriolen wenn Papaverine Dosis Antwort bewertet (gepaart subkutane und viszerale Gefäße, n = 8). * Kennzeichnet Gruppenunterschiede zwischen Depots; †Denotes Depot-spezifische Unterschiede zwischen Acetylcholin mit L-NAME im Vergleich zu Acetylcholin allein; NS: nicht signifikant. Daten werden als Mean± SEM, p präsentiert < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Dissektion und Isolierung von adipösen Arteriolen aus den umliegenden Geweben können ein Zeit- und arbeitsintensiver Prozess mit viel Liebe zum Detail und technisches Protokoll sein. Das Mikrodissektion Verfahren erfordert sorgfältige Fähigkeiten und spezialisierte Dissektion Utensilien um mögliche Schäden zu vermeiden, der glatten Muskulatur oder endothelialen Schichten von den Microvasculature Zelle. Selbst kleinste versehentliche Einstiche in der Arteriolen Wand können Intraluminal Druckbeaufschlagung und Ergebnisse in einem erfolglosen Versuch verhindern. Darüber hinaus ist Kanülierung der Arteriolen mit Nahtmaterial entscheidend für die Arteriolen zwischen den Glas-Kapillare Pipettenspitzen an jedem Ende des Schiffes zu sichern.
Menschlichen isolierende Mikrogefäßen können spontane myogen Ton nach 30-40 min Druckbeaufschlagung bei 60 MmHg entwickeln. Allerdings haben wir festgestellt, dass menschliche Fettgewebe Arteriolen Größe in der Regel 50-350 µm der luminalen Innendurchmesser sind relativ klein mit geringer Dichte Schichten von vaskulären glatten Muskelzellen und neigen nicht zu signifikanten myogen Ton im Vergleich zu Skelettmuskeln Arteriolen zu entwickeln. Somit haben wir die Pre-Verengung der diese kleinen Arteriolen mit ET-1 vor der Exposition gegenüber Vasodilatatoren auslösen. Wir finden, dass ET-1 eine zuverlässigere Vasokonstriktor Antwort ausübt, während in einigen Fällen möglicherweise Variabilität in Antworten auf alpha-Rezeptor-Agonisten wie Phenylephrin. Es ist unbedingt erforderlich, die entsprechende Agonisten induzieren eine gewünschte ~ 55 % Pre Einschnürung zu wählen; Allerdings ist es auch wichtig, wählen die richtige Menge an Pre einengenden Agent über Dosierung und toxische Schäden des Schiffes zu verhindern. Dies erreichen wir mit der unteren Reihe Dosis beginnen und bis titrieren, wie in Abschnitt 4.1.2 beschrieben zu bewirken.
Arteriolen im Fettgewebe reagieren empfindlich auf Veränderungen im pH-Wert und Temperatur; 14 ist es daher entscheidend zur Überwachung und Kontrolle der entsprechenden pH-Wert (7,4) und Temperatur (37 ° C) während der experimentellen Verfahren. Während Videomicroscopy ein streng regulierte Temperatur gesteuert ist, ist es unerlässlich, den pH-Wert der Lösung in das Experiment um Verschiebungen zu vermeiden, die die Ergebnisse verzerren kann KREBS zu überwachen. Kontinuierliche sprudelt der KREBS Lösung und Ersatz-Lösung alle 15 Minuten während der Druckbeaufschlagung und Waschschritte werden pH-Schwankungen im Laufe der Zeit verringern.
Videomicroscopy ist eine nützliche Technik, um die funktionellen Eigenschaften von Mikrogefäßen untersuchen, die Technik hat eine erhebliche Lernkurve und möglicherweise arbeitsintensiv besonders während des Prozesses der vaskulären Isolation. Abhängig von der Art des Gewebes, das biopsiert, hat unsere Erfahrung mit Fettgewebe Mikrogefäßen gezeigt, dass die Kanülierung Verfahren erhebliche Menge an Zeit und Geduld nehmen kann. Darüber hinaus gibt es inhärente Zeit Empfindlichkeit zu den Experimenten als Schiffe außerhalb des Körpers neigen dazu, ihre physiologischen und funktionellen Eigenschaften im Laufe der Zeit zu verlieren. Die Experimente müssen also innerhalb der lebensfähigen Fenster der Schiffe von Minuten bis Stunden nach chirurgischen Biopsie vor eventuellen Gewebe Verfall durchgeführt werden.
Die klinische Relevanz sowie die Begründung für dieses Versuchsmodell mit Hilfe Videomicroscopy für Studium der Arteriolen durch unsere Fähigkeit, direkt Pathophysiologie in intakten ganze Segmente der menschlichen Blutgefäße entfernt von lebendigen Subjekten, Sonde unterstützt wird, kann durch nicht-invasive Bildgebung repliziert werden. In der Tat, unsere Fähigkeit, direkt zugreifen und untersuchen dysfunktionalen menschlichen Blutgefäße im Körper zum Beispiel eines fettleibig, bieten uns Gelegenheit, Einblick in die Wege, die sind differentiell in Erkrankungen verändert und entdecken Sie Roman therapeutische Ziele. Darüber hinaus veröffentlichte Daten aus unserem Labor und andere zeigen, dass ex-Vivo -Bewertung der adipösen Arteriolen Funktion korreliert mit in Vivo systemische Endothelfunktion Antworten in anderen vaskulären Betten innerhalb eines Individuums und zuordnen mit Herz-Kreislauf-Risikofaktoren wie Bluthochdruck, Rauchen, Diabetes und Entzündungen. 12 , 15 , 16 haben wir auch Daten, die zeigen einer signifikanten Korrelation zwischen immunhistochemische Ergebnisse relevant für Stickoxid-Biologie im viszeralen Fettgewebe Endothelzellen und brachial arterielle Flow-vermittelten Vasodilatation schlägt veröffentlicht parallele Anomalien in Fettgewebe und systemischer Zirkulationen. 17 da den systemischen Charakter der endothelialen Dysfunktion, glauben wir, dass diese Technik einen pragmatischen Ansatz stellt zu studieren nicht nur menschliche Gefäßgewebe aber auch potenziell nutzen diese Methode bei Tieren und klinischen Langzeitstudien Behandlungseffekte zu untersuchen. Daneben gibt es andere Techniken, um den Microvasculature untersuchen wie Draht Myographie, die tendenziell weniger technisch schwierig durchzuführen und Maßnahmen von isometrischer Anspannung der isolierten Schiffe, die verschiedenen Agonisten mit einem Kraftaufnehmer ermöglicht. Während diese Methode auch Informationen zu physiologischen Eigenschaften von Mikrogefäßen bietet, nutzen die Einrichtung keine Intra-luminalen Druck System wodurch es weniger geneigt, in Vivo Bedingungen rekapitulieren kann. Ein Vorteil des Videomicroscopy ist die Fähigkeit, einen relativ konstanten Intraluminal Druck minimieren Änderungen in Scherung in das Lumen zu induzieren. Die Methode kann auf ähnliche Größe Mikrogefäßen bei Mensch und Tier angewendet werden. 9 , 12 , 18 schließlich ist anzumerken, dass eine Reihe von im Handel erhältlichen Videomicroscopy Systeme für Kauf und Einrichtung zur Verfügung stehen; jedoch sind die insgesamt physiologische Konzepte ziemlich einheitlich über alle Plattformen hinweg. 2 , 6 , 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Autoren haben keine Angaben oder Interessenkonflikte zu berichten.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Freiwilligen für ihre Teilnahme an diesen Studien und das OP-Personal an der Boston Medical Center für die Bereitstellung von Fettgewebe Biopsien zu danken. Dr. Gökce wird unterstützt von der National Institutes of Health (NIH) Zuschüsse, HL081587, HL114675 und HL126141. Dr. Farb stützt sich auf NIH K23 HL135394 zu gewähren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
