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Developmental Biology

महाधमनी अंगूठी सह संस्कृति परख: एक सुविधाजनक उपकरण में Mesenchymal Stromal कोशिकाओं की Angiogenic क्षमता का आकलन करने के लिए इन विट्रो

Published: September 18, 2017 doi: 10.3791/56083
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4,5
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

Summary

यहां, हम महाधमनी अंगूठी परख के एक उपंयास आवेदन वर्तमान जहां mesenchymal कोशिकाओं के साथ सह रहे है-महाधमनी endothelial नेटवर्क व्युत्पंन चूहे के साथ संस्कृति । इस उपंयास विधि Mesenchymal Stromal कोशिकाओं (MSCs) डाक और endothelial नेटवर्क, नेटवर्क संपत्तियों के ठहराव के साथ एकीकरण के दृश्य की अनुमति देता है, और एमएससी immunophenotypes और जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन ।

Abstract

Angiogenesis एक जटिल, अत्यधिक विनियमित प्रक्रिया प्रदान करने और पर्याप्त ऊतक छिड़काव को बनाए रखने के लिए जिंमेदार है । अपर्याप्त vasculature रखरखाव और रोग विकृतियों गंभीर कोरोनरी रोगों में परिणाम कर सकते हैं, जबकि पीढ़ी प्रचुर नाड़ी विकास कैंसर और भड़काऊ विकारों के साथ जुड़ा हुआ है । प्रो angiogenic थेरेपी के एक होनहार फार्म angiogenic सेल सूत्रों का उपयोग है, जो विनियामक कारकों के साथ ही नव विकासशील vasculature के लिए भौतिक समर्थन प्रदान कर सकते हैं ।

Mesenchymal Stromal कोशिकाओं (MSCs) बड़े पैमाने पर अपने paracrine प्रभाव और पता लगाने और कोरोनरी या सूजन के ऊतकों को घर की क्षमता के कारण संवहनी उत्थान के लिए उंमीदवारों की जांच कर रहे हैं । विशेष रूप से, पहली तिमाही मानव गर्भनाल perivascular कोशिकाओं (FTM HUCPVCs) अपने pericyte की तरह गुण, उच्च प्रफलन और multilineage क्षमता, प्रतिरक्षा-विशेषाधिकार प्राप्त गुणों के कारण एक उच्च होनहार उम्मीदवार हैं, और मजबूत paracrine प्रोफ़ाइल. प्रभावी रूप से संभावित angiogenic अपक्षयी कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए, यह एक उन्हें विश्वसनीय और "अनुवाद योग्य" पूर्व नैदानिक परख में परीक्षण करने के लिए अपेक्षित है. महाधमनी अंगूठी परख ट्यूबलर endothelial संरचनाओं के आसान ठहराव के लिए अनुमति देता है कि एक पूर्व vivo angiogenesis मॉडल है, मेजबान से गौण सहायक कोशिकाओं और extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रदान करता है, भड़काऊ घटकों शामिल नहीं है, और तेजी से और सस्ती स्थापित करने के लिए । यह लाभप्रद है जब vivo में मॉडल (जैसे, corneal परख, Matrigel प्लग परख) की तुलना में; महाधमनी अंगूठी परख प्रशासित कोशिकाओं को ट्रैक कर सकते है और सेलुलर बातचीत का पालन करते हुए एक्सो से परहेज-प्रतिरक्षा अस्वीकृति ।

हम महाधमनी अंगूठी परख, जो चूहे महाधमनी endothelial नेटवर्क के विकास के साथ सह संस्कृतियों में मानव MSCs शामिल है के एक उपंयास आवेदन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं । यह परख pericyte के माध्यम से ट्यूब गठन और विकास के लिए एमएससी योगदान के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है-बातचीत और उनकी शक्ति की तरह सक्रिय रूप से angiogenesis की साइटों के लिए पलायन के लिए, और उनके प्रदर्शन और मध्यस्थता करने की क्षमता के मूल्यांकन के लिए ECM प्रोसेसिंग. यह प्रोटोकॉल एमएससी phenotype और जीन अभिव्यक्ति निंनलिखित सह संस्कृति में परिवर्तन पर अधिक जानकारी प्रदान करता है ।

Introduction

angiogenesis की जटिल प्रक्रिया में सुधार और पूर्व मौजूदा vasculature1से नए रक्त वाहिका विकास को बढ़ावा देने के द्वारा ऊतक छिड़काव बनाए रखता है । यह समर्थक angiogenic और विरोधी angiogenic कारकों द्वारा एक कसकर विनियमित, संतुलित प्रक्रिया है । इस प्रणाली में कोई कमी अपर्याप्त पोत रखरखाव या वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, रोधगलन रोग, स्ट्रोक, और neurodegenerative विकारों सहित गंभीर कोरोनरी रोगों के कारण. हालांकि, अतिरंजित संवहनी विकास की स्थिति के लिए विशेषता है सहित कैंसर और भड़काऊ विकारों2.

उपचार है कि angiogenesis नियंत्रण के लिए अनुकूल ऊतक पुनर्जनन प्राप्त करने के उद्देश्य महत्वपूर्ण महत्व का है विकासशील । व्यापक नैदानिक और नैदानिक जांच के बावजूद, समर्थक angiogenic कारकों और microRNAs का उपयोग कर angiogenesis को उत्तेजित करने के लिए वांछित परिणाम3,4,5प्राप्त करने में विफल रहे हैं । क्षणिक प्रभाव के लिए संभावित कारणों में शामिल हैं: angiogenic प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की सीमित दीर्घायु, और लक्षित विकास कारकों की परिमित संख्या6,7. हालांकि घुलनशील angiogenic कारकों angiogenesis की शुरुआत के लिए आवश्यक हैं, रखरखाव और vasculature की कार्यक्षमता pericytes और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं8सहित सेल प्रकार के समर्थन पर निर्भर करते हैं । प्रो angiogenic चिकित्सा के क्षेत्र में अब संभावित स्टेम सेल और जनक सेल सूत्रों है कि angiogenic कारकों स्थानीय रूप से प्रदान कर सकते है तलाश है, जबकि शारीरिक रूप से नए विकसित vasculature, आत्म नवीकरण या यहां तक कि में अंतर का समर्थन endothelial-की तरह कोशिकाओं9,10। इन कार्यात्मक आवश्यकताओं को पूरा करने की क्षमता के साथ इष्टतम angiogenic सेल प्रकार ढूँढना कोरोनरी ऊतक पुनर्जनन के लिए एक महान वादा रखती है ।

आदेश में सफलतापूर्वक नैदानिक परीक्षणों में संभावित कोशिका आधारित उपचारों का अनुवाद करने के लिए, पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए अपने प्रभावकारिता प्रदर्शन और अंतर्निहित angiogenic तंत्र पर प्रकाश डाला की जरूरत है । स्थापित angiogenesis परख की उच्च संख्या के बावजूद, क्षेत्र का अभाव इन विट्रो परख कि मज़बूती से संभावित उंमीदवार सेल प्रकार11,12की प्रभावकारिता का मूल्यांकन सकता है में एक "सोने की मानक", 13. इन विट्रो angiogenesis परख (endothelial प्रसार, प्रवास और ट्यूब गठन की परख सहित) आम तौर पर कोशिकाओं या यौगिकों के प्रभाव का आकलन endothelial ' कोशिकाओं phenotypical परिवर्तन या में भेदभाव ट्यूबलर और नेटवर्क संरचनाएं14,15। हालांकि इन सुविधाओं angiogenesis के लिए महत्वपूर्ण हैं, एक "अनुवाद" परख भी मूल्यांकन करना चाहिए: 1) वृद्धि या pericytes या चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, 2) ECM के प्रसंस्करण और/या तहखाने झिल्ली सहित समर्थन सेल प्रकार के प्रतिस्थापन, और 3) कार्यात्मक microvasculature के गठन को बढ़ावा देने के लिए दक्षता । vivo angiogenesis मॉडल, जिसमें corneal परख और Matrigel प्लग की परख शामिल है, में vivo microenvironment में अद्वितीय दोहराऊंगा लेकिन शारीरिक बातचीत का पालन करने के लिए प्रशासित कोशिकाओं पर नज़र रखने की कठिनाई से चुनौती दी है । इसके अलावा, में vivo मॉडल, एक्सो-प्रतिरक्षा अस्वीकृति हो सकता है जबकि परीक्षण संभावित allogeneic सेल थेरेपी के उंमीदवारों16। पूर्व vivo angiogenesis मॉडल, विशेष रूप से महाधमनी अंगूठी परख प्रदान कर सकते हैं: 1) आसान अवलोकन और ट्यूबलर संरचनाओं के ठहराव, 2) गौण सहायक कोशिकाओं, 3) मेजबान और कृत्रिम आपूर्ति से ECM, 4) भड़काऊ के अपवर्जन अवयव, और 5) त्वरित और सस्ती सेटअप17,18। आमतौर पर, महाधमनी अंगूठी परख छोटे स्रावी प्रोटीन की angiogenic क्षमता का परीक्षण कर सकते हैं, औषधीय एजेंटों, और ट्रांसजेनिक कुतर मॉडल19,20,21।

MSCs अपने paracrine के माध्यम से संवहनी पुनर्जनन के लिए होनहार उंमीदवारों रहे है मुख्य रूप से मध्यस्थता प्रभाव22,23,24। MSCs प्रमुख angiogenic कारकों को स्रावित करने के लिए दिखाया गया है संवहनी Endothelial वृद्धि कारक सहित (वीईजीएफ़), Hepatocyte वृद्धि कारक (एचजीएफ), इंसुलिन जैसे विकास कारक-1 (IGF-1), बुनियादी Fibroblast वृद्धि कारक (bFGF), और angiopoeitin-1 (आंग-1)25 ,26. MSCs भी पता लगाने और कोरोनरी या सूजन ऊतकों को घर कर सकते हैं, हालांकि, सटीक तंत्र अभी भी जांच के तहत कर रहे हैं । तेजी से, साहित्य परिकल्पना का समर्थन करता है कि अधिकांश MSCs perivascular कोशिकाओं, सह-एक्सप्रेस pericyte मार्कर से उत्पन्न होते हैं, और pericytes27की तरह व्यवहार कर सकते हैं । HUCPVCs मानव गर्भनाल के perivascular क्षेत्र से व्युत्पंन MSCs के एक युवा स्रोत हैं । वे pericyte की तरह गुणों के साथ MSCs की आबादी का प्रतिनिधित्व करते है और दोनों FTM और अवधि गर्भनाल से विशेषता है । FTM HUCPVCs CD146 और NG2, उच्च प्रफलन और multilineage क्षमता, प्रतिरक्षा-विशेषाधिकार प्राप्त गुणों सहित pericyte मार्करों की एक उच्च अभिव्यक्ति का प्रदर्शन, और एक मजबूत paracrine प्रोफ़ाइल28प्रदर्शित करते हैं । FTM HUCPVCs एक आदर्श उंमीदवार सेल प्रकार के नए vasculature के संवर्धन के माध्यम से घायल ऊतक के उत्थान को बढ़ावा देने के लिए अपने pericyte तरह गुण हैं ।

angiogenic क्षमता और मानव MSCs, angiogenesis परख की एक बहुत ही सीमित संख्या के गुण की तरह परीक्षण उपलब्ध है जहां सकारात्मक angiotropic प्रवास (इसके बाद "डाक" के रूप में संदर्भित), ECM प्रसंस्करण, और शारीरिक के विकास microvasculature विकास पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करते समय कक्ष प्रकारों के बीच इंटरैक्शन की जांच की जा सकती है.

इसके द्वारा हम एक प्रोटोकॉल है कि महाधमनी अंगूठी परख के एक उपंयास आवेदन का वर्णन प्रस्तुत करते हैं । मानव MSCs चूहे के विकास के साथ सह-प्रसंस्कृत थे-व्युत्पंन महाधमनी endothelial नेटवर्क ट्यूब गठन, परिपक्वता के लिए उनके योगदान का आकलन करने के लिए, और homeostasis । महाधमनी अंगूठी परख के इस संस्करण की क्षमता और सेल थेरेपी के उंमीदवारों की शक्ति का आकलन करने के लिए घर angiogenesis की साइटों, प्रदर्शन और मध्यस्थता ECM प्रसंस्करण, और endothelial ट्यूबलर विकास के लिए योगदान की स्थापना के माध्यम से pericyte-भौतिक की तरह बातचीत. इन विट्रो endothelial नेटवर्क गठन और देख सेलुलर बातचीत में पर MSCs के शुद्ध प्रभाव को बढ़ाता है के अलावा, हम भी सह संस्कृतियों से MSCs को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित । प्रवाह cytometry और qPCR प्रदर्शन करके, यह एमएससी phenotype में परिवर्तन की विशेषता संभव है और सह संस्कृति के बाद जीन अभिव्यक्ति । मॉडल सेल प्रकार के रूप में, हम ontogenetically की तुलना में जल्दी (जंम के पूर्व) और स्वर्गीय (वयस्क) मानव MSCs के सूत्रों: FTM HUCPVCs और मानव अस्थि मज्जा-MSCs (BMSC), क्रमशः महाधमनी अंगूठी परख में व्युत्पंन । हम प्रस्ताव है कि महाधमनी अंगूठी परख के लिए किसी भी शारीरिक रूप से समर्थन सेल प्रकार की angiogenic क्षमता का अध्ययन किया जा सकता है जब angiogenic अपक्षयी अनुप्रयोगों के लिए जांच के तहत ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > पशुओं से जुड़े सभी अध्ययनों का आयोजन किया गया और आने वाले दिशानिर्देशों के अनुसार रिपोर्ट की गई < सुप क्लास = "xref" > 29 . सभी अध्ययनों संस्थागत अनुसंधान नैतिकता बोर्ड अनुमोदन (REB संख्या ४२७६) के साथ प्रदर्शन किया गया । सभी पशु प्रक्रियाओं विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क (टोरंटो, कनाडा) के पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है, और सभी जानवरों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं , 8 वें संस्करण के उपयोग के लिए गाइड के अनुपालन में मानवीय देखभाल प्राप्त ( राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान २०११).

< p class = "jove_title" > 1. महाधमनी अंगूठी परख सेटअप

  1. को अलग कर चूहे महाधमनी ।
    1. Euthanize 8-10-सप्ताह पुराने Sprague-Dawley सह 2 asphyxiation का उपयोग चूहों: सेट सह 2 मंडलों को 20% गैस प्रतिस्थापन (प्रवाह दर = ०.२ x चैंबर मात्रा/ टटोलने सीने से चुटकी पलटा और दिल की धड़कन के अभाव से पुष्टि करें.
    2. गीला छाती क्षेत्र पर फर ७०% इथेनॉल के साथ निष्फल धुंध का उपयोग कर । छाती midline में एक चीरा बनाने और त्वचा और मांसपेशियों की परतों के माध्यम से कटौती करने के लिए निष्फल संदंश और कैंची का प्रयोग करें ।
    3. एक बार रिब पिंजरे उजागर है, हर तरफ रिब पिंजरे में कटौती और हर तरफ उरोस्थि से 5 मिमी के बारे में गुना ऊपर । कुछ रक्तस्राव ताजा cadavers में पसलियों के बीच धमनियों से उंमीद की जाती है ।
    4. महाधमनी बेनकाब करने के लिए संरचनात्मक दाईं ओर फेफड़े के ऊतकों और दिल धक्का । महाधमनी स्पाइनल कॉलम के अगल-बगल स्थित सफेद रंग का पोत है ।
    5. (महाधमनी आर्क के बाद) महाधमनी चुटकी के लिए संदंश का उपयोग करें और महाधमनी के साथ संदंश पकड़े हुए पहली चीरा बनाने के लिए शल्य कैंची का उपयोग करें । महाधमनी काटने पर, छाती गुहा जल्दी से रक्त के साथ भरना होगा, इसलिए यह जल्दी से काम करने के लिए रक्त जमावट से पहले महाधमनी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    6. संदंश का उपयोग करने के लिए महाधमनी पकड़ और धीरे महाधमनी नीचे की दूरी पर, रीढ़ की हड्डी कॉलम से छील । पुल आगे चीरा के बिना पसलियों के बीच धमनियों विच्छेद होगा । ऊतक के लगभग 10 सेमी प्राप्त करें और/महाधमनी से पहले उदर गुहा में दो शाखाओं में विभाजित है और लोथ से बाहर महाधमनी में कटौती । महाधमनी.
      के निचले वर्गों के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए caudal दिशा की जरूरत है, तो डायाफ्राम पुश नोट: क्योंकि तीव्र बल यह आंसू करने के लिए पैदा कर सकता है धीरे महाधमनी छील । यदि महाधमनी आँसू, कुछ सेकंड के लिए रक्त जमावट अनुमति देते हैं और एक कागज तौलिया का उपयोग करने के लिए coagulated रक्त को दूर, शेष महाधमनी की दृश्यता की अनुमति.
    7. जगह 15 मिलीलीटर ट्यूब में महाधमनी को 10 मिलीलीटर बर्फ के साथ ठंडा हांक & #39; एस संतुलित नमक समाधान (HBSS) 1% पेनिसिलिन/streptomycin (पी/एस) के साथ पूरक । बर्फ पर ट्यूबों रखें.
      नोट: महाधमनी ऊतक बर्फ पर 1-2 ज के लिए पिछले कर सकते हैं, लेकिन यह सबसे अच्छा है यह प्रक्रिया के रूप में जल्दी संभव के रूप में ।
  2. एक बाँझ सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में महाधमनी अंगूठी परख संस्कृति मीडिया तैयार करते हैं ।
    1. 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (Endothelial), 1% इबीएम और वृद्धि कारकों के साथ पूरक FBS बेसल मध्यम (gentamicin) के ५०० मिलीलीटर फ़िल्टर करने के लिए एक निस्पंदन इकाई का उपयोग करके Endothelial विकास माध्यम (ईजीएम) तैयार ( सामग्री की तालिका देखें) । एक मनका या जल स्नान में फ़िल्टर मीडिया के ५० एमएल प्लेस पर ३७ & #176; C.
    2. 2% FBS के साथ पूरक इबीएम के १०० मिलीलीटर फ़िल्टर करने के लिए एक और निस्पंदन इकाई का उपयोग करें और 1% P/S इबीएम 2% FBS (इबीएम-FBS) तैयार करने के लिए और 4 & #176 पर स्टोर; C.
  3. कोट 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति बेसल झिल्ली निकालने (BME) के साथ प्लेटें जबकि बर्फ पर काम कर रहे ।
    1. एक ठंडी सतह (बड़ी बर्फ पैक या ट्रे) पर एक 12 अच्छी तरह से थाली जगह है । Add २०० & #181; L/हौसले से गल BME का अच्छी तरह से प्रशीतित पिपेट युक्तियों का प्रयोग और भंवर BME भी कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए । BME के असमान बहुलकीकरण से बचने के लिए जल्दी से काम करें ।
      नोट: एक ठेठ महाधमनी उत्पाद की पैदावार 20 महाधमनी के छल्ले । महाधमनी अंगूठी परख के बीच परिवर्तनशीलता के लिए खाते में, सेटअप उपचार समूह के अनुसार कम से तीन महाधमनी अंगूठी परख और एक नियंत्रण शामिल हैं । यदि स्रोत परमिट, प्रति उपचार समूह 6 रिंगों की सिफारिश की है ।
    2. जगह humidified (९५% सापेक्ष आर्द्रता में लेपित प्लेटें नमी, ३७ & #176; ग, 5% कं 2 ; इन शर्तों को लागू करने के लिए सभी humidified मशीन कदम इसके बाद) के लिए 30 min. Place १,००० & #181; L पिपेट टिप्स बैक इन-20 & #176; ग फॉर स्टेप 1.5.3.
      नोट: जबकि बेसल झिल्ली निकालने स्टॉक एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है, इसकी निरंतरता और कठोरता कड़ाई से बहुलकीकरण समय द्वारा नियंत्रित है । सभी समानताएं और स्वतंत्र प्रयोगों के लिए सटीक एक ही बहुलकीकरण बार रखने के लिए सुनिश्चित करें ।
  4. धारा महाधमनी वर्दी में बजता है ।
    1. 15 मिलीलीटर ट्यूब से महाधमनी ले और यह 10 सेमी डिश में जगह ताजा HBSS के साथ पूरक 1% पी के साथ 10 मिलीलीटर/S.
    2. संदंश के दो सेट का उपयोग करने के लिए ध्यान से अतिरिक्त संयोजी ऊतक अलग, वसा ऊतक, और महाधमनी से जुड़े पसलियों के बीच धमनियों की शेष शाखाओं के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें । यह रिंग इकाइयों के बीच परिवर्तनशीलता अवशिष्ट ऊतक के भिन्न स्तरों के आधार पर कम कर देता है. महाधमनी के अंदर से कोई भी अवशिष्ट coagulated रक्त निकाल दें.
    3. 10 सेमी डिश के तहत एक शासक या ग्रिड जगह ठीक बाँझ स्केलपेल और संदंश का उपयोग कर महाधमनी के 1-2 मिमी चौड़ा वर्गों में कटौती करने के लिए । इकाइयों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए यथासंभव सटीक अनुभागों को काटें.
  5. महाधमनी रिंगों को BME में एंबेड करें ।
    नोट: यदि महाधमनी के छल्ले के अनुभाग BME बहुलकीकरण मशीन से पहले पूरा नहीं हुआ है, humidifiedी मशीन से लेपित प्लेटों को हटा दें और जोड़ें १०० & #181, इबीएम के एल प्रत्येक अच्छी तरह से बहुलकीकरण को समाप्त करने के लिए । सटीक समय BME के बहुलकीकरण के रूप में महत्वपूर्ण है endothelial नेटवर्क विकास और सेल माइग्रेशन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । एक बार महाधमनी के छल्ले तैयार कर लें, इबीएम को कुएं से निकाल दें और स्टेप 1.5.2 से जारी रखें ।
    1. humidified से BME लेपित कुओं को हटाने और बीएससी के लिए वापस ।
    2. ध्यान से संदंश के साथ व्यक्तिगत महाधमनी के छल्ले उठाओ और एक BME के बीच में एक जगह-अच्छी तरह से लेपित । शेष महाधमनी के छल्ले के लिए दोहराएं ।
      नोट: मीडिया महाधमनी अंगूठी के साथ स्थानांतरित ंयूनतम रखा जाना चाहिए ताकि बहुलकीकरण अनियमितताओं से बचने के लिए ।
    3. प्रयोग कूल्ड (-20 & #176; ग) १,००० & #181; l पिपेट टिप्स add ३०० & #181; l प्रत्येक महाधमनी रिंग के शीर्ष पर BME का और समान रूप से BME के आसपास अच्छी तरह से वितरित ।
    4. 30 min.
      5. के लिए humidified मशीन के लिए एंबेडेड महाधमनी के छल्ले वापस
    5. humidifiedी मशीन से एंबेडेड महाधमनी अंगूठी के साथ प्लेटों को हटा दें और धीरे से जोड़ें १,००० & #181; ईजीएम के एल (तैयार और कदम 1.2.1 में गरम) संस्कृति की दीवार के खिलाफ पिपेट टिप रखकर अच्छी तरह से ।
      नोट: सीधे BME पर मीडिया pipetting बहुलक BME को बाधित कर सकते है और सतत endothelial नेटवर्क के विकास में बाधा । यदि उपलब्ध हो तो किसी उपयुक्त मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें.
    6. म् 24 ज, निकाल १,००० & #181; l के ईजीएम और स्थ के साथ १,००० & #181; इबीएम के एल-FBS चरण 1.2.2 में तैयार की, फिर धीरे से pipetting द्वारा संस्कृति के पक्ष में अच्छी तरह से ।
  6. रख कर महाधमनी रिंग परख की जगह ५०० & #181; l के इबीएम-FBS के साथ ५०० & #181; l ताज़े इबीएम-FBS (३७ & #176; C) हर ४८ h.
    नोट: देखें सेकंडtion 2 को एमएससी कल्चरल विस्तार की शुरुआत उसी दिन महाधमनी रिंग परख प्रतिष्ठान के रूप में करें । यह सुनिश्चित करेगा कि MSCs सह संस्कृति के लिए तैयार हैं, जब endothelial नेटवर्क तैयार हैं ।
  7. उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए महाधमनी अंगूठी परख endothelial नेटवर्क विकास का पालन करें (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 इष्टतम नेटवर्क के विकास के लिए संदर्भ के रूप में). एक बार endothelial नेटवर्क्स पहलू के रूप में दिखाया गया है < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 , महाधमनी अंगूठी परख की स्थापना के साथ आगे बढ़ें-एमएससी सह-संस्कृतियों (धारा 3) । इमेजिंग endothelial नेटवर्क्स के अधिक विवरण के लिए चरण ४.१ का संदर्भ लें ।
< p class = "jove_title" > 2. टिशू कल्चर

  1. टिशू कल्चर मीडिया के स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करते हैं ।
    1. Culture FTM HUCPVCs (पहले से स्थापित, n & #8805; प्रत्येक के लिए 3 स्वतंत्र पंक्तियां) < सुप वर्ग = "xref" > 30 और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध BMSCs अल्फा-मेम के पूरक 10% FBS और 1% P/S.
    2. नसबंदी का उपयोग कर मीडिया ०.२ & #181; मी पोरे आकार फिल्टर बोतलों.
    3. 3 सप्ताह तक के लिए 4 & #176; C पर तैयार मीडिया समाधान की दुकान ।
  2. HUCPVC में FTM BMSC और humidified संस्कृतियों को बनाए रखने और ७० पर बीतने-८०% चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित प्रवाह. उपयोग टिशू कल्चर डिश के आकार के लिए मीडिया के उचित मात्रा में इस्तेमाल किया (एक 10 सेमी डिश में यानी 10 मिलीलीटर) । MSCs को बनाए रखने और passaging के लिए इन कल्चरल शर्तों का उपयोग करें ।
  3. अलग passaging या महाधमनी अंगूठी परख के लिए एमएससी monolayers-एमएससी सह एक पृथक्करण एंजाइम समाधान का उपयोग संस्कृतियों (4 मिलीलीटर/10 सेमी पकवान) और 3 मिनट के लिए humidifiedी मशीन में मशीन । उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कोशिकाओं की टुकड़ी सुनिश्चित करें; मशीन यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त 1-2 मिनट के लिए ।
  4. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में असंबद्ध कोशिकाओं हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
  5. महाप्राण सेल गोली परेशान बिना supernatant है और एक उपयुक्त संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर (अल्फा-मेम पूरा मीडिया passaging कोशिकाओं या इबीएम के लिए FBS-महाधमनी अंगूठी परख/एमएससी सह संस्कृतियों के लिए) एक सेल काउंटर का उपयोग कर गिनती के लिए में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
< p class = "jove_title" > 3. महाधमनी रिंग परख/MSC सह संस्कृतियों की तैयारी

  1. बीज 10 4 MSCs पर प्रत्येक एंबेडेड महाधमनी अंगूठी (९,००० कक्षों/सेमी 2 /12-well प्लेट) । महाधमनी अंगूठी परख की संख्या के आधार पर, पूर्व, व्यवहार्य, हस्तांतरणीय फ्लोरोसेंट डाई के साथ MSCs दाग । एक नियंत्रण समूह के लिए MSCs के बिना महाधमनी रिंगों के कम से कम तीन कुओं को बनाए रखें ।
    1. को दाग 10 5 MSCs/एमएल इबीएम-FBS मीडिया, add २.५ & #181; व्यवहार्य, गैर हस्तांतरणीय फ्लोरोसेंट डाई/एमएल मीडिया (5 & #181; M) में एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और humidified मशीन में 30 मिनट के लिए जगह के एल धीरे ट्यूब आधे रास्ते में मशीन के माध्यम से मिश्रण ।
    2. 30 मिनट की मशीन के बाद, ताजा इबीएम की 1 मात्रा-FBS में सना हुआ कोशिकाओं को जोड़ने और 5 मिनट के लिए ४०० x g पर स्पिन.
    3. supernatant निकालें और इबीएम-FBS मीडिया के 1 मिलीलीटर में सेल गोली पुनः निलंबित । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर MSCs के सफल दाग की पुष्टि करें.
  2. humidified मशीन से महाधमनी रिंग-युक्त प्लेटों को हटा दें और ५०० & #181 को निकाल दें; प्रत्येक कुआं से इबीएम-FBS के एल.
  3. जतन बीज 10 4 MSCs म ५०० & #181; इबीएम-FBS की हर एक एंबेडेड महाधमनी रिंग पर समान रूप से pipetting नेटवर्क के आसपास endothelial । धीरे संस्कृति थाली मिलाते हुए भी वितरण सुनिश्चित करें ।
    1. जोड़ने के अतिरिक्त इबीएम-FBS यह सुनिश्चित करने के लिए कि महाधमनी रिंग की परख पर मीडिया का कुल आयतन/MSC सह-संस्कृतियों १,००० & #181; L.
  4. का उपयोग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की कल्पना करने के लिए MSCs रिंग की परख में फ्लोरोसेंट बला महाधमनी.
< p class = "jove_title" > 4. माइक्रोस्कोपी

  1. छवि के लिए उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग चूहे endothelial नेटवर्क महाधमनी अंगूठी परख करने से पहले/endothelial नेटवर्क संपत्तियों की माप (दिन 0) मापन के लिए ( जैसे , नेटवर्क लंबाई, नेटवर्क छोरों). 4 छवि महाधमनी अंगूठी से endothelial नेटवर्क के दूर खंड के लिए है कि चक्र के भीतर प्रति अच्छी तरह से चक्रों ।
    1. छवि महाधमनी अंगूठी परख के बाद महाधमनी अंगूठी नेटवर्क/एमएससी सह-संस्कृतियों के दिनों में 3, 5 और 7 । इन छवियों का उपयोग करने के लिए endothelial नेटवर्क विकास पर एमएससी प्रभाव यों तो ।
  2. का उपयोग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी टू इमेज प्री-बला MSCs में महाधमनी रिंग परख.
    1. निंनलिखित 24 महाधमनी अंगूठी परख के एच/msc सह संस्कृतियों, डाक नेटवर्क के साथ एमएससी endothelial, बढ़ाव और एकीकरण कल्पना करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें । दोनों सेल प्रकार के colocalization का पालन करने के लिए endothelial कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के साथ MSCs के फ्लोरोसेंट छवियों ओवरलैप ।
    2. छवि MSCs विकसित endothelial नेटवर्क के भीतर स्थानीय महाधमनी अंगूठी ऊतक के समीपस्थ, और MSCs रिंग ऊतक (< मजबूत वर्ग = "महाधमनी" > चित्रा 2 xfig) के लिए बाहर नए विकासशील नेटवर्क के भीतर स्थानीयकृत ।
< p class = "jove_title" > 5. फ्लो Cytometry और qPCR

  1. एक दिन पहले ही dissociating रिंग महाधमनी नेटवर्क्स, गल जम endothelial पर 4 & #176; C O/N. धारा ५.३ दोनों प्रवाह dispase और Cytometry के लिए समरूप है । qPCR
  2. गर्म ५० मिलीलीटर की dispase और ५० मिलीलीटर की ०.५% trypsin में ३७ & #176; सी मनका या जल स्नान.
  3. महाधमनी अंगूठी परख से विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को पुनः प्राप्त/
    1. के बाद महाधमनी अंगूठी परख के 1 सप्ताह/MSC co-संस्कृति, संस्कृति मीडिया को हटाने और फॉस्फेट बफर खारा की 1 मिलीलीटर (पंजाब) धीरे से एक अच्छी तरह से 3 मिनट के लिए और हटाने के लिए जोड़ें । इस धो दो बार और अधिक दोहराएं ।
    2. Add ८०० & #181; पूर्व के एल गर्म dispase के लिए एक अच्छी तरह से और humidified में मशीन के लिए 15 min.
    3. humidified से प्लेटें हटाने और pipetting द्वारा dispase निलंबित (5-10x) को तोड़ने के BME, और एक अच्छी तरह से अलग 15 मिलीलीटर ट्यूबों में की सामग्री हस्तांतरण ।
    4. दोहराने कदम फिर से ताजा पूर्व गर्म dispase के साथ 5.3.3 जब तक कोई अवशिष्ट BME संस्कृति में अच्छी तरह से मनाया जाता है । dispase को निष्क्रिय करने के लिए dispase-सेल निलंबन के लिए 3% FBS के साथ पूरक पंजाब के 1 खंड जोड़ें । सेल में फ़्लोटिंग महाधमनी रिंग्स निकालें पिपेट युक्तियों का उपयोग कर निलंबन ।
    5. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर सेल सस्पेंशन को स्पिन करें । 15 एमएल ट्यूब में सेल सस्पेंशन के 3 एमएल छोड़ने supernatant ध्यान से निकालें ।
      नोट: एक स्पष्ट, ठोस गोली दिखाई नहीं हो सकता है, लेकिन कोशिकाओं और BME मौजूद हैं.
    6. सेल निलंबन के लिए गरम ०.५% trypsin के 3 मिलीलीटर जोड़ें और जोरदार reसस्पेंड (5-pipetting द्वारा 10x) कोशिकाओं । 10 मिनट के लिए humidified में trypsinized सेल समाधान मशीन
    7. humidified मशीन से trypsinized सेल सस्पेंशन निकालें और 3% FBS के साथ पूरक और पंजाब के 6 मिलीलीटर जोड़ने और कुछ टिम reसस्पेंडes. 5 min.
      8. के लिए ४०० x g पर सेल सस्पेंशन को स्पिन करे
    8. ध्यान से सभी supernatant को दूर, ट्यूब में सेल गोली जा रहा है और 1 मिलीलीटर पंजाबियों में कोशिकाओं को reसस्पेंड प्रत्येक ट्यूब में 3% FBS के साथ पूरक ।
    9. फ़िल्टर 1 मिलीलीटर सेल निलंबन का उपयोग कर ७० & #181; m सेल छलनी सेल निलंबन से एकत्रित कोशिकाओं और अवशिष्ट BME को दूर करने के लिए । सेल काउंटर का उपयोग करके कक्ष के 1 मिलीलीटर में कक्षों को गिनना ।
  4. कोशिकाओं को फ्लो cytometry के लिए तैयार करते हैं ।
    1. के लिए सेल सस्पेंशन (10 5 कोशिकाओं में २०० & #181; L पंजाब 3% FBS के साथ पूरक) fluorophore के साथ-संयुग्मित (FITC या APC) प्राथमिक एंटीबॉडी (तर्-1-85-, CD146, CD31) एकाग्रता = 1:40) पर 4 & #176; C 30 मिनट के लिए, प्रकाश से सुरक्षित.
      नोट: MSCs के लिए फ्लो cytometry अफ एट अल. , 2013 < सुप क्लास = "xref" > 28 द्वारा ऑप्टिमाइज़ किया गया था । १०,००० कोशिकाओं की एक ंयूनतम सटीक रीडिंग के लिए आवश्यक है ।
      2. 30 मिनट की मशीन के बाद
    2. , तीन% FBS और केंद्रापसारक (४०० x g, 5 मिनट) के साथ पूरक पंजाब के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड.
    3. पर कोशिकाओं को रखने के लिए 4 & #176; ग प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण जब तक प्रकाश से सुरक्षित (कम 1 x 10 4 घटनाओं) के भीतर 1 ज । गेटिंग कार्यनीति के लिए, supplement figure 1 देखें. एंटी-तर्-1-85 (APC) (एकाग्रता: 1:40 और ०.५% FBS/पंजाब) में सॉर्ट करें और कक्षों को ३५० & #181; qPCR विश्लेषण के लिए कक्ष lysis बफ़र के L का उपयोग करते हुए छांटें मानव MSCs ।
      नोट: लीजड कोशिकाओं पर संग्रहित किया जा सकता है-८० & #176; C भावी qPCR विश्लेषण के लिए 3 महीने तक के लिए.
  5. qPCR विश्लेषण के लिए कोशिकाएं तैयार करते हैं ।
    1. स्तंभ आधारित आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर लीजड कोशिकाओं से आरएनए अलग और आरएनए एकाग्रता और गुणवत्ता का निर्धारण.
    2. तैयार सीडीएनए तक 5 & #181; ग आरएनए के प्रति १०० & #181; L उलटे transcriptase प्रतिक्रिया. आरएनए उपज कम हो तो पूर्व-प्रवर्धन चरण निष्पादित करें (& #60; 10 एनजी/& #181; L) । आरएनए के १०० से कम एनजी का उपयोग झूठी नकारात्मकता की एक उच्च दर में परिणाम होगा ।
      नोट: सीडीएनए टेम्पलेट्स को 4 महीने तक के लिए आगे के विश्लेषण के लिए-20 & #176; C पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    3. जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाने के लिए angiogenesis अभिव्यक्ति profiler सरणियों का उपयोग कर qPCR निष्पादित करें । प्रति प्रतिक्रिया सीडीएनए के 5 एनजी का उपयोग करें (४० चक्र, ६० & #176; C एनीलिंग/तापमान का विस्तार) । एक्सप्रेस विभेदित एमएससी व्युत्पंन सीडीएनए नमूनों की तुलना में अभिव्यक्ति का परिवर्तन गुना । चलाएं उचित नकारात्मक नियंत्रण (महाधमनी अंगूठी मानव MSCs के बिना) ।
< p class = "jove_title" > 6. नेटवर्क ठहराव म् महाधमनी रिंग की परख/MSC सह संस्कृतियों

  1. ImageJ विश्लेषक प्लगइन के साथ Angiogenesis के रूप में इमेजिंग सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें < सुप वर्ग = "xref" > ३१ .
  2. आयात endothelial नेटवर्क छवियां लिया और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खुला ।
  3. इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप के विनिर्देशों के आधार पर छवि तराजू परिवर्तित.
  4. रेडियल नेटवर्क विकास को मापने के लिए एक सीधी-लाइन उपकरण का उपयोग करें ।
  5. गणना endothelial नेटवर्क सेल काउंटर उपकरण का उपयोग छोरों (के साथ छोरों कम से 4 पक्षों मात्रा होना चाहिए).
  6. नेटवर्क गुणों के अतिरिक्त ठहराव के लिए, मास्टर सेगमेंट, कुल खंड लंबाई, कुल नेटवर्क क्षेत्रों, और जंक्शनों की संख्या का विश्लेषण करने के लिए Angiogenesis विश्लेषक प्लगइन या अन्य समान plugins का उपयोग करें. झूठी सकारात्मक गणना से बचने के लिए महाधमनी अंगूठी ऊतक और खाली जगह कलंक के लिए धुंधला मुखौटा उपकरण का प्रयोग करें ।
  7. एक सांख्यिकी कार्यक्रम और ग्राफ endothelial नेटवर्क गुण महाधमनी अंगूठी परख के बाद और एमएससी सह संस्कृतियों के मूल्यों हस्तांतरण ।

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Representative Results

महाधमनी रिंग स्थापित करने के लिए योजनाबद्ध कार्य-प्रवाह/MSC सह-संस्कृति परख चित्रा 1में प्रदर्शित किया जाता है । मुख्य कदम शामिल हैं: चूहा महाधमनी अलगाव, खोदी और महाधमनी के छल्ले के embedding, endothelial अंकुरण और नेटवर्क विकास की निगरानी, और अंत में लेबलिंग और MSCs प्रशासन । endothelial नेटवर्क विश्लेषण की समयरेखा सह के प्रत्येक अवधि के लिए व्यवहार्य विश्लेषण के लिए खिड़की की रूपरेखा-संवर्धन: day 1, 5 & #38; 7. अतिरिक्त नोट्स डॉटेड बक्सों द्वारा हाइलाइट किए जाते हैं ।

महाधमनी अंगूठी endothelial कोशिका संस्कृतियों में संरचनात्मक रूप से अलग क्षेत्रों की पहचान उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जाता है, 3-5 डी के बाद महाधमनी के छल्ले ECM में एंबेडेड है(चित्रा 2) । अनस्ट्रक्चर्ड क्षेत्र (चित्र 2a) उच्च कोशिका प्रसार लेकिन महाधमनी ऊतक के प्रत्यक्ष आसपास के क्षेत्र में कम संरचनात्मक संगठन के एक इलाके के रूप में विशेषता है । विकसित endothelial नेटवर्क (चित्र बीसी) उच्च संरचनात्मक संगठन है, जहां नेटवर्क पूरी तरह से स्थापित कर रहे है और मुख्य रूप से बंद छोरों से बना रहे हैं, यहां तक कि MSCs के अलावा करने से पहले के साथ क्षेत्रों को देखें । विकासशील नेटवर्क (चित्रा 2c) endothelial संस्कृतियों के बाहर के क्षेत्रों में स्थित हैं । इन endothelial सेल माइग्रेशन की साइटों रहे हैं, और नए नेटवर्क संरचनाओं फार्म के रूप में बढ़ाव । उपर्युक्त 3 क्षेत्रों को आसानी से प्रयोग भर में पहचाने जाते है और जब संदर्भित जहां MSCs सह में घर संस्कृतियों का इस्तेमाल कर रहे हैं । जब सभी तीन नेटवर्क खंडों का विकास किया है तो महाधमनी रिंग परख के साथ MSCs को सह-संस् कृत किया जाना चाहिए । MSC सह संस्कृतियों के बाद endothelial नेटवर्क के ठहराव विकसित और विकासशील नेटवर्क के क्षेत्रों में शामिल है (चित्रा 2, सफेद फ्रेम) ।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी महाधमनी रिंग में endothelial नेटवर्क के विकास के साथ संयोजन के रूप में एमएससी प्रवास, एकीकरण और आकृति विज्ञान के गुणात्मक माप के लिए अनुमति देता है-एमएससी सह संस्कृति परख (चित्रा 3) । व्यवहार्य के साथ MSCs लेबल, cytoplasmic fluorophore के लिए प्रशासन के बाद 24 ज छवि थे सह संस्कृतियों । FTM HUCPVCs विकासशील endothelial नेटवर्क की परिधि में पाए गए, लंबी सेल morphologies प्रदर्शित, और endothelial नेटवर्क के आगे विकास के लिए योगदान दिया (चित्र 3, बी) । तुलना के लिए, BMSCs endothelial कोशिकाओं के साथ कम बातचीत प्रदर्शित करते हुए विकासशील नेटवर्क के लिए homed (चित्रा 3सी, डी) । ७२ एच में उच्च आवर्धन छवियों से पता चला है कि FTM HUCPVCs उच्च कवरेज और endothelial नेटवर्क के स्थिरीकरण बनाए रखा, जबकि सह में BMSCs morphologies नेटवर्क में सीमित एकीकरण के साथ गोलाकार endothelial के साथ प्रस्तुत संस्कृतियों (चित्रा 3E , च). मनाया मतभेद स्पष्ट रूप से मानव एमएससी प्रकार के बीच गुणात्मक, कार्यात्मक मतभेदों को प्रदर्शित करता है । एक चिकित्सीय उंमीदवार सेल प्रकार है कि महत्वपूर्ण डाक और endothelial एकीकरण गुण (चित्रा 3, बी & #38; ई) है बाहर खड़ा है जब सीमित endothelial नेटवर्क एकीकरण और वृद्धि के साथ एक सेल प्रकार की तुलना में क्षमताएं (चित्र 3 c, D & #38; F) ।

उच्च आवर्धन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों को आगे टुकड़े endothelial कोशिकाओं और ट्यूबलर नेटवर्क में FTM HUCPVCs के बीच शारीरिक बातचीत करने के लिए अधिग्रहीत किए गए थे । पूर्व बला FTM HUCPVCs (चित्र 4a, हरा) unसना हुआ endothelial कोशिकाओं (चित्रा 4a, सफेद तीर) के साथ पालन दिखाए जाते हैं । FTM HUCPVCs नोड्स के बीच एक अक्ष और अनुलग्नक सतह के रूप में सेवारत द्वारा endothelial कोशिकाओं को संरचनात्मक समर्थन प्रदान करने के लिए पाए गए । महाधमनी अंगूठी endothelial नेटवर्क भी पूर्व हो सकता है एक व्यवहार्य fluorophore का उपयोग करने के लिए इसी तरह एमएससी धुंधला (चित्रा 4B, लाल) लेबल । डबल सना हुआ सह संस्कृतियों में, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दो कोशिका प्रकार के बीच लंबी आसंजन का पता चला, fortifying सहयोग और सहायक सेल व्यवहार का अवलोकन ।

endothelial नेटवर्क संरचनात्मक संपत्तियों के ठहराव एमएससी सह संस्कृतियों के 5 दिन में प्रदर्शन किया गया था (चित्रा 5) । वर्दी चक्र पूरे महाधमनी रिंग endothelial नेटवर्क (चित्रा 2, सफेद फ्रेम) भर में माप के लिए परिभाषित किया गया था । मतलब नेटवर्क विकास दूर बाहर बंद छोरों (त्रिज्या आकार) (आंकड़ा 5) के लिए महाधमनी अंगूठी द्वारा पहली समीपस्थ बंद नेटवर्क छोरों से दूरी के रूप में गणना की गई थी. मतलब नेटवर्क महाधमनी अंगूठी की वृद्धि-एमएससी सह संस्कृतियों इस प्रकार थे: FTM HUCPVCs (२.९८ ± ०.३ मिमी) और BMSCs (१.५ ± ०.१५ मिमी) । अनुपचारित endothelial नेटवर्क १.९ ± 0.1 mm का एक मतलब त्रिज्या विकसित की है । एमएससी उपचार समूहों के बीच सांख्यिकीय तुलना प्रदर्शन किया है कि FTM HUCPVCs काफी अधिक नेटवर्क विकास के लिए योगदान दिया जब BMSCs और अनुपचारित नेटवर्क (पी ≤ ०.००१) की तुलना में । अनुपचारित endothelial नेटवर्क काफी अधिक सह संस्कृतियों (पी ≤ ०.०१) (चित्रा 5B) युक्त BMSC से विकसित की है ।

छोरों की कुल संख्या प्रत्येक वृत्त का चक्र में गणना की गई और औसत कुल पाश गठन (चित्रा 5C) के रूप में व्यक्त किया गया. कुल बंद छोरों की औसत संख्या निम्नानुसार थे: FTM HUCPVC इलाज सह संस्कृतियों (८१ ± 7), BMSCs (26 ± 3) और अनुपचारित अंगूठियां (५५ ± 7). FTM HUCPVCs काफी अधिक endothelial पाश गठन करने के लिए योगदान दिया जब BMSCs (पी ≤ ०.०१) और अनुपचारित नेटवर्क (पी ≤ ०.०१) की तुलना में । BMSC सह-संस्कृतियों के परिणामस्वरूप कम endothelial नेटवर्क छोरों जब अनुपचारित नेटवर्क की तुलना में (p ≤ ०.०१) । इस ठहराव endothelial नेटवर्क विकास (FTM HUCPVC) और भी endothelial नेटवर्क ख़राब हो सकता है एक सेल प्रकार पर एक काफी सकारात्मक प्रभाव है कि एक सेल प्रकार की पहचान करता है । यह उल्लेखनीय है कि काफी वृद्धि हुई नेटवर्क विकास endothelial नेटवर्क पर एमएससी कवरेज के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित करने के लिए मनाया गया है । यह पता चलता है कि प्रत्यक्ष बातचीत MSCs उनके सहायक समारोह को अंजाम देने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

महाधमनी अंगूठी सह संस्कृति प्रतिष्ठानों के संभावित नुकसान चित्रा 6में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । अपर्याप्त या असमान बहुलकीकरण BME की एक समस्या है कि सफल endothelial नेटवर्क के विकास के साथ हस्तक्षेप कर सकते है । सही ढंग से 30 मिनट के लिए BME बहुलकीकरण समय और बहुलक को बाधित किए बिना मीडिया स्थानांतरित एक बरकरार, कार्यात्मक BME चरण (चित्रा 6A) सुनिश्चित करेगा । लंबे समय तक मशीन समय के लिए MSCs धुंधला और MSCs विस्तारित अवधि के लिए गोली करने की अनुमति सेल आकृति विज्ञान और सह संस्कृतियों पर phenotype के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । 1 h के लिए सना हुआ चित्रा 5B FTM HUCPVCs से पता चलता है और अनुमति दी1 एच के लिए गोली करने से पहले सह संस्कृति, दोनों जा रहा है उप इष्टतम समय । FTM HUCPVCs endothelial नेटवर्क की साइटों को वरीयता दिखाने के लिए नहीं है और नेटवर्क भर में फैले हुए हैं । ठीक से उपचारित कक्षों की तुलना करना (आरेख 3), FTM HUCPVCs को हैंडल करने के लिए, प्रबंधित कक्षों को endothelial कक्षों (चित्र घमण्ड) के साथ गोलाकार कक्ष आकृति विज्ञान और सीमित सेल-टू-सेल इंटरैक्शन प्रदर्शित करते हैं । अंत में, यदि महाधमनी अंगूठी परख विच्छेदन के दिन पर स्थापित नहीं किया जा सकता है, aortas में संग्रहित किया जा सकता-८० डिग्री सेल्सियस ईजीएम-सी मीडिया में 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) और 10% FBS के साथ पूरक । endothelial नेटवर्क के विकास के ताजा ऊतक की तुलना में गल महाधमनी के छल्ले लागू करते समय 1-3 d लंबे समय लग सकता है, लेकिन endothelial नेटवर्क एमएससी सह संस्कृति प्रतिष्ठान(चित्रा 6C) के लिए पर्याप्त होगा ।

महाधमनी अंगूठी सह संस्कृति आकलन की एक वैकल्पिक कार्यवाही के रूप में, BME एंबेडेड महाधमनी छल्ले के सेलुलर अंश निकाला जा सकता है और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण (अनुपूरक चित्रा 1) । मानव विशिष्ट मार्कर तर्-1-85 (अनुपूरक आंकड़ा 1a, बी, वाई अक्ष) सह संस्कृतियों से युक्त FTM HUCPVC से सकारात्मक कोशिका जनसंख्या मानव MSCs के रूप में पहचान की गई । सह लेबलिंग endothelial सेल मार्कर CD31 (अनुपूरक आंकड़ा 1a) और मानव विशिष्ट मार्कर सकारात्मक सेल जनसंख्या के भीतर pericyte मार्कर CD146 (अनुपूरक आंकड़ा 1b) की उच्च अभिव्यक्ति की कम अभिव्यक्ति दिखाई । इस तरह के मूल्यांकन अंततः immunophenotypic और वंश endothelial कोशिकाओं के साथ बातचीत से प्रेरित MSCs की प्रतिबद्धता परिवर्तन को समझने, और परीक्षण किया सेल प्रकार के बारे में और अधिक मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकते हैं । आदेश में एफसी विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए, एक ही प्रयोगात्मक समूह के समानांतर कुओं से निकाली कोशिकाओं जोड़ा जा सकता है । यह गैर का उपयोग करने पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है पूर्व सना हुआ एमएससी प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए महाधमनी छल्ले युक्त इतना है कि व्यवहार्य डाई की याद ताजा प्रतिदीप्ति एंटीबॉडी से संबंधित fluorophores के संकेत के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । अन्यथा निगेटिव गेटिंग को ध्यान में रखते हुए प्री-सना सेल प्रतिदीप्ति लेना चाहिए.

हम मानव MSCs निकाला फार्म महाधमनी अंगूठी सह संस्कृतियों (सह के दिवस 7 संस्कृति) मानव कोशिका सतह मार्कर विशिष्ट एंटीबॉडी (तर्-1-85) का उपयोग कर हल । महाधमनी रिंग की परख से FTM HUCPVCs और BMSCs बरामद qPCR जीन की अभिव्यक्ति का परीक्षण करने के लिए angiogenic विश्लेषण के लिए कार्रवाई की गई. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध qPCR सरणी का उपयोग करते हुए, तीन महाधमनी अंगूठी सह संस्कृतियों ८४ मानव विकास कारक जीन (अनुपूरक आंकड़ा 2a) की अभिव्यक्ति का अंदाजा लगाने के लिए आनुवंशिक सामग्री की पर्याप्त मात्रा में प्रदान की । प्रारंभिक परिणाम संकेत मिलता है कि FTM HUCPVCs और BMSCs एक्सप्रेस कुंजी तुलनीय स्तर (अनुपूरक आंकड़ा बीसी) में angiogenic कारकों स्रावित । परख में विभिंन प्रकार के सेल की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना के अलावा, अपने विस्तार संस्कृति मीडिया से इबीएम आधारित परख मीडिया के लिए कोशिकाओं के हस्तांतरण के प्रभाव पर विचार किया जाना चाहिए । जब उच्च phenotypic या आनुवंशिक प्लास्टिक की कोशिकाओं का उपयोग कर, इबीएम मीडिया में मानव MSCs के एक तुलनित्र नियंत्रण समूह-महाधमनी ऊतक के बिना-मूल्यांकन में शामिल किया जाना चाहिए ।

MSCs के angiogenic फैक्टर अभिव्यक्ति में समानता से पता चलता है कि उनके नेटवर्क में वृद्धि में महत्वपूर्ण अंतर अलग paracrine गतिविधियों का परिणाम नहीं है । यह पहले के अवलोकन के साथ सामंजस्य में है कि वृद्धि हुई प्रत्यक्ष सेलुलर बातचीत endothelial नेटवर्क विकास को बढ़ावा देने के लिए प्रकट होता है ।

Figure 1
चित्रा 1: महाधमनी अंगूठी परख सेटअप के एक उपंयास आवेदन के योजनाबद्ध आरेख ।
सेटअप और महाधमनी अंगूठी परख के साथ एमएससी सह संस्कृतियों के विश्लेषण के मुख्य कदम ठोस बक्से में उल्लिखित है और अतिरिक्त नोट बिंदीदार बक्से में उल्लिखित हैं । स्केल बार = १,००० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: महाधमनी अंगूठी नेटवर्क विश्लेषण के प्रतिनिधि छवि ।
Endothelial नेटवर्क संरचनात्मक मतभेदों के आधार पर तीन गाढ़ा क्षेत्रों में विभाजित हैं: महाधमनी रिंग ऊतक (A) के करीब निकटता में अनस्ट्रक्चर्ड क्षेत्र, विकसित/संरचित Endothelial नेटवर्क्स (B), और नेटवर्क विकसित करना पूर्व vivo टिशू कल्चर (सी) की परिधि में स्थित है । रेडियल नेटवर्क विकास और पाश गिनती के लिए समान वृत्त का चक्र विकसित endothelial नेटवर्क (बी) के भीतर परिभाषित कर रहे हैं. एक्स: बंद endothelial वर्दी चक्र में गिना पाश । स्केल बार = २५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नेटवर्क क्षेत्र के फ्लोरोसेंट इमेजिंग-मानव MSCs के आश्रित एकीकरण महाधमनी अंगूठी परख में 24 & #38; ७२ एच.
सना (ग्रीन) FTM HUCPVCs और BMSCs को डेवलपिंग महाधमनी रिंग endothelial ट्यूब नेटवर्क्स से जोड़ा गया । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों एमएससी सह की स्थापना के बाद 24 ज लिया संस्कृतियों FTM HUCPVCs है कि ECM और परिधीय विकासशील endothelial नेटवर्क (ए) के लिए घर के माध्यम से प्रवास का प्रदर्शन । endothelial नेटवर्क्स (B) के साथ निकट संपर्क में रहते हुए उच्च आवर्धन छवियां FTM HUCPVCs की लंबी morphologies प्रदर्शित करते हैं । कम BMSCs परिधीय विकासशील नेटवर्क (सी) के लिए कोई चौकस पसंद के साथ ECM और घर endothelial नेटवर्क के लिए प्रक्रिया । BMSCs गोलाकार कक्ष morphologies (D) प्रदर्शित करें ।
उच्च आवर्धन चूहे महाधमनी अंगूठी परख में दाग MSCs के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों के बाद ७२ सह संस्कृति (E, F) के एच । नेटवर्क नोड्स और endothelial (E) दोनों में नलिकाओं कक्षों (ठोस सफ़ेद तीरों) के साथ सीधे सेल-टू-सेल इंटरैक्शन के माध्यम से endothelial कवरेज प्रदर्शित करते समय FTM HUCPVCS वर्तमान विस्तृत morphologies । BMSCs गोलाकार कक्ष morphologies endothelial नेटवर्क नोड्स (F) में clustered बनाए रखें । टूटा हुआ तीर महाधमनी अंगूठी ऊतक से endothelial नेटवर्क के विकास की दिशा का प्रतिनिधित्व करता है । A, C: स्केल बार = १,००० µm B, D: स्केलबार = ४०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Pericyte-endothelial सेल शारीरिक बातचीत के उच्च आवर्धन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियां ।
अनदाग endothelial कोशिकाओं को ट्यूबलर नेटवर्क (A) में पूर्व-दाग FTM HUCPVCs को जोड़ने वाले निरंतर दखल से जुड़े पाए गए । पूर्व दाग endothelial नेटवर्क के फ्लोरोसेंट छवियां (ईसी, लाल) पूर्व दाग FTM HUCPVCs (FTM, हरे रंग) के साथ बातचीत recapitulating endothelial सेल, pericyte बातचीत (बी) का प्रदर्शन. A: स्केल बार = १०० µm B: स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एमएससी ट्रीटमेंट ग्रुप में नेटवर्क ग्रोथ के ठहराव सह संस्कृति प्रतिष्ठान के बाद 5 डी.
कम आवर्धन चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी छवियों महाधमनी अंगूठी उपचार समूहों से नेटवर्क विकास और विकास (A) को मापने के लिए ले जाया गया । बिखरा हुआ तीर नेटवर्क विकास की दिशा दिखाता है । स्केल बार = २५० µm. माइक्रोस्कोप छवियों के लिए नेटवर्क गुण, मतलब नेटवर्क विकास और एक परख चक्र में नेटवर्क पाश गठन मतलब सहित, यों तो इस्तेमाल किया गया । FTM HUCPVCs अधिक से अधिक नेटवर्क विकास के लिए योगदान दिया, जब BMSC सह संस्कृतियों और अनुपचारित नेटवर्क (पी ≤ ०.००१) (ख) की तुलना में । p मान का उपयोग कर परिकलित किया गया था p & #60;०.०००१ का उपयोग करके Tukey के पोस्ट परीक्षण (N = 3) का प्रयोग कर ANOVA । नेटवर्क छोरों के साथ कम से बंद चार पक्षों मात्रा थे (C) । FTM HUCPVC सह संस्कृतियों जब BMSC सह संस्कृतियों (पी ≤ ०.००१) और अनुपचारित नेटवर्क (पी ≤ ०.०१) की तुलना में अधिक से अधिक नेटवर्क छोरों विकसित की है । p मान को एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग कर परिकलित किया गया था p & #60; 0 .0001 का उपयोग Tukey की पोस्ट परीक्षण (N = 3) । endothelial नेटवर्क के ४ क्षेत्रों का औसत मात्रा गया. स्केल बार = २५० µm । pairwise तुलना के लिए, * = p ≤ ०.०५, * * = p ≤ ०.०१, * * * = p ≤ ०.००१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: महाधमनी अंगूठी परख स्थापना में संभावित त्रुटियों ।
अपूर्ण BME बहुलकीकरण में एंबेडेड महाधमनी रिंग्स असंगत और भंग endothelial नेटवर्क्स (A) तक ले सकती हैं । FTM HUCPVCs धुंधला और सह संस्कृतियों की स्थापना के बीच बड़े समय अंतराल के साथ लंबी अवधि के लिए दाग, ंयूनतम डाक और endothelial सेल बातचीत (बी) । चूहे महाधमनी से endothelial नेटवर्क में संग्रहित-८० डिग्री सेल्सियस और महाधमनी अंगूठी परख (सी) के लिए गल । A: स्केल बार = २५० µm B, C: स्केल बार = ४०० µm. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: मानव FTM महाधमनी अंगूठी सह संस्कृतियों से निकाले HUCPVCs के प्रवाह Cytometry विश्लेषण ।
महाधमनी अंगूठी संस्कृतियों के सेलुलर अंशों अलग और प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए संसाधित किया गया । मानव विशिष्ट कोशिका सतह मार्कर (तर्-1-85, APC) के खिलाफ Fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी endothelial मार्कर (CD31, FITC, (ए)) या pericyte मार्कर (CD146, FITC, (बी)) विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ संयोजन में लागू किया गया था । कोशिका मानव मार्कर (वाई अक्ष) के लिए सकारात्मक जनसंख्या endothelial मार्कर CD31 (एक, Q2) और pericyte मार्कर CD146 (बी, स्वप्रमाणित) के लिए उच्च सकारात्मक के लिए कम धनात्मकता का परीक्षण किया । यह पता चलता है कि FTM HUCPVCs महाधमनी अंगूठी सह संस्कृतियों में अपने perivascular सेल गुण बनाए रखा और एक endothelial phenotype विकसित नहीं किया । भूखंडों पर चक्रों लागू प्राथमिक एंटीबॉडी मिलान isotype नियंत्रण का उपयोग कर परिभाषित किया गया. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक आंकड़ा 2: मात्रात्मक पीसीआर कुंजी Angiogenic जीन का विश्लेषण ।
FTM HUCPVCs और BMSCs द्वारा प्रमुख angiogenic जीन की इसी तरह जीन अभिव्यक्ति 1 सप्ताह सह महाधमनी अंगूठी परख (ए) में संस्कृति के बाद । प्रतिनिधि सीटी मान तालिका (B) में दिखाए जाते हैं । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

वहां एक सफल महाधमनी अंगूठी परख एमएससी सह संस्कृति प्रयोग स्थापित करने में कई महत्वपूर्ण चरणों रहे हैं । पहला, सबसे महत्वपूर्ण कदम जब अलग और महाधमनी के खंड कर रहे हैं: 1) महाधमनी के वक्ष खंड विशेष रूप से प्राप्त; 2) ध्यान से शाखाओं में बंटी रक्त वाहिकाओं को हटाने, संयोजी और वसा ऊतक और; 3) महाधमनी (~ 1 मिमी) के भी वर्गों को काटने के लिए प्रत्येक परख के बीच परिवर्तनशीलता सीमा । दूसरा, BME में महाधमनी के छल्ले के सफल embedding इस परख के लिए महत्वपूर्ण है । यदि BME पूरी तरह से बहुलक नहीं है या असमान रूप से बहुलक, BME में एंबेडेड महाधमनी रिंगों endothelial अंकुरण शुरू करने में सक्षम नहीं होगा या वे सतत endothelial नेटवर्क विकसित कर सकते हैं । यदि BME बहुलकीकरण अपर्याप्त है, परख ठहराव के लिए विश्वसनीय नहीं हैं । तीसरा, पूरा कारक-समृद्ध endothelial मीडिया अंकुरण आरंभ करने के लिए महाधमनी के छल्ले के लिए पोषण प्रदान करने के लिए आवश्यक है । एक बार महाधमनी अंगूठी के छल्ले अंकुरण शुरू की है, अगले महत्वपूर्ण आगामी कदम सेल प्रकार शामिल करने के लिए परीक्षण किया जाएगा । इस अंत करने के लिए, MSCs को सफलतापूर्वक पूर्व दाग और अंकुरित महाधमनी के छल्ले को प्रशासित किया जाना चाहिए । इस अनुभाग के लिए दो महत्वपूर्ण कार्यविधियां हैं । 1) सीडिंग के लिए उपयुक्त दिन का चयन: नेटवर्क विकासशील चरण में होना चाहिए और संस्कृति के उच्च कवरेज अच्छी तरह से नहीं पहुंच रहा है । यदि MSCs एक समय पर ढंग से प्रशासित नहीं कर रहे हैं, यह नेटवर्क के विकास पर MSCs के शुद्ध प्रभाव यों तो चुनौतीपूर्ण हो जाता है । 2) MSCs पहले इसके अलावा करने के लिए: यदि MSCs अधिक दाग या गोली में समय की एक व्यापक अवधि के लिए रह रहे हैं, का झुरमुट है कि बिगड़ती डाक और endothelial नेटवर्क के भीतर एकीकरण हो जाएगा । अंत में, नेटवर्क को बढ़ाता है आसानी से प्राप्त किया जा सकता है अगर उचित नियंत्रण तैयार कर रहे हैं । MSCs बिना महाधमनी छल्ले endothelial नेटवर्क का विकास होगा क्योंकि महाधमनी ही अंकुरण का समर्थन करता है, लेकिन MSCs विभिंन नेटवर्क संरचनाओं के साथ अधिक से अधिक नेटवर्क विकास को बढ़ावा देने के रूप में इस पांडुलिपि में वर्णित हो सकता है । endothelial networks के ठहराव कम 5 d प्रदर्शन किया जाना चाहिए सह संस्कृतियों की स्थापना के बाद । बंद प्रणाली के कारण, angiogenic प्रतिक्रिया क्षणिक और endothelial नेटवर्क लगभग 7 डी निंनलिखित चूकने शुरू है । यदि अवलोकन के प्रयोजन के लिए endothelial नेटवर्क के विकास पर परीक्षण सेल प्रकार प्रभाव का मूल्यांकन है, छवियों को सह के पहले सप्ताह के भीतर प्राप्त किया जाना चाहिए संवर्धन ।

वर्तमान परख के एक संभव संशोधन प्राथमिक मानव ऊतक के आवेदन किया जा सकता है । चूहे महाधमनी की एक 1 मिमी अनुभाग के रूप में सह संस्कृति के लिए एक इकाई बनाता है, मानव aortas अत्यधिक सुसंगत माप के वर्गों की एक उच्च संख्या के साथ प्रदान कर सकते हैं । व्यवहार्य मानव प्राथमिक ऊतक के अत्यधिक प्रतिबंधित उपलब्धता के बावजूद, उच्च उत्पादन संभावित व्यवहार्यता पता चलता है । जब बड़े पैमाने पर मूल्यांकन के लिए एक परख विकासशील, पूर्व परख बनाने और उसके घटकों के भंडारण के लिए जब तक कोशिकाओं के परीक्षण के लिए उपलब्ध हो विचार किया जा सकता है । BME कोटिंग ऊतक संस्कृति प्लेटों पर तैयार किया जा सकता है और समय की लंबी अवधि के लिए एक जमे हुए, निर्जलित रूप में संग्रहीत । इसके अलावा, जैसा कि हम अपनी प्रयोगशाला में परीक्षण किया, चूहे महाधमनी ऊतक जम सकता है और बाद में आवेदन के लिए संग्रहीत, इस प्रकार परख के सबसे महत्वपूर्ण तत्व के साथ और अधिक सुविधाजनक बनाने के काम करते हैं ।

महाधमनी अंगूठी परख के कई फायदे के बावजूद, वहां कुछ सीमाओं को सूचीबद्ध कर रहे हैं । सबसे पहले, परख संस्कृतियों की स्थापना चुनौतीपूर्ण हो सकता है । अपने वर्तमान रूप में, नियमित आवेदन के लिए पर्याप्त मैनुअल कौशल की आवश्यकता है । ऑपरेटर त्रुटियों परिवर्तनशीलता लागू कर सकते हैं । यह नेटवर्क के विकास में प्रतिबिंबित किया जा सकता है और यह मुश्किल मज़बूती से प्रशासित कोशिकाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए और फलस्वरूप महत्वपूर्ण angiogenic गुण कर सकते हैं । हालांकि, इन चुनौतियों के समान है तो जब अंय उपलब्ध तरीकों की तुलना में छोटे नहीं है, और आवश्यक प्रशिक्षण अवधि सुविधाजनक रूप से लघु और आर्थिक हो सकता है के रूप में vivo प्रयोगों में विरोध किया । दूसरा, पूर्व vivo महाधमनी ऊतक और प्रारंभिक नेटवर्क विकास है कि सेल प्रशासन के समय के निशान की embedding के बीच एक अंतराल अवधि के लिए उपयोगकर्ता द्वारा जवाबदेह होने की जरूरत है । तीसरा, endothelial नेटवर्क संपत्तियों के ठहराव समय लगता हो सकता है, लेकिन रेडियल वृद्धि, ट्यूब की लंबाई और नेटवर्क जाल आयामों सहित पहचान मापदंडों, निर्दिष्ट द्वारा हल किया जा सकता है । यह छवियों के कंप्यूटर सहायता प्राप्त विश्लेषण का उपयोग करके किया जा सकता है (छवि J), जो काफी सुसंगत और विश्वसनीय ठहराव के लिए आवश्यक समय कम कर सकते हैं । चौथा, प्रत्येक परख के बीच परिवर्तनशीलता पशु ऊतक स्रोत में मामूली विसंगतियों का एक परिणाम के रूप में हो सकता है और ऑपरेटर द्वारा हैंडलिंग । हमने पाया है कि इस चुनौती को प्रभावी ढंग से दूर किया जा सकता है और ठहराव प्रत्येक उपचार समूह के लिए triplicates की स्थापना के द्वारा सांख्यिकीय विश्वसनीय हो जाता है । अंत में, निकालने और पोस्ट-परख विश्लेषण के लिए मानव और चूहे मूल की कोशिकाओं छंटाई चुनौतीपूर्ण हो सकता है । हालांकि, विशिष्ट proteinases, dispase सहित, और कक्ष पुनर्प्राप्ति समाधान immunophenotypic या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए कक्षों को पुनर्प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

मौजूदा तरीकों की तुलना में है कि या तो संस्कृति एक एकल endothelial सेल प्रकार या जीवित पशु प्रणालियों, यह प्रस्तुत परख पूर्व vivo महाधमनी ऊतक और BME के संयोजन का उपयोग करता है । यह सेटअप उपयोगकर्ता को गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा elucidating सेल थेरेपी के उंमीदवारों के angiogenic गुण प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है । BME और मल्टी सेलुलर पूर्व vivo ऊतक का मेल बारीकी से microenvironment कि चिकित्सीय कोशिका प्रकार स्थानीय प्रशासन के बाद मुठभेड़ हो सकता है नकल उतार गुण प्रदान करता है । क्योंकि समानताएं और संस्कृति की स्थिति पर करीब नियंत्रण के एक उच्च संख्या की संभावना की, ऑपरेटर एक प्रणाली है कि विश्वसनीय मूल्यांकन के लिए आवश्यक तत्व शामिल है के साथ प्रदान की जाती है, जबकि चर और विसंगतियों को नष्ट करने में पाया पशु मॉडल । इसके अलावा, मूल्यांकन और अधिक संभव है क्योंकि यह लागत और दोहराया पशु प्रक्रियाओं की जरूरत कम कर देता है । एकल सेल परख और सबसे पशु मॉडल कारकों और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं कि अंयथा सेल थेरेपी उंमीदवारों के नैदानिक आवेदन में होते है द्वारा शुरू की चर की कमी है । भड़काऊ प्रतिक्रिया angiogenesis बदल जाता है और इसलिए, प्रत्यारोपित पदार्थों या कोशिकाओं के उपचारात्मक प्रभाव सही मात्रा नहीं किया जा सकता । महाधमनी अंगूठी परख कई भड़काऊ घटक है कि परख माप परेशान होता शामिल नहीं है । हालांकि, यह निवासी मैक्रोफेज कि microvasculature विकास३२में महत्वपूर्ण खिलाड़ी है शामिल हैं । दोनों endothelial नेटवर्क और दाग मानव कोशिकाओं की आसान पहचान के साथ, MSC स्रावित भड़काऊ साइटोकिंस के प्रभाव, और यहां तक कि प्रतिरक्षा प्रणाली के सेलुलर तत्वों, आसानी से इस परख का उपयोग कर मनाया जा सकता है ।

परख शर्तों और प्रायोगिक सेटअप के प्रतिलिपि प्रकृति पर उपयोगकर्ता द्वारा उच्च नियंत्रण प्रणाली को आगे तत्वों की शुरूआत के लिए अनुमति देता है । सबसे पहले, महाधमनी अंगूठी परख एक चोट मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । महाधमनी के छल्ले और endothelial अंकुरण के embedding के बाद, परख कोरोनरी चोट, भड़काऊ कारकों (TNF-α) या बैक्टीरियल lipopolysaccharide (एलपीएस), एमएससी के बाद angiogenic के संभावित बचाव के निर्धारण के लिए शुरू किया जा सकता है प्रतिक्रिया के बाद चोट । दूसरे, कैसे MSCs angiogenic प्रतिक्रिया में योगदान के संभावित तंत्र स्पष्ट करने के लिए, neutralizing एंटीबॉडी के लिए सेल के लिए महत्वपूर्ण संभावित रिसेप्टर्स करने वाली सेल बातचीत मौन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । अंत में, MSCs के paracrine गुणों की जांच करने के लिए, महाधमनी अंगूठी परख एक transwell प्रणाली में सेटअप किया जा सकता है सेल के प्रभाव को बाहर करने के लिए angiogenic प्रतिक्रिया के सेल बातचीत लेकिन paracrine संपत्तियों पर ध्यान केंद्रित ।

सारांश में, महाधमनी अंगूठी परख की क्षमता और सेल थेरेपी के उंमीदवारों की शक्ति का आकलन कर सकते है ECM प्रसंस्करण मध्यस्थता, angiogenesis के क्षेत्रों के लिए पलायन, और शारीरिक संपर्क के माध्यम से पोत विकास में योगदान । महाधमनी अंगूठी पूर्व vivo angiogenesis परख एक मूल्यवान, मात्रात्मक पूर्व-अपक्षयी चिकित्सा के लिए उंमीदवार सेल लाइनों के लिए उपकरण स्क्रीनिंग के रूप में विकसित किया जा सकता है ।

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Disclosures

डॉ क्लिफर्ड एल Librach पेटेंट के संयुक्त धारक है: अलगाव और पहली तिमाही गर्भनाल ऊतक से व्युत्पंन कोशिकाओं के उपयोग के तरीके। कनाडा और ऑस्ट्रेलिया में दी ।

Acknowledgments

लेखक निंनलिखित स्टाफ के सदस्यों और अनुसंधान कर्मियों का धंयवाद: Andrée Gauthier-फिशर, मैथ्यू Librach, तान्या Barretto, Tharsan Velauthapillai, और सारा Laronde ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

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References

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Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

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