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Developmental Biology

El ensayo de co-cultivo del anillo aórtico: Una herramienta conveniente para evaluar el potencial angiogénico de las células mesenquimales estromales In Vitro

Published: September 18, 2017 doi: 10.3791/56083
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4,5
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

Summary

Aquí, presentamos un uso nuevo del ensayo de anillo aórtico donde prelabelled las células mesenquimales son cultivadas conjuntamente con redes endotelial derivado de aorta de rata. Este novedoso método permite la visualización de autoguiado hacia el blanco las células estromales mesenquimales (MSCs) y la integración con redes endoteliales, cuantificación de propiedades de red y la evaluación del MSC immunophenotypes y expresión genética.

Abstract

La angiogénesis es un proceso complejo y altamente regulado responsable de proveer y mantener la perfusión adecuada del tejido. Mantenimiento insuficiente de la vasculatura y malformaciones patológicas pueden resultar en graves enfermedades isquémicas, mientras que demasiado abundante desarrollo vascular está asociado con cáncer y enfermedades inflamatorias. Una forma prometedora de la terapia pro-angiogénica es el uso de fuentes de células angiogénicas, que puede proporcionar factores reguladores, así como soporte físico para el desarrollo de nueva vasculatura.

Células estromales mesenquimales (MSCs) son candidatos extensivamente investigados para la regeneración vascular debido a sus efectos paracrinos y su capacidad para detectar y hogar de los tejidos isquémicos o inflamados. En particular, primer trimestre células perivascularias de cordón umbilical humano (FTM HUCPVCs) están un candidato muy prometedor debido a su propiedades pericyte-como, alto potencial proliferativo y del multilineage, propiedades inmunes privilegiados y paracrina robusto Perfil. Evaluar con eficacia potencialmente células regenerativas angiogénica, es un requisito para probar en confiable y ensayos preclínicos "traducible". El ensayo del anillo aórtico es un modelo ex vivo angiogénesis que permite fácil cuantificación de estructuras endoteliales tubulares, ofrece accesorios apoyo células y matriz extracelular (ECM) del anfitrión, excluye componentes inflamatorios y es rápido y barato configurar. Esto es ventajoso en comparación con modelos en vivo (p. ej., análisis de córnea, Matrigel enchufe de ensayo); el ensayo de anillo aórtico puede seguir las células administradas y observar las interacciones intercelulares evitando xeno inmune rechazo.

Presentamos un protocolo para un uso nuevo de la prueba del anillo aórtico, que incluye MSCs humanos en co-cultivos con redes endotelial aórtica de la rata en desarrollo. Este análisis permite el análisis de la contribución de MSC para formación y desarrollo a través de interacciones físicas pericyte-como del tubo y de su potencia para activamente migrar a sitios de la angiogénesis y para evaluar su capacidad para realizar y mediar Procesamiento de ECM. Este protocolo proporciona más información sobre cambios en MSC fenotipo y expresión genética después de co-cultivo.

Introduction

El complejo proceso de la angiogénesis mejora y mantiene la perfusión del tejido de sangre nueva buque promoción de las preexistentes vasculatura1. Es un proceso estrechamente regulado y equilibrado por factores pro-angiogénicos y antiangiogénicos. Cualquier deficiencia en este sistema puede llevar a buque insuficiente mantenimiento o crecimiento, causando graves enfermedades isquémicas, incluyendo enfermedad miocardio, accidente cerebrovascular y trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, el exagerado desarrollo vascular es característica para condiciones como cáncer y trastornos inflamatorios2.

Desarrollo de terapias que tienen como objetivo controlar la angiogénesis para lograr regeneración tisular favorable es de importancia clave. A pesar de extensas investigaciones preclínicas y clínicas, intentos para estimular la angiogénesis mediante microRNAs y factores pro-angiogénicos han fracasado para lograr los resultados deseados3,4,5. Posibles razones de los efectos transitorios incluyen: longevidad limitada de proteínas angiogénicas y ácidos nucleicos y el finito número de objetivo de6,de factores de crecimiento7. Aunque factores angiogénicos solubles son esenciales para iniciar la angiogénesis, el mantenimiento y la funcionalidad de vasculatura dependen de apoyo tipos de células incluyendo células de pericitos y músculo liso8. El campo de la favorable-angiogenic terapias ahora está explorando fuentes potenciales de células madre y progenitoras celulares que pueden proporcionar factores angiogénicos localmente, mientras que apoyar físicamente recién desarrollado vasculatura, uno mismo-renovar o incluso diferenciarse en las células endoteliales como9,10. Encontrar la óptima angiogénicos tipos celulares con la capacidad para cumplir con estos requisitos funcionales sostiene una gran promesa para la regeneración de tejido isquémico.

Con el fin de traducir con éxito terapias basadas en células potenciales en ensayos clínicos, los estudios preclínicos necesitan demostrar su eficacia y resaltar los mecanismos angiogénicos subyacentes. A pesar del alto número de ensayos de angiogénesis establecida, el campo carece de un análisis de "estándar de oro" en vitro que confiablemente podría evaluar la eficacia del potencial candidato célula tipos11,12, 13. mayoría en vitro angiogénesis ensayos (incluyendo los ensayos de formación endoteliales de proliferación, migración y tubo) por lo general evaluación los efectos de las células o compuestos en cambio fenotípico o diferenciación en células endoteliales tubulares y estructuras de red14,15. Mientras que estas características son esenciales para la angiogénesis, también debe de evaluar un ensayo "traducible": 1) el aumento o reemplazo de los tipos celulares soporte incluyendo pericitos o células musculares lisas, 2) el proceso del ECM o la membrana del sótano, y 3). la eficiencia para promover la formación de microvascularización funcional. En vivo modelos de angiogénesis, incluyendo la córnea ensayo y ensayo de tapón de Matrigel, recapitulan el microambiente único en vivo pero se enfrentan con la dificultad de seguimiento administrado células para observar interacciones físicas. Además, en modelos en vivo , xeno inmune rechazo puede ocurrir durante la prueba de potencial de candidatos de terapia allogeneic de la célula16. Ex vivo modelos de angiogénesis, particularmente el ensayo del anillo aórtico puede proporcionar: 1) la fácil observación y cuantificación de estructuras tubulares, células de apoyo 2) accesorias, 3) ECM de acogida y de fuentes artificiales, 4) exclusión de inflamatoria componentes y 5) configuración rápida y barata17,18. Por lo general, el ensayo de anillo aórtico puede probar el potencial angiogénico de pequeñas proteínas secretoras, agentes farmacológicos y modelos de roedores transgénicos19,20,21.

MSCs son candidatos prometedores para la regeneración vascular principalmente a través de sus efectos paracrina mediada22,23,24. MSCs se ha demostrado que secretar factores angiogénicos clave como Factor de crecimiento endotelial Vascular (VEGF), Factor de crecimiento de hepatocito (HGF), Factor de crecimiento insulínico-1 (IGF-1), Factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) básicos y angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs pueden también detectar y tejidos hogar de isquémico o inflamada, sin embargo, los mecanismos exactos son todavía objeto de investigación. Cada vez más, la literatura apoya la hipótesis de que MSCs mayoría surgen de células perivasculares, co expresan pericyte marcadores, pueden comportarse como del pericitos27. HUCPVCs son una fuente joven de MSCs derivada de la región perivascular del cordón umbilical humano. Representan una población de MSCs con pericyte-como las características y se han caracterizado de cordón umbilical FTM y término. HUCPVCs FTM demuestran una alta expresión de marcadores pericyte incluyendo propiedades de privilegio inmunitario CD146 y NG2, alto potencial proliferativo y del multilineage y mostrar un perfil robusto paracrina del28. HUCPVCs FTM son un tipo de célula del candidato ideal para promover la regeneración del tejido lesionado mediante la promoción de nueva vasculatura a través de sus propiedades pericyte-como.

Para probar el potencial angiogénico y pericyte-como propiedades de MSCs humanas, un número muy limitado de ensayos de angiogénesis es migración de angiotropic disponible donde positivo (en lo sucesivo denominado el "homing"), ECM procesamiento y desarrollo de la física interacciones entre tipos de células pueden investigarse, mientras que la obtención de datos cuantitativos en el desarrollo de la microvascularización.

Por este medio presentamos un protocolo que describe un uso nuevo del ensayo de anillo aórtico. MSCs humanos fueron cultivadas conjuntamente con redes endoteliales aórticas derivados de rata en desarrollo para evaluar su contribución a la formación, maduración y homeostasis del tubo. Esta versión del ensayo de anillo aórtico evalúa la capacidad y la potencia de los candidatos de terapia celular inicio a sitios de la angiogénesis, realizar median el procesamiento de ECM y contribuir al desarrollo tubular endotelial mediante el establecimiento de pericyte-como física interacciones. Además de cuantificar el efecto neto de MSCs en vitro formación red endotelial y la observación de las interacciones intercelulares, nosotros también optimizado un protocolo para aislar MSCs de co-cultivos. Mediante qPCR y citometría de flujo, es posible caracterizar cambios en MSC fenotipo y expresión genética después de co-cultivo. Como tipos de la célula del modelo, se compararon ontogeneticamente temprano (prenatal) y últimas fuentes (adultas) de MSCs humanos: mAh HUCPVCs y humanas derivadas de la médula ósea MSCs (CMMo), respectivamente, en el análisis del anillo aórtico. Proponemos que el ensayo de anillo aórtico puede utilizarse para estudiar el potencial angiogénico de cualquier tipo de célula física apoyo cuando bajo investigación para aplicaciones regenerativas angiogénicos.

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Protocol

todos los estudios que involucran animales fueron realizados e informados según llegar directrices 29. Todos los estudios fueron realizados con la aprobación de la Junta de investigación institucional ética (número de REB 4276). Animales todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de cuidado Animal de la red de salud de la Universidad (Toronto, Canadá), y todos los animales recibieron atención humanitaria conforme a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8 th edición ( Institutos nacionales de salud 2011).

1. instalación de ensayo de anillo aórtico

  1. aislante de la aorta de rata.
    1. Euthanize 8 - 10 semanas de edad ratas Sprague-Dawley con CO 2 asfixia: conjunto CO 2 cámaras al 20% de reemplazo de gas (caudal = 0.2 x cámara volumen/min). Confirmar la ausencia de sujetador reflejo y corazón latidos palpando pecho.
    2. Mojar la piel en el área del pecho con una gasa esterilizada con etanol al 70%. Utilizar pinzas esterilizadas y tijeras para hacer una incisión en la línea media del tórax y cortar a través de capas de piel y músculo.
    3. Una vez que está expuesta la caja torácica, corte las costillas en cada lado y dobla hacia arriba unos 5 mm desde el esternón a cada lado. Algún sangrado se espera de arterias intercostales en cadáveres frescos.
    4. Empuje el tejido pulmonar y el corazón a la derecha anatómica para exponer la aorta. La aorta es el blanco color recipiente situado junto a la columna vertebral.
    5. Uso pinzas para pinzar la aorta (después del arco aórtico) y tijeras quirúrgicas para hacer la primera incisión mientras sostiene la aorta con fórceps. Al cortar la aorta, la cavidad torácica se llenará rápidamente de sangre, por lo tanto, es fundamental para trabajar con rapidez para obtener la aorta antes de la coagulación de sangre.
    6. Pinzas uso pelar suavemente la aorta hacia abajo, lejos de la columna vertebral y la aorta. El tirón será cortar las arterias intercostales sin más incisiones. Obtener aproximadamente 10 cm de tejido o antes de que la aorta se divide en dos ramas en la cavidad abdominal y corta la aorta de la canal. Empuje el diafragma si es necesario a la dirección caudal para tener acceso para bajar las secciones de la aorta.
      Nota: Pelar la aorta suavemente porque fuerza intensa puede hacer que se rasgue. Si las lágrimas de la aorta, permite la coagulación de la sangre durante unos segundos y utilice una toalla de papel para remover la sangre coagulada, lo que permite visibilidad de la aorta remanente.
    7. Coloque la aorta en un tubo de 15 mL con 10 mL de helado Hank ' s solución sal balanceada (HBSS) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Mantener los tubos en hielo.
      Nota: El tejido aórtico puede durar 1-2 h en el hielo pero es mejor procesar lo antes posible.
  2. Preparar los medios de cultivo de ensayo de anillo aórtico en un estéril gabinete de bioseguridad (BSC).
    1. Preparar el medio de crecimiento endotelial (EGM) utilizando una unidad de filtración para filtrar 500 mL de medio Basal endotelial (EBM) suplementado con 2% de suero bovino Fetal (FBS), gentamicina 1% y factores de crecimiento (véase Tabla de materiales). Coloque 50 mL de los medios de filtrado en un baño de agua o grano a 37 ° C.
    2. Utilizar otra unidad de filtración para filtrar 100 mL de EBM suplementado con 2% de SBF y el 1% P/S a preparado el EBM 2% FBS (EBM-FBS) y almacenar a 4 ° C.
  3. Capa de placas de cultivo de tejidos 12-bien con extracto de membrana Basal (BME) mientras trabajaba en el hielo.
    1. Lugar una placa de 12 pozos sobre una superficie fría (paquete de hielo grande o bandeja). Agregar 200 μL/pocillo de recién descongelados usando BME refrigerados puntas de pipeta y remolino BME para asegurar incluso la capa. Trabajo rápidamente para evitar la polimerización desigual de la BME.
      Nota: La supresión de una aorta típica rinde 20 anillos aórticos. Para tener en cuenta la variabilidad entre los ensayos del anillo aórtico, configurar al menos tres ensayos de anillo aórtico por grupo de tratamiento e incluyen un control. Si la fuente lo permite, se recomienda 6 anillos por grupo de tratamiento.
    2. Colocar las placas recubiertas en incubadoras humidificados (37 ° C, humedad relativa de 95%, 5% CO 2, estas condiciones se aplican a todos los pasos incubadora humidificada en adelante) para 30 minutos lugar 1.000 puntas de pipeta μl nuevamente dentro de-20 ° C para paso 1.5.3.
      Nota: Mientras que el extracto de la membrana basal se usa en la concentración de acciones, su consistencia y rigidez está estrictamente controlado por el tiempo de polimerización. Asegúrese de mantener los tiempos de polimerización mismo exactos para todos los paralelos y experimentos independientes.
  4. Sección de la aorta en uniforme anillos.
    1. Tomar la aorta desde el tubo de 15 mL y colóquelo en un plato de 10 cm con 10 mL de HBSS dulce suplementado con 1% P/S.
    2. Utilizar dos juegos de pinzas para separar cuidadosamente el exceso de tejido conectivo, tejido adiposo y utilice un bisturí para las restantes ramas de las arterias intercostales conectado a la aorta. Esto reduce la variabilidad entre las unidades del anillo basado en diferentes niveles del tejido residual. Quite cualquier residuo coagulado la sangre del interior de la aorta.
    3. Coloque una regla o cuadrícula bajo el plato de 10 cm para cortar precisamente 1-2 mm de amplios sectores de la aorta mediante pinzas y bisturí estéril. Corte las secciones tan exacto como sea posible para reducir la variabilidad entre las unidades.
  5. Incrustar los anillos aórticos en BME.
    Nota: Si el seccionamiento de anillos aórticos no se completa antes de la incubación de polimerización de BME, retire las placas cubiertas de incubadoras humidificados y añadir 100 μl de EBM a cada bien para terminar la polimerización. Sincronización exacta es crítica como excesiva polimerización de BME puede interferir con la red endotelial desarrollo y migración celular. Una vez preparados los anillos aórticos, quitar el EBM de los pozos y continuar desde el paso 1.5.2.
    1. Quitar los pozos BME revestido de las incubadoras humidificadas y volver a la BSC.
    2. Cuidadosamente recoger anillos aórticos individuales con pinzas y coloque uno en el centro de cada pozo revestido de BME. Repetición de los restantes anillos aórticos.
      Nota: Medios trasladados junto con el anillo aórtico se deben tener un mínimo para evitar las irregularidades de la polimerización.
    3. Uso refrigerado (-20 ° C) 1.000 μl puntas de pipeta añadir 300 μL de BME en la cima de cada anillo aórtico y distribuir uniformemente el BME alrededor del pozo.
    4. Devolver los anillos aórticos incrustados a las incubadoras humidificados durante 30 minutos
    5. Quitar las placas con el anillo aórtico embebido de las incubadoras humidificadas y lentamente agregue 1 000 μl de EGM (preparada y calentada a paso 1.2.1) mediante la colocación de la pipeta de punta contra la pared de la cultura bien.
      Nota: Pipetear directamente los medios de comunicación sobre BME puede interrumpir la BME polimerizado y frenan desarrollo continuo red endotelial. Use una pipeta multicanal correspondiente si está disponible.
    6. Después de 24 h, retirar 1.000 μl de EGM y cambiarlo por 1 000 μl de EBM-FBS preparado en el paso 1.2.2, otra vez transfiriendo lentamente contra el lado de la cultura bien.
  6. Mantener el ensayo del anillo aórtico mediante la sustitución de 500 μl de EBM-FBS con 500 μl de fresco EBM-FBS (37 ° C) cada 48 h.
    Nota: Véase sección 2 para iniciar la expansión de la cultura MSC en el mismo día como establecimiento de ensayo del anillo aórtico. Esto se asegurará de que MSCs están listos para el cocultivo cuando las redes endoteliales.
  7. Utilizar la microscopía de campo brillante para seguir desarrollo de red endotelial de ensayo de anillo aórtico (vea la figura 1 como referencia para el desarrollo óptimo de la red). Una vez el aspecto endotelial redes como se muestra en la figura 2, proceder con la configuración de los co-cultivos de ensayo MSC anillo aórtico (sección 3). Consulte el paso 4.1 para más detalles de la proyección de las redes endoteliales de.

2. Cultivo de tejidos

  1. preparar las soluciones madre de medios de cultivo de tejidos.
    1. HUCPVCs de cultura FTM (previamente establecidas, n ≥ 3 líneas independientes para cada uno) 30 y BMSCs comercialmente disponibles en alfa-MEM suplementado con 10% FBS y 1% P/S.
    2. Esterilizar los medios de comunicación utilizando un botellas de filtro de tamaño de poro de 0,2 de μm.
    3. Almacenar las soluciones de medios preparados a 4 ° C hasta por 3 semanas.
  2. HUCPVC FTM mantener y CMMo culturas en incubadoras humidificados y paso en el 70-80% de confluencia determinado por microscopía de contraste de fase. Uso adecuados volúmenes de medios de comunicación para el tamaño del plato de cultivo de tejidos utilizan (es decir, 10 mL en un plato de 10 cm). Utilice estas condiciones de cultivo para el mantenimiento y pases el MSCs.
  3. Disociar las monocapas MSC para pases o anillo aórtico ensayo-MSC Co culturas usando una solución de enzima de disociación (plato de 4 mL/10 cm) e incuban en los incubadores humidificados para asegurar la separación de las células mediante microscopía de campo brillante de 3 minutos; Incube para un adicional 1-2 min si es necesario.
  4. Transferir las células disociadas a un tubo de 15 mL y centrifugar a 400 x g por 5 min
  5. Aspire el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares y resuspender las células en 1 mL de un medio de cultivo apropiado (alfa-MEM completo los medios de comunicación para pases de células o EBM-FBS para anillo aórtico co-cultivos de ensayo/MSC) para contar con un contador celular.

3. Preparación de co-cultivos de ensayo/MSC anillo aórtico

  1. semilla 10 4 MSCs en cada integrado anillo aórtico (9.000 células/cm 2 / 12-pozo de la placa). Basado en el número de ensayos del anillo aórtico, la mancha MSCs con colorante fluorescente viable, intransferible. Mantener al menos tres pozos de anillos aórticos sin MSCs para un grupo de control.
    1. Mancha 10 medios 5 MSCs/mL EBM-FBS, añadir 2,5 μl de viable, medios intransferibles tinte fluorescente/mL (5 μm) en un tubo de 15 mL y colóquela en la incubadora humidificada durante 30 minutos mezclan suavemente el tubo a la mitad de la incubación.
    2. Los siguientes 30 min incubación, agregar 1 volumen de frescos EBM-FBS a las células y centrifugar a 400 x g durante 5 min.
    3. Quite el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 1 mL de medio de EBM-FBS. Confirmar la coloración exitosa de MSCs mediante microscopía de fluorescencia.
  2. Eliminar las placas que contienen el anillo aórticas de la incubadora humidificada y quitar 500 μl de EBM-FBS de cada bien.
  3. Cuidadosamente la semilla 10 4 MSCs en 500 μl de EBM-FBS en cada anillo aórtico incrustado mediante pipeteo uniformemente alrededor de las redes endoteliales. Asegurar la distribución uniforme agitando suavemente la placa de cultivo.
    1. Agregar adicional EBM-FBS para asegurarse de que el volumen total de los medios de comunicación en las culturas co del ensayo/MSC anillo aórtico es 1.000 μl.
  4. Uso de microscopía de fluorescencia para visualizar las fluorescencia con MSCs en el ensayo de anillo aórtico.

4. microscopia

  1. microscopía de campo brillante de uso a la imagen de las redes endotelial de rata antes del ensayo de anillo aórtico/MSC culturas Co para mediciones iniciales (día 0) de las propiedades de red endotelial (p. ej., red longitud, bucles de red). Imagen 4 cuadrantes por bien del anillo aórtico de la sección más alejada de la red endotelial dentro de ese cuadrante. Redes de anillo de
    1. imagen la aorta tras el anillo aórtico ensayo/MSC Co las culturas a los 3, 5 y 7 días. Utilizar estas imágenes para cuantificar el efecto MSC en el desarrollo de la red endotelial.
  2. Usar microscopía de fluorescencia para MSCs etiquetadas en el análisis del anillo aórtico de la imagen.
    1. Siguientes 24 h de ensayo de anillo aórtico/MSC co-cultivos, usar microscopía de fluorescencia para visualizar MSC autoguiado hacia el blanco, elongación e integración con las redes endoteliales. Se superponen las imágenes fluorescentes de MSCs con las imágenes de campo brillante de las células endoteliales para observar la colocalización de ambos tipos de células.
    2. Imagen MSCs localizadas dentro de las redes endoteliales desarrolladas proximales en el tejido del anillo aórtico y MSCs localizadas en nuevo desarrollo de redes distales en el tejido del anillo aórtico ( figura 2).

5. El flujo Cytometry y qPCR

  1. un día antes de disociar las redes endotelial del anillo aórtico, descongelar dispase congelado a 4 ° C O/N. sección 5.3 es idéntico para la citometría de flujo y qPCR.
  2. Calentar 50 mL de dispase y 50 mL de 0.5% de tripsina en el grano o baño de 37 ° C.
  3. Recuperar las células para el análisis de los co-cultivos de ensayo/MSC anillo aórtico.
    1. Después de 1 semana de la cultura co del ensayo/MSC del anillo aórtico, eliminar los medios de cultivo y añadir 1 mL de Phosphate-Buffered salina (PBS) lentamente a cada uno bien por 3 minutos y retire. Repita este lavado dos veces más.
    2. Añadir 800 μl de pre calentado dispase en cada pocillo e incubar en las incubadoras humidificadas durante 15 minutos
    3. Quitar las placas de las incubadoras humidificadas y suspender dispase mediante pipeteo (5-10 x) para romper para arriba el BME y transferir el contenido de cada pocillo a tubos separados 15 mL.
    4. Repetir paso 5.3.3 nuevo con dispase fresco precalentado hasta no residual BME se observa en la cultura también. Agregar 1 volumen de PBS suplementado con 3% FBS a la suspensión de células dispase para inactivar la dispase. Quite los anillos aórticos flotando en la suspensión de células usando pipetas.
    5. Girar las suspensiones celulares a 400 x g por 5 minutos Retire el sobrenadante con cuidado, dejando 3 mL de la suspensión celular en el tubo de 15 mL.
      Nota: Una pelotilla sólida, obvio no puede ser visible, pero existen células y BME.
    6. Añadir 3 mL de tripsina 0,5% precalentadas a la suspensión de la célula y vigorosamente resuspender (5-10 x mediante pipeteo) células. Incubar las soluciones tripsinizaron celular en las incubadoras humidificadas durante 10 minutos
    7. Retirar las suspensiones celulares tripsinizaron incubadoras humidificados y añadir 6 mL de PBS suplementado con 3% FBS y resuspender tim unoses. Las suspensiones celulares a 400 x g por 5 min de la vuelta
    8. Cuidadosamente retire todo el sobrenadante, dejando el precipitado de células en el tubo y resuspender las células en 1 mL de PBS suplementado con 3% FBS en cada tubo.
    9. Filtro de la suspensión de células de 1 mL utilizando un colador de célula 70 μm para eliminar las células agregadas y BME residual de la suspensión de células. Contar las células en 1 mL de la suspensión celular usando un contador celular.
  4. Preparar las células para citometría de flujo. Suspensiones
    1. incubar la célula (10 5 células en 200 de μl de PBS suplementado con 3% FBS) con anticuerpos primarios (FITC o APC) conjugados fluoróforo (TRA-1 - 85 - CD146, CD31) concentración = 1:40) a 4 ° C por 30 min, protegidos de la luz.
      Nota: Citometría de flujo para MSCs se ha optimizado por Hong et al., 2013 28. Se requiere para una lectura precisa un mínimo de 10.000 células.
    2. Después de la incubación de 30 min, resuspender las células en 2 mL de PBS suplementado con 3% FBS y centrífuga (400 x g, 5 min).
    3. Mantener las células a 4 ° C protegido de la luz hasta el análisis por citometría de flujo (eventos de al menos 1 x 10 4) en 1 h. Para la bloquea, véase figura 1 complementaria. Ordenar MSCs humanos utilizando anti-TRA-1-85 (APC) (concentración: 1:40 y en 0.5% FBS/PBS) y clasificar las células en 350 μl de tampón de lisis de la célula para el análisis de qPCR.
      Nota: Células sometidas a lisis pueden conservarse a-80 ° C hasta 3 meses para análisis de qPCR futuro.
  5. Preparar las células para el análisis de qPCR.
    1. Aislar el ARN de las células sometidas a lisis mediante kits de aislamiento de RNA base de columna y determinar la concentración de RNA y la calidad.
    2. Prepare cDNA de hasta 5 μg de ARN por 100 μl reacción reversa del transcriptase. Realizar una etapa de pre-amplificacion si la producción de RNA es baja (< 10 ng/μL). Uso de menos de 100 ng de ARN resultará en una alta tasa de falsos negativos.
      Nota: Las plantillas de cDNA pueden conservarse a-20 ° C para su posterior análisis hasta 4 meses.
    3. Realizar la qPCR utilizando angiogénesis expresión profiler para detectar cambios en la expresión génica. Uso 5 ng de cDNA por reacción (ciclos de 40, 60 ° C temperatura de recocido/extensión). Express doble cambio de expresión frente a muestras de cDNA MSC derivada indiferenciadas. Ejecutar los correspondientes controles negativos (anillo aórtico sin MSCs humanas).

6. Red de cuantificación aórtica anillo ensayo/MSC Co culturas siguientes

  1. Descargar software tratamiento de imágenes como el ImageJ junto con angiogénesis Analyzer plugin 31.
  2. Importar imágenes de red endotelial y abrir usando el software.
  3. Convertir las escalas de imagen basadas en las especificaciones del microscopio utilizado.
  4. Utilizar una herramienta de línea recta para medir el crecimiento radial de la red.
  5. Contar los bucles de red endotelial utilizando la herramienta del contador de célula (lazos con al menos 4 lados deben ser cuantificadas).
  6. Para cuantificación adicional de propiedades de red, utilice el plugin del analizador de la angiogénesis u otros plugins similares para analizar segmentos de maestro, total longitud de segmentos, áreas de red total y el número de uniones. Utilice la herramienta de máscara borrosa para blur tejido del anillo aórtico y espacios vacíos para evitar falsos positivos cálculos.
  7. Transferir los valores a una estadística programa gráfico red endotelial propiedades y siguiendo los co-cultivos de anillo aórtico ensayo/MSC.

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Representative Results

El mismo flujo de trabajo para establecer el ensayo de co-cultivo anillo aórtico/MSC se demuestra en la figura 1. Los pasos principales son: la rata aorta aislamiento, seccionamiento y fijación de los anillos aórticos, monitoreo de brotes endoteliales y desarrollo de la red y finalmente etiquetado y administrar las MSCs. La línea de tiempo del análisis de red endotelial describe la ventana para el análisis factible para cada período de co-cultivo: día 1, 5 & 7. Notas adicionales se destacan por las cajas de puntos.

La identificación de las regiones estructuralmente distintas en las culturas de célula endothelial del anillo aórtico se realiza por microscopía de campo brillante, 3-5 d después de que los anillos aórticos están incrustados en ECM (figura 2). La zona no estructurada (figura 2A) se caracteriza como una región de proliferación celular alta pero baja organización estructural en las inmediaciones del tejido aórtico. Las redes endoteliales desarrolladas (figura 2B) se refieren a regiones con alta organización estructural, donde redes completamente y se compone predominante de bucles cerrados, incluso antes de la adición de MSCs. Las redes en desarrollo (figura 2) se encuentran en las zonas distales de las culturas endoteliales. Estos son los sitios de migración de la célula endotelial y el alargamiento como la nueva forma de estructuras de red. Las 3 regiones mencionadas son fácilmente identificables a lo largo de los experimentos y se utilizan al hacer referencia a donde los MSCs alberga en las culturas Co. MSCs prelabelled deben ser cultivadas conjuntamente con el ensayo de anillo aórtico cuando han desarrollado los tres segmentos de red. La cuantificación de redes endoteliales después de co-cultivos MSC incluyen regiones de red desarrollada y en desarrollo (figura 2, marco blanco).

Microscopía de fluorescencia permite mediciones cualitativas de MSC migración, integración y morfología junto con el desarrollo de redes endoteliales en el ensayo de cocultivo de MSC de anillo aórtico (figura 3). El MSCs marcados con fluoróforo viable, citoplásmico se reflejada 24 h después de la administración a co-cultivos. HUCPVCs FTM se encontraban en la periferia de las redes en desarrollo endoteliales muestran morfologías celulares alargadas y contribuyó al desarrollo de redes endoteliales (Figura 3A, B). Para la comparación, BMSCs alojados a las redes en desarrollo mientras se muestra menos interacción con las células endoteliales (figura 3, D). Imágenes de magnificación de alta a las 72 h demostraron que FTM HUCPVCs mantiene una cobertura alta y estabilización de redes endoteliales mientras BMSCs en co-cultivos presentadas con morfologías esféricas con integración limitada en redes endoteliales (figura 3E , F). Observado diferencias demuestran claramente las diferencias cualitativas, funcionales entre tipos humanos de MSC. Un tipo de célula candidato terapéutico que tiene significativa autoguiado hacia el blanco y las características de integración endotelial (Figura 3A, B & E) está parado hacia fuera en comparación con un tipo de células con integración limitada red endotelial y aumento de capacidades (figura 3, D & F).

Se adquirieron imágenes de microscopía de fluorescencia de alta magnificación para diseccionar más interacciones físicas entre las células endoteliales y HUCPVCs FTM en redes tubulares. La HUCPVCs FTM etiquetadas (Figura 4A, verde) se muestran adhesión con las células endoteliales sin manchas (Figura 4A, blanco las flechas). HUCPVCs FTM fueron encontrados para proporcionar soporte estructural a las células endoteliales al servir como una superficie eje y conexión entre nodos. Las redes de anillo aórtico endotelial también pueden ser etiquetadas con un fluoróforo viable igual que el MSC tinción (Figura 4B, rojo). Doble tinción co-cultivos, microscopía de fluorescencia reveló alargadas adherencias entre los dos tipos celulares, fortaleciendo la observación de cooperación y comportamiento solidario de la célula.

La cuantificación de las propiedades estructurales de red endotelial fue realizada en el día 5 de co-cultivos MSC (figura 5). Cuadrantes uniforme fueron definidos para la medición en toda la red endotelial todo anillo aórtico (figura 2, marco blanco). El crecimiento de la red de media se calculó como la distancia de los bucles de red cerrada proximal primer anillo aórtico, a los más lejos lazos cerrados distales (tamaño de radio) (figura 5A). El crecimiento de la red media de co-cultivos anillo aórtico-MSC fueron los siguientes: HUCPVCs FTM (2.98 ±0. 3 mm) y BMSCs (1,5 ±0. 15 mm). Las redes untreated endoteliales desarrollaron un radio promedio de 1,9 ±0. 1 mm. La comparación estadística entre los grupos de tratamiento MSC demostró que FTM HUCPVCs contribuido al mayor crecimiento de la red en comparación con BMSCs y redes no tratadas (p ≤0.001). El endoteliales redes desarrollado significativamente más de CMMo conteniendo co-cultivos (p ≤0. 01) (figura 5B).

El número total de bucles se calcula en cada cuadrante y expresado en la formación del bucle total promedio (figura 5). El número promedio de bucles cerrados total fueron los siguientes: HUCPVC FTM tratados co-cultivos (±7 81), BMSCs (26 ±3) y no se trata de anillos (55 ±7). FTM HUCPVCs contribuyó a la formación de bucle endotelial significativamente mayor comparado con redes no tratadas (p ≤0. 01) y BMSCs (p ≤0. 01). La CMMo Co culturas dio como resultados menos endotelial bucles comparado con redes no tratadas (p ≤0. 01) de la red. Esta cuantificación identifica un tipo de células que tiene un efecto significativamente positivo en el desarrollo de la red endotelial (FTM HUCPVC) y un tipo de células que puede incluso afectar redes endoteliales. Debe tenerse en cuenta que el desarrollo de la red aumentó significativamente fue observado para correlacionar bien con la cobertura MSC en las redes endoteliales. Sugiere que las interacciones directas son fundamentales para el MSCs ejecutar su función de apoyo.

Posibles peligros de los establecimientos de cultura Co anillo aórtico están representados en la figura 6. Polimerización inadecuada o irregular de BME es un problema que puede interferir con el desarrollo de la exitosa red endotelial. La polimerización BME durante exactamente 30 minutos de la sincronización y la transferencia de los medios de comunicación sin interrumpir el polímero se asegurará de una fase BME intacta y funcional (figura 6A). Coloración el MSCs para tiempos de incubación prolongados y permitiendo que las MSCs a pellets por largos períodos pueden interferir con la morfología celular y el fenotipo en co-cultivos. La figura 5B muestra HUCPVCs FTM manchado durante 1 hora y permitiópara pellets de 1 h antes de la cultura, ambos que son tiempos de óptimos. HUCPVCs FTM no mostrar preferencia a sitios de redes endoteliales y están dispersos en toda la red. Comparar correctamente tratados las células (figura 3) para obras HUCPVCs de FTM, las células CNDH Mostrar la morfología de la célula redonda y limita las interacciones célula a célula con las células endoteliales (Figura 6B). Por último, si el ensayo de anillo aórtico no se puede establecer el día de la disección, las aortas pueden ser almacenados a-80 ° C en medios de comunicación EGM-C suplementado con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y 10% FBS. El desarrollo de la red endotelial puede tomar 1-3 d más al aplicar anillos aórticos descongelados comparados con tejido fresco, pero las redes endoteliales será suficientes para el establecimiento de la cultura MSC (figura 6).

Como un procedimiento alternativo de la evaluación de la cultura del anillo aórtico, la fracción celular de anillos aórticos BME incrustado puede extraerse y analizada por citometría de flujo (figura 1 complementaria). El marcador específico humano población de TRA-1-85 (complementario de la figura 1A, B, eje y) positivo de la célula de HUCPVC FTM que contiene co-cultivos fue identificado como MSCs humanos. El etiquetado Co demostró la baja expresión del marcador de células endoteliales CD31 (complementario de la figura 1A) y alta expresión del marcador pericyte CD146 (figura suplementaria 1B) dentro de la población de positivo de la célula humana marcador específico. Tal evaluación puede descifrar eventual immunophenotypic y cambios de compromiso de linaje de las MSCs inducidos por las interacciones con las células endoteliales y proporcionar más información valiosa sobre el tipo de celular probado. Con el fin de obtener un número suficiente de células para el análisis de la FC, se pueden combinar las células extraídas de pozos paralelos de un mismo grupo experimental. Es importante considerar el uso de MSC no-pre-manchadas que contienen los anillos aórticos para análisis de citometría de flujo para que la recuerda a fluorescencia del tinte viable no interfiere con la señal de los fluoróforos relacionadas con el anticuerpo. De lo contrario la compuerta negativa debe tomar la fluorescencia de células previamente manchada en consideración.

Nos ordenan MSCs extraído forma anillo aórtico Co culturas humanas (día 7 de co-cultivo) usando el anticuerpo específico del marcador superficial de la célula humana (TRA-1-85). HUCPVCs FTM y BMSCs recuperados del ensayo del anillo aórtico se procesaron para que el análisis de qPCR probar la expresión de genes angiogénicos. Utilizando una matriz de qPCR comercialmente disponibles, tres culturas Co anillo aórtico proporcionan cantidades suficientes de material genético para cuantificar la expresión de genes de factor de crecimiento humano 84 (figura complementaria 2A). Los resultados preliminares indican que HUCPVCs FTM y BMSCs expresar factores angiogénicos secretados clave nivel comparable (suplementario figura 2B). Además de comparar los niveles de expresión de diferentes tipos de células en el ensayo, el efecto de transferir las células a EBM basado en análisis de medios de comunicación de sus medios de cultivo de expansión deben ser considerado. Cuando se utilizan células de mayor plasticidad fenotípica o genética, un grupo de control del comparador de MSCs humanos en medios EBM - sin tejido aórtico - debe incluirse en la evaluación.

Las similitudes en la expresión de factores angiogénicos de MSCs sugiere que la diferencia significativa en el aumento de su red no es un resultado de paracrine diferentes actividades. Esto está en concordancia con la observación anterior que mayor interacción intercelular directa aparece para promover el desarrollo de la red endotelial.

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático de un uso nuevo de la configuración del ensayo de anillo aórtico.
Los pasos principales de la instalación y el análisis de culturas Co MSC con el ensayo de anillo aórtico se contornean en cajas sólidas y notas adicionales se exponen en cajas de puntos. Barra de escala = 1.000 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagen de representante de la análisis de la red de anillo aórtico.
Redes endoteliales se dividen en tres regiones concéntricas basadas en diferencias estructurales: área no estructurado en proximidad cercana a tejido de anillo aórtico (A), desarrollado/estructura endoteliales redes (B) y en desarrollo de redes situado en la periferia de la ex vivo cultivo de tejidos (C). Crecimiento de la red radial y cuadrante uniforme para la cuenta de lazo se definen dentro de la red endotelial desarrollada (B). x: cerrado endotelial contado en cuadrante uniforme. Barra de escala = 250 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Fluorescente región depende de la proyección de imagen de red integración de humanos MSCs en el análisis del anillo aórtico tras 24 & h 72.
Prestained HUCPVCs (verde) de la FTM y BMSCs fueron agregados a las redes de tubos endoteliales anillo aórtico en vías de desarrollo. Imágenes de microscopía de fluorescencia tomadas 24 horas después de establecer culturas Co MSC Mostrar HUCPVCs FTM que migran a través de la ECM y el hogar para redes endoteliales en desarrollo periférico (A). Más imágenes de aumento muestran morfologías alargadas HUCPVCs FTM en estrecho contacto con las redes endoteliales (B). Menos BMSCs proceso del ECM y el hogar redes endoteliales con ninguna preferencia observable a las redes en desarrollo periféricas (C). BMSCs Mostrar morfologías celulares esféricos (D).
Magnificación de alta fluorescencia microscopía las imágenes de prestained MSCs en ensayo del anillo aórtico de ratas después de 72 h de cocultivo (E, F). HUCPVCS FTM presentar morfologías alargadas mientras se muestra la cobertura endotelial a través de directas interacciones célula a célula con las células endoteliales (flechas blancas sólidas) en nodos de la red y túbulos (E). BMSCs mantener la morfología de células esféricas agrupada en los nodos de red endotelial (F). Broken arrow representa la dirección del crecimiento del red endotelial del tejido del anillo aórtico. A, C: Barra de escala = 1.000 μm B, escala D:Bar = 400 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Magnificación de alta fluorescencia microscopía imágenes de interacciones físicas Pericyte-endotelial de la célula.
Las células endoteliales sin manchas se encontraron asociados a protuberancias continuas conectando previamente manchada HUCPVCs FTM en la Red tubular (A). Imágenes fluorescentes de redes endoteliales previamente manchadas (CE, rojo) con la manchada HUCPVCs FTM (FTM, verde) demuestran interacciones Recapitulando endotelial de la célula, las interacciones pericyte (B). A: bar escala = 100 μm escala B: barra = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cuantificación del crecimiento de la red en el tratamiento de MSC grupos 5 D después del establecimiento de la cultura.
Imágenes de microscopía de contraste de fase de ampliación baja fueron tomadas de los grupos de tratamiento de anillo aórtico para medir crecimiento de la red y el desarrollo (A). Dispersos de la flecha indica la dirección de crecimiento de la red. Barra de escala = 250 μm. microscopía de imágenes se utilizaron para cuantificar las propiedades de red, incluyendo el crecimiento de la red de media y significa formación de bucle de red en el cuadrante de un ensayo. HUCPVCs FTM contribuyó a un mayor crecimiento de la red en comparación con CMMo co-cultivos y redes no tratadas (p ≤0.001) (B). El valor de p se calculó usando un ANOVA unidireccional que p <0.0001 usando de Tukey Post prueba (N = 3). Se cuantificaron los bucles de red con al menos cuatro lados cerrados (C). FTM HUCPVC Co las culturas desarrollados bucles de red mayor en comparación con las culturas CMMo Co (p ≤0.001) y redes no tratadas (p ≤0. 01). El valor de p se calculó usando un ANOVA unidireccional que p < 0.0001 con Post test de Tukey (N = 3). El promedio de 4 campos de redes endoteliales fueron cuantificados. Barra de escala = 250 μm. Para la comparación pares, * = p ≤0. 05, ** = p ≤0. 01, *** = p ≤0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Posibles errores en el establecimiento de ensayo del anillo aórtico.
Aórticos anillos incrustados en la incompleta polimerización de BME pueden conducir a redes endoteliales inconsistentes y rotas (A). HUCPVCs FTM manchado durante largos períodos con diferencias de tiempo grande entre la coloración y el establecimiento de co-cultivos, rendimiento mínimo autoguiado hacia el blanco y las interacciones de la célula endotelial (B). La red endotelial de aorta de rata almacenado de-80 ° C y descongelar para ensayo de anillo aórtico (C). A: barra de escala = 250 μm B, C: escala bar = 400 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Complementarios Figura 1: Flujo Cytometry análisis de HUCPVCs FTM humano extraídos de co-cultivos de anillo aórtico.
Fracciones celulares de culturas anillo aórtico fueron aislados y procesadas para el análisis de citometría de flujo. Anticuerpos conjugados fluoróforo contra el marcador de superficie celular específico humano (TRA-1-85, APC) fue aplicado en combinación con marcador endotelial (CD31, FITC, (A)) o anticuerpos específicos de pericyte marcador (CD146, FITC, (B)). La población de células positiva para el marcador humano (eje y) había probado baja positividad para el marcador endotelial CD31 (A, P2) y positivo alto para marcador pericyte CD146 (B, P6). Esto sugiere que HUCPVCs FTM mantiene sus propiedades de célula perivascular en las culturas Co anillo aórtico y no desarrolló un fenotipo endotelial. Los cuadrantes en parcelas fueron definidos mediante los controles de isotipo que empareja los anticuerpos primarios aplicados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 2 complementaria: PCR cuantitativa análisis de Genes angiogénicos clave.
La similar expresión génica de genes angiogénicos clave HUCPVCs FTM y BMSCs después de 1 semana la cultura en el análisis del anillo aórtico (A). Valores representativos de la CT se muestran en la tabla (B). Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Hay varias etapas críticas en la creación de un ensayo de anillo aórtico exitoso experimento de cocultivo MSC. En primer lugar, los pasos más importantes cuando aislar y seccionar la aorta son: 1) obtener exclusivamente el segmento torácico de la aorta; 2) con cuidado quitar la ramificación de los vasos sanguíneos, conjuntivo y tejido adiposo y; 3) cortar hasta secciones de la aorta (~ 1 mm) para limitar la variabilidad entre cada ensayo. En segundo lugar, la incorporación exitosa de anillos aórticos en BME es fundamental para este ensayo. Si BME es no completamente polimerizado o polimerizado irregularmente, los anillos aórticos encajados BME no podrán iniciar brotes endoteliales o pueden desarrollar redes endoteliales discontinuas. Si la polimerización de BME es insuficiente, los ensayos no son confiables para la cuantificación. En tercer lugar, los medios endotelial completado enriquecida con factor es necesario para proporcionar el alimento para los anillos aórticos iniciar la brotación. Una vez los anillos anillo aórtico han iniciada vasos brotación, los pasos críticos próximos incluyen el tipo de la célula para ser probado. Con este fin, MSCs necesitan previamente teñidos y administrado a los anillos aórticos despunte con éxito. Existen dos procedimientos fundamentales para esta sección. 1) seleccionar el día apropiado para la siembra: las redes deben estar en la etapa de desarrollo y no llegar a una cobertura máxima de la cultura bien. Si el MSCs no se administran de manera oportuna, resulta difícil cuantificar los efectos netos de las MSCs en el desarrollo de la red. 2) prestaining el MSCs antes de la adición: si las MSCs se tiñen demasiado o permanecen en pellets para un extenso período de tiempo, agrupar ocurrirá que deteriora autoguiado hacia el blanco y la integración en redes endoteliales. Por último, cuantificar las redes fácilmente se puede lograr si se preparan los controles adecuados. Anillos de aorta sin MSCs desarrollará redes endoteliales porque la aorta misma soporta la brotación, pero el MSCs pueden promover un mayor desarrollo de la red con estructuras diferentes de la red como se describe en este manuscrito. La cuantificación de las redes endoteliales debe ser realizado al menos 5 días establecer cooperación culturas siguientes. Debido al sistema cerrado, respuesta angiogénica es transitorio y redes endoteliales empezar a degenerar después de aproximadamente 7 días. Si el propósito de la observación es evaluar el efecto del tipo de celular probado en el desarrollo de redes endoteliales, se deben adquirir las imágenes dentro de la primera semana de co-cultivo.

Una posible modificación del ensayo actual puede ser la aplicación de primario del tejido humano. Como una sección de 1 mm de la aorta de rata deja una unidad para el cocultivo, aortas humanas pueden proporcionar un gran número de secciones de medidas altamente consistentes. A pesar de la disponibilidad de tejido primario humano viable muy restringido, el alto rendimiento sugiere viabilidad potencial. En el desarrollo de un ensayo para las evaluaciones de gran escala, pueden considerarse formando previamente el análisis y almacenamiento de sus componentes hasta las células para la prueba estén disponibles. La capa de BME puede ser preparada en placas de cultivo de tejidos y almacenada en forma congelada, deshidratada por períodos más largos de tiempo. También, como hemos probado en nuestro laboratorio, tejido aórtico de ratas puede ser congelado y almacenado para uso posterior, así que trabajar con el elemento más crucial del ensayo más conveniente.

A pesar de las múltiples ventajas del ensayo de anillo aórtico, existen algunas limitaciones para figurar. En primer lugar, el establecimiento de los cultivos de ensayo puede ser difícil. En su forma actual, la aplicación rutinaria requiere habilidad manual suficiente. Errores de operador pueden introducir variabilidad. Puede ser reflejado en el crecimiento de la red y puede hacer difícil evaluar confiablemente el efecto de células administradas y, en consecuencia, las propiedades angiogénicas importante. Sin embargo, estos desafíos son similares si no menor comparados con los de otros métodos disponibles, y el período de capacitación puede ser convenientemente corto y económico en comparación con experimentos en vivo . En segundo lugar, un período de retraso entre la inclusión del tejido aórtico ex vivo y el desarrollo de la red inicial que marca el momento de la administración de células debe ser contabilizados por el usuario. En tercer lugar, la cuantificación de las propiedades de red endotelial puede ser desperdiciador de tiempo pero puede resolverse asignando parámetros de sello, incluyendo crecimiento radial, dimensiones de malla de red y longitud del tubo. Esto puede realizarse mediante análisis asistido por ordenador de imágenes (Image J), que puede disminuir significativamente el tiempo requerido para la cuantificación consistente y confiable. En cuarto lugar, la variabilidad entre cada ensayo puede ocurrir como resultado de inconsistencias leves en tejidos animales origen y manipulación por el operador. Se encontró que este reto puede superarse efectivamente y la cuantificación se convierte en estadísticamente fiable estableciendo triplicados para cada grupo de tratamiento. Por último, extraer y clasificar las células de humanos y origen de la rata para el análisis posterior al ensayo pueden ser difíciles. Sin embargo, proteinasas específicas, incluyendo dispase y solución de recuperación de la célula pueden aplicarse para recuperar las células para el análisis de immunophenotypic o gene expresión.

Comparado con los métodos existentes que un tipo de célula endotelial de la cultura o los sistemas animales en vivo, presentó este ensayo utiliza la combinación de ex vivo el tejido aórtico y BME. Esta configuración permite al usuario obtener datos cuantitativos y cualitativos, elucidar las propiedades angiogénicas de candidatos de terapia celular. Combinar la BME y multicelulares ex vivo tejido proporciona propiedades mímico de cerca el microambiente que puede encontrar el tipo de terapéutica celular después de la administración local. Debido a la posibilidad de un alto número de paralelos y el estricto control sobre las condiciones de cultivo, el operador está provisto de un sistema que contiene los elementos necesarios para la evaluación confiable, mientras que eliminar variables e inconsistencias en modelos animales. Además, las evaluaciones son más factibles porque reduce el costo y la necesidad de procedimientos repetidos de animales. Sola célula ensayos y modelos más animales carecen de los factores y variables introducidas por las respuestas inmunitarias que de lo contrario se producirían en la aplicación clínica de los candidatos de la terapia celular. La respuesta inflamatoria altera la angiogénesis y por tanto, el efecto terapéutico de las sustancias implantadas o las células no pueden cuantificarse con precisión. El ensayo de anillo aórtico excluye muchos componentes inflamatorios que perturban las mediciones de ensayo. Sin embargo, contiene macrófagos residentes que son jugadores importantes en la microcirculación desarrollo32. Con la fácil identificación de la red endotelial y prestained células humanas, el efecto de las citoquinas inflamatorias MSC secretada y elementos incluso celulares del sistema inmune, se pueden observar fácilmente mediante este ensayo.

Alto control por el usuario sobre las condiciones de ensayo y lo reproducible de la disposición experimental permite la introducción de otros elementos en el sistema. En primer lugar, el ensayo de anillo aórtico puede ser usado como un modelo de lesión. Tras la incorporación de los anillos aórticos y brotes endoteliales, ensayos pueden ser introducidos a la lesión isquémica, factores inflamatorios (TNF-α) o bacteriano lipopolysaccharide (LPS), seguido por la adición de MSC para determinar el posible rescate de angiogénicos respuesta después de lesión. En segundo lugar, para dilucidar los mecanismos posibles de cómo las MSCs contribuyen a la respuesta angiogénica, neutraliZing de anticuerpos pueden ser utilizados para silenciar a los receptores potenciales críticos para las interacciones célula a célula. Por último, para investigar las propiedades paracrino de MSCs, el ensayo de anillo aórtico puede configurar en un sistema transwell para excluir el efecto de las interacciones célula a célula de la respuesta angiogénica pero se centran en propiedades paracrino.

En Resumen, el ensayo de anillo aórtico puede evaluar la capacidad y potencia de los candidatos de terapia celular para mediar ECM procesa, migran a las áreas de la angiogénesis y contribuir al desarrollo de vasos a través del contacto físico. El anillo aórtico ex vivo análisis de la angiogénesis podría ser desarrollado como una herramienta valiosa, cuantitativa preselección para líneas celulares de candidato para terapia regenerativa.

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Disclosures

El Dr. Clifford L. Librach es común titular de la patente: métodos de aislamiento y uso de células derivadas de tejido de cordón umbilical de primer trimestre. Concedido en Canadá y Australia.

Acknowledgments

Los autores agradecemos a los siguientes funcionarios y personal de investigación: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai y Sarah Laronde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

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References

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Biología del desarrollo número 127 angiogénesis ensayo del anillo aórtico migración celular redes endoteliales células estromales mesenquimales interacciones físicas factores paracrinos células perivasculares cordón umbilical
El ensayo de co-cultivo del anillo aórtico: Una herramienta conveniente para evaluar el potencial angiogénico de las células mesenquimales estromales <em>In Vitro</em>
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Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

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