Summary
Videomicroscopia sistemi sono utilizzati per esaminare le proprietà funzionali delle arteriole del tessuto adiposo isolato in risposta a stimoli fisiologici e farmacologici. Questa tecnica può essere utilizzata per esaminare microvascolari fenotipi in domini differenti del tessuto adiposo in esseri umani obesi.
Abstract
Mentre l'obesità è strettamente legata allo sviluppo della malattia cardiovascolare e metabolica, piccolo è conosciuto circa i meccanismi che regolano questi processi. È supposto che pro--atherogenic mediatori liberati dai tessuti grassi, particolarmente in associazione con adiposità centrale/viscerale possono promuovere cambiamenti vascolari patogeni a livello locale e sistemica, e la nozione che la malattia cardiovascolare può essere il conseguenza di disfunzione del tessuto adiposo in continua evoluzione. Qui, descriviamo un metodo unico di videomicroscopia che coinvolge l'analisi delle risposte vasodilatatore e vasocostrittore di intatti piccole arteriole umani rimossi dal deposito adiposo dei soggetti umani viventi. Videomicroscopia è utilizzato per esaminare le proprietà funzionali dei microvasi isolati in risposta a stimoli fisiologici o farmacologici, utilizzando un sistema sotto pressione che imita le condizioni in vivo . La tecnica è un approccio utile per acquisire una comprensione della patofisiologia e meccanismi molecolari che contribuiscono alla disfunzione vascolare localmente all'interno il milieu di tessuto adiposo. Inoltre, le anomalie nel microvasculature tessuto adiposo inoltre sono state collegate con malattie sistemiche. Abbiamo applicato questa tecnica per esaminare depot specifiche risposte vascolari in soggetti obesi. Abbiamo valutato la vasodilatazione endotelio-dipendente sia aumentato flusso e acetilcolina in arteriole adipose (50-350 µm di diametro interno, 2-3 mm di lunghezza) isolato da due diversi depositi adiposi durante chirurgia bariatrica dallo stesso individuo. Abbiamo dimostrato che arteriole dal grasso viscerale esibiscono alterata vasodilatazione endotelio-dipendente rispetto ai vasi isolati dal deposito sottocutaneo. I risultati suggeriscono che il microambiente viscerale è associato con disfunzione endoteliale vascolare che può essere rilevante per l'osservazione clinica che collega adiposità viscerale aumentata ai meccanismi di malattia sistemica. La tecnica di videomicroscopia può essere utilizzata per esaminare i fenotipi vascolari da diversi depositi di grasso, nonché confrontare i risultati tra gli individui con diversi gradi di obesità e disfunzione metabolica. Il metodo è utilizzabile anche per esaminare le risposte vascolari longitudinalmente in risposta a interventi clinici.
Introduction
Videomicroscopia è una tecnica utile utilizzata per esaminare la funzione vasomotore delle piccole arteriole rimosso da soggetti umani viventi ex vivo. Il nostro laboratorio è concentrata sulla dissezione fuori dei microvasi piccoli compartimenti differenti del tessuto adiposo di caratterizzare gli effetti di vari microambienti adipose il microvasculature. Dei principali vantaggi di questa tecnica è che i vasi sanguigni rimossi dal corpo umano rimangono funzionali e può essere esaminati prontamente a pochi minuti da ore che seguono la biopsia. Condizioni fisiologiche sono ha imitate e costante pressione transmurale mantenuta nello spazio intraluminal tramite cannule di vetro che ricapitolano molte caratteristiche in vivo . 1 , 2 inoltre, un set-up affidabile videomicroscopia con software di rilevamento bordo automatizzato permette per la valutazione qualitativa e quantitativa della capacità vasodilatatore e vasocostrittore endotelio-dipendente e - indipendenti di isolato navi in tempo reale, permettendo la rapida valutazione fisiologica in risposta a stimoli fisici e farmacologici. 3 altre tecniche microvascolari sono anche disponibili come filo myography che tende ad essere meno che richiede tempo e misurare tensione risposte a vari agonisti da un trasduttore di forza.
Il nostro laboratorio ha applicato videomicroscopia per esaminare la relazione tra obesità e disfunzione vascolare, concentrandosi sugli effetti del tessuto adiposo diversi domini sul sistema vascolare. Adiposità centrale con accumulo di grasso viscerale intra-addominale è legata più strettamente alla produzione di adipocitochine, disfunzione metabolica e rischio cardiometabolico. È stato postulato che la disfunzione del tessuto adiposo con eccessiva produzione di pro--atherogenic disregolazione di citochine e adipokine sono fortemente implicati in questi processi, ma specifiche molecole regolatrici e obiettivi di trattamento rimangono in gran parte da scoprire. 4 inoltre, al livello locale del tessuto adiposo, rarefazione capillare ed aspersione alterata sono stati collegati al tessuto adiposo pseudohypoxia e dysregulation metabolico. L'ipotesi che la malattia cardiovascolare può essere la conseguenza di disfunzione del tessuto adiposo è in continua evoluzione. Pro--atherogenic mediatori liberati da grasso, particolarmente in associazione con adiposità centrale/viscerale, probabile promuovono la disfunzione endoteliale e patogeni cambiamenti vascolari che possono essere manifestano localmente nel vasculature adiposo e rilevato utilizzando il qui descritti metodologia. 5
La valutazione funzionale delle arteriole isolato del tessuto adiposo è un approccio utile per acquisire una comprensione della patofisiologia e meccanismi molecolari che contribuiscono alla disfunzione vascolare nell'obesità umana. Per studiare i meccanismi che contribuiscono a disfunzione di deposito specifico grassa, abbiamo sviluppato metodi per esaminare endotelio-dipendente e - indipendenti risposte vasodilatatori del microvasculature e valutare l'espressione di varie normative candidati in viscerali e sottocutanei (SC) tessuto adiposo esemplari accoppiati ottenuti da soggetti obesi al momento della chirurgia bariatrica.
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Protocol
il protocollo e gli esempi descritti qui sono stati approvati dalla Boston University School di medicina Institutional Review Board (IRB, protocollo #H-25644) e sono stati condotti in conformità con la dichiarazione di Helsinki. Tutti gli oggetti hanno fornito consenso informato scritto prima della partecipazione.
1. preparazione di soluzioni e Micro-vetro cannule
- preparare la soluzione salina acida 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic (HEPES). Per 1 L, sciogliere 8,059 g NaCl, g 0,298 KCl, g. 0,296 MgSO 4 • 7 H 2 O, 0,235 g CaCl 2 • 2 H 2 O, 0,16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1,081 g D-glucosio e g 2,383 HEPES acido in 950 mL di deionizzata acqua. Portare al volume di 1 L con acqua deionizzata. Regolare il pH a 7.4 utilizzo NaOH. Tampone HEPES possa essere memorizzati a 7 giorni a 4 ° C.
- Preparare il tampone salino Stock 20x. Per 1 L, aggiungere 143,8 g NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 g MgSO 4 e 7,4 g di CaCl 2 • 2 H 2 O in 900 mL di acqua distillata. Compongono il volume a 1 L con acqua deionizzata. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
- Preparare il 20 x Buffer Stock. Per 1 L, aggiungere 26,8 g NaHCO 3 e 0,2 g EDTA·2H 2 O in 900 mL di acqua deionizzata. Compongono il volume a 1 L con acqua deionizzata. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
- Preparare la soluzione di KREBS per essere utilizzato durante gli esperimenti fisiologici. Per 1 L, aggiungere 900 mL di acqua deionizzata, 50 mL di Buffer Stock: 20x, 50 mL di soluzione salina tampone, 0,99 g D-glucosio e 0,16 g KH 2 PO 4: 20x. Regolare il pH a 7.4 utilizzo HCl. Per mantenere il pH del tampone, mescolare continuamente e coprire con paraffina o bubble continuamente.
- Check il pH ogni 20 min. rendere la soluzione di KREBS fresca ogni giorno.
- Rendere cannule di vetro con un diametro interno di 40-240 µm utilizzando un estrattore di ago/pipetta commercialmente disponibili. La dimensione delle cannule di vetro è determinata dalle dimensioni del diametro interno dei vasi sanguigni isolati (50-350 µm). In alternativa, acquistare cannule di vetro delle dimensioni predeterminate.
2. Preparazione dei reagenti
- preparare l'acetilcolina (Ach, 10 -2 M, soluzione di riserva). Sciogliere 18,29 g in 10 mL di acqua deionizzata. Conservare le aliquote di 1 mL di soluzione di riserva (10 -2 M) a-80 ° C. Il giorno dell'esperimento in serie diluito per ottenere le seguenti concentrazioni di lavoro: 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.
- Preparare la papaverina (2 x 10 -2 M, soluzione di riserva). Sciogliere 0,07517 g in 10 mL di acqua deionizzata. Preparare 10 aliquote µ l di soluzione madre e conservare a -80 ° C. in serie diluire per ottenere il giorno dell'esperimento 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M.
- Preparare l'endotelina-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, soluzione di riserva). Sciogliere 50 µ g di endotelina-1 in 1 mL di 1% BSA/PBS. Conservare le aliquote di 1 mL di soluzione di riserva (2 x 10 -5 M) a-80 ° C. Il giorno dell'esperimento diluito per ottenere una concentrazione di lavoro del 10 -10 M il giorno dell'esperimento.
- Conservare i reagenti a-20 ° C o fino a-80 ° C a seconda del tipo di congelatore disponibile, ma non più di 6 mesi.
3. Raccolta di tessuto adiposo e vaso preparazione
- recluta uomini e donne obesi (indice di massa corporea (BMI) ≥ 35 kg/m ², età ≥ 18 anni) iscritti al programma di chirurgia bariatrica presso Boston Medical Center (BMC). Un totale di 40 soggetti hanno partecipato a questi esperimenti.
- Raccogliere campioni di tessuto adiposo sottocutaneo e viscerale durante interventi chirurgici bariatrica previste dal chirurgo che esegue l'operazione.
- Raccolto il sottocutaneo adiposo dalla parete addominale inferiore e viscerale del grasso al maggior omento, rispettivamente. Tessuto grasso tipico esempio dimensione varia da 3-10 mg di tessuto. Tessuti
- posto immediatamente fredda LIOFILIZZATE in tampone con un pH di 7,4 e conservare a 4 ° C per fino a 24 h.
Nota: Inoltre, arteriole adipose può essere ottenute da individui magri anche durante altri tipi di interventi chirurgici come la riparazione di ernia o chirurgia plastica e può anche essere biopsiati dal deposito tramite biopsia trans-cutanea cuscinetto di grasso addominale sottocutaneo < sup classe = "xrif" > 6.
- Utilizzando un microscopio di dissezione del tessuto, micro-forbici e micro-forcipe, attentamente rimuovere grasso e tessuto connettivo circostanti da piccole arteriole adipose (50-350 µm di diametro intraluminal, 2-3 mm di lunghezza).
- Cravatta fuori tutti i rami su arteriole utilizzando piccoli nylon o seta suture prima incannulamento sulle pipette capillari di vetro. Accuratamente sezionare le arteriole dal momento che anche i più piccoli danni della parete arteriolare provoca cambiamenti funzionali significativi.
Esposizione del vaso
- Riduci a icona alla luce e al calore come esso può causare vasodilatazione. Poiché esso può essere a volte difficile da distinguere arteriole da venule, identificare il tono del muscolo liscio e la dimensione dei vasi di stroncare le punte dei vasi. Arteriole sono solitamente più piccoli e dimostrare maggiore tono rispetto alle venule.
- Preparare la camera di organo. Riempire lentamente la pipette capillari in vetro e tubi di gomma con usando una siringa da 10 mL di soluzione di KREBS.
- Una volta tubazione di gomma viene riempita e pipette capillari in vetro sono immersi in soluzione di KREBS all'interno della camera di organo, incannulare le arteriole in modo sicuro sulle pipette protette e legare entrambe le estremità dell'arteriola con nylon o seta nodi di suturazione attentamente.
- Riempire la camera di organo con soluzione di KREBS fino a 2 mL.
- Fissare la camera di organo su un palcoscenico con il microscopio invertito (obiettivo di ingrandimento 10 X / 0.25) e videocamera.
- Attivare il software di rilevazione di bordo che viene trasmesso in tempo reale a una frequenza di campionamento di 1 kHz (1 frame/s).
- Collegare un lato del tubo pressurizzato per la soluzione di KREBS serbatoi a pressione riempiti gratis di microbolle, come bolle possono introdurre un errore sperimentale. Collegare l'altra estremità del tubo pressurizzato alla camera organo.
- Collegare i serbatoi di pressione riempita di soluzione di KREBS al trasduttore di pressione con tubo pulito.
- Controllo flusso intra-luminale regolando l'altezza di questi due bacini; così, quando i serbatoi siano posti alla stessa altezza, si verificherà nessun flusso intra-luminale.
- Una volta che tutti questi processi sono completi, accendere riscaldamento blocco e software programma per mantenere la temperatura a 37 ° C. continuamente irrorare la nave con soluzione di KREBS e aerare con una miscela di gas di 5% CO 2 e 21% O 2% di 74 N 2 7 , 8 durante tutta la procedura sperimentale.
- Per raggiungere la pressione desiderata inside il lume dei vasi isolati aumentare gradualmente la pressione intraluminale (5 mmHg, ogni 5 min) tramite l'unità di controllo di pressione nel pannello myo-interfaccia, in questo modo ad un ritmo lento per evitare danni di strato endoteliale.
Nota: Una volta che la pressione raggiunge 60 mmHg, è necessario un periodo di equilibrazione di 20-30 min per stabilizzare la nave. Tutti gli studi di funzione vascolare vengono eseguiti a 60 mmHg e 37 ° C a pH 7,4. 7
4. Valutazione della funzione microvascolare Adipose
Nota: In generale, la vasodilatazione endoteliale-dipendente arteriola adiposa può essere suscitata in risposta alle fisiologiche (indotta da flusso) e stimoli farmacologici (Ach-indotto).
- La vasodilatazione flusso-mediata, endoteliale-dipendente a seguito di pressurizzazione, registrare il diametro dell'arteriola adiposa a riposo (Di). Ciò si riferisce a come il riposo diametro basale.
- Pre-restringono i vasi sanguigni al ~ 55% del diametro della linea di base di riposo (Dp) aggiungendo 1 µ l di endotelina-1 (ET-1, 10 − 10 M) direttamente al bagno e attendere 5 min per effetto. Ripetere questo processo fino a raggiungere il desiderato ~ 55% pre-ristretto stato.
- a seguito di pre-costrizione, indurre flusso continuo nello spazio intraluminale delle arteriole del tessuto adiposo, nell'ambito di equal e direzioni opposte così che una differenza di pressione può essere sviluppata attraverso la nave senza alterare la pressione intraluminal media di 60 mmHg.
Nota: ad esempio, se un serbatoio sposta verso l'alto di 10 cm di altezza, l'altro deve essere spostato in basso di 10 cm per alterare i gradienti di pressione e così cambiare intraluminal portata. Se si desiderano più accurate misure di portata, un sistema di misuratore di portata quantitativa può essere applicato alla messa a punto sperimentale. - Misurare la dilatazione flusso-mediata 3-5 min dopo l'inizio dell'induzione flusso. I livelli di flusso intraluminal (gradienti di pressione) possono essere nella gamma di 0 - 100 cmH 2 O. aumentare ogni incremento del gradiente di pressione di Δ10 cmH 2 O ogni 5-6 minuti, fino ad un massimo di 100 cmH 2 O.
Nota: Al fine di indurre stabile flusso laminare in lumen, entrambi formati di punta di vetro micro cannula devono essere molto vicino al diametro interno delle arteriole; in caso contrario, sarà produrre un flusso turbolento all'interno del lume e indurre errori di misura indesiderati. - Seguito della valutazione di dilatazione flusso-mediata, restituire serbatoi di pressione alla stessa altezza (60 mm Hg).
- Quindi, lavare arteriola e alloggiamento rimuovendo immediatamente la soluzione dalla camera e sostituire con soluzione di KREBS fresca. Questa operazione viene eseguita con cautela per non disturbare l'arteriola sospeso all'interno della camera.
- Ripetere questo processo 3 - 4 volte per 20-30 minuti, o fino a quando il vaso isolato restituisce al riposo diametro basale.
- Vasodilatazione acetilcolina-mediata endoteliale-dipendente,
- quando l'arteriola adiposa ha restituito al riposo diametro basale, pre-costrizione nave ~ 55% con la somministrazione di endotelina-1 (ET-1, 10 − 10 M) direttamente al bagno, come descritto sopra nella sezione 4.1.2.
- a seguito di pre-costrizione, in sequenza somministrare dosi aumentanti (2 µ l) di acetilcolina che è un recettore-mediata, agonista di ossido nitrico (Ach, 10 -9 a 10 -5 M) direttamente al bagno. Registrare il cambiamento di diametro arteriolare 5 min dopo la somministrazione di ciascuna dose.
- Una volta che la nave ha raggiunto un plateau dopo somministrazione della dose finale Ach, lavare il vaso 3 - 4 volte con soluzione di KREBS. Consentire il 20-30 min per la nave recuperare e restituire al diametro basale di riposo. Per aiutare a mantenere il pH al camber di organo, cambiare soluzione di KREBS ogni 15 min.
- Incubare l'arteriola con l w - nitro - N-estere metilico dell'arginina (L-NAME, 10 -4 M), un inibitore della sintasi dell'ossido nitrico per 30 min e poi ripetere 4.2.1 e 4.2.2 per caratterizzare il contributo relativo di l'ossido di azoto per vasodilatazione mediata Ach.
- Valutare la vasodilatazione endotelio-indipendente (muscolo liscio vascolare funzione) e l'attuabilità di vaso di una somministrazione sequenziale di dosi aumentanti di papaverina (10 -8 a 10 -4 M) direttamente al bagno. Se il diametro del vaso non tornare, o superare il diametro della linea di base (Di) che riposa in risposta alla papaverina (cioè appropriato vasodilatazione), considera la nave non vitali e scartare i punti dati.
5. Analisi dei dati e calcolo
- Calcola la reattività vascolare. Utilizzare percentuale vasodilatazione per espressione dati per tenere conto delle differenze di base diametro del vaso e calcolare usando la seguente equazione:
% vasodilatazione = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
dove DT è il diametro registrato in un punto determinato momento (massimo diametro), Dp è il diametro registrato dopo l'aggiunta dell'agente vasocostrizione (cioè. ET-1 indotto da diametro di costrizione), e Di è il diametro registrato immediatamente prima dell'aggiunta dell'agente vasocostrizione (riposo diametro basale). 9 - definire la vasocostrizione e la vasodilatazione sensibilità (dose-risposta) per un agonista come la concentrazione di Ach, papaverina o ET-1 che suscita il 50% della risposta massima (CE 50) che può essere definito da un parametro sigmoidale e tracciati, come descritto in precedenza. 10
Nota: gli studi di riproducibilità inter-osservatore della vasodilatazione dei microvasi adiposi ha un elevato coefficiente di correlazione (CC) di 0,99 (n = 10 esperimenti di nave) nel nostro laboratorio.
6. analisi statistica
- Express continue misurazioni come media ± SEM Questi tendono ad essere distribuito normalmente. Analizzare la reattività vascolare in arteriole adipose di misure ripetute ANOVA a due vie.
- In alternativa, confronta l'area sotto la curva (AUC) della trama per vasodilatazione cumulativa di dose-risposta tra gruppi di trattamento. In tutti i casi, considera P < 0.05 statisticamente significativo.
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Representative Results
Il nostro laboratorio ha usato videomicroscopia per esaminare endotelio-dipendente e - indipendente vasodilatazione, così come vasocontractile funzione del tessuto adiposo arteriole isolato dal grasso sottocutaneo e viscerale degli esseri umani obesi. La caratteristica struttura sperimentale viene visualizzata in Figura 1A. Tessuto adiposo arteriole sono sospesi tra due pipette capillari in vetro e saldamente fissata con punti di sutura all'interno della camera di organo come mostrato in Figura 1B. Come descritto sopra nella sezione 5.1, risposte arteriolare quindi possono essere valutate esaminando la nave alla linea di base (Figura 2A), seguita da pre-costrizione con ET-1 ~ 55% del diametro della linea di base (Figura 2B) e poi indotta da agonista vasodilatazione e rilassamento del lume vascolare come visualizzato in Figura 2.
Noi ed altri abbiamo osservato che le risposte di vasodilatazione endotelio-dipendente di flusso aumentato (shear stress)11 e12 di Ach sono state smussate significativamente in viscerale rispetto alle arteriole adiposi sottocutanei (Figura 3A, 3B ) nell'obesità umana. Tuttavia, la vasodilatazione endotelio-indipendente in risposta alla papaverina non è stata alterata differenzialmente tra due depositi (Figura 3). Insieme, questi risultati suggeriscono che la disfunzione vascolare in domini viscerale è in gran parte un risultato di disfunzione a livello dell'endotelio, almeno nelle fasi iniziali della malattia. Questa tecnica permette l'analisi sistematica delle risposte vasodilatatori delle arteriole umani piccoli intatti e può essere applicata anche ad altre regioni accessibili del vasculature umano. Il sistema ex vivo possa essere manipolato utilizzando numerosi metodi farmacologici quali risposte all'insulina come indice di vascolare endoteliale insulina resistenza6, o studi di dose-risposta a nitroglicerina per testare il muscolo liscio vascolare funzione di strato. 12 metodi biologici come il silenziamento RNA possono anche essere introdotto13 potenzialmente sviluppare quadri meccanicistici per comprendere regolatori critici che conferiscono disfunzione vascolare in condizioni di malattia specifica.
Figura 1: set-up videomicroscopia. (A) immagine raffigurante i componenti dell'alloggiamento dell'organo videomicroscopia. (B) immagine di un'arteriola adiposo umano montato tra due pipette capillari in vetro nella camera di organo. Diametro del vaso cambia in risposta a stimoli fisiologici e farmacologici che possono essere esaminati e quantificati utilizzando specializzata in software di analisi e un allegato di telecamera invertita nel sistema. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: illustrazione di vasodilatazione microvascolare usando pressione videomicroscopia. Diametro arteriolare di riposo della linea di base (A) (post-pressurizzazione diametro, nessun agonista o stimolazione: Di) (B) pre-ristretto diametro (dopo ET-1 indotta diametro ristretto: Dp), (C) indotta da agonista vasodilatati diametro (dopo che è stato aggiunto Ach: DT). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: vasodilatazione endotelio-dipendente e - indipendente in sottocutaneo vs arteriole adiposi viscerale in esseri umani obesi. Vasodilatazione endotelio-dipendente è stata attenuata significativamente in viscerale rispetto al tessuto adiposo sottocutaneo arteriole quando valutati da (A) aumento del flusso (accoppiato vasi sottocutanei e viscerali, n = 20), o (B) risposta di dose di acetilcolina con/senza L-NAME (accoppiato vasi sottocutanei e viscerali, n = 16). (C) indipendente dall'endotelio vasodilatazione non è stata alterata differenzialmente tra arteriole viscerale e sottocutanei quando valutato dalla dose risposta papaverina (accoppiato vasi sottocutanei e viscerali, n = 8). * Denota le differenze del gruppo tra depositi; †Denotes depot-differenze tra acetilcolina con L-NAME rispetto ad acetilcolina da solo; NS: non significativo. I dati sono presentati come mean± SEM, p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La dissezione e l'isolamento delle arteriole adipose dai tessuti circostanti può essere un processo lungo e laborioso con grande attenzione ai dettagli e protocollo tecnico. La procedura di microdissection richiede competenze meticolose e dissezione specializzati utensili per prevenire danni al muscolo liscio o endoteliale delle cellule strati del microvasculature. Anche piccole punture accidentali nella parete arteriolare possono prevenire intraluminal pressurizzazione e risultati in un esperimento riuscito. Inoltre, inserimento di una canula di arteriole che utilizza suture è cruciale per garantire le arteriole tra le punte di pipetta capillare di vetro ad ogni estremità della nave.
Microvasi isolati umani possono sviluppare spontaneo tono myogenic dopo 30-40 min di pressurizzazione a 60 mmHg. Tuttavia, abbiamo trovato che arteriole adiposi umani generalmente dimensioni 50-350 µm di diametro luminal interno sono relativamente piccole, con radi strati del muscolo liscio vascolare e tendono a non sviluppare tono miogenico significativo rispetto alle arteriole del muscolo scheletrico. Induciamo così pre-costrizione di queste piccole arteriole che utilizza ET-1 prima dell'esposizione ai vasodilatatori. Troviamo che ET-1 esercita una risposta vasocostrittore più prevedibile, mentre in alcuni casi ci può essere variabilità nelle risposte agli agonisti del recettore alfa come fenilefrina. È indispensabile scegliere l'appropriato agonisti per indurre una desiderata ~ 55% pre-costrizione; Tuttavia è anche fondamentale per selezionare la corretta quantità di agente pre-costrittivo per evitare sopra dosaggio e danno tossico alla nave. Raggiungiamo questo iniziando con la dose più bassa di gamma e titolazione fino a effetto come descritto nella sezione 4.1.2.
Arteriole nel tessuto adiposo sono sensibili ai cambiamenti di pH e temperatura; 14 di conseguenza, è fondamentale monitorare e controllare il pH appropriato (7,4) e temperatura (37 ° C) durante il processo sperimentale. Mentre videomicroscopia è un sistema strettamente regolato a temperatura controllata, è indispensabile per monitorare il pH della soluzione di KREBS in tutto l'esperimento per evitare spostamenti che possono falsare i risultati. Bubbling continuo della soluzione di KREBS e sostituzione di soluzione ogni 15 minuti durante la pressurizzazione e fasi di lavaggio ridurrà variazioni del pH nel tempo.
Mentre videomicroscopia è una tecnica utile per esaminare le proprietà funzionali di microvasi, la tecnica ha una curva di apprendimento notevole e può essere laborioso specialmente durante il processo di isolamento vascolare. A seconda del tipo di tessuto che è biopsiato, la nostra esperienza con tessuto adiposo microvasi ha dimostrato che la procedura di inserimento di una canula potrebbe richiedere una quantità significativa di tempo e pazienza. Inoltre, c'è tempo intrinseca sensibilità agli esperimenti come vasi all'esterno del corpo tendono a perdere le loro proprietà fisiologiche e funzionali nel tempo. Così, gli esperimenti devono essere eseguite all'interno della finestra vitale delle navi di minuti o ore dopo biopsia chirurgica prima del decadimento di eventuale tessuto.
La rilevanza clinica e la spiegazione razionale di questo modello sperimentale che utilizza videomicroscopia per studiare arteriole è supportato dalla nostra capacità di sonda direttamente patofisiologia in intatti interi segmenti di vasi sanguigni umani rimossi da soggetti viventi, che non può essere replicata da imaging non-invasivo. In effetti, la nostra capacità di accedere direttamente e di esaminare i vasi sanguigni umani disfunzionali in, ad esempio un corpo obeso, noi può fornire opportunità di approfondire le vie che sono differenzialmente alterato in condizioni di malattia e scoprire il romanzo bersagli terapeutici. Inoltre, i dati pubblicati dal nostro laboratorio e altri mostrano tale valutazione ex vivo di funzione arteriolare adiposa correla con in vivo le risposte funzione endoteliale sistemica in altri distretti vascolari all'interno di un individuo e associare con fattori di rischio cardiovascolari tra cui ipertensione, fumo, diabete e l'infiammazione. 12 , 15 , 16 abbiamo anche pubblicato i dati che dimostrano una correlazione significativa fra i risultati immunohistochemical sono relativi alla biologia dell'ossido di azoto in cellule endoteliali adipose viscerali e vasodilatazione flusso-mediata arteriosa brachiale suggerendo anomalie parallele in adiposo e circolazioni sistemica. 17 data la natura sistemica di disfunzione endoteliale, crediamo che questa tecnica rappresenta un approccio pragmatico per studiare non solo umano del tessuto vascolare, ma anche potenzialmente utilizzare questo metodo in animali e studi clinici longitudinali per esaminare gli effetti del trattamento. Altre tecniche per esaminare il microvasculature sono anche disponibili come filo myography, che tende ad essere meno tecnicamente difficili da eseguire e consente misure di tensione isometrica dei vasi isolati di vari agonisti utilizzando un trasduttore di forza. Mentre questo metodo fornisce anche informazioni relative alle proprietà fisiologiche dei microvasi, il set-up non utilizza un sistema di pressione intra-luminale che potrebbe renderlo meno incline a ricapitolare condizioni in vivo . Un vantaggio di videomicroscopia è la capacità di indurre una pressione intraluminal relativamente costante, riducendo al minimo le modifiche a taglio nel lume. Il metodo può essere applicato per microvasi dimensioni simili in entrambi gli esseri umani e animali. 9 , 12 , 18 infine, si deve osservare che una serie di sistemi di videomicroscopia commercialmente disponibili è disponibile per l'acquisto e la messa a punto; Tuttavia i concetti fisiologici nel complesso sono abbastanza uniformi su tutte le piattaforme. 2 , 6 , 18
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Disclosures
Gli autori non hanno informazioni integrative o conflitti di interesse al rapporto.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare i volontari per la loro partecipazione in questi studi e lo staff chirurgico al Boston Medical Center per fornire le biopsie del tessuto adiposo. Dr. Gokce è supportato dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute (NIH) HL081587, HL114675 e HL126141. Dr. Farb è supportato da NIH concedere K23 HL135394.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
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