Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Assay Сопредседатель культуры аортального кольца: Удобным инструментом для оценки потенциала ангиогенных мезенхимальных стромальных клеток In Vitro

Published: September 18, 2017 doi: 10.3791/56083
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4,5
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

Summary

Здесь мы представляем Роман применение аортального кольца assay где prelabelled Мезенхимальные клетки совместно культивируемых с крыса аорто производные эндотелиальной сетями. Этот новый метод позволяет визуализация самонаведения мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и интеграцию с эндотелиальной сетями, количественная оценка свойств сети и оценки иммунофенотипа и генной экспрессии MSC.

Abstract

Ангиогенез-это комплекс, жестко регулируемых процесс, ответственный за обеспечение и поддержание адекватного ткани перфузии. Обслуживания недостаточно сосудистую и патологических уродств может привести к тяжелой ишемической болезни, в то время как чрезмерно обильные сосудистой развитие связано с рак и воспалительные заболевания. Перспективной формой pro ангиогенных терапии является использование ангиогенных клеток источников, которые могут обеспечить регуляторные факторы, а также физической поддержки для новых развивающихся сосудистую.

Мезенхимальные стромальные клетки (Майкрософт) (MSCs) являются широко исследованы кандидатами для сосудистой регенерации из-за их паракринными эффекты и их способность обнаруживать и домом для ишемического или воспаленных тканей. В частности первый триместр человеческой пуповинной периваскулярной клетки (FTM HUCPVCs) являются весьма перспективный кандидат из-за их перицит как свойства, Высокий пролиферативный и мультилинейного потенциал, иммунной привилегированный свойства и надежные паракринными профиль. Чтобы эффективно оценить потенциально ангиогенных регенерации клеток, это условие, чтобы проверить их в надежных и «перевода» предварительно клинических анализов. Assay аортального кольца является ex vivo ангиогенеза модель, которая позволяет легко количественная оценка эндотелиальной трубчатых структур, обеспечивает аксессуар поддержки клетки и внеклеточного матрикса (ECM) от хоста, исключает воспалительного компонентов и является быстрый и недорогой для установки. Это выгодно, когда по сравнению с моделями в естественных условиях (например, роговицы пробирного, Matrigel вилка пробирного); assay аортального кольца можно отслеживать управляемых клетки и наблюдать межклеточных взаимодействий избегая xeno иммунной неприятие.

Мы представляем протокол для Роман применение assay аортального кольца, которая включает в себя человека MSCs в совместное культур с развивающимися крыса аорты эндотелиальной сетями. Этот assay позволяет для анализа вклада MSC в трубку формирования и развития посредством физических взаимодействий перицит как и их потенции для активно мигрируют на сайты по ангиогенез и для оценки их способности выполнять и посредником ECM обработки. Этот протокол обеспечивает дополнительную информацию об изменениях в MSC фенотипа и ген выражение после совместного культуры.

Introduction

Сложный процесс ангиогенеза улучшает и поддерживает перфузии тканей путем содействия развитию новой крови судна из существующих сосудистую1. Это жестко регулируется, сбалансированный процесс про ангиогенных и анти ангиогенными факторами. Любой недостаток в этой системе может привести к недостаточной судно обслуживания или роста, вызывая тяжелые ишемического заболевания, включая болезни миокарда, инсульта и нейродегенеративных расстройств. Однако преувеличенные сосудистой развития характерно для условий, включая рак и воспалительные заболевания2.

Ключевое значение имеет разработка методов лечения, которые направлены на контроль ангиогенеза для достижения благоприятного регенерацию. Несмотря на обширные доклинических и клинических исследований попытки стимулировать ангиогенеза, с помощью про ангиогенных факторов и микроРНК не смогли достичь желаемых результатов3,4,5. Возможные причины для переходных эффектов: ограниченное долголетия ангиогенных белков и нуклеиновых кислот, и конечное число целевых факторов роста6,7. Хотя растворимые ангиогенных факторов необходимы для инициирования ангиогенеза, содержание и функциональность сосудистую зависят от поддержки типов клеток, включая pericytes и гладкомышечные клетки8. Поле pro ангиогенных терапии в настоящее время изучает потенциальные источники стволовых клеток и прародитель клеток, которые могут предоставить ангиогенных факторов на местном уровне, хотя физически поддерживать недавно разработали сосудистую, самостоятельного обновления или даже дифференциации в 9,клетки эндотелия как10. Нахождение оптимального ангиогенных типы клеток с возможностью выполнять эти функциональные требования открывает большие перспективы для регенерации ишемии тканей.

Для того, чтобы успешно воплотить потенциальные терапии на основе ячеек в клинических испытаниях, доклинические исследования должны продемонстрировать их эффективность и выделить основные механизмы ангиогенных. Несмотря на большое количество установленных ангиогенеза анализов, поле не хватает «золотой стандарт» в vitro assay, который может достоверно оценить эффективность потенциального кандидата ячейка типы11,12, 13. Большинство в vitro ангиогенеза анализы (в том числе эндотелиальной анализов формирования распространения, миграции и трубки) обычно оценить влияние клеток или соединений на эндотелиальных клеток фенотипические изменения или различия в трубчатые и сетевых структур14,15. Хотя эти особенности важны по ангиогенез, «переводимые» Пробирная следует также оценить: 1) увеличения или замена вспомогательных типов клеток, включая pericytes или гладких мышечных клеток, 2) обработка ECM и/или базальной мембраны, и 3). эффективность для поощрения формирования функциональных microvasculature. В естественных условиях ангиогенез моделей, включая роговицы пробирного и Matrigel вилка assay, пилки микроокружения уникальный в естественных условиях , но оспариваются трудности отслеживания управляемых клеток соблюдать физических взаимодействий. Кроме того в в естественных условиях модели, xeno иммунной отказа может произойти во время тестирования кандидатов терапии потенциальных аллогенных клеток16. Ex vivo модели ангиогенеза, особенно аортального кольца assay может обеспечить: 1) легко наблюдения и количественная оценка трубчатых структур, 2) аксессуар поддержки клетки, 3) ECM от принимающей страны и искусственные материалы, 4) исключения воспалительных компоненты и 5) быстрый и недорогой установки17,18. Как правило пробирного аортального кольца можно протестировать ангиогенных потенциал малых выделительные протеины, фармакологических агентов и трансгенных грызунов модели19,,2021.

MSCs являются перспективными кандидатами для сосудистой регенерации главным образом через их паракринными опосредованной эффекты22,,2324. Было показано, что MSCs выделяют ключевые ангиогенных факторов, включая Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), инсулина подобный фактор роста-1 (ИФР-1), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и angiopoeitin-1 (анг-1)25 ,26. MSCs может также обнаружить и ишемического или воспаленные ткани, однако, точные механизмы находятся в стадии расследования. Все больше литературы поддерживает гипотезу о том, что большинство MSCs возникают из клеток периваскулярной, совместно Экспресс перицит маркеры и могут вести себя как pericytes27. HUCPVCs являются источником молодой MSCs, производный от региона периваскулярной человека пуповины. Они представляют собой население MSCs с перицит как свойства и характеризовались из пуповины FTM и срок. FTM HUCPVCs демонстрируют высокое выражение перицит маркеров, включая CD146 и NG2, Высокий пролиферативный и мультилинейного потенциал, иммунной привилегированный свойства и отображать надежный паракринными профиль28. FTM HUCPVCs являются тип ячейки идеальным кандидатом для содействия восстановлению пораженных тканей путем поощрения новой сосудистую через их свойства перицит как.

Чтобы проверить ангиогенных потенциал и перицит как свойства человека MSCs, очень ограниченное количество анализов по ангиогенез, где положительные angiotropic миграции (в дальнейшем именуемый «самонаведения»), ECM обработки и развитие физической взаимодействий между типами клеток могут быть исследованы, во время получения количественных данных о microvasculature развитии.

Настоящим мы представляем протокол, который описывает Роман применение assay аортального кольца. Человека MSCs были совместно культивируемых с развивающимися крыса производные аорты эндотелиальных сетями, оценить их вклад в формирование, созревания и гомеостаза. Эта версия аортального кольца assay оценивает способности и потенции кандидатов терапии клетки Главная сайты по ангиогенез, выполнять и посредником ECM обработки и вносить эндотелиальной трубчатых развития путем установления перицит как физической взаимодействий. Помимо количественного чистый эффект MSCs на в vitro формирование эндотелиальной сети и наблюдения межклеточных взаимодействий, мы также оптимизирован протокол изолировать MSCs от совместного культур. Выполняя проточной цитометрии и ПЦР, это можно охарактеризовать изменения в MSC фенотипа и ген выражение после совместного культуры. Как модель типов клеток мы сравнили онтогенетически рано (дородовой) и поздний (взрослый) источники человека MSCs: FTM HUCPVCs и человека МСК костного мозга-производных (BMSC), соответственно, в assay аортального кольца. Мы предлагаем, что аортального кольца assay может использоваться для изучения ангиогенных потенциал любой физически поддержки типа ячейки, когда расследуется ангиогенных регенеративной приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

все исследования, с участием животных были проведены и согласно прибытия рекомендации 29. Все исследования были проведены с одобрения Совета этики институциональных исследований (номер 4276 REB). Всех животных, которые процедуры были утверждены Комитетом животных ухода из университетской сети здравоохранения (Торонто, Канада) и все животные получили гуманной помощи в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных, 8 (th) издание Национальные институты здравоохранения 2011).

1. аортального кольца Assay установки

  1. изолировать аорты крысы.
    1. Euthanize 8 - 10-недельных Sprague-Dawley крыс с помощью CO 2 удушение: набор CO 2 камер до 20% газ замена (скорость потока = 0,2 x камеры тома/мин). Подтвердите отсутствие щепотку рефлекс и сердце бьется, пальпируя груди.
    2. Мокрый мех на области груди, с использованием стерилизовать марлей с 70% этиловом спирте. Использовать стерилизованные щипцы, ножницы и надрезают в средней линии груди и прорваться через слои кожи и мышц.
    3. Когда грудная клетка подвергается, разрезать грудную клетку на каждой стороне и сложить вверх примерно на 5 мм от грудины на каждой стороне. Некоторые кровотечение ожидается от межреберных артерий в свежих трупов.
    4. Ткани легких и сердца Нажимай анатомические правой стороне подвергать аорты. Аорты является белый цветной судна расположенный рядом хребтовой колонки.
    5. Использования щипцов щепотку аорты (после аорты) и использовать Ножницы хирургические, чтобы сделать первый разрез удерживая аорты с щипцами. После резки аорты, грудной полости будут быстро наполнить кровью, поэтому важно, чтобы работать быстро, чтобы получить аорты до свертывания крови.
    6. Использования щипцов провести аорты и аккуратно чистить аорты вниз, от позвоночника. Тянуть будет разорвать межреберных артерий без дальнейшего разрезов. Получите около 10 см ткани и/или аорты делится на две ветви в брюшной полости и вырезать аорты из каркаса. Толкать диафрагму при необходимости хвостового направления для получения доступа к ниже разделы аорты.
      Примечание: Корки аорты осторожно потому что интенсивной силы может привести к его разорвать. Если слезы аорты, разрешить свертывание крови в течение нескольких секунд и использовать бумажную салфетку, чтобы удалить коагулированного крови, позволяя видимость оставшихся аорты.
    7. Место аорты в 15 мл тюбик 10 мл ледяной Хэнк ' s, сбалансированный соли раствора (HBSS) дополнен с 1% пенициллина/стрептомицина (P/S). Держите трубы на льду
      Примечание: Аорты ткани может длиться в течение 1-2 ч на льду, но это лучше обработать его как можно скорее.
  2. Подготовить аортального кольца пробирного культуры средств массовой информации в стерильных биобезопасности кабинета (BSC).
    1. Подготовить эндотелиальной среднего роста (СГЭ), используя блок фильтрации для фильтрации 500 мл эндотелиальной базальной среды (дм) с 2% плода Bovine сыворотки (ФБС), гентамицин 1% и факторы роста (см. Таблицу материалы). Место 50 мл отфильтрованных СМИ в ванну из бисера или воды 37 ° C.
    2. Использовать другой блок фильтрации для фильтрации 100 мл EBM, дополненная 2% FBS и 1% P/S для подготовил МВБ 2% FBS (EBM-FBS) и хранить при 4 ° C.
  3. Пальто 12-ну тканевые культуры пластин по экстракт с базальной мембраны (BME) во время работы на льду.
    1. Место 12-ну плиты на холодной поверхности (большой пакет со льдом или лоток). Добавьте 200 мкл/хорошо свежей талой BME использования рефрижераторов наконечники и вихрем BME обеспечить ровное покрытие. Работа быстро, чтобы избежать неравномерного полимеризации БМЭ.
      Примечание: Типичный аорты иссечение дает 20 аортального кольца. Чтобы учесть изменчивость между аортального кольца анализов, установки по крайней мере три аортального кольца анализов в группе лечения и включать элемент управления. Если источник позволяет, 6 колец в группе лечения рекомендуется.
    2. Место пластины с покрытием в увлажненные инкубаторы (относительная влажность 95%, 37 ° C, 5% CO 2; эти условия применяются к все увлажненной инкубатор шаги далее) для 30 min. место 1000 мкл наконечники обратно в-20 ° C для шага 1.5.3.
      Примечание: Хотя в складе концентрации используется экстракт базальной мембраны, ее последовательность и жесткость строго контролируется время полимеризации. Не забудьте сохранить точное же время полимеризации для всех параллелей и независимых экспериментов.
  4. Раздел аорты в единообразных кольца.
    1. Взять аорты из 15 мл трубки и поместить его в 10 см блюдо с 10 мл свежего HBSS дополнен с 1% P/S.
    2. Использовать два набора щипцами осторожно отделить избыток соединительной ткани, жировой ткани и использования скальпеля для остальных ветвей межреберных артерий связано в аорту. Это снижает изменчивость между подразделениями кольцо, основанные на различных уровнях остаточной ткани. Удалить любые остаточные свернувшийся крови от внутри аорту.
    3. Место правителя или сетки под 10 см блюдо точно отрезать 1-2 мм широкого круга аорты, используя стерильным скальпель и пинцет. Вырезать в разделах как точные, как можно снизить изменчивость между подразделениями,.
  5. Вставлять аортального кольца в БМЭ.
    Примечание: Если секционирование аортального кольца не завершена до инкубации полимеризации BME, удалить пластины с покрытием из увлажненной инкубаторы и 100 мкл EBM по каждой скважине прекратить полимеризации. Точные сроки имеет решающее значение, как чрезмерной полимеризации BME может помешать миграции развития и клеток эндотелия сети. Как только готовы аортального кольца, удалите МВБ из скважин и продолжите с шага 1.5.2.
    1. Удалить скважин BME покрытием из увлажненной инкубаторы и вернуться к BSC.
    2. Тщательно подобрать индивидуальные аортального кольца с щипцами и одна в середине каждой скважины, BME-покрытием. Повторите эти действия для остальных аортального кольца.
      Примечание: СМИ, переданы вместе с аортальной кольцо должно быть минимальным для того, чтобы избежать нарушения полимеризации.
    3. Использование охлаждением (-20 ° C) 1000 мкл наконечники 300 мкл БМЭ метки поверх каждого аортального кольца и равномерно распределять BME вокруг колодца.
    4. Возвращает встроенный аортального кольца для увлажненные инкубаторы для 30 мин
    5. Удалить пластины с помощью встроенного аортального кольца из увлажненной инкубаторы и медленно добавить 1000 мкл EGM (подготовленные и утепленные на шаг 1.2.1), поместив пипеткой подсказка к стене культуры хорошо.
      Примечание: Непосредственно закупорить СМИ на BME может нарушить полимеризованной БМЭ и препятствовать развитию непрерывного эндотелиальной сети. При наличии используйте соответствующие многоканальные пипетки.
    6. После 24 ч, удалите 1000 мкл внеочередного общего собрания акционеров и замените 1000 мкл EBM-FBS, подготовленный на этапе 1.2.2, снова медленно хорошо закупорить против стороны культуры.
  6. Поддерживать пробирного аортального кольца, заменив 500 мкл EBM-FBS 500 мкл свежих EBM-FBS (37 ° C) каждые 48 ч.
    Примечание: См. секТион 2 начать MSC культура расширение, в тот же день, как создание пробирного аортального кольца. Это будет гарантировать, что MSCs готовы для совместного культуры, когда эндотелиальной сети готовы.
  7. Использовать яркие поля микроскопии следовать аортального кольца пробирного эндотелиальной сети развития (см. Рисунок 1 как ссылка для развития оптимальной сети). После эндотелиальной сетей аспект является, как показано на рисунке 2, продолжите создание совместного культур аортального кольца пробирного MSC (раздел 3). Обратитесь к шагу 4.1 для дальнейших деталей изображений эндотелиальной сетей.

2. Культура ткани

  1. подготовка запасов решения тканевой культуры средств массовой информации.
    1. HUCPVCs FTM культуры (ранее созданных, n ≥ 3 независимые линии для каждого) 30 и коммерчески доступных BMSCs в альфа MEM дополнена 10% FBS и 1% P/S.
    2. Стерилизации средств массовой информации, с использованием 0.2 мкм поры размер фильтра бутылок.
    3. Хранения подготовленных медиа-решения на 4 ° C до 3 недель.
  2. Поддерживать HUCPVC FTM и BMSC культур в увлажненные инкубаторы и проход на 70-80% confluency определяется фазово-контрастной микроскопии. Соответствующие объемы использования средств массовой информации для размера тканевой культуры блюдо используется (т.е. 10 мл в 10 см блюдо). Используйте эти культуры условий для сохранения и пассированый MSCs.
  3. Отделить MSC монослои для пассированый или аортального кольца пробирного MSC совместно культур с помощью раствором фермента диссоциации (4 мл/10 см блюдо) и инкубировать в увлажненные инкубаторы для 3 мин обеспечить отряд клеток, используя яркие области микроскопии; инкубировать для дополнительных 1-2 мин, если требуется.
  4. Передача диссоциированных клетки в 15 мл трубки и центрифуги на 400 g x 5 мин
  5. Аспирационная супернатант не нарушая Пелле клеток и Ресуспензируйте клеток в 1 мл соответствующей культуры средств массовой информации (альфа MEM полный СМИ для пассированый клетки или EBM-FBS аортального кольца пробирного/MSC Сопредседатель культур) для подсчета, используя счетчик клеток.

3. Подготовка аортального кольца Assay/MSC Сопредседатель культур

  1. 10 семян 4 MSCs на каждом встроенных аорты кольцо (9000 клеток/см 2 / 12-ну пластины). Основываясь на количество анализов аортального кольца, предварительно пятно MSCs с жизнеспособным, непередаваемую Люминесцентную краску. Поддерживать по крайней мере три скважины аортального кольца без MSCs для группы управления.
    1. Пятно 10 5 MSCs/мл ДМ-FBS СМИ, 2,5 мкл жизнеспособным, непередаваемую Флюоресцентная краска/мл СМИ (5 мкм) в 15 мл трубки и место в увлажненные инкубатора для 30 мин осторожно смешать трубки на полпути через инкубации.
    2. Следующие 30 мин инкубации, добавить 1 объем свежего EBM-FBS окрашенных клеток и спина на 400 x g 5 мин
    3. Удалить супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл ДМ-FBS средств массовой информации. Подтверждение успешного пятнать MSCs, с помощью микроскопии флуоресцирования.
  2. Аортального кольца содержащих пластины из увлажненной инкубатора и удалите из каждой скважины 500 мкл EBM-FBS.
  3. Тщательно семян 10 4 MSCs в 500 мкл EBM-FBS на каждого внедренного аортального кольца, равномерно закупорить вокруг эндотелиальной сетей. Обеспечить равномерное распределение, слегка покачивая пластину культуры.
    1. Добавить дополнительные EBM-FBS для обеспечения того, чтобы общий объем средств массовой информации на аортального кольца пробирного/MSC Сопредседатель культур 1000 мкл.
  4. Визуализировать дневно помечены MSCs в assay аортального кольца с помощью микроскопии флуоресцирования.

4. микроскопия

  1. использования ярко поле микроскопии изображений крыса эндотелиальной сетей до аортального кольца пробирного/MSC совместно культур для измерения базовых (день 0) свойства эндотелия сети (например, сеть Длина сети петли). Изображение 4 квадрантов на колодец из аорты кольцо в секцию дальней эндотелиальной сети в этом квадранте.
    1. Изображения аортального кольца сетей после аортального кольца пробирного/MSC совместно культур на 3, 5 и 7 дней. Используйте эти образы для количественного определения MSC эффект на развитие эндотелиальной сети.
  2. Использовать изображение предварительно помечены MSCs в assay аортального кольца микроскопии флуоресцирования.
    1. Следующие 24 часа аортального кольца пробирного/КБМ Сопредседатель культур, использовать микроскопии флуоресцирования визуализировать MSC самонаведения, удлинение и интеграцию с эндотелиальной сетями. Перекрытие флуоресцентного изображения MSCs с светлые области изображения эндотелиальных клеток соблюдать colocalization обоих типов клеток.
    2. Изображения MSCs, локализованные в рамках развитых сетей эндотелиальной проксимальнее аортального кольца ткани и MSCs, локализованные в новых развивающихся сетей дистальнее аортального кольца ткани ( рис. 2).

5. Поток цитометрии и ПЦР

  1. за один день до отделения аортального кольца эндотелиальной сетей, оттепель замороженных dispase при температуре 4 ° C O/н. раздел 5.3 идентичен для проточной цитометрии и ПЦР.
  2. Теплый 50 мл dispase и 50 мл 0,5% трипсина в ванне шарик или воды 37 ° С.
  3. Получить клетки для анализа из культур совместного анализа/MSC аортального кольца.
    1. После 1 недели аортального кольца пробирного/MSC Сопредседатель культуры, извлеките носитель культуры и добавьте 1 mL из Phosphate-Buffered солевой (PBS) медленно, чтобы каждый хорошо для 3 мин и удалить. Повторите это мыть дважды больше.
    2. Добавить 800 мкл предварительно разогретую dispase для каждой скважины и инкубировать в увлажненные инкубаторы для 15 мин
    3. Удалить пластины из увлажненной инкубаторы и приостановить dispase, дозирование (5-10 x) с распадаются БМЭ и перенесите содержимое каждой скважины в отдельные 15 мл пробирок.
    4. Повторите шаг 5.3.3 снова с свежими подогретым dispase пока не остаточной BME наблюдается также в культуре. Добавить 1 объем PBS, дополненный 3% FBS в суспензии dispase клеток для инактивации dispase. Удаление аортального кольца, плавающие в суспензии клеток, используя наконечники.
    5. Спина клеточных суспензий на 400 x g для 5 минут удалить супернатант тщательно, оставляя 3 мл суспензии клеток в 15 мл тюбик.
      Примечание: Очевидно, твердые гранулы могут быть не видны, но присутствуют клетки и БМЭ.
    6. Добавить 3 мл 0,5% подогретую трипсина в суспензию клеток и энергично Ресуспензируйте (5-10 x, закупорить) клетки. Инкубировать решения trypsinized клеток в увлажненные инкубаторы для 10 мин
    7. Снять trypsinized клеточных суспензий с увлажненной инкубаторы и добавить 6 мл PBS, дополненный 3% FBS и Ресуспензируйте несколько ТимES. Спиновые клеточных суспензий на 400 g x 5 мин
    8. Тщательно удалить все супернатанта, оставляя ячейки гранул в трубе и Ресуспензируйте клеток в 1 мл PBS, дополненный 3% FBS в каждой тюбике.
    9. Фильтр 1 мл суспензии клеток, используя стрейнер ячейки 70 мкм для удаления из суспензии клеток агрегированных клетки и остаточной БМЭ. Подсчет клеток в 1 мл суспензии клеток, используя счетчик клеток.
  4. Подготовить клетки для проточной цитометрии.
    1. Инкубировать клетка подвески (10 5 клеток в 200 мкл PBS, дополненный 3% FBS) с Флюорофор (FITC или APC) первичных антител конъюгированных (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) концентрация = 1:40) на 4 ° C на 30 мин, защищенном от света.
      Примечание: Гонконг et al., 2013 28 был оптимизирован проточной цитометрии для MSCs. Для точных результатов требуется как минимум 10 000 ячеек.
    2. После 30 минут инкубации, Ресуспензируйте клетки в 2 мл PBS, дополненный 3% FBS и центрифуги (400 x g, 5 мин).
    3. Клетки хранить при 4 ° C, защищенном от света до анализа подачей cytometry (по крайней мере 1 x 10-4 события) в течение 1 ч. Шлюзовые стратегии смотрите Дополнительные рисунок 1. Сортировать человека MSCs с помощью анти TRA-1-85 (APC) (концентрация: 1:40 и в 0,5% FBS/PBS) и сортировать клетки в 350 мкл буфера lysis клетки для ПЦР анализа.
      Примечание: Лизированных клетки могут храниться при температуре-80 ° C до 3 месяцев для будущих ПЦР анализа.
  5. Подготовить клетки для ПЦР анализа.
    1. Изолировать РНК от лизированных клеток, используя наборы изоляции RNA на основе столбцов и определения концентрации РНК и качество.
    2. Подготовка cDNA от до 5 мкг РНК на 100 мкл обратной транскриптазы реакции. Выполнение предварительного усиления шаг при низкой урожайности РНК (< 10 нг/мкл). Использование менее чем 100 нг РНК приведет к высокий уровень ложных негативов.
      Примечание: CDNA шаблоны могут храниться при температуре-20 ° C для дальнейшего анализа на срок до 4 месяцев.
    3. Выполнять ПЦР с помощью ангиогенеза выражение профилировщик массивы обнаружить изменения в экспрессии генов. Использование 5 нг cDNA в реакции (40 циклов, отжиг/расширение температура 60 ° C). Экспресс раз изменения выражения по сравнению с недифференцированными MSC получены образцы cDNA. Запустите соответствующий негативный контроль (аортального кольца без человека MSCs).

6. Сети количественной оценки следующие аортального кольца Assay/MSC совместно культуры

  1. скачать изображений программное обеспечение таких как ImageJ наряду с ангиогенеза анализатор плагин 31.
  2. Импорта эндотелиальной сети снимки и открывать с помощью программного обеспечения.
  3. Конвертировать изображения весы, основанный на спецификации используется Микроскоп.
  4. Использовать прямой инструмент для измерения роста радиальная сеть.
  5. Количество эндотелиальных сети петли, с помощью инструмента Счетчик клеток (петли с по крайней мере 4-х сторон должны быть количественно).
  6. Для дополнительного количественного определения свойств сети, использовать анализатор ангиогенеза плагин или другие аналогичные плагины для анализа главных сегментов, Общая длина сегмента, областях общей сети и количество узлов. Используйте средство затуманенное маски для размытия аортального кольца ткани и пустые пространства, чтобы избежать ложных положительных расчеты.
  7. Передачи значения статистики программы и график эндотелиальной свойства сети после совместного культур аортального кольца пробирного/MSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схема работы потока для создания пробирного Сопредседатель культуры аортального кольца/MSC показана на рисунке 1. Основные этапы включают в себя: Крыса аорты изоляции, секционирование и встраивание аортального кольца, мониторинг эндотелиальной прорастания и развития сети и наконец маркировки и администрирование MSCs. Хронология эндотелиальной сетевого анализа описаны окна для анализа осуществимости для каждого периода совместного культивирования: день 1, 5 & 7. Дополнительные примечания выделяются пунктирной коробки.

Идентификация структурно отдельных регионов в культурах эндотелиальных клеток аортального кольца осуществляется светлые области микроскопии, 3-5 d после аортального кольца встроены в ECM (рис. 2). Неструктурированной области (рисунок 2A) характеризуется как регион высокой пролиферации, но низкой структурной организации в непосредственной близости от аорты ткани. Развитых сетей эндотелия (рис. 2B) относятся к регионы с высокой структурной организации, где сети полностью создана и преимущественно состоит из закрытых петель, даже перед добавлением MSCs. Развивающихся сетей (рис. 2 c) расположены на дистальной области эндотелиальной культур. Это сайты, миграцию эндотелиальных клеток и удлинения как новой формы структуры сети. Упомянутые выше 3 регионы легко идентифицировать на протяжении эксперименты и используются при ссылке, где MSCs домом для совместного культур. Prelabelled MSCs необходимо совместно культивируемых с assay аортального кольца, когда разработали всех трех сегментов сети. Количественная оценка эндотелиальной сетей после MSC Сопредседатель культур включают регионов развитых и развивающихся сети (Рисунок 2, белый кадр).

Микроскопии флуоресцирования позволяет для качественного измерения MSC миграции, интеграции и морфология в сочетании с развивающейся эндотелиальной сетей в assay Сопредседатель культуры аортального кольца MSC (рис. 3). MSCs, помечены жизнеспособным, цитоплазматических Флюорофор были образы 24 ч после приема для совместного культур. FTM HUCPVCs были найдены на периферии развивающихся сетей эндотелия, отображается удлиненные клетки морфологии и способствовали дальнейшему развитию эндотелиальной сетей (рис. 3а, B). Для сравнения BMSCs, размещенных в развивающихся сетей при отображении менее взаимодействие с эндотелиальных клеток (рис. 3 c, D). Высокое увеличение изображения на 72 ч, показал, что FTM HUCPVCs сохранить высокий уровень охвата и стабилизации эндотелиальной сетей во время BMSCs в совместное культур с сферически морфологии с ограниченной интеграции в эндотелиальных сети (Рисунок 3E , F). Наблюдаемые различия ясно показывают качественные и функциональные различия между типами человеческой MSC. Тип ячейки терапевтических кандидат, имеющий значительные самонаведения и свойства эндотелия интеграции (Рисунок 3А, B & E) выделяется, когда по сравнению с типом ячейки с ограниченной эндотелиальной сетевой интеграции и увеличение возможности (рис. 3 c, D & F).

Высокое увеличение флуоресцентной микроскопии изображений были приобретены для дальнейшего изучения физических взаимодействий между эндотелиальных клеток и FTM HUCPVCs в трубчатых сетях. Предварительно помечены FTM HUCPVCs (рис. 4A, зеленый) показываются присоединения с неокрашенных эндотелиальных клеток (рис. 4A, белые стрелки). FTM HUCPVCs были найдены для структурной поддержки эндотелиальных клеток, выступая в качестве оси и вложение поверхности между узлами. Аортального кольца эндотелиальной сети также могут быть предварительно помечены с помощью жизнеспособной Флюорофор аналогично MSC, окрашивание (рис. 4б, красный). В двойной окрашенных Сопредседатель культур микроскопии флуоресцирования показали удлиненные спайки между типами двух клеток, усиление наблюдения за сотрудничество и поддержку клеток поведение.

Количественная оценка структурных свойств эндотелия сети была исполнена на 5 день MSC Сопредседатель культур (рис. 5). Равномерное квадрантах были определены для измерения на протяжении всего аортального кольца эндотелиальной сети (Рисунок 2, белый кадр). Рост средней сети была рассчитана как расстояние от первой петли проксимальной закрытой сети аортального кольца для дальней дистальной замкнутые петли (размер радиуса) (Рисунок 5A). Рост средней сети аортального кольца MSC Сопредседатель культур были следующие: FTM HUCPVCs (2.98 ±0, 3 мм) и BMSCs (1.5 ±0, 15 мм). Необработанной эндотелиальной сетей разработал средний радиус 1.9 ± 0,1 мм. Статистические сравнения между группами лечения MSC показал, что FTM HUCPVCs способствовали значительно больший рост сети по сравнению с необработанными сетей (p ≤0.001) и BMSCs. Необработанной эндотелиальной сетей разработаны значительно больше, чем BMSC, содержащие Сопредседатель культур (p ≤0.01) (Рисунок 5B).

Общее количество петель были рассчитаны в каждом квадранте и выраженное как средний общий цикл формирования (рис. 5 c). Среднее количество всего замкнутые петли были следующие: FTM HUCPVC рассматриваться совместно культур (81 ±7), BMSCs (26 ±3) и лечить кольца (55 ±7). FTM HUCPVCs способствовали значительно больше эндотелиальной цикла образования по сравнению с необработанными сетей (p ≤0.01) и BMSCs (p ≤0.01). BMSC совместного культур привела к меньше эндотелиальной сети петли по сравнению с необработанными сетей (р ≤0.01). Эта количественная оценка идентифицирует тип ячейки, что значительно положительно влияет на развитие сети эндотелия (FTM HUCPVC) и тип ячейки, который может даже ухудшить эндотелиальной сетей. Это следует отметить, что развитие значительно увеличили сети было отмечено для хорошо коррелируют с MSC покрытие на эндотелиальных сетях. Это предполагает, что прямого взаимодействия имеют решающее значение для MSCs для выполнения их вспомогательную функцию.

Возможные опасности учреждения совместного культуры аортального кольца представлены на рисунке 6. Неадекватные или неравномерным полимеризации БМЭ является проблемой, которая может помешать развитию эндотелиальной сети успешной. Сроки BME полимеризации для ровно 30 минут и передачи средств массовой информации не нарушая полимера обеспечит нетронутыми, функциональные BME, этапа (рис. 6A). Пятнать MSCs для длительного инкубации раз и позволяя MSCs в гранулах для длительных периодов может помешать морфологии клеток и фенотип на совместное культур. Рисунок 5B показывает HUCPVCs FTM витражи для 1 h и позволилов Пелле за 1 ч до совместного культуры, оба они являются оптимальными таймингов. FTM HUCPVCs не показывать предпочтение сайтам эндотелиальной сетей и разбросаны по всей сети. Сравнивая должным образом угощали засланный FTM HUCPVCs клеток (рис. 3), засланный клеток дисплей округлые клеток морфологии и ограниченных ячеек для взаимодействия с эндотелиальных клеток (Рисунок 6B). Наконец, если assay аортального кольца нельзя установить на день рассечение, аорты может храниться при температуре-80 ° C в СМИ ЭГМ-C с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и 10% FBS. Развитию эндотелиальной сети может занять 1-3 d дольше при применении талой аортального кольца, по сравнению с свежие ткани, но эндотелиальной сетей будет достаточно для создания совместного культуры MSC (рис. 6 c).

Как альтернативного производства аортального кольца Сопредседатель культуры оценки, сотовой фракция BME встроенных аортального кольца можно извлечено и проанализированы подачей cytometry (дополнительный рис. 1). Человека конкретных маркер TRA-1-85 (дополнительный Рисунок 1A, B, y ось) положительный клеточный населения от HUCPVC FTM, содержащие Сопредседатель культур была определена как человека MSCs. Совместной маркировки показали низкий выражение эндотелиальных клеток маркера CD31 (дополнительный рис. 1A) и высокое выражение перицит маркера CD146 (дополнительный рис. 1B) в популяции позитивных клеток человека конкретных маркер. Такая оценка может расшифровать возможного иммунофенотипических и происхождение обязательства изменения MSCs, вызванных взаимодействия с эндотелиальных клеток и дополнительную ценную информацию о тип испытания ячейки. Чтобы получить достаточное количество клеток для анализа ФК, клетки, извлеченные из параллельных скважин одной экспериментальной группы могут быть объединены. Важно рассмотреть вопрос об использовании не pre окрашенных MSC, содержащий аортального кольца для cytometry анализ потока так, что напоминают флуоресценции жизнеспособных краска не вмешиваться с сигналом флуорофоров антитела, относящиеся. В противном случае отрицательный строб следует принимать заранее окрашенных клеток флуоресцентным во внимание.

Мы отсортировано MSCs извлеченные формы аортального кольца Сопредседатель культурами (день 7 совместного культуры) с использованием клеток человека поверхности маркер специфическое антитело (TRA-1-85). FTM HUCPVCs и BMSCs, оправился от пробирного аортального кольца были обработаны для ПЦР анализа для проверки выражения ангиогенных генов. Использование коммерчески доступных ПЦР массива, три культуры совместного аортального кольца предусмотрено достаточное количество генетического материала для количественного определения экспрессии генов, 84 человеческого фактора роста (дополнительный рисунок 2A). Предварительные результаты показывают, что FTM HUCPVCs и BMSCs Экспресс ключевых секретируемые ангиогенных факторов на сопоставимых уровнях (дополнительный рисунок 2B). Помимо сравнения уровней выражения различных типов клеток в assay, эффект передачи клетки EBM основе пробирного СМИ от их расширение культуры средств массовой информации должны рассматриваться. При использовании клеток высших фенотипические или генетических пластичности, компаратора контрольной группе человека MSCs в СМИ EBM - без аорты ткани - должны включаться в оценки.

Сходства в ангиогенных факторов выражение MSCs свидетельствует о том, что значительная разница в их сети увеличение не является результатом деятельности различных паракринными. Это в соответствии с ранее замечание, что увеличение прямых Межклеточные взаимодействия, как представляется, содействовать развитию эндотелиальной сети.

Figure 1
Рисунок 1: Схема Роман приложения установки Assay аортального кольца.
Основные этапы установки и анализ MSC Сопредседатель культур с assay аортального кольца, изложенные в твердых коробки и дополнительные замечания изложены в пунктирной коробки. Шкалы бар = 1000 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель изображение аортального кольца сетевого анализа.
Эндотелиальные сети делятся на три концентрические регионов на основе структурных различий: неструктурированной области в непосредственной близости от аортального кольца ткани (A), разработал структуру эндотелия сетей (B) и развивающихся сетей Расположенный на периферии ex vivo культуры ткани (C). Радиальная сеть роста и форма квадранта для подсчета цикла определяются в развитую сеть эндотелия (B). x: эндотелиальной замкнутой учитываются в форма квадранта. Шкалы бар = 250 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Флуоресцентные региона Imaging сети зависит от интеграции из человека MSCs в аортального кольца Assay после 24 & 72 ч.
Prestained (зеленый) FTM HUCPVCs и BMSCs были добавлены развивающихся сетей эндотелиальной трубки аортального кольца. Флуоресценции микроскопии изображений, снятых 24 ч после установления сотрудничества культур MSC отображения HUCPVCs FTM, которые мигрируют через ECM и домом для периферийных сетей развивающихся эндотелия (A). Выше изображения масштаб отображения удлиненные морфологии HUCPVCs FTM в тесном контакте с эндотелиальной сетей (B). Меньше BMSCs процесс ECM и домой к эндотелиальной сетям с не наблюдаемый предпочтение периферийных развивающихся сетей (C). BMSCs отображения сферические клетки морфологии (D).
Высокое увеличение изображения микроскопии флуоресцирования prestained MSCs в assay аортального кольца крыс после 72 ч Сопредседатель культуры (E, F). FTM HUCPVCS представляют удлиненные морфологии при отображении эндотелиальной охвата путем прямого взаимодействия для ячеек с эндотелиальных клеток (твердые белые стрелки) в узлах сети и трубочки (E). BMSCs поддерживать сферические клетки морфологии кластерированные в эндотелиальных сетевых узлов (F). Брокен-Эрроу представляет направление роста эндотелия сети из ткани аортального кольца. C:, шкалы бар = 1000 мкм Б, D: шкалаБар = 400 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Высокое увеличение флуоресценции микроскопии изображений перицит эндотелиальных клеток физических взаимодействий.
Безупречная эндотелиальные клетки были найдены связанные с непрерывной выступов, соединяющий предварительно окрашенные FTM HUCPVCs в трубчатых сети (A). Флуоресцентного изображения предварительно окрашенные эндотелиальной сетей (EC, красный) с предварительно окрашенные FTM HUCPVCs (FTM, зеленый) демонстрируют взаимодействие изложив эндотелиальных клеток, перицит взаимодействий (B). A: шкалы бар = 100 мкм B: шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Количественная оценка роста сети в лечении MSC группы 5 D после создания совместного культуры.
Малое увеличение фазы контраст микроскопии изображения были взяты из группы лечения аортального кольца мера сети росту и развитию (A). Рассеянные стрелка показывает направление роста сети. Шкалы бар = 250 мкм. микроскопия, изображения были использованы для количественной оценки свойства сети, включая рост средней сети и означает формирование сети цикла в одной пробы штанге. HUCPVCs FTM, способствовали рост сети по сравнению с BMSC совместного культур и необработанной сетей (p ≤0.001) (B). Значение p была рассчитана с использованием односторонней ANOVA быть p <0,0001, используя Тьюки в должность тест (N = 3). Сети петли с по крайней мере четыре закрытых сторонами были количественно (C). FTM HUCPVC совместно культуры развитых большей сети петли по сравнению с BMSC совместного культур (p ≤0.001) и необработанной сетей (р ≤0.01). Значение p была рассчитана с использованием односторонней ANOVA быть p < 0.0001 используя тест Post Тьюки (N = 3). В среднем 4 поля эндотелиальной сетей были количественно. Шкалы бар = 250 мкм. Для попарного сравнения * = p ≤0.05, ** = p ≤0.01, *** = p ≤0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Возможные ошибки в создании Assay аортального кольца.
Аортального кольца, встроенных в неполной полимеризации BME может привести к непоследовательным и сломанной эндотелиальной сетей (A). FTM HUCPVCs витражи для длительных периодов с большой время разрыв между окрашивание и создание совместного культур, доходность минимальный самонаведения и эндотелиальных клеток взаимодействий (B). Эндотелиальные сети от аорты крысы хранятся в-80 ° C и размороженным для аортального кольца assay (C). A: шкалы бар = 250 мкм B, C: шкалы бар = 400 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные рисунок 1: Поток Cytometry анализ человеческого FTM HUCPVCs, извлеченные из аорты кольцо Сопредседатель культур.
Клеточных фракций аортального кольца культур были изолированы и обрабатываются для анализа потока цитометрии. Флюорофор конъюгированных антител против конкретных клеток человека поверхности маркер (TRA-1-85, APC) применяется в сочетании с эндотелиальной маркер (CD31, FITC, (A)) или специфические антитела перицит маркер (CD146, FITC, (B)). Положительное для человека маркера (ось y) популяции клеток испытания низкой позитивность для маркера эндотелиальной CD31 (A, Q2) и высоким положительным для перицит маркер CD146 (B, Q6). Это свидетельствует о том, что FTM HUCPVCs их свойства ячейки периваскулярной аортального кольца сотрудничества культур и не развивать эндотелиальной фенотип. Квадранты на участках были определены с использованием изотипа контроль соответствия применяемых первичных антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные рисунок 2: Количественная ПЦР анализ ключевых ангиогенных генов.
Аналогичные генной экспрессии генов ключевых ангиогенных FTM HUCPVCs и BMSCs, после 1 недели совместного культуры в assay аорты кольцо (A). Представитель CT значения приведены в таблице (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существует несколько критических этапов в создании успешных аортального кольца пробирного MSC Сопредседатель культуры эксперимент. Во-первых, являются наиболее важных шагов при изоляции и секционирование аорты: 1) получения исключительно сегмента грудной аорты; 2) тщательно устранения ветвления кровеносных сосудов, соединительной и жировой ткани и; 3) резки даже участки аорты (~ 1 мм) ограничить изменчивость между каждой пробы. Во-вторых успешное внедрение аортального кольца в БМЭ имеет решающее значение для этот assay. Если БМЭ является не полностью полимеризуется или полимеризуется неравномерно, аортального кольца, встроенных в БМЭ не сможет инициировать эндотелиальной прорастания или они могут развивать разрывными эндотелиальной сетей. Если BME полимеризации является недостаточным, анализы не являются надежными для количественной оценки. В-третьих полный обогащенная фактором эндотелиального СМИ необходимо обеспечить питание для аортального кольца для начала прорастания. После аортального кольца кольца инициировали судно прорастания, следующий критические предстоящие шаги включают тип ячейки для проверки. С этой целью MSCs необходимо успешно предварительно окрашенные и ведении для прорастания аортального кольца. Есть два критических процедур для этого раздела. 1) выбрав подходящий день для посева: сети должны находиться в стадии развития и не хорошо достижение высокого охвата культуры. Если своевременно не управляются MSCs, становится сложно количественно чистого эффекта MSCs на развитие сети. 2) prestaining MSCs до того: Если MSCs чрезмерно окрашенные или остаться в Пелле за длительный период времени, глыба произойдет что ухудшает самонаведения и интеграции в рамках эндотелиальной сетей. Наконец количественная оценка сетей может легко быть достигнуто если готовятся соответствующие элементы управления. Аортального кольца без MSCs будет развиваться эндотелиальной сетей, потому что аорты, сам поддерживает прорастания, но MSCs может способствовать большей развития сети с различными сетевые структуры, как описано в этой рукописи. Количественная оценка эндотелиальной сетей должна быть осуществляется по крайней мере 5 d следующие создание совместного культур. Благодаря закрытой системе ангиогенных ответ является несохраняемым и эндотелиальных сети начать вырождающихся, после примерно 7 d. Если цель наблюдения для оценки испытания ячейки типа влияние на развитие эндотелиальной сетей, изображения должны быть приобретены в течение первой недели совместного культивирования.

Возможного изменения текущего анализа может быть применение первичных человеческих тканей. Как часть аорты крысы 1 мм делает одной единицы для совместного культуры, человека аорты может предоставить большое количество секций весьма последовательной измерений. Несмотря на весьма ограниченный наличие жизнеспособного человека основной ткани высокой выходной предлагает потенциальные возможности. При разработке assay для крупномасштабных оценок, может считаться предварительно формируя assay и хранение его компонентов до тех пор, пока клетки для тестирования становятся доступны. БМЕ покрытия могут быть подготовлены на культуре ткани пластины и хранится в виде замороженных, обезвоженный для более длительных периодов времени. Кроме того как мы проверили в нашей лаборатории, крыса аорты ткани можно замороженные и сохранены для последующей заявки, таким образом делая работу с важнейшим элементом анализа более удобным.

Несмотря на многие преимущества assay аортального кольца есть несколько ограничений должны быть перечислены. Во-первых создание пробирного культур может быть сложным. В его нынешнем виде обычные приложения требует достаточные навыки ручного труда. Ошибки оператора можно ввести изменчивости. Это может быть отражено в рост сети и может сделать это трудно достоверно оценить эффект управляемых клеток и, следовательно, важной ангиогенных свойства. Однако эти проблемы схожи, если не меньше, по сравнению с теми из других методов, доступных, и необходимое обучение период может быть удобно, короткие и экономических экспериментов в естественных условиях в отличие от. Во-вторых период задержки между встраивание ex vivo аорты тканей и развития первоначальной сети, отмечающий время клетки администрации должен учитываться пользователем. В-третьих количественная оценка свойств эндотелия сети может занять много времени, но может решаться путем присвоения Параметры визитной карточкой, включая радиального роста, трубку сетка размеров длины и сети. Это можно выполнить с помощью автоматизированного анализа изображений (Image J), которые могут существенно снизить время, необходимое для последовательной и надежной количественной оценки. В-четвертых изменчивость между калибровочных может произойти в результате незначительные несоответствия в животных тканях источник и обработку оператором. Мы обнаружили, что этот вызов может быть эффективно преодолеть и количественная оценка становится статистически надежным путем создания triplicates для каждой группе лечения. И наконец извлечения и сортировки клеток человека и крыса происхождения после пробирного анализа может быть сложным. Однако конкретные протеиназы, включая dispase и решение восстановления клеток может применяться для восстановления клеток для иммунофенотипических или гена анализ выражения.

По сравнению с существующими методами, которые культура типа единого эндотелиальных клеток или жить животных систем, это представил пробирного использует сочетание ex vivo аорты ткани и БМЭ. Эта установка позволяет пользователю получить качественные и количественные данные, выяснения ангиогенных свойства ячейки терапии кандидатов. Сочетая БМЭ и многоклеточной ex vivo ткани предоставляет свойства, тесно имитирует микроокружения, что тип терапевтического ячейки могут столкнуться после местной администрации. Из-за возможности большое количество параллелей и тесного контроля над культуры условий оператор предоставляется с системой, которая содержит необходимые элементы для надежной оценки, а устранение переменных и несоответствия в Животные модели. Кроме того оценки являются более осуществимым, потому что это уменьшает стоимость и необходимость повторных процедур животных. Одноячеистый анализов и большинства животных моделей отсутствие факторов и переменных, представленный иммунных реакций, которые могут возникнуть в клиническое применение клетки терапии кандидатов. Воспалительный процесс изменяет ангиогенеза и, следовательно, терапевтический эффект имплантированных веществ или клетки не могут быть количественно точно. Assay аортального кольца исключает многих воспалительных компонентов, которые будут беспокоить пробирного измерений. Однако она содержит резидентов макрофаги, которые являются важными игроками в развитии microvasculature32. С легкой идентификации эндотелиальной сети и prestained человеческих клеток эффект MSC выделяется воспалительных цитокинов и даже клеточных элементов иммунной системы, можно легко заметить используя этот assay.

Высокий контроль над условиями пробирного и воспроизводимый характер экспериментальной установки пользователем позволяет введение дополнительных элементов в системе. Во-первых аортального кольца assay может использоваться как модель травмы. После встраивания аортального кольца и эндотелиальных прорастания, анализов могут быть введены ишемического повреждения, воспалительные факторов (TNF-α) или бактериальной липополисахарида (LPS), следуют MSC дополнение для определения возможных спасения ангиогенных ответ после травмы. Во-вторых для выяснения возможных механизмов как MSCs способствовать ангиогенных ответ, neutraliЗин антитела могут быть использованы для замолчать потенциальных рецепторов критических для взаимодействия к ячейке. Наконец исследовать свойства паракринными MSCs, аортального кольца assay может быть установка в систему transwell, чтобы исключить эффект взаимодействия к ячейке ангиогенных ответ но фокус на паракринными свойства.

В резюме аортального кольца assay может оценить способность и потенции клетки терапии кандидатов посредничать ECM обработки, мигрируют в районы по ангиогенез и способствовать развитию судна через физический контакт. Аортального кольца ex vivo ангиогенеза assay может быть разработан как ценные, количественного предварительного отбора инструмент для кандидата клеточных линий для восстановительной терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Доктор Клиффорд л Librach является совместное держателем патента: методы изоляции и использования клеток, полученных от первого триместра ткани пуповины. Предоставлено в Канаде и Австралии.

Acknowledgments

Авторы поблагодарить следующих сотрудников и исследования персонала: Andrée Готье-Фишер, Мэтью Librach, Таня Барретто, Tharsan Velauthapillai и Сара Laronde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).

Tags

Биология развития выпуск 127 ангиогенез аортального кольца пробирного миграции клеток эндотелиальных сети Мезенхимальные стромальные клетки физических взаимодействий паракринными факторов периваскулярной клетки пуповины
Assay Сопредседатель культуры аортального кольца: Удобным инструментом для оценки потенциала ангиогенных мезенхимальных стромальных клеток <em>In Vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz,… More

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter