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Cancer Research

तैयारी और 3 के चयापचय परख-आयामी अंडाकार अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं और Fibroblasts की सह संस्कृतियों

Published: August 23, 2017 doi: 10.3791/56081
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1Molecular Medicine Division, Translational Genomics Research Institute, 2Agilent Technologies

Summary

यहां, एक विधि 3 आयामी की तैयारी के लिए वर्णित है (3 डी) अंडाकार सह अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं और fibroblasts की संस्कृति, चयापचय कार्यों की माप के बाद एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर ।

Abstract

अग्नाशय के कैंसर सहित कई कैंसर प्रकार, एक घने fibrotic स्ट्रोमा कि ट्यूमर प्रगति और आक्रमण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । सक्रिय कैंसर एसोसिएटेड fibroblasts ट्यूमर स्ट्रोमा का एक प्रमुख घटक है कि कैंसर की कोशिकाओं के साथ बातचीत और उनके विकास और अस्तित्व का समर्थन कर रहे हैं । मॉडल है कि कैंसर कोशिकाओं और सक्रिय fibroblasts की बातचीत दोहराऊंगा stromal जीवविज्ञान और अर्बुदरोधी एजेंटों के विकास के लिए अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं । यहां, एक विधि की तेजी से उत्पादन के लिए वर्णित है मजबूत 3 आयामी (3 डी) अंडाकार co-संस्कृति अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं और सक्रिय अग्नाशय fibroblasts कि बाद में जैविक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, वर्णित कार्यात्मक चयापचय परख बाहर ले जाने में 3 डी spheroids का उपयोग करने के लिए सेलुलर एक extracellular फ्लक्स एक अंडाकार microplate के साथ युग्मित विश्लेषक का उपयोग कर रास्ते जांच है । अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं (Patu8902) और सक्रिय अग्नाशय fibroblast कोशिकाओं (PS1) सह-संस्कृति और एक संगत nanoparticle विधानसभा का उपयोग कर चुंबकीय थे । चुंबकीय कोशिकाओं को तेजी से एक ९६ अच्छी तरह से प्रारूप में, विकास मीडिया में चुम्बकीय ड्राइव का उपयोग कर एक 400-600 µm के बीच संस्कृति के 5-7 दिनों के भीतर लेकर व्यास के साथ spheroids उत्पंन कर रहे थे । कार्यात्मक चयापचय Patu8902-PS1 spheroids का उपयोग कर परख तो extracellular फ्लक्स प्रौद्योगिकी का उपयोग करने सेलुलर ऊर्जावान रास्ते जांच कर रहे थे । यहां विधि सरल है, कैंसर कोशिका के अनुरूप पीढ़ी fibroblast अंडाकार सह संस्कृतियों की अनुमति देता है और संभवतः वर्तमान वर्णित पद्धति के अनुकूलन पर अंय कैंसर कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

पिछले दशक में, इन विट्रो में कई 3 डी मॉडल दोहराऊंगा करने के लिए विकसित किया गया है और vivo ट्यूमर जीवविज्ञान, microenvironment और कैंसर कोशिकाओं1के विकास की स्थिति,2 में जांच । दो आयामी (2d) जैव रासायनिक कारकों और जांच यौगिकों के लिए वर्दी जोखिम के साथ monolayer सेल संस्कृति प्रणालियों के लिए देशी 3 डी ट्यूमर-stromal extracellular के माध्यम से फैलाना यौगिकों के एक ढाल को उजागर बातचीत विफल मैट्रिक्स प्रोटीन (ECM)3,4। इस प्रकार, 2d ऊतक संस्कृति मॉडल की तुलना में, 3 डी कैंसर मॉडल ट्यूमर microenvironment अनुकरण में बेहतर क्षमता दिखाने के लिए उभरा है और महत्वपूर्ण उपकरणों के रूप में सेवा की बेहतर vivo में ट्यूमर विशेषताओं को समझने के लिए, जैसे हाइपोक्सिया, desmoplasia, निद्रा, औषध penetrance, विषाक्तता और चिकित्सीय प्रतिरोध5,6. इस अंत करने के लिए, 3 डी मॉडल के लिए vivo ट्यूमर सुविधाओं में नकल उतार द्वारा 2d सेल संस्कृति और पूरे पशु मॉडलों के बीच अंतर को पाटने की क्षमता है, जबकि अपेक्षाकृत सस्ती जा रहा है और तेजी से उत्पादन और निरंतरता के लिए अनुकूलित । कैंसर बायोलॉजी, morphogenesis और टिशू इंजीनियरिंग7,8सहित कई क्षेत्रों में शोधों के शोध में तेजी लाने के लिए ये फायदे बताए जा रहे हैं ।

3 डी ऊतक संस्कृति के तरीकों को विकसित करने की एक वृद्धि में, चुंबकीय उत्तोलन तकनीक हाल ही में विकसित किया गया है और विकास, परख और विभिंन प्रकार के सेल से व्युत्पंन spheroids के इमेजिंग के लिए वर्णित9,10, 11 , 12. चुंबकीय 3 डी प्रिंटिंग नैनोकणों के साथ magnetizing कोशिकाओं द्वारा चुंबकीय बलों के ऊतकों इंजीनियर के उपयोग का कारनामे और उंहें बहु-अच्छी तरह से प्रारूपों में मुद्रण । यह संगत के तेजी से उत्पादन की अनुमति देता है, समान 3d spheroids के पास, जो और दोहन किया जा सकता है जैव रासायनिक और भौतिक जांच के लिए अनुप्रवाह अनुप्रयोगों के एक बहुतायत के लिए कार्यरत10। यहां हम चुंबकीय प्रिंटिंग तकनीक Nanoshuttle (एन एस) लौह ऑक्साइड, पाली एल lysine और सोने की नैनो कणों से बना नामक एक संगत सामग्री का उपयोग अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं और fibroblasts लेबल के लिए अनुकूलित किया है । एन एस प्लाज्मा झिल्ली को electrostatically देता है, किसी भी विशिष्ट रिसेप्टर्स को बांध करने के लिए नहीं जाना जाता है, और एक सप्ताह के भीतर बंद सेल सतह विज्ञप्ति. यह बहुत कम चुंबकीय बलों की आवश्यकता है (30pN), कुल के लिए पर्याप्त नहीं बल्कि नुकसान कोशिकाओं और सेल व्यवहार्यता, चयापचय या प्रसार को प्रभावित नहीं करता है यह 3 डी संस्कृतियों के लिए अत्यंत संगत है10,13,14 ,15.

इस अध्ययन में, एक उदाहरण और मॉडल के रूप में अग्नाशय के कैंसर का उपयोग, हम पीढ़ी और 3 डी कैंसर कोशिका की चयापचय परख-fibroblast spheroids का वर्णन । 2 डी जहाजों में प्रसंस्कृत कोशिकाओं से शुरू, हम संस्कृति और अग्नाशय के ट्यूमर के विकास की स्थिति-fibroblast सह संस्कृति spheroids चुंबकीय प्रिंटिंग का उपयोग उदाहरण देकर स्पष्ट करना । प्रसंस्कृत spheroids तो कार्यात्मक चयापचय परख में एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक, एक तकनीक का उपयोग करने के लिए एक साथ दो प्रमुख रास्ते उत्पादन ऊर्जा, glycogen और mitochondrial श्वसन, जीने की एक किस्म में उपाय का प्रदर्शन किया गया कोशिकाओं और ऊतकों16,17,18,19,20। glycogen को extracellular अंलीकरण दर (ीकार) में बदलाव के रूप में मापा गया, जबकि mitochondrial श्वसन या oxidative फास्फारिलीकरण को ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के रूप में मापा गया । हम प्रस्ताव है कि इस विधि अग्नाशय ट्यूमर spheroids के लिए विकसित के अनुकूलन और 3 डी ट्यूमर अंडाकार पीढ़ी और अंय कोशिका के लिए परख का अनुवाद करने के लिए एक रीढ़ की हड्डी के रूप में सेवा कर सकते है/

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. अग्नाशय के कैंसर की संस्कृति 3d Spheroids चुंबकीय प्रिंटिंग का उपयोग कर

  1. मानक रोकनेवाला ऊतक संस्कृति तकनीक का उपयोग कर, एक T75 कुप्पी में ब्याज की संस्कृति कोशिकाओं उचित विकास मीडिया में 70-80% की एक प्रवाह के लिए.
    नोट: सामान्यतया, 5-7 & #215; 10 6 कोशिकाओं से एक 70-80% धाराप्रवाह T75 कुप्पी काटा गया । इस अध्ययन-Patu8902 (अग्नाशय के ट्यूमर कोशिकाओं) और PS1 कोशिकाओं (सक्रिय अग्नाशय stellate कोशिकाओं < सुप वर्ग = "xref" > 21 ) में दो विभिन्न प्रकार के सेल का इस्तेमाल किया गया । दोनों सेल लाइनों रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट मीडिया १६४० (RPMI-१६४०) 10% (v/वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1 & #215; पेनिसिलिन-streptomycin (पी एस) के साथ पूरक में कल्चरित थे.
  2. धोने की कोशिकाओं को एक बार 5 मिलीलीटर के साथ Dulbecco & #39; एस फास्फेट बफर खारा (DPBS).
  3. trypsinizing द्वारा प्लास्टिक की सतह से अलग कोशिकाओं ०.०५% Trypsin-EDTA के लिए 5-10 मिनट पर ३७ & #176; C. एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल टुकड़ी के लिए जांच करें ।
  4. अलग कोशिकाओं को 8 मिलीलीटर वृद्धि मीडिया के अलावा द्वारा trypsin निष्क्रिय । trypsinization से बचें, क्योंकि यह प्रतिकूल कोशिकाओं की स्वास्थ्य/
    5. को प्रभावित कर सकते हैं ।
  5. प्लास्टिक कोशिकाओं को ऊपर और नीचे एक एकल कोशिका निलंबन उत्पंन करने के लिए और सेल घनत्व एक स्वचालित सेल काउंटर या एक hemocytometer का उपयोग कर गणना ।
    6. इस बीच में
  6. , equilibrate एक शीशी एन एस के परिवेश के तापमान के लिए ।
  7. spheroids (कुओं) की वांछित संख्या बोने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा और एक नया 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए aliquot की गणना । उदाहरण के लिए, ५,००० कोशिकाओं के साथ एक पूरी ९६ अच्छी तरह से थाली बीज के लिए/अच्छी तरह से, aliquot से कम ५.५ & #215; 10 5 cells.
  8. 3 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा इकट्ठा कोशिकाओं को ध्यान से महाप्राण या खिचड़ी भाषा supernatant और १.० x 10 6 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर कोशिकाओं reसस्पेंड वृद्धि मीडिया में । पिपेट धीरे एक व्यापक ऊब प्लास्टिक टिप का उपयोग करने के लिए बाल काटना से बचने । उदाहरण के लिए, ५.५ x 10 5 कक्षों में ५५० & #181; ग्रोथ मीडिया के एल.
  9. आकृष्ट equilibrated NS (चरण १.६) का उपयोग करते हुए कक्षों की इच्छित मात्रा को ।
    1. सीधे वृद्धि मीडिया में सेल निलंबन के लिए एन एस जोड़ने और धीरे आंदोलन । कोशिकाओं के कुशल चुंबकीय लेबलिंग के लिए, 10 & #181 का उपयोग करें; l NS प्रति १०० & #181; l कक्षों (1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल) पर reसस्पैंड.
      नोट: एक विशिष्ट प्रयोग के लिए, लैबल ५.५ & #215; 10 5 Patu8902 कोशिकाओं में ५५० & #181; l के साथ ५५ & #181; l एनएस और १.१ & #215; 10 6 PS1 कक्षों में ११०० & #181; l, (अलग से) के साथ ११० & #181; l NS.
    2. धीरे से पलटना ट्यूब कुछ समय के लिए सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए । अस्थाई रूप से, कक्ष-NS मिश्रण को 24-वेल प्लेट के एकल कुआं में स्थानांतरित करें । यह अलग से प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए चुंबकीय किया जा करने के लिए करते हैं । कवर प्लेट और कोमल झटकों के साथ 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को गर्मी सेल की सतह के लिए एन एस बाध्यकारी अनुमति देते हैं ।
      नोट: संस्कृति और spheroids की परख या तो Patu8902 या PS1 अकेले कोशिकाओं से शुरू, सह संस्कृति spheroids के अलावा दोनों सेल प्रकार चुंबकीय ड्राइव पर मुद्रण से पहले मिश्रित के साथ शुरू सफलतापूर्वक स्वतंत्र में इस पद्धति का उपयोग कर प्राप्त किया गया प्रयोगों. Patu8902 और PS2 कोशिकाओं से सह संस्कृति spheroids पैदा करने के लिए एक विधि नीचे बाद के चरणों में वर्णित है ।
  10. प्लास्टिक ऊपर और नीचे धीरे चुंबकीय कोशिकाओं को समान रूप से मिश्रण करने के लिए और वांछित सेल नंबर युक्त एक मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं । spheroids सीडिंग के लिए, कुल १५,००० कक्षों (५,००० Patu8902 + १०,००० PS1) का उपयोग करें और एक ९६-अच्छी तरह से थाली के १५० & #181; L के प्रति अच्छी तरह से कुल मात्रा को समायोजित.
    नोट: अंतिम मात्रा में तिरस्कृत प्रत्येक अच्छी तरह से इस्तेमाल किया कोशिकाओं की संख्या की परवाह किए बिना होना चाहिए.
  11. जगह एक सेल से बचाने वाली क्रीम ९६-अच्छी तरह से ९६ के ऊपर प्लेट-चुंबकीय अंडाकार ड्राइव और वितरण १५० & #181; एक अच्छी तरह से सेल मिश्रण के एल । कोशिकाओं का निरीक्षण धीरे चुंबक के ऊपर अच्छी तरह से केंद्र के लिए इकट्ठा । कवर और एक 5% सह 2 मशीन ३७ & #176 पर सेट में रात भर थाली, चुंबकीय अंडाकार ड्राइव के साथ अभी भी संलग्न सी । चुंबकीय ड्राइव निकालें और 7 दिनों तक के लिए आगे की वृद्धि के लिए मशीन ।
    नोट: यह अंडाकार मुद्रण चुंबकीय अंडाकार ड्राइव का उपयोग करने के लिए सेल से बचाने वाली क्रीम वृद्धि प्लेट का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । पतले छोटे मैग्नेट के साथ अंडाकार ड्राइव का उपयोग किया जाता है कि सुनिश्चित करें, नहीं होल्डिंग ड्राइव.
  12. हर दिन spheroids के विकास की निगरानी । विकास की थाली एक कोण पर चुंबकीय होल्डिंग ड्राइव पर घुड़सवार और एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग करने के लिए बाहर खर्च मीडिया आकर्षित रखकर हर तीन दिनों में ताजा विकास मीडिया के साथ भरपाई ।
    नोट: Patu8902 और PS1 कक्ष १५,००० कक्षों पर सह-वरीयता प्राप्त/400-600 & #181 के व्यास के साथ 3d spheroids में बढ़ेगा, 5-7 दिनों के भीतर m. इस बिंदु पर spheroids चयापचय लक्षण वर्णन, दवा मूल्यांकन के लिए तैयार हैं, और अंय बहाव अनुप्रयोगों ।
< p class = "jove_title" > 2. 3 डी अग्नाशय के ट्यूमर Spheroids के चयापचय परख Extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर रास्ते के लिए-इन...

< p class = "jove_content" > नोट: इस खंड में, एक Extracellular प्रवाह का उपयोग कर Spheroids के चयापचय कार्यों का विश्लेषण परख microplates विशेष रूप से 3 डी spheroids के लिए डिजाइन के साथ विश्लेषक वर्णित है ।

  1. धुलाई और spheroids के अंतरण को वृद्धि प्लेटों से अंडाकार परख microplates.
    नोट: Spheroids चयापचय परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब वे के एक व्यास तक पहुंचने ~ ५०० & #181; m.
    1. ने दिन पूर्व ही प्रदर्शन कर परख की, हाइड्रेट जांच या सेंसर कारतूस के साथ परख calibrant (२०० & #181; एल/ठीक है) प्रदान की उपयोगिता थाली में और रात भर गर्मी (4-18 ज) में एक humidified मशीन (गैर सह 2 ) पर सेट ३७ & #176; C.
    2. आधार मीडिया का सप्लीमेंट द्वारा वांछित चयापचय परख के लिए उपयुक्त परख मध्यम तैयार (सामग्री की मेज देखें) के साथ या तो 2 मिमी एल-glutamine glycogen तनाव परीक्षण के लिए (जीएसटी) परख या 1 मिमी पाइरूवेट, 2 मिमी एल-glutamine और 10 मिमी के लिए ग्लूकोज के साथ एक mitochondrial ताण चाचणी (MST) परख.
      नोट: extracellular फ्लक्स विश्लेषक उपायों दोनों mitochondrial श्वसन (ओसीआर) और glycogen (ीकार) एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में रहते कोशिकाओं की. इन दरों जांच के तहत नमूनों में सेलुलर चयापचय समारोह का अवलोकन प्रदान करते हैं । कृपया विस्तृत निर्देशों के लिए परख किट में मैनुअल को देखें ।
    3. परख विशिष्ट खुराक जोड़ने के बाद (देखें 2.1.1 कदम), एक ३७ & #176 में पूरक परख मध्यम गर्म, सी जल स्नान और ७.४ & #177 के लिए पीएच को समायोजित करें; ०.१ 0.1 n NaOH के साथ । प्रयोग करने तक मध्यम गर्म रखें ।
    4. की सिफारिश की स्टॉक सांद्रता करने के लिए नपे परख माध्यम में परख किट एजेंट का पुनर्गठन ।
      NOTE: ये 10 & #215 पर बने हैं; अंतिम एकाग्रता कुओं में वांछित । ग्लूकोज, oligomycin और 2-deoxy-ग्लूकोज (2-डीजी) के लिए स्टॉक सांद्रता १०० mm, १०० & #181; M और ५०० mm, क्रमशः है ।
    5. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विकास की थाली में spheroids निरीक्षण अंडाकार आकृति विज्ञान और समग्र एकरूपता के लिए जांच करने के लिए; आकार और structur के संदर्भ मेंspheroids.
      6. के ई
    6. एक चुंबकीय होल्डिंग ड्राइव पर विकास की थाली हस्तांतरण और ध्यान से महाप्राण ~ १२० & #181; एल विकास मीडिया । धीरे से धो spheroids के साथ ~ १२० & #181; गर्म और पूर्व नपे परख मीडिया के एल, महाप्राण और धो दो बार दोहराएं । माइक्रोस्कोप के नीचे spheroids का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि spheroids धुल न जाए ।
    7. को १८० & #181 जोड़कर अंडाकार परख microplate तैयार करना; L गर्म परख मीडिया को एक अच्छी तरह से ।
    8. एक P20 micropipette को 10 & #181; L और फिट एक विस्तृत ऊब टिप करने के लिए सेट करें । अगर वाइड बोर टिप्स उपलब्ध नहीं हैं, तो एक साफ कैंची या बोर को चौड़ा करने के लिए स्केलपेल के साथ नियमित पिपेट सुझावों के सुझावों को काट.
      नोट: यह बाल काटना कम करना चाहिए और spheroids के समग्र आकृति विज्ञान की रक्षा करते हुए परख प्लेटों में स्थानांतरित किया जा रहा है ।
    9. spheroids का स्थानांतरण करने के लिए एक गर्म (३७ & #176; C) सतह का उपयोग करें । एक एक्स-रे फिल्म दर्शक की सतह का उपयोग करने के लिए एक सफेद प्रकाश दीपक के साथ गरम कंट्रास्ट और स्थानांतरण प्रक्रिया के दौरान spheroids की सहायता दृश्य को बढ़ाने के ।
    10. ध्यान से महाप्राण एक एकल पूर्व सेल से बचाने वाली क्रीम से धो अंडाकार एक P20 एक व्यापक बोर टिप के साथ सुसज्जित micropipette का उपयोग कर प्लेट और धीरे सीधे एक अंडाकार परख प्लेट की एक अच्छी तरह से बाहर चयापचय ले जाने के लिए के केंद्र में अंडाकार हस्तांतरण बीएसए. प्रत्येक अंडाकार धीरे शुद्ध गुरुत्वाकर्षण द्वारा केंद्रीय सूक्ष्म एक अच्छी तरह से चैंबर में गिर करने के लिए परख थाली आबाद अनुमति देते हैं ।
      नोट: यह आमतौर पर गुरुत्वाकर्षण द्वारा अच्छी तरह के केंद्र में गिर करने के लिए प्रत्येक अंडाकार के लिए 5-8 एस लेता है. जब तक पिपेट को बाहर न खींचे तब तक spheroids को माइक्रो-चैंबर में ही बसा दिया जाए । परख प्लेट के 4 कोने कुओं में spheroids जमा मत करो (A1, A12, H1, H12) के बाद से इन पृष्ठभूमि कुओं के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
      11. प्रत्येक अंडाकार प्रत्येक कुआं के केंद्र में है यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक अंडाकार की आकृति विज्ञान और स्थिति की निगरानी
    11. । यदि आवश्यक हो, एक विस्तृत बोर प्लास्टिक टिप का उपयोग कर अंडाकार बाहर aspirating द्वारा अच्छी तरह से केंद्र की स्थिति, और गुरुत्वाकर्षण द्वारा बाद में जमाव ।
    12. एक बार सभी spheroids का तबादला हो गया है, एक ३७ & #176 में परख थाली जगह है; सी humidified एयर मशीन (गैर सह 2 ) एक घंटे के लिए पहले परख के लिए ।
  2. लोडिंग सेंसर कारतूस यौगिकों के साथ और प्रदर्शन परख
    1. तैयार 10 & #215; परख विशिष्ट मीडिया में केंद्रित परख विशिष्ट reagents कदम 2.1.2 में वर्णित है । उदाहरण के लिए, GST को पूरा करने के लिए, ग्लूकोज, oligomycin, और 2-डीजी अनुशंसित वॉल्यूम में परख पुस्तिका में संदर्भित करने के लिए का पुनर्गठन । दोनों जीएसटी और MST परख Patu8902-PS1 spheroids का उपयोग कर बाहर किए गए थे ।
    2. ठीक से बाएं हाथ की ओर एक एच लेबल पंक्तियों के साथ सेंसर कारतूस ओरिएंट और सेंसर कारतूस के शीर्ष पर एक लोडिंग गाइड जगह है । लोड हो रहा है गाइड इतना है कि बंदरगाह के लिए इसी पत्र के ऊपरी बाएं हाथ कोने पर है ओरिएंट द्वारा वांछित बंदरगाह के सही लदान सुनिश्चित करें ।
    3. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, इंजेक्शन बंदरगाहों में सीधे एजेंट वितरण । प्रक्रिया भर में उंगलियों का उपयोग कर स्थिति में लोड गाइड पकड़ो.
      नोट: प्रत्येक एजेंट एक अनुशंसित परख मैनुअल में निर्दिष्ट बंदरगाह में इंजेक्ट किया जाएगा । हवा के बुलबुले बनाने से बचें, लेकिन हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए कारतूस के किसी भी भाग का दोहन नहीं है ।
    4. भी लोड हो रहा है के लिए नेत्रहीन इंजेक्शन बंदरगाहों का निरीक्षण करने के लिए कारतूस के साथ नेत्र स्तर पर गाइड और स्थिति लोड हटाने.
    5. खंड २.३ में वर्णित के रूप में उपकरण नियंत्रक वेव सॉफ्टवेयर (से, विश्लेषण सॉफ्टवेयर) का उपयोग कर प्रयोगात्मक परख डिजाइन/साधन प्रोटोकॉल बनाने के लिए ।
  3. परख डिजाइन और निष्पादन विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर
    1. एक परख टेंपलेट बनाने के प्रयोग के लिए
      1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और क्लिक करें & #34; टेम्पलेट्स & #34; या किसी मौजूदा परख से चुनें टेंपलेट. & #34 पर डबल क्लिक करें; रिक् त टें पलेट & #34;.
      2. प्रयोगात्मक समूहों और शर्तों को परिभाषित ।
        1. पोर्ट A, B, और C. छोड़ पोर्ट D के लिए इंजेक्शन रणनीतियाँ निर्धारित करें खाली.
          नोट: जीएसटी परख के लिए, केवल इन बंदरगाहों ग्लूकोज, Oligomycin और 2-डीजी के साथ लोड किया जाएगा । MST परख के मामले में oligomycin, FCCP और रोटेनोन को लोड किया जाएगा ।
        2. परिभाषित पूर्व उपचार अगर spheroids एक या एक से अधिक परीक्षण यौगिकों और नियंत्रण समूह के साथ इलाज किया गया । परख मीडिया को परिभाषित करने के लिए स्रोत, पूरक शामिल हैं, और अंय जानकारी ।
        3. घनत्व और गद्यांश संख्या की जानकारी देखकर एक या अधिक कक्ष प्रकार (उदा. Patu8902, PS1) को परिभाषित करें ।
      3. Click & #34; उत्पन्न समूहको & #34;.
      4. Click & #34;P स्वर्गीय नकाशा & #34; टैब और परख प्लेट के लिए समूह असाइन प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए इसी ।
      5. पृष्ठभूमि कुओं के रूप में चार कोने कुओं का चयन करें । सुनिश्चित करें कि इन कुओं में कोई spheroids नहीं हैं.
  4. विश्लेषक
      पर चलाएं परख उपकरण प्रोटोकॉल टैब पर क्लिक करें । चेक करके डिफ़ॉल्ट प्रोटोकॉल आदेश रखें & #34; नपे & #34;, & #34;
    1. & #34; र & #34; बेसलाइन मापन चक्र & #34;. Equilibrate
    2. Click & #34; इंजेक्शन & #34; और प्रत्येक पोर्ट के लिए यौगिक निर्धारित करें । spheroids के लिए डिफ़ॉल्ट 3 चक्र से 6 चक्र के लिए माप चक्र को संपादित करें । डिफ़ॉल्ट 3 मिनट मिश्रण, 0 मिनट रुको, और 3 मिनट के उपाय समय रखो ।
      नोट: डिफ़ॉल्ट मिश्रण-रुको-माप बार 3 मिनट, 0 मिनट, 3 मिनट, क्रमशः कर रहे हैं । तीन बेसल दर माप आम तौर पर पहले परख यौगिक के इंजेक्शन से पहले ले रहे हैं । इन मापनों को प्रायोगिक डिजाइन के अनुसार नपे और पुनः समायोजन किया जा सकता है.
    3. समीक्षा प्रोटोकॉल और समूह सारांश.
    4. सहेजें परख डिजाइन टेंपलेट ।
    5. पूर्व परख अंशांकन के लिए आगे बढ़ना एक बार इंजेक्शन बंदरगाहों परख सब्सट्रेट के साथ भरी हुई है । extracellular फ्लक्स विश्लेषक के लिए उपयोगिता थाली के साथ कारतूस हस्तांतरण ।
      नोट: यह आमतौर पर 15-20 मिनट के भीतर पूरा करता है और सेंसर ओसीआर और ीकार माप आचरण करने के लिए जांचता है ।
    6. कारतूस के अंशांकन के बाद, पूर्व गर्म परख 3 डी spheroids युक्त प्लेट के साथ उपयोगिता प्लेट की जगह और परख शुरू करते हैं । माप पूरा होने के बाद, डेटा का विश्लेषण करने के लिए स्प्रेडशीट या रेखांकन और सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर के लिए डेटा निर्यात करें.

Representative Results

3 डी spheroids के चुंबकीय प्रिंटिंग और extracellular फ्लक्स विश्लेषण के लिए सामान्य कार्यप्रवाह
आरेख 1 इस प्रोटोकॉल में वर्णित संपूर्ण प्रक्रिया का ओवरव्यू दर्शाया गया है । अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं (Patu8902) और सक्रिय stellate कोशिकाओं (PS1) ऊतक संस्कृति में 70-80% की एक प्रवाह के लिए उचित विकास मीडिया युक्त कुप्पी में कल्चरित थे । कोशिकाओं 2 डी संस्कृति पोत से अलग थे और धोया, सेल घनत्व निर्धारित किया गया था और कोशिकाओं को अंत में 1 × 106 कोशिकाओं पर विकास मीडिया में reसस्पैंड/ एनएस, एक nanoparticle गोल्ड, आयरन ऑक्साइड, और पाली-एल lysine से मिलकर विधानसभा आकृष्ट कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया था । व्यक्तिगत रूप से चुंबकीय Patu8902 और PS1 कोशिकाओं को फिर मिलाया गया और ९६ पर मुद्रित-अच्छी तरह से सेल से बचाने वाली क्रीम वृद्धि प्लेटें एक चुम्बकीय अंडाकार ड्राइव पर घुड़सवार. हम १५,००० को अनुकूलित किया है एक अच्छी तरह से बोने के लिए कक्षों की कुल संख्या (५,००० Patu8902 कोशिकाओं १०,००० PS1 कोशिकाओं के साथ मिश्रित एक एकल अंडाकार उत्पंन करने के लिए) । 5-7 दिनों के लिए उपयुक्त ऊतक संस्कृति की स्थिति के तहत गर्मी के बाद, 3 आयामी spheroids प्राप्त किया गया, जो समय के दौरान इन spheroids की वृद्धि पर नजर रखी और दर्ज की गई । परख मीडिया के साथ धोने के बाद, spheroids शारीरिक रूप से एक अंडाकार microplate पर स्थानांतरित करने के लिए बाहर चयापचय परख glycogen और mitochondrial श्वसन के एक साथ माप के लिए एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर रहे थे ।

संस्कृति और अग्नाशय के ट्यूमर के विकास-fibroblast spheroids
कार्यात्मक और मजबूत spheroids प्राप्त करने के लिए, उपकला कैंसर सेल लाइन Patu8902 और सक्रिय stellate कोशिकाओं PS1 RPMI में कल्चरित थे-१६४० भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक । Pat8902 और PS1 एन एस के साथ चुंबकीय कोशिकाओं को 1:2 के अनुपात में फिर एक साथ मिलाया गया, ताकि एक विकास की थाली में प्रति अच्छी तरह से १५,००० कोशिकाओं की कुल बीज के लिए । चुंबकीय ड्राइव पर कोशिकाओं मुद्रण के 24 घंटे के भीतर, कोशिकाओं को एक अच्छी तरह के तहत प्रत्येक चुंबकीय पिन के शीर्ष पर अच्छी तरह से बिल्कुल के केंद्र को फोकल । Patu8902-PS1 spheroids की वृद्धि इमेजिंग द्वारा दिनों के 2, 4, 7 और 9 पर कोशिकाओं को बोने के बाद निगरानी की गई । चित्रा 2 के ऊपर विभिन्न समय अंक पर प्रतिनिधि spheroids के औसत व्यास के ठहराव से पता चलता है. spheroids के व्यास ४१४ µm से दिन 2 पर ५९६ µm दिन 7 पोस्ट प्रिंटिंग से बढ़ जाती है । 7 और 9 दिनों में वृद्धि के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, और इस प्रकार सभी आगे प्रयोग अंडाकार विकास के 7 दिनों तक ही सीमित था । हमने देखा है कि spheroids विशेष रूप से बाहरी किनारों के आसपास एक तेज आकृति विज्ञान के अधिग्रहण और एन एस सी उत्तरोत्तर अधिक समान रूप से संस्कृति में अधिक दिनों के साथ अंडाकार की मात्रा भर में फैलाना है । हम भी अपने प्रमुख और छोटे अक्षों की लंबाई के आधार पर 10 spheroids के sphericity का अनुमान है । औसत sphericity Patu8902 अकेले (ट्यूमर) के लिए ०.९२ ± ०.०४, PS1 (stromal) अकेले और सह संस्कृति spheroids के लिए ०.९४ ± ०.०२ के लिए ०.९५ ± ०.०४ है ।

अग्नाशय 3 डी spheroids का उपयोग कर के कार्यात्मक चयापचय परख extracellular फ्लक्स विश्लेषक
spheroids की कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए, हम चयापचय और spheroids में ऊर्जा रास्ते जांच करने के लिए ऊर्जावान विश्लेषण कार्यरत हैं । हम ऊपर वर्णित के रूप में spheroids संस्कृति पर एक glycogen तनाव परीक्षण किया । यह अंत करने के लिए, spheroids दो कोशिका प्रकार की एक सह संस्कृति से उत्पंन उन के अलावा या तो Patu8902 या PS1 कोशिकाओं से उत्पंन परख के अधीन थे । दिलचस्प है, spheroids के सभी तीन प्रकार, कि अलग या मिश्रित कोशिकाओं से उत्पंन, जीएसटी परख के लिए एक जैविक कार्यात्मक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया । ग्लूकोज की एक संतृप्त एकाग्रता इंजेक्शन पर, spheroids प्रकार का परीक्षण किया glycolytic मार्ग में शो बढ़ जाती है के रूप में ीकार में वृद्धि (चित्रा 3) द्वारा सबूत. जब, mitochondrial एटीपी उत्पादन oligomycin का उपयोग कर हिचक रहा था, ऊर्जा उत्पादन glycogen करने के लिए पाली और अधिक से अधिक glycolytic क्षमता के लिए कोशिकाओं को धकेल दिया, ीकार में और अधिक वृद्धि के रूप में देखा. glycogen के निषेध 2 का उपयोग-डीजी, एक ग्लूकोज अनुरूप है कि प्रतिस्पर्धात्मक रूप से ग्लूकोज hexokinase बांध, ीकार में कमी के परिणामस्वरूप, पुष्टि है कि ीकार में पूर्व वृद्धि glycolytic गतिविधि के कारण था । हमने देखा है कि इस अध्ययन में परीक्षण spheroids इस फैशन में जवाब दिया, हालांकि PS1 अकेले spheroids (औसत व्यास २५० µm) एक अपेक्षाकृत कम संकेत था, संभवतः उनके छोटे आकार और कम glycolytic Patu8902 कैंसर की तुलना में क्षमता के कारण कोशिकाओं (औसत व्यास ६०० µm) । सामांय में, ट्यूमर सेल से एक उच्च ीकार संकेत अपेक्षाकृत छोटे PS1 fibroblast व्युत्पंन spheroids से उन लोगों की तुलना में spheroids व्युत्पंन, संभवतः कैंसर ' कोशिकाओं glycogen22की ओर निहित चयापचय झुकाव के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, 23. spheroids के सभी तीन प्रकार के कक्षों की एक ही नंबर सीडिंग से व्युत्पंन थे, हालांकि हम प्रत्येक प्रकार के बीच अंडाकार आकार भिन्नता देखा, PS1 अकेले spheroids के साथ सबसे छोटी जा रहा है, सह संस्कृति spheroids द्वारा पीछा किया, और अकेले Patu8902 spheroids जा रहा है सबसे.

3 डी spheroids में mitochondrial समारोह का परीक्षण करने के लिए, हम एक MST परख के लिए सह संस्कृति spheroids अधीन । MST सीधे कोशिकाओं के ओसीआर को मापने के द्वारा mitochondrial समारोह के प्रमुख मापदंडों का उपाय (चित्रा 4और 4B). यौगिकों के साथ एक सीरियल इंजेक्शन (oligomycin, FCCP, और रोटेनोन और antimycin ए का मिश्रण) जैसे, एटीपी उत्पादन, अधिक से अधिक श्वसन, और गैर mitochondrial श्वसन के रूप में प्रमुख mitochondrial मापदंडों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इन मापदंडों और बेसल श्वसन दर आगे प्रोटॉन रिसाव और अतिरिक्त श्वसन क्षमता (चित्र 4c) की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया । oligomycin के जवाब में ओसीआर में कमी, एटीपी सिंथेस (जटिल वी) के एक अवरोधक सेलुलर एटीपी उत्पादन के साथ जुड़े mitochondrial श्वसन को संबद्ध । Spheroids oligomycin के साथ एक लंबी अवधि के लिए अधिक से अधिक प्रवेश और कुशल प्रतिक्रिया समय की अनुमति के लिए मशीन थे । युग्मक FCCP के साथ एक दूसरे इंजेक्शन अधिक ऑक्सीजन की खपत और ओसीआर में एक इसी वृद्धि को उत्तेजित करता है । FCCP-उत्तेजित ओसीआर के लिए स्पेयर श्वसन क्षमता, कोशिका की क्षमता का एक उपाय करने के लिए वृद्धि की ऊर्जा की मांग का जवाब की गणना किया गया था । तीसरा इंजेक्शन; रोटेनोन का एक मिश्रण है, (एक जटिल मैं अवरोध करनेवाला), और antimycin एक (एक जटिल III अवरोध करनेवाला) ब्लॉक mitochondrial श्वसन, ओसीआर में एक तेज कमी के रूप में देखा (चित्रा 4बीांग >).

कुल मिलाकर, हमारी टिप्पणियों को अपने चयापचय पदचिह्न का एक उपाय के रूप में एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर spheroids की कार्यक्षमता की पुष्टि/दोनों के रूप में ऊपर वर्णित glycolytic और mitochondrial क्षमता के संदर्भ में ।

Figure 1
चित्र 1 . संस्कृति और अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं की परख के लिए क्रियाविधि विज्ञान के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व/fibroblast spheroids । Patu8902 और PS1cells कल्चर्ड थे, trypsinized, धुल और गिने जाते थे । प्रत्येक अंडाकार बोने के लिए, Patu8902 (५,००० कक्ष/अच्छी तरह से) और PS1 fibroblasts (१०,००० कक्ष/NS का उपयोग कर चुंबकीय थे और 1 दिन पर एक सेल से बचाने वाली क्रीम की वृद्धि प्लेट पर मुद्रित । बोने के बाद, विकास की थाली एक चुंबकीय अंडाकार ड्राइव (९६ अच्छी तरह से प्रारूप विकास की थाली के प्रत्येक कुआं के नीचे एक चुंबक के साथ) पर मुहिम शुरू की और 2-7 दिनों के लिए संस्कृति की अनुमति के लिए 3 डी spheroids प्राप्त किया गया । परिणामस्वरूप spheroids धोया और अंडाकार परख microplates को स्थानांतरित करने के लिए बाहर extracellular फ्लक्स साधन पर चयापचय परख ले रहे थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . अग्नाशय के ट्यूमर के विकास-fibroblast spheroids. (एक) संस्कृति में दिन के लिए इसी Patu8902-PS1 सह संस्कृति अंडाकार की एक प्रतिनिधि छवि शीर्ष पर दिखाया गया है और अंडाकार (µm) के व्यास में आकार नीचे मात्रा है । अंडाकार आकार और एनएस कणों के प्रसार में प्रगतिशील वृद्धि (डार्क डॉट्स) इसकी मात्रा में 2 और 7 दिनों के बीच स्पष्ट है । Spheroids संस्कृति में एक अतिरिक्त 2 दिनों के लिए रखा गया था इस के बाद, जो अंडाकार व्यास में एक महत्वपूर्ण वृद्धि में परिणाम नहीं था । (ख) ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पन्न spheroids के प्रतिनिधि चित्रों (Patu8902), स्ट्रोमा कोशिकाओं (ps1) और सह-कल्चर्ड कोशिकाओं (Patu8902 + ps1) दिखाया गया है. (ग) प्रत्येक समूह से १० वैयक्तिक spheroids से Sphericity डेटा दर्शाया गया है. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . अग्नाशय spheroids के साथ glycogen तनाव परीक्षण (जीएसटी) । (एक) विभिंन परख पैरामीटर के साथ एक ठेठ glycolytic समारोह परख के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रण । (ख) अग्नाशय spheroids वर्णित पद्धति का उपयोग करते हुए कल्चरल पर किए गए एक जीएसटी परीक्षण का एक उदाहरण है । ग्लूकोज इंजेक्शन ीकार में वृद्धि के रूप में देखा glycogen ऊपर रैंप, oligomycin के अलावा पर आगे बढ़ाने के लिए बंद mitochondrial श्वसन के साथ. ीकार 2-डीजी, ग्लूकोज के प्रतिस्पर्धी अनुरूप, glycogen अवरुद्ध द्वारा के जवाब में गिर जाता है । सभी spheroids जीएसटी परख के लिए एक कार्यात्मक प्रतिक्रिया प्रदर्शित करने के लिए उल्लेख कर रहे हैं । (ग) जीएसटी की रिपोर्ट जनरेटर का उपयोग करते हुए जीएसटी परख के एक उत्पादन के तीन प्रमुख मापदंडों का चित्रण है । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि माध्य (SEM) का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4। Mitochondrial तनाव परीक्षण (MST) Patu8902-PS1 spheroids के साथ । (एक) विभिंन परख मापदंडों के साथ एक ठेठ mitochondrial समारोह परख के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दर्शाया गया है । (ख) अग्नाशय के ट्यूमर पर एक MST का एक उदाहरण-fibroblast spheroids दिखाया गया है । (ग) सह संस्कृति 3 डी spheroids MST परख के लिए एक कार्यात्मक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन । उंमीद के रूप में, mitochondrial ओसीआर में गिरावट के रूप में मापा समारोह देखा जब spheroids oligomycin, एक एटीपी सिंथेस अवरोधक के साथ चुनौती दी गई थी । FCCP का प्रयोग इलेक्ट्रॉन प्रवाह रैंप के लिए अधिक से अधिक ओसीआर, जो तुरंत mitochondrial श्वसन के निषेध पर ढह mitochondrial परिसर अवरोधकों के कॉकटेल का उपयोग कर के परिणामस्वरूप । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि माध्य (SEM) का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

अग्नाशय के कैंसर का प्रयोग, 3rd संयुक्त राज्य अमेरिका में कैंसर से संबंधित मौतों के प्रमुख कारण24, एक उदाहरण और मॉडल के रूप में, एक तेजी से और लगातार विधि विकसित और परख 3 डी spheroids का उपयोग सह-संस्कृति अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं और आपन अग्नाशय fibroblasts. चुंबकीय प्रिंटिंग का प्रयोग, व्यास में 400-600 µm से आकार में लेकर spheroids प्राप्त किए गए. इन करने के लिए चयापचय परख के अधीन थे सफलतापूर्वक संस्कृतिपूर्ण 3d spheroids की कार्यक्षमता का परीक्षण । इस विधि सरल, सुसंगत है और आसानी से अंय प्रकार के सेल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

हालांकि इस पद्धति में तेजी लाने और 3d spheroids के साथ प्रदर्शन किया परख के शोधों के मूल्य में जोड़ने के लिए, यह तकनीक है कि अंडाकार हेरफेर और हैंडलिंग के मल्टीप्लेक्स की अनुमति विकसित करने से सुधार किया जा सकता है । यह आगे समग्र समय कम करना चाहिए, लागत और श्रम को परख बाहर ले जाने की आवश्यकता है । साथ ही, अंडाकार वॉल्यूम के रूप में दूसरों द्वारा रिपोर्ट की गई ओसीआर संकेतों को सामान्य करने के लिए उपयोग किया जा सकता6। अंडाकार एक सेल के औसत मात्रा से सामान्यीकृत मात्रा सेल प्रति ओसीआर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन spheroids के विकास के बाद से समान नहीं होगा, सेल प्रति एक निरपेक्ष ओसीआर की गणना चुनौतीपूर्ण हो सकता है. वर्तमान में, यह पद्धति मल्टीप्लेक्स अंडाकार हैंडलिंग और विकास प्लेटों से परख पर्यावरण के हस्तांतरण के लिए एक कुशल उपकरण की कमी से सीमित है ।

वर्णित विधि को संशोधित किया है और चुंबकीय प्रिंटिंग प्रौद्योगिकी से अनुकूलित है, और आगे एक बहाव चयापचय परख के लिए प्रसंस्कृत spheroids लागू करने से कार्यात्मक प्रासंगिकता दिखाने के लिए मांय है । विधि एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है मजबूत, व्यवहार्य और कार्यात्मक spheroids है कि दो प्रमुख कोशिका प्रकार शामिल सबसे ट्यूमर के ऊतकों, कैंसर की कोशिकाओं और कैंसर से जुड़े fibroblasts, जो अंय जांच परख के लिए नियोजित किया जा सकता है में पाया जाता है, जैसे ड्रग स्क्रीन । एन एस पद्धति की सापेक्ष सुगमता और दक्षता अन्य तरीकों25पर एक बड़ा सुधार है, जैसे फांसी छोड़ विधि2,अंडाकार पीढ़ी के26 .

मजबूत spheroids के रूप में इस तरह के एक इन विट्रो ट्यूमर मॉडल है कि stromal कोशिकाओं है, जो अक्सर कई 3d संस्कृति अध्ययन से लापता है शामिल प्रदान के रूप में उत्पंन । इस तरह के रूप में उत्पंन 3 डी अंडाकार मॉडल के आवेदन के लिए संभावनाएं विशाल हैं । उदाहरण के लिए, इस तरह के मॉडल सेल सेल बातचीत की जांच करने के लिए कार्यरत किया जा सकता है, बदलाव और आनुवंशिक संवेदनशीलता और विभिंन चिकित्सीय आहारों की निर्भरता का परीक्षण करने के लिए ऊर्जावान । 3d spheroids कि दोहराऊंगा vivo में ट्यूमर microenvironment दवा स्क्रीनिंग के अध्ययन के लिए अत्यधिक प्रासंगिक और उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा और वर्तमान और उपंयास चिकित्सकीय की कार्रवाई के तंत्र की जांच उन । चयापचय परख उत्परिवर्ती कोशिकाओं के साथ spheroids संस्कृतियों का उपयोग कर ऊर्जा रास्ते की जांच में मदद कर सकता है उन जीनों और कैंसर के एक प्रासंगिक 3d मॉडल में pathobiology में संबंधित रास्ते की भूमिका में नई रोशनी शेड, इस अध्ययन में वर्णित spheroids की तरह ।

इस विधि के सफल आवेदन चुंबकीय मुद्रण के लिए आवश्यक कोशिकाओं के स्वास्थ्य पर सबसे ऊपर निर्भर करता है, यही वजह है कि लघुगणक चरण में बढ़ रही कोशिका काटा और चुंबकीय किया जाना चाहिए । यह चुंबकीय अंडाकार ड्राइव का उपयोग करने के लिए चुम्बकीय कोशिकाओं और नहीं होल्डिंग ड्राइव, जो केवल अंडाकार धुलाई और मीडिया वर्णित विधि के चरणों की भरपाई के दौरान उपयोग किया जाना चाहिए मुद्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । चयापचय परख के सफल readout के लिए अंय सबसे महत्वपूर्ण पहलू को विकास की थाली से परख थाली से स्थानांतरण प्रक्रिया के दौरान spheroids की आकृति विज्ञान बनाए रखने के लिए है ।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल 3 डी spheroids की पीढ़ी के लिए स्थापित किया गया है कि दोनों कैंसर और stromal कोशिकाओं, extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग spheroids के बाद चयापचय परख निंनलिखित होते हैं । इस विधि की मुख्य विशेषताएं है कि यह जल्दी है, आसानी से अनुकूलनीय और सुसंगत, प्रासंगिक और नकल करता है vivo ट्यूमर microenvironment में , अपेक्षाकृत सस्ती है और ट्यूमर जीव विज्ञान और विकासशील विरोधी अध्ययन के लिए एक नए उपकरण के रूप में सेवा कर सकते है एजेंटों.

Disclosures

लेखक जॉर्ज व. रोजर्स और एंड्रयू Neilson टेक्नोलॉजीज प्रौद्योगिकियों के कर्मचारी/शेयरधारकों और इस लेख में इस्तेमाल किया उपकरणों का उत्पादन कर रहे हैं । अंय सभी लेखकों की घोषणा की है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम संस्कृति की स्थिति और निगरानी अंडाकार विकास के अनुकूलन में सहायता के लिए शमूएल Zirbel शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम SeaHorse XFe९६ विश्लेषक, परख रिएजेंट और तकनीकी अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए टेक्नोलॉजीज प्रौद्योगिकियों के लिए आभारी हैं । हम यूनाइटेड किंगडम में barts कैंसर संस्थान में डॉ हेमंत कोच PS1 कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए भी धंयवाद । इस काम के हिस्से में अग्नाशय के कैंसर अनुसंधान के लिए Seena Magowitz फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था और एक खड़े कैंसर के लिए-कैंसर अनुसंधान ब्रिटेन-Lustgarten फाउंडेशन अग्नाशय के कैंसर ड्रीम टीम रिसर्च ग्रांट (अनुदान संख्या: SU2C-AACR-DT-20-16) । कैंसर के लिए खड़े हो जाओ मनोरंजन उद्योग फाउंडेशन का एक कार्यक्रम है । अनुसंधान अनुदान कैंसर अनुसंधान, SU2C के वैज्ञानिक भागीदार के लिए अमेरिकन एसोसिएशन द्वारा प्रशासित रहे हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA Sigma 25300-054
96 well cell repellant plate USA Scientific/ Griener Bio-One 655970 spheroid growth plate
Cellometry Cell counting slides Nexcelom  CHT4-SD100-002
D-Glucose Sigma D9434
DPBS Gibco 14190-144
Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103020-100
L-Glutamine Sigma 59202C
Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103015-100
n3D Magnetic Spheroid drive Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D Magnetic Spheroid holding drive Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit
n3D NanoShuttle-PL  Nano3D Bioscience 655841 Part of Spheroid Bioprinting Kit:  store at 4 °C
Patu8902 cells Laboratory Stock pancreatic ductal adenocarcinoma cells
PS1 cells Laboratory Stock activated pancreatic stellate cells
RPMI1640 Gibco 11875-093 growth media for cells, spheroids
SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer Agilent Technologies extracellular flux analyzer
Sodium Pyruvate Sigma S8636
XF Base media Agilent Technologies 102365-100 base media for metabolic assays on XFe96

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १२६ अग्नाशय के कैंसर 3 आयामी spheroids सह संस्कृति extracellular फ्लक्स ऊर्जा mitochondrial तनाव
तैयारी और 3 के चयापचय परख-आयामी अंडाकार अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं और Fibroblasts की सह संस्कृतियों
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Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. … More

Noel, P., Muñoz, R., Rogers, G. W., Neilson, A., Von Hoff, D. D., Han, H. Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts. J. Vis. Exp. (126), e56081, doi:10.3791/56081 (2017).

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