Summary
Aqui, apresentamos uma aplicação nova do ensaio do anel aórtico onde prelabelled as células mesenquimais são co cultivadas com redes endotelial derivado de aorta de ratos. Este novo método permite a visualização de células estromais mesenquimais (MSCs) homing e integração com redes endoteliais, quantificação das propriedades de rede e avaliação de expressão de gene e immunophenotypes MSC.
Abstract
Angiogênese é um processo complexo, altamente regulamentado, responsável pela criação e manutenção de perfusão do tecido adequado. Manutenção de vascularização insuficiente e malformações patológicas podem resultar em graves doenças isquêmicas, enquanto excessivamente abundante desenvolvimento vascular está associado com câncer e doenças inflamatórias. Uma forma promissora de pro-angiogênico terapia é a utilização de fontes de célula angiogênico, que podem fornecer fatores regulatórios, bem como suporte físico para o desenvolvimento de recém vasculatura.
Células estromais mesenquimais (MSCs) são candidatos extensivamente investigados para regeneração vascular devido a seus efeitos parácrina e sua capacidade para detectar e lar de tecidos isquêmicos ou inflamados. Em particular, primeiro trimestre humana cordão umbilical perivasculares células (FTM HUCPVCs) são um candidato altamente promissor devido a suas propriedades como Pericito, alto potencial proliferativo e multilineage, Propriedades imune privilégios e parácrina robusta o seu perfil. Para efetivamente avaliar potencialmente angiogênico células regenerativas, é um requisito para testá-los em confiável e ensaios pré-clínicos "traduzíveis". O ensaio do anel aórtico é um ex vivo modelo de angiogênese que permite a fácil quantificação de estruturas tubulares endoteliais, fornece acessórias apoia células e matriz extracelular (ECM) do host, exclui componentes inflamatórios e é rápida e barata para configurar. Isto é vantajoso em relação na vivo modelos (por exemplo, ensaio da córnea, Matrigel ficha de ensaio); o ensaio do anel aórtico pode rastrear as células administradas e observar interações intercelulares, evitando a rejeição de xeno-imune.
Apresentamos um protocolo para um aplicativo de romance do ensaio do anel da aorta, que inclui a humanas MSCs em culturas co com desenvolvimento rato aórtica endotelial das redes. Este ensaio permite a análise da contribuição da MSC para tubo de formação e desenvolvimento através de interações físicas como Pericito e de sua potência para ativamente migrando para sites da angiogênese e para avaliar sua capacidade de realizar e mediar Processamento de ECM. Este protocolo fornece mais informações sobre as alterações na expressão de gene e fenótipo MSC seguinte co-cultura.
Introduction
O complexo processo de angiogênese melhora e mantém a perfusão do tecido, promovendo o desenvolvimento de embarcação de sangue novo de pré-existente vasculatura1. É um processo rigidamente regulamentado, equilibrado por fatores pro-angiogênico e antiangiogênico. Qualquer deficiência neste sistema pode conduzir a embarcação insuficiente manutenção ou crescimento, causando graves doenças isquêmicas, incluindo doença do miocárdio, acidente vascular cerebral e doenças neurodegenerativas. No entanto, exagerado desenvolvimento vascular é característica para as condições, incluindo câncer e doenças inflamatórias2.
Desenvolvimento de terapias que visam controlar a angiogênese para alcançar a regeneração tecidual favorável é de primordial importância. Apesar de extensas investigações pré-clínicos e clínicas, tentativas de estimular a angiogênese usando microRNAs e fatores de pro-angiogênico conseguiram alcançar os resultados desejados3,4,5. Possíveis razões para os efeitos transitórios incluem: longevidade limitada de angiogênico proteínas e ácidos nucleicos e o número finito de alvo de fatores de crescimento6,7. Embora fatores solúveis angiogênico são essenciais para dar início a angiogênese, a manutenção e a funcionalidade da vasculatura dependem de suporte a tipos de células, incluindo células de pericitos e músculo liso8. O campo de pro-angiogênico terapias agora é explorar potenciais células-tronco progenitoras célula fontes e que podem fornecer fatores angiogênico localmente, enquanto fisicamente apoiando recém desenvolvido vasculatura, auto renovação ou até mesmo diferenciar em células endoteliais9,10. Encontrar o ideal angiogênico tipos de células com a capacidade de cumprir estes requisitos funcionais detém uma grande promessa para a regeneração do tecido isquêmico.
Para traduzir com sucesso potenciais terapias baseadas em células em ensaios clínicos, estudos pré-clínicos precisam demonstrar sua eficácia e destacar os mecanismos subjacentes de angiogênico. Apesar do elevado número de ensaios de angiogênese estabelecida, o campo carece de um "padrão-ouro" em vitro ensaio que confiantemente poderia avaliar a eficácia do potencial candidato célula tipos11,12, 13. maioria em vitro angiogênese ensaios (incluindo os ensaios de formação de proliferação, migração e tubo endoteliais) normalmente avaliar os efeitos de células ou de compostos em mudanças fenotípica ou diferenciação em células endoteliais tubular e rede de estruturas de14,15. Enquanto estes recursos são essenciais para a angiogênese, um ensaio "traduzível" também deve avaliar: 1) o aumento ou substituição do suporte tipos de células, incluindo pericitos ou células musculares lisas, 2) o processamento de ECM e/ou membrana basal, e 3). a eficiência para promover a formação de microvasculatura funcional. Na vivo angiogênese modelos, incluindo o ensaio da córnea e Matrigel plug ensaio, recapitular o microambiente exclusivo na vivo mas são desafiados pela dificuldade de rastreamento administrado células para observar interações físicas. Além disso, em modelos na vivo , xeno-imune rejeição pode ocorrer ao testar potenciais alogênico terapia candidatos16. Ex vivo angiogênese modelos, particularmente o ensaio do anel aórtico pode fornecer: 1) fácil observação e quantificação de estruturas tubulares, células de apoia 2) acessórias, 3) ECM de host e fontes artificiais, 4) exclusão de inflamatória componentes e 5) instalação rápida e barata de17,18. Normalmente, o ensaio do anel aórtico pode testar o potencial angiogênico de pequenas proteínas secretoras, agentes farmacológicos e modelos de roedores transgênicos19,20,21.
MSCs são candidatos promissores para regeneração vascular, principalmente através de seus efeitos mediados por parácrina22,23,24. MSCs foram mostrados para secretar fatores chave angiogênico incluindo o fator de crescimento endotelial Vascular (VEGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), fator de crescimento do fibroblasto (bFGF) básica e angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. Também podem detectar o MSCs e tecidos lar de isquêmico ou inflamadas, no entanto, os mecanismos exatos estão ainda sob investigação. Cada vez mais, a literatura suporta a hipótese de que a maioria MSCs surgem de células perivasculares, co expressam Pericito marcadores e podem comportar-se como pericitos27. HUCPVCs são uma fonte jovem de MSCs derivado da região perivascular do cordão umbilical humano. Eles representam uma população de MSCs com propriedades como Pericito e foram caracterizados de ambos FTM e termo de cordões umbilicais. FTM HUCPVCs demonstram uma alta expressão de marcadores Pericito incluindo CD146 e NG2, alto potencial proliferativo e multilineage, Propriedades imune privilégios e exibir um parácrina robusto perfil28. FTM HUCPVCs são um tipo de célula do candidato ideal para promover a regeneração do tecido lesado através da promoção de Nova vasculatura através de suas propriedades como Pericito.
Para testar o potencial angiogênico e Pericito, como propriedades de MSCs humanas, um número muito limitado de angiogênese ensaios está disponíveis onde positivo angiotropic migração (doravante referida como "homing"), ECM processamento e desenvolvimento da física interações entre tipos de células podem ser investigadas, enquanto a obtenção de dados quantitativos sobre o desenvolvimento da microvasculatura.
Temos a honra de apresentar um protocolo que descreve um novo aplicativo do ensaio do anel aórtico. MSCs humanas foram co cultivadas com desenvolvimento rato-derivado da aorta endotelial das redes para avaliar a sua contribuição para a formação, maturação e homeostase de tubo. Esta versão do ensaio do anel aórtico avalia a capacidade e a potência dos candidatos à terapia celular para casa para sites da angiogênese, realizar e mediar o processamento de ECM, e contribuir para endotelial desenvolvimento tubular através de estabelecer como Pericito física interações. Além de quantificar o efeito líquido de MSCs na formação de rede endotelial em vitro e observando interações intercelulares, nós também Aperfeiçoamos um protocolo para isolar MSCs de culturas co. Realizando qPCR e citometria de fluxo, é possível caracterizar mudanças na expressão de gene e fenótipo MSC co-cultura a seguir. Como tipos de células do modelo, comparamos ontogenetically cedo (pré-natal) e finais (adultas) fontes de MSCs humanos: HUCPVCs FTM e humano derivadas da medula óssea MSCs (BMSC), respectivamente, no ensaio de anel aórtico. Propomos que o ensaio do anel da aorta pode ser usado para estudar o potencial angiogênico de qualquer tipo de célula fisicamente apoio quando sob investigação por aplicações regenerativa angiogênico.
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Protocol
todos os estudos que envolvam animais foram conduzidos e relatados de acordo com orientações de chegada 29. Todos os estudos foram realizados com a aprovação do Conselho de pesquisa institucional ética (número de REB 4276). Animal de todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal do University Health Network (Toronto, Canadá), e todos os animais receberam atendimento humano em conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, 8 th edição ( Institutos nacionais de saúde 2011).
1. configuração de ensaio de anel da aorta
- isolar a aorta de rato.
- Euthanize 8 - ratos Sprague-Dawley de 10 semanas de idade usando CO 2 asfixia: substituição de gás conjunto CO 2 câmaras para 20% (taxa de fluxo = 0,2 x Câmara volume/min). Confirmar pela ausência de pitada reflexo e o coração bate por palpar peito.
- Molhar a pele na área do peito usando gaze esterilizada com etanol a 70%. Usar Pinças esterilizadas e tesoura para fazer uma incisão na linha média do peito e cortar através de camadas de pele e músculo.
- , Uma vez que a caixa torácica é exposta, corte a caixa torácica de cada lado e dobre para cima cerca de 5mm do esterno em cada lado. Algum sangramento é esperado de artérias intercostais em cadáveres frescos.
- Empurre o tecido do pulmão e do coração para o lado direito anatômico para expor a aorta. A aorta é o branco colorido navio localizado ao lado da coluna vertebral.
- Uso de fórceps para beliscar a aorta (após o arco aórtico) e use uma tesoura cirúrgica para fazer a primeira incisão, mantendo a aorta com fórceps. Após cortar a aorta, cavidade torácica vai encher rapidamente com sangue, portanto é fundamental trabalhar rapidamente para obter a aorta antes da coagulação sanguínea.
- Uso de fórceps para segurar a aorta e descasque delicadamente a aorta para baixo, longe da coluna vertebral. A atração vai cortar as artérias intercostais sem incisões ainda mais. Obtenção de aproximadamente 10 cm de tecido e/ou antes da aorta se divide em dois ramos na cavidade abdominal e corta a aorta fora da carcaça. Empurre o diafragma se necessário para a direção caudal para obter acesso para diminuir as seções da aorta.
Nota: Descasque a aorta suavemente porque força intensa pode causar rasgá-la. Se as lágrimas da aorta, permitir a coagulação sanguínea por alguns segundos e use uma toalha de papel para remover o sangue coagulado, permitindo a visibilidade da aorta restante. - Coloque a aorta em um tubo de 15 mL com 10ml de Hank gelada ' s solução sal equilibrado (HBSS) suplementado com 1% penicilina/estreptomicina (P/S). Manter os tubos em gelo
Nota: O tecido da aorta pode durar 1-2 h no gelo, mas é melhor para processá-la tão rapidamente quanto possível.
- Preparar os meios de cultura de ensaio do anel aórtico em um armário de biossegurança estéril (BSC).
- Preparar o meio de crescimento endotelial (EGM) usando uma unidade de filtração para filtrar 500 mL do meio Basal endotelial (EBM) suplementado com 2% de soro Fetal bovino (FBS), 1% gentamicina e fatores de crescimento (ver Tabela de materiais). Coloque 50ml da mídia filtrada em um banho do grânulo ou água a 37 ° C.
- Usar outra unidade de filtração para filtrar 100 mL de EBM suplementado com 2% FBS e 1% P/S para preparou o EBM 2% FBS (EBM-FBS) e armazenar em 4 ° C.
- Revestimento de placas de cultura de tecidos de 12 poços com extrato de membrana Basal (BME) enquanto trabalhava no gelo.
- Lugar uma placa sobre uma superfície fria (grande bloco de gelo ou bandeja) 12. Adicione 200 µ l/poço de recém descongelado usando o BME refrigerado pontas de pipetas e agite o BME para garantir o mesmo revestimento. Trabalhar rapidamente para evitar a polimerização desigual do BME.
Nota: Uma excisão de aorta típico produz 20 anéis da aorta. Para levar em conta a variabilidade entre ensaios o anel aórtico, configurar pelo menos três ensaios de anel aórtico por grupo de tratamento e incluir um controle. Se permite que a fonte, 6 anéis por grupo de tratamento recomenda-se. - Colocar as placas revestidas em incubadoras umidificadas (37 ° C, umidade relativa de 95%, 5% CO 2; estas condições se aplicam a todas as etapas da incubadora umidificado daqui em diante) por 30 min. lugar 1.000 pontas de pipetas µ l de retorno em-20 ° C para etapa 1.5.3.
Nota: Enquanto o extrato de membrana basal é usado em concentração de ações, sua consistência e rigidez é estritamente controlado pelo tempo de polimerização. Certifique-se de manter os tempos de polimerização mesma exata para todos os paralelos e experimentos independentes.
- Lugar uma placa sobre uma superfície fria (grande bloco de gelo ou bandeja) 12. Adicione 200 µ l/poço de recém descongelado usando o BME refrigerado pontas de pipetas e agite o BME para garantir o mesmo revestimento. Trabalhar rapidamente para evitar a polimerização desigual do BME.
- Secção da aorta em rodelas uniformes.
- Levar a aorta do tubo de 15 mL e coloque-o em um prato de 10 cm com 10 mL de HBSS fresco suplementado com 1% P/S.
- Usar dois conjuntos de pinças para separar cuidadosamente o excesso de tecido conjuntivo, tecido adiposo e o uso de um bisturi para os restantes ramos das artérias intercostais ligado a aorta. Isto reduz a variabilidade entre as unidades de anel com base nos diferentes níveis do tecido residual. Remover qualquer resíduo coagulado sangue de dentro da aorta.
- Coloque uma régua ou grade sob o prato de 10cm para precisamente seções de corte 1-2 mm largura da aorta usando pinças e bisturi estéril. As seções de corte tão exata quanto possível reduzir a variabilidade entre unidades.
- Incorporar os anéis da aorta BME.
Nota: Se o seccionamento dos anéis da aorta não é concluída antes da incubação de polimerização BME, remover as placas revestidas de incubadoras umidificadas e adicione 100 µ l de EBM a cada poço para finalizar a polimerização. Timing exato é crítico como polimerização excessiva do BME pode interferir com a migração de desenvolvimento e célula endotelial rede. Uma vez que os anéis da aorta são preparados, remover o EBM dos poços e continuar da etapa 1.5.2.- Remover os poços BME revestido das incubadoras umidificadas e retornar para o BSC.
- Cuidadosamente pegar anéis da aorta individuais com pinça e coloque um no meio de cada poço revestido BME. Repita para os restantes anéis da aorta.
Nota: Mídia transferida juntamente com o anel da aorta deve ser mantida como mínima para evitar irregularidades de polimerização. - Uso de refrigeração pontas de pipetas (-20 ° C) 1.000 µ l para adicionar 300 µ l de BME no topo de cada anel aórtico e distribuir uniformemente o BME em torno do poço.
- Retornar os anéis da aorta incorporados para as incubadoras umidificados por 30 min.
- Retire as placas com o anel aórtico incorporado às incubadoras umidificadas e lentamente adicione 1.000 µ l da EGM (preparado e aquecido no passo 1.2.1), colocando a pipeta ponta contra a parede da cultura bem.
Nota: Pipetar diretamente os meios de comunicação para o BME pode perturbar o BME polimerizado e prejudicam o desenvolvimento contínuo de rede endotelial. Usar uma pipeta multicanal apropriada, se disponível. - Após 24 h, remover 1.000 µ l da EGM e substituir com 1.000 µ l de EBM-FBS preparado na etapa 1.2.2, novamente pipetando lentamente contra o lado da cultura bem.
- Manter o ensaio do anel aórtico, substituindo 500 µ l de EBM-FBS com 500 µ l de fresco EBM-FBS (37 ° C) a cada 48 h.
Nota: Veja secção 2 para iniciar a expansão da cultura MSC no mesmo dia como estabelecimento de ensaio do anel aórtico. Isto garantirá que MSCs estejam prontos para co-cultura quando as redes endoteliais estão prontas. - Usar a microscopia de campo claro para seguir o anel aórtico ensaio rede endotelial desenvolvimento (veja a Figura 1 como referência para o desenvolvimento da rede ideal). Uma vez que o aspecto de redes endotelial como mostrado na Figura 2, prosseguir com a criação das culturas de co de ensaio-MSC (secção 3) do anel aórtico. Consulte a etapa 4.1 para mais detalhes da imagem latente as redes endoteliais.
2. Cultura do tecido
- preparar soluções estoque de meios de cultura de tecido.
- Cultura FTM HUCPVCs (previamente estabelecidas, n ≥ 3 linhas independentes para cada um) 30 e BMSCs disponíveis comercialmente em alfa-MEM suplementado com 10% FBS e 1% P/S.
- Esterilizar a mídia usando garrafas de filtro de tamanho de poro 0,2 µm.
- Armazenar as soluções de mídia preparada a 4 ° C por até 3 semanas.
- HUCPVC de FTM manter e BMSC culturas em incubadoras umidificadas e passagem livre na confluência de 70-80% determinada pela microscopia de contraste de fase. Uso de volumes adequados de mídia para o tamanho do prato de cultura de tecidos utilizados (ou seja, 10 mL em um prato de 10 cm). Use estas condições de cultura para a manutenção e a passagem do MSCs.
- Dissociar as monocamadas MSC para passagem ou ensaio do anel aórtico-MSC co culturas usando uma solução de enzima de dissociação (prato de 4 mL/10 cm) e faça a incubação de incubadoras umidificadas para 3 min. Certifique-se de desprendimento das células usando microscopia de campo claro; incubar por um adicional 1-2 min, se necessário.
- Transferir as células dissociadas em um tubo de 15 mL e centrifugar a 400 x g por 5 min.
- Sem perturbar o centrifugado, Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de uma adequada cultura mídia (alfa-MEM completa para passagem de células ou EBM-FBS para anel aórtico ensaio/MSC co culturas) para a contagem, usando um contador de célula.
3. Preparação de aórtica anel ensaio/MSC culturas co
- 10 sementes 4 MSCs em cada incorporado anel aórtico (9.000 células/cm 2 / 12-bem placa). Com base no número de ensaios de anel aórtico, pre-manche os MSCs com tintura fluorescente viável, intransferível. Manter pelo menos três poços de anéis da aorta sem MSCs para um grupo de controle.
- Mancha 10 5 MSCs/mL EBM-FBS mídia, adicionar 2,5 µ l de viável, mídia intransferível corante fluorescente/mL (5 µM) em um tubo de 15 mL e lugar na incubadora umidificada por 30 min. Misture suavemente o tubo no meio da incubação.
- As seguintes 30 min incubação, adicionar 1 volume de EBM-FBS fresco para as células coradas e girar a 400 x g durante 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 mL de mídia EBM-FBS. Confirmar a coloração bem sucedida dos MSCs usando microscopia de fluorescência.
- Remova as placas contendo anel aórtica da incubadora umidificada e 500 µ l de EBM-FBS de cada poço.
- Sementes cuidadosamente 10 4 MSCs em 500 µ l de EBM-FBS em cada anel aórtico incorporado pipetando uniformente em torno das redes endoteliais. Garantir a distribuição uniforme agitando suavemente a placa de cultura.
- Adicionar EBM-FBS adicionais para assegurar que o volume total dos meios de comunicação sobre as culturas de co de ensaio/MSC anel aórtico é 1.000 µ l.
- Usar microscopia de fluorescência para visualizar os MSCs fluorescente rotulados no ensaio de anel aórtico.
4. microscopia
- microscopia de campo claro uso a imagem das redes endotelial rato antes do anel aórtico ensaio/MSC co culturas para medições de linha de base (dia 0) das propriedades de rede endotelial (por exemplo, rede comprimento, loops de rede). Imagem 4 quadrantes por alvéolo do anel aórtico a seção mais distante da rede endotelial dentro esse quadrante.
Redes de anel
- imagem a aórtica seguindo o anel aórtico ensaio/MSC co culturas nos dias 3, 5 e 7. Use estas imagens para quantificar o efeito de mestrado sobre o desenvolvimento da rede endotelial.
- Usar microscopia de fluorescência para imagem previamente rotulados MSCs no ensaio de anel aórtico.
Culturas de co
- seguintes 24 h do anel aórtico ensaio/MSC, usar microscopia de fluorescência para visualizar MSC homing, alongamento e integração com as redes endoteliais. Sobrepor as imagens fluorescentes do MSCs com as imagens de campo brilhante das células endoteliais para observar o colocalization de ambos os tipos de célula.
- De imagem os MSCs localizadas dentro das redes endoteliais desenvolvidas proximais ao tecido do anel aórtico e os MSCs localizadas dentro recentemente desenvolvendo redes distais ao tecido do anel da aorta ( Figura 2).
5. Flow Cytometry e qPCR
- um dia antes da dissociando as redes endotelial anel aórtico, descongelar congelado dispase a 4 ° C O/s. secção 5.3 é idêntica para citometria de fluxo e qPCR.
- Aqueça 50 mL de dispase e 50 mL de tripsina de 0,5% em banho de água ou talão de 37 ° C.
- Recuperar as células para análise de culturas ensaio/MSC-co o anel aórtico.
- Após 1 semana da cultura co do ensaio/MSC anel aórtico, remova a mídia de cultura e adicione 1 mL de Phosphate-Buffered salino (PBS) lentamente para cada um bem por 3 min e remover. Repetir esta lavagem mais duas vezes.
- Adicionar 800 µ l de pré aquecido dispase a cada poço e faça a incubação de incubadoras umidificadas por 15 min.
- Remover as placas das incubadoras umidificadas suspender dispase pipetando (5-10 x) para separar o BME e transferir o conteúdo de cada poço para tubos de 15ml separada.
- Repita o passo 5.3.3 novamente com fresco dispase previamente aquecido até não residual BME é observada na cultura do bem. Adicionar 1 volume de PBS, complementada com 3% FBS para a suspensão de células dispase para inactivar a dispase. Remova os anéis da aorta flutuando na suspensão de célula usando pontas de pipetas.
- Girar as suspensões celulares a 400 x g por 5 min. Retire o sobrenadante cuidadosamente, deixando 3 mL de suspensão de células no tubo de 15 mL.
Nota: Um sedimento sólido, óbvio pode não ser visível, mas as células e BME estão presentes. - Adicionar 3 mL de tripsina escaldadas de 0,5% para a suspensão de células e vigorosamente os eritrócitos (5-10 x pipetando). Incubar as soluções de célula trypsinized nas incubadoras umidificadas por 10 min.
- Remover as suspensões celulares de trypsinized de incubadoras umidificadas e adicionar 6 mL de PBS, complementada com 3% FBS e ressuspender alguns times. Girar as suspensões celulares em 400 x g, durante 5 min.
- Cuidadosamente retire todo o sobrenadante, deixando o centrifugado no tubo e ressuspender as células em 1 mL de PBS, complementada com 3% FBS em cada tubo.
- Filtrar a suspensão de células de 1 mL usando um coador de célula 70 µm para remover células agregadas e BME residual da suspensão celular. Contar as células em 1 mL de suspensão de células usando um contador celular.
- Preparar as células por citometria de fluxo.
- Incubar a célula suspensões (10 5 células em 200 µ l PBS, complementada com 3% FBS) com fluoróforo conjugado (FITC ou APC) anticorpos primários (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) concentração = 01:40) a 4 ° C por 30 min, protegido da luz.
Nota: Citometria de fluxo para MSCs foi otimizada por Hong et al, 2013 28. Um mínimo de 10.000 células é necessário para leituras precisas. - Após incubação a 30 min, Ressuspender as células em 2 mL de PBS, complementada com 3% FBS e centrífuga (400 x g, 5 min).
- Células de manter a 4 ° C, protegido da luz, até a análise por citometria de fluxo (pelo menos 1 x 10 4 eventos) dentro de 1h. Para a estratégia associada, consulte complementar Figura 1. Classificar o MSCs humanas usando anti-TRA-1-85 (APC) (concentração: 01:40 e em 0,5% FBS/PBS) e classificar as células em 350 µ l de tampão de lise celular para análise de qPCR.
Nota: Lisadas células podem ser armazenadas a-80 ° C por até 3 meses para análise futura qPCR.
- Incubar a célula suspensões (10 5 células em 200 µ l PBS, complementada com 3% FBS) com fluoróforo conjugado (FITC ou APC) anticorpos primários (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) concentração = 01:40) a 4 ° C por 30 min, protegido da luz.
- Preparar as células para análise de qPCR.
- Isolar o RNA das células lisados usando kits de isolamento de RNA baseada em coluna e determinar a concentração de RNA e qualidade. Reação de transcriptase reversa
- preparar cDNA de até 5 µ g de RNA por 100 µ l. Executar uma etapa de Pre-amplificação se o rendimento do RNA é baixo (< 10 ng / µ l). Utilização de menos de 100 ng do RNA resultará em uma alta taxa de falsos negativos.
Nota: Os modelos de cDNA podem ser armazenados a-20 ° C para posterior análise por até 4 meses. - Executar o qPCR usando matrizes de criador de perfil de expressão de angiogênese para detectar alterações na expressão gênica. Uso 5 ng de cDNA por reação (40 ciclos, 60 ° C temperatura de recozimento/extensão). Express prega mudança de expressão em comparação com amostras de cDNA indiferenciadas MSC derivado. Executar os controles negativos apropriados (anel aórtica sem humanos MSCs).
6. Quantificação anel aórtico seguinte ensaio/MSC de co culturas de rede
- baixar software de imagem tais como ImageJ juntamente com analisador de angiogênese plugin 31.
- Importar as imagens endoteliais rede tomadas e abra usando o software.
- Converter as escalas de imagem com base nas especificações do microscópio usado.
- Usar uma ferramenta em linha reta para medir o crescimento da rede radial.
- Contar os loops de rede endotelial usando a ferramenta de contador de célula (loops com pelo menos 4 lados devem ser quantificadas).
- Para adicional quantificação das propriedades de rede, use o plugin de angiogênese Analyzer ou outros plugins semelhantes para analisar segmentos mestre, total comprimento do segmento, áreas de rede total e o número dos cruzamentos. Use a ferramenta máscara borrada para desfocar o tecido do anel aórtico e espaços vazios para evitar falsos positivos cálculos.
- Transferir os valores para um programa e gráfico rede endotelial Propriedades de estatísticas seguindo as anel aórtico ensaio/MSC co culturas.
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Representative Results
O fluxo de trabalho esquemático para estabelecer o ensaio de co-cultura de anel/MSC aórtica é demonstrado na Figura 1. As etapas principais incluem: rato isolamento da aorta, seccionamento e incorporação dos anéis da aorta, monitoramento da brotação endotelial e desenvolvimento da rede e finalmente a rotulagem e administrando os MSCs. A linha do tempo da análise endotelial rede descreve a janela para as análises viáveis para cada período de cultivo co: dia 1, 5 & 7. Notas adicionais são destacadas por caixas pontilhadas.
A identificação das regiões estruturalmente distintas nas culturas de células endoteliais do anel aórtico é realizada por microscopia de campo claro, 3-5 d após os anéis da aorta são incorporados em ECM (Figura 2). A área não-estruturada (Figura 2A) é caracterizada como uma região de proliferação celular alta, mas baixa organização estrutural nas imediações do tecido da aorta. As redes endoteliais desenvolvidas (Figura 2B) referem-se às regiões com alta organização estrutural, onde as redes são plenamente estabelecidas e predominantemente compostas de ciclos fechados, mesmo antes da adição do MSCs. O desenvolvimento das redes (Figura 2) está localizado em regiões distais das culturas endoteliais. Estes são os locais de migração de células endoteliais e alongamento como a nova forma de estruturas de rede. As 3 regiões acima mencionadas são facilmente identificáveis em todo os experimentos e são usadas ao referenciar onde os MSCs abriga nas culturas co. Os MSCs prelabelled devem ser co cultivadas com o ensaio do anel da aorta quando desenvolveram-se todos os três segmentos de rede. A quantificação das redes endoteliais após MSC co culturas incluem regiões de rede desenvolvida e em desenvolvimento (Figura 2, quadro branco).
Microscopia de fluorescência permite medições qualitativas da MSC migração, integração e morfologia em conjunto com o desenvolvimento de redes endoteliais no ensaio de co-cultura de anel-MSC aórtica (Figura 3). Os MSCs rotulados com fluoróforo viável, citoplasmático foram fotografadas 24 h após a administração de culturas co. FTM HUCPVCs foram encontrados na periferia das redes endoteliais em desenvolvimento, exibido morfologias de células alongadas e contribuiu para o desenvolvimento das redes endoteliais (Figura 3A, B). Para comparação, BMSCs adaptadores de rede para o desenvolvimento das redes enquanto exibindo menos interação com células endoteliais (Figura 3, D). Imagens de alta ampliação em 72 h mostrou que HUCPVCs FTM mantida alta cobertura e estabilização das redes endoteliais, enquanto BMSCs em culturas co apresentadas com morfologias esféricas com a limitada integração em redes endoteliais (Figura 3E , F). Observado diferenças demonstram claramente as diferenças entre tipos humanos MSC qualitativas, funcionais. Um tipo de célula do candidato terapêutico que tem significativa homing e propriedades de integração endotelial (Figura 3A, B & E) se destaca quando comparado a um tipo de célula com integração limitada rede endotelial e aumento da capacidades (Figura 3, D & F).
Imagens de microscopia de fluorescência de alta ampliação foram adquiridas para dissecar mais interações físicas entre as células endoteliais e HUCPVCs FTM em redes tubulares. O HUCPVCs pre-rotulados de FTM (Figura 4A, verde) são mostrados aderindo com células endoteliais imaculadas (Figura 4A, branco setas). FTM HUCPVCs foram encontrados para fornecer suporte estrutural às células endoteliais, servindo como uma superfície de eixo e apego entre nós. As redes endotelial anel aórtica também podem ser pre-rotuladas usando um fluoróforo viável da mesma forma que a MSC coloração (Figura 4B, vermelho). Em culturas co manchadas duplas, microscopia de fluorescência revelou alongadas aderências entre os tipos de dois célula, fortificando a observação do comportamento de célula de apoio e cooperação.
A quantificação das propriedades estruturais da rede endotelial foi realizada no dia 5 de culturas co de MSC (Figura 5). Quadrantes uniformes foram definidos para medição em toda a rede de anel aórtico inteiro endotelial (Figura 2, quadro branco). O crescimento da rede de média foi calculado como a distância entre o primeiro loops de rede fechada proximal pelo anel da aorta para os mais distante distais ciclos fechados (tamanho de raio) (Figura 5A). O crescimento médio da rede do anel aórtico-MSC co culturas foram os seguintes: HUCPVCs FTM (2.98 ± 0,3 mm) e BMSCs (1,5 ± 0,15 mm). As redes não tratadas endoteliais desenvolveram num raio médio de 1,9 ± 0,1 mm. A comparação estatística entre os grupos de tratamento MSC demonstrou que FTM HUCPVCs contribuíram para o crescimento de rede significativamente maior quando comparada a redes não tratadas (p . ≤0.001) e BMSCs. O não tratadas redes endoteliais desenvolvidas significativamente mais do que a BMSC contendo culturas co (≤0.01p ) (Figura 5B).
O número total de loops foram calculado em cada quadrante e expresso em formação média total de laço (Figura 5). O número médio de ciclos fechados totais foram os seguintes: FTM HUCPVC tratada co culturas (81 ±7), BMSCs (26 ± 3) e não tratada anéis (55 ±7). FTM HUCPVCs contribuiu para a formação de laço endotelial significativamente maior quando comparada a redes não tratadas (≤0.01p ) e BMSCs (≤0.01p ). A BMSC co culturas endoteliais resultou em menos laços quando comparada a redes não tratadas (≤0.01p ) de rede. Esta quantificação identifica um tipo de célula que tem um efeito significativamente positivo no desenvolvimento de rede endotelial (FTM HUCPVC) e um tipo de célula que sequer pode afectar redes endoteliais. É de notar que o desenvolvimento da rede significativamente aumentada observou-se correlacionar bem com a cobertura MSC nas redes endoteliais. Ele sugere que as interações diretas são cruciais para os MSCs executar sua função de apoia.
Possíveis armadilhas dos estabelecimentos co-cultura anel aórtico são representadas na Figura 6. Polimerização insuficiente ou irregular do BME é um problema que pode interferir com o desenvolvimento bem sucedido rede endotelial. Cronometrando a polimerização BME por 30 minutos e transferir mídia sem interromper o polímero irão garantir uma fase BME intacta, funcional (figura 6A). Manchando os MSCs para tempos de incubação prolongado e permitindo os MSCs granular por períodos prolongados podem interferir com a morfologia celular e fenótipo em culturas de co. Figura 5B mostra FTM HUCPVCs manchado por 1h e permitidopara pelotas para 1 h antes da co-cultura, ambos sendo temporizações sub-ótimo. HUCPVCs FTM não mostram preferência a sites de redes endoteliais e estão espalhadas por toda a rede. Comparando-se adequadamente tratados células (Figura 3) para mal-cuidada FTM HUCPVCs, as células mal-cuidada exibem morfologia celular arredondado e interações de célula para célula limitadas com as células endoteliais (Figura 6B). Por último, se o ensaio do anel aórtico não pode ser estabelecido no dia da dissecação, a aorta pode ser armazenada a-80 ° C em mídia EGM-C suplementada com 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e 10% FBS. O desenvolvimento da rede endotelial pode demorar 1-3 d mais ao aplicar descongeladas anéis da aorta em relação ao tecido fresco, mas as redes endoteliais serão suficientes para o estabelecimento de co-cultura MSC (Figura 6).
Como um processo alternativo da avaliação de co-cultura de anel da aorta, a fração celular dos anéis da aorta BME incorporado pode ser extraída e analisada por citometria de fluxo (complementar a Figura 1). O marcador específico humano população de células positivas TRA-1-85 (complementar a figura 1A, B, eixo y) de FTM HUCPVC contendo culturas co foi identificado como humanos MSCs. A rotulagem co mostrou baixa expressão do marcador de células endoteliais CD31 (complementar figura 1A) e alta expressão do marcador Pericito CD146 (complementar a figura 1B) dentro da população de células positivas humana marcador específico. Tal avaliação pode decifrar imunofenotípica eventual e alterações de compromisso linhagem dos MSCs induzidos pelas interações com células endoteliais e fornecer mais informações valiosas sobre o tipo de célula testado. A fim de obter um número suficiente de células para análise FC, as células extraídas de poços paralelos do mesmo grupo experimental podem ser combinadas. É importante considerar o uso de não-pré-manchado MSC contendo os anéis da aorta para análise de citometria de fluxo, para que a fluorescência reminiscente do corante viável não interfere com o sinal do fluorophores anticorpo-relacionada. Caso contrário o gating negativo deve tomar a fluorescência da célula pré-manchado em consideração.
Estamos classificados MSCs formulário extraído da aorta anel co culturas humanas (dia 7 de co-cultura) usando o anticorpo específico de marcador de superfície de célula humana (TRA-1-85). FTM HUCPVCs e BMSCs recuperadas o ensaio do anel da aorta foram processadas para análise de qPCR testar a expressão de genes angiogênico. Usando uma matriz de qPCR comercialmente disponíveis, três culturas co do anel aórtico fornecido quantidades suficientes de material genético para quantificar a expressão dos genes de fator de crescimento humano 84 (complementar Figura 2A). Os resultados preliminares indicam que o FTM HUCPVCs e BMSCs expressar fatores chave angiogênico secretada em níveis comparáveis (complementar figura 2B). Além de comparar os níveis de expressão de diferentes tipos de células no ensaio, o efeito da transferência de células para EBM baseado do ensaio devem ser considerados meios de comunicação de seus meios de cultura de expansão. Ao usar células de maior plasticidade fenotípica ou genética, um grupo de controle de comparador de MSCs humanas na mídia EBM - sem tecido aórtico - deve ser incluído na avaliação.
As similaridades na expressão do fator angiogênico do MSCs sugere que a diferença significativa no aumento de sua rede não é um resultado de actividades diferentes parácrina. Isto está em concordância com a observação anterior de que maior interação intercelular direta surge para promover o desenvolvimento de rede endotelial.
Figura 1: Diagrama esquemático de um aplicativo de novela da instalação do ensaio do anel aórtico.
As principais etapas de configuração e análise de MSC co culturas com o ensaio do anel aórtico são esboçados em caixas de sólidos e notas adicionais são esboçadas em caixas pontilhadas. Barra de escala = 1.000 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem de representante da análise de rede de anel aórtico.
Redes endoteliais são divididas em três regiões concêntricas com base em diferenças estruturais: área não-estruturada em estreita proximidade com o tecido do anel aórtico (A), desenvolvido/estruturado redes endoteliais (B) e desenvolvimento das redes de localizado na periferia da ex vivo tecido cultura (C). Crescimento radial rede e quadrante uniforme para a contagem de loop são definidos dentro da rede endotelial desenvolvida (B). x: endotelial de circuito fechado de contados no quadrante uniforme. Barra de escala = 250 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fluorescente dependente da região de imagem da rede integração de humano MSCs no ensaio de anel aórtico após 24 & 72 h.
(Verde) Prestained FTM HUCPVCs e BMSCs foram adicionadas para o desenvolvimento das redes de tubo endotelial anel aórtico. Imagens de microscopia de fluorescência tiradas 24 h após o estabelecimento de culturas co MSC exibir HUCPVCs FTM que migram através do ECM e casa para redes endoteliais em desenvolvimento periféricas (A). Imagens de alta ampliação exibem morfologias alongadas de FTM HUCPVCs enquanto em estreito contacto com as redes endoteliais (B). Menos BMSCs processo de ECM e lar de redes endoteliais sem preferência observáveis para redes em desenvolvimento periféricas (C). BMSCs exibir morfologias célula esférica (D).
Alta magnificação fluorescência microscopia imagens de prestained MSCs no ensaio de anel da aorta de rato após 72 h de co-cultura (E, F). FTM HUCPVCS apresentam morfologias alongadas durante a exibição de cobertura endotelial através de interações de célula para célula diretas com células endoteliais (setas brancas sólidas) tanto em nós de rede e túbulos (E). BMSCs manter morfologias célula esférica agrupadas em nós de rede endotelial (F). Broken arrow representa a direção do crescimento do tecido do anel aórtico rede endotelial. Um, c: Barra de escala = 1.000 µm B, escala de d:barra = 400 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ampliação elevada fluorescência imagens de microscopia de interações físicas Pericito-endothelial da pilha.
Células endoteliais imaculadas foram encontradas associados a contínuas saliências conectando pre-manchado FTM HUCPVCs na rede tubular (A). Imagens fluorescentes das redes endoteliais pre-manchadas (CE, vermelho) com pre-manchado FTM HUCPVCs (FTM, verde) demonstram interações recapitulando a célula endotelial, interações Pericito (B). R: barra escala = 100 µm b: escala barra = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quantificação do crescimento da rede no tratamento MSC grupos 5 D após o estabelecimento da cultura co.
Imagens de microscopia de contraste de fase de baixa ampliação dos grupos de tratamento do anel aórtico foram retiradas para medida rede de crescimento e desenvolvimento (A). Dispersa seta mostra a direção de crescimento da rede. Barra de escala = 250 µm. microscopia imagens foram usadas para quantificar as propriedades de rede, incluindo o crescimento da rede de média e significa a formação de rede laço no quadrante de um ensaio. FTM HUCPVCs contribuíram para o crescimento de rede maior quando comparado a BMSC co culturas e redes não tratadas (p. ≤0.001) (B). O valor de p foi calculado usando uma ANOVA one-way para ser p <0,0001 usando de Tukey Post teste (N = 3). Loops de rede com pelo menos quatro lados fechados foram quantificados (C). FTM HUCPVC co culturas desenvolvidas loops de rede maiores quando comparado a BMSC co culturas (≤0.001 p) e redes não tratadas (p. ≤0.01). O valor de p foi calculado usando uma ANOVA one-way para ser o p < 0.0001 usando o teste de Tukey Post (N = 3). A média de 4 campos de redes endoteliais foram quantificados. Barra de escala = 250 µm. Para comparação emparelhada, * = p ≤0.05, * * = p ≤0.01, * * * = p ≤0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Possíveis erros no estabelecimento do ensaio anel aórtico.
Anéis da aorta incorporados em polimerização incompleta do BME podem levar a redes endoteliais inconsistentes e quebradas (A). FTM HUCPVCs manchado por longos períodos com intervalos de tempo grande entre a mancha e estabelecimento de culturas co, rendimento mínimo homing e interações da célula endotelial (B). A rede endotelial de aorta de ratos armazenados no-80 ° C e descongelado para ensaio do anel aórtico (C). R: barra de escala = 250 µm B, c: escala bar = 400 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: Fluxo Cytometry análise de HUCPVCs FTM humano extraídos de culturas co anel aórtico.
Celulares frações de culturas de anel da aorta foram isoladas e processadas para análise de citometria de fluxo. Fluoróforo conjugado anticorpo contra marcador de superfície de célula humana específica (TRA-1-85, APC) foi aplicado em combinação com marcador endotelial (CD31, FITC, (A)) ou anticorpos específicos do Pericito marcador (CD146, FITC, (B)). A população de células positiva para o marcador humano (eixo y) testado baixa positividade para marcador endotelial CD31 (A, Q2) e positivo alto para marcador Pericito CD146 (B, Q6). Isto sugere que HUCPVCs FTM mantiveram suas propriedades de célula perivascular nas culturas co anel aórtico e não desenvolveu um fenótipo endotelial. Os quadrantes em parcelas foram definidos usando controles de isotipo combinando os anticorpos primários aplicados. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementar Figura 2: Análise PCR quantitativo de Genes chave angiogênico.
A expressão de gene semelhante de genes chave angiogênico por FTM HUCPVCs e BMSCs 1 semana co-cultura no ensaio de anel aórtico (A) a seguir. Valores de CT representativos são mostrados na tabela (B). Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Existem vários estágios críticos na criação de um ensaio de anel aórtico bem sucedida experiência de co-cultura MSC. Primeiro, os passos mais importantes quando isolando e aorta de corte são: 1) obtenção exclusivamente o segmento torácico da aorta; 2) cuidadosamente removendo a ramificação dos vasos sanguíneos, o conjuntivo e o tecido adiposo e; 3) seções até corte da aorta (~ 1mm) para limitar a variabilidade entre cada ensaio. Em segundo lugar, a incorporação de sucesso dos anéis da aorta em BME é fundamental para este ensaio. Se não completamente, o BME é polimerizado ou polimerizado desigualmente, os anéis da aorta incorporados no BME não será capazes de iniciar a brotação endoteliais ou eles podem desenvolver redes endoteliais descontínuas. Se a polimerização BME é insuficiente, os ensaios não são confiáveis para quantificação. Em terceiro lugar, a mídia endotelial fator enriquecido completa é necessária fornecer alimento para os anéis da aorta iniciar a germinação. Uma vez os anéis anel aórtico tenham iniciado a embarcação brotando, os próximos passos futuros críticos envolvem o tipo de célula a ser testado. Para este fim, MSCs precisam com sucesso pre-manchado e administrado aos anéis da aorta germinação. Há dois procedimentos críticos para esta seção. 1) selecionando o dia adequado para propagação: as redes devem estar na fase de desenvolvimento e não chegar a alta cobertura da cultura bem. Se o MSCs não são administrados de forma atempada, torna-se desafiador para quantificar os efeitos líquidos dos MSCs no desenvolvimento da rede. 2) prestaining os MSCs antes da adição: se o MSCs são excessivamente manchados ou permanecem em pelota por um extenso período de tempo, aglutinação ocorrerá isso prejudica a orientação e integração em redes endoteliais. Por último, a quantificar as redes pode ser conseguido facilmente se controles apropriados são preparados. Anéis da aorta sem MSCs irão desenvolver redes endoteliais porque a aorta se suporta brotando, mas os MSCs podem promover maior desenvolvimento de redes com estruturas de rede diferentes, conforme descrito neste manuscrito. A quantificação das redes endoteliais deve ser realizada pelo menos 5 d seguintes estabelecendo co culturas. Devido ao sistema fechado, angiogênico resposta é transitória e redes endoteliais começam a degenerar após aproximadamente 7 d. Se o objetivo da observação é avaliar o efeito do tipo de célula testado sobre o desenvolvimento das redes endoteliais, as imagens devem ser adquiridas na primeira semana de cultivo co.
Uma eventual modificação do ensaio atual pode ser a aplicação de tecido humano primário. Como uma seção de 1 milímetro da aorta de rato faz com que uma unidade para co-cultura, aorta humana pode fornecer com um elevado número de seções de medições altamente consistentes. Apesar da disponibilidade altamente restrito de tecido primário humano viável, a saída elevada sugere potencial viabilidade. Ao desenvolver um ensaio para avaliações de larga escala, podem ser considerados pré-formando o ensaio e guardar os seus componentes até células para teste se tornam disponíveis. O revestimento de BME pode ser preparado em placas de cultura de tecidos e armazenado em uma forma desidratada, congelada por longos períodos de tempo. Também, como nós testamos em nosso laboratório, tecido da aorta de rato pode ser congelado e armazenado para posterior aplicação, assim fazendo trabalho com o elemento mais importante do ensaio mais conveniente.
Apesar das muitas vantagens do ensaio do anel aórtico, existem algumas limitações a serem listados. Em primeiro lugar, o estabelecimento das culturas de ensaio pode ser um desafio. Na sua forma actual, a aplicação de rotina requer habilidades manuais suficientes. Erros do operador podem apresentar variabilidade. Ele pode ser espelhado no crescimento da rede e pode tornar difícil confiavelmente avaliar o efeito das células administrados e, consequentemente, as propriedades importantes angiogênico. No entanto, estes desafios são semelhantes, se não menor quando comparado dos outros métodos disponíveis, e o período de treinamento necessário pode ser convenientemente curto e econômico em oposição a experimentos na vivo . Em segundo lugar, um período de defasagem entre a incorporação de tecido aórtico ex vivo e o desenvolvimento da rede inicial que marca o tempo de administração da célula precisa ser contabilizada pelo usuário. Em terceiro lugar, a quantificação das propriedades de rede endotelial pode ser demorada, mas pode ser resolvida por atribuir parâmetros de marca, incluindo crescimento radial, tubo dimensões de comprimento e rede do engranzamento. Isso pode ser executado usando análise assistida por computador de imagens (Image J), que pode diminuir significativamente o tempo necessário para a quantificação de consistente e confiável. Em quarto lugar, a variabilidade entre cada ensaio pode ocorrer como resultado de ligeiras inconsistências na fonte de tecido animal e manuseio pelo operador. Descobrimos que este desafio pode ser efetivamente superado e a quantificação torna-se estatisticamente confiável instituindo triplica para cada grupo de tratamento. Por último, extraindo e as células de humanos e origem de rato para análise pós-ensaio de classificação podem ser desafiadoras. No entanto, protease específico, incluindo dispase e solução de recuperação da célula pode ser aplicado para recuperar as células para análise de expressão imunofenotípica ou gene.
Em comparação com os métodos existentes que cultura um tipo único de célula endotelial ou vivem animais sistemas, este apresentado ensaio utiliza a combinação de ex vivo tecido aórtico e BME. Esta configuração permite ao usuário obter dados qualitativos e quantitativos, elucidar as propriedades angiogênico dos candidatos à terapia celular. Combinar o BME e multicelulares ex vivo tecido fornece propriedades intimamente imitando o microambiente que o tipo de célula terapêuticas pode ocorrer após a administração local. Devido à possibilidade de um elevado número de paralelos e o controle sobre as condições de cultura, o operador é fornecido com um sistema que contém os elementos necessários para uma avaliação fiável, enquanto eliminar variáveis e inconsistências encontradas no modelos animais. Além disso, as avaliações são mais viáveis porque ela reduz o custo e a necessidade de procedimentos repetidos de animais. Única célula ensaios e modelos animais mais faltam os fatores e variáveis introduzidas por respostas imunes que ocorreriam caso contrário na aplicação clínica dos candidatos à terapia celular. A resposta inflamatória altera a angiogênese e, portanto, o efeito terapêutico de substâncias implantados ou células não podem ser quantificadas com precisão. O ensaio do anel aórtico exclui muitos componentes inflamatórios que perturbariam as medições do ensaio. No entanto, ele contém macrófagos residentes que são importantes no setor de desenvolvimento da microvasculatura32. Com a fácil identificação da rede endotelial e prestained células humanas, o efeito dos MSC secretada de citocinas inflamatórias e elementos até mesmo celulares do sistema imunológico, podem ser facilmente observados usando este ensaio.
Alto controle pelo usuário sobre as condições de ensaio e a natureza reprodutível da instalação experimental permite a introdução de mais elementos para o sistema. Em primeiro lugar, o ensaio do anel da aorta pode ser usado como um modelo de lesão. Após a incorporação dos anéis da aorta e brotação endotelial, ensaios podem ser introduzidos a lesão isquêmica, fatores inflamatórios (TNF-α) ou bacteriano lipopolissacarídeo (LPS), seguido por adição de MSC para determinar o possível resgate de angiogênico resposta após lesão. Em segundo lugar, para elucidar os mecanismos possíveis de como os MSCs contribuem para a resposta de angiogênico, neutraliZing anticorpos podem ser utilizados para silenciar potenciais receptores críticos para interações de célula para célula. Por último, para investigar as propriedades parácrina do MSCs, o ensaio do anel da aorta pode ser configurado em um sistema transwell para excluir o efeito de interações de célula para célula da resposta angiogênico mas foco nas propriedades de parácrina.
Em resumo, o ensaio do anel aórtico pode avaliar a capacidade e potência dos candidatos à terapia celular para mediar ECM processamento, migrar para áreas de angiogênese e contribuir para o desenvolvimento do navio através do contato físico. O anel aórtico ex vivo angiogênese ensaio poderia ser desenvolvido como uma ferramenta de pré-seleção valiosa, quantitativa para linhas de célula candidato para terapia regenerativa.
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Disclosures
Dr. Clifford L. Librach é co-titular da patente: métodos de isolamento e o uso de células derivadas de tecido de cordão umbilical do primeiro trimestre. Concedido no Canadá e Austrália.
Acknowledgments
Os autores agradecer aos seguintes membros funcionários e pessoal de pesquisa: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai e Sarah Laronde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
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