Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

سحب الأنابيب النانوية الأغشية من الحويصلات أونيلاميلار العملاقة

Published: December 7, 2017 doi: 10.3791/56086
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,4, 1,5
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR168, 2Department of Genetics and Complex Diseases, T. H. Chan School of Public Health, Harvard Medical School, 3Department of Cell Biology, Harvard Medical School, 4Sorbonne Universités, UPMC University Paris 06, 5Center for Studies in Physics and Biology, The Rockefeller University
* These authors contributed equally

Summary

شعور العديد من البروتينات في الخلية والحث على انحناء غشاء. يصف لنا طريقة لسحب الأنابيب النانوية الأغشية من الحويصلات الدهنية دراسة التفاعل بين البروتينات أو أي جزيء انحناء نشطة مع الأغشية منحنى في المختبر.

Abstract

إعادة تشكيل غشاء الخلية جزء لا يتجزأ من العديد من الظواهر الخلوية، مثل الالتقام، الاتجار، وتشكيل فيلوبوديا، و ما إلى ذلك. إقران العديد من البروتينات المختلفة الأغشية منحنى بسبب قدرتهم على الشعور أو الحث على غشاء انحناء. وتشمل هذه العمليات عادة، العديد من البروتينات يجعلها معقدة للغاية لدراسة كمياً في الخلية. يصف لنا وضع بروتوكول لإعادة تشكيل غشاء منحنى في المختبر، محاكاة بنية خلوية منحنى مثل الرقبة اندوسيتيك. حويصلة أونيلاميلار عملاقة (جوف) كنموذج لغشاء الخلية، الضغط الداخلي والتوتر السطحي الذي يتم التحكم بتطلع ميكروبيبيتي. تطبيق قوة سحب نقطة على جيوف استخدام الملقط البصري يخلق نانو انحناء عالية متصلة بغشاء مسطح. تقليديا، استخدمت هذا الأسلوب لقياس الخواص الميكانيكية الأساسية للأغشية الدهنية، مثل الانحناء الصلابة. في السنوات الأخيرة، قد اتسع لدراسة كيفية تفاعل البروتينات مع انحناء الأغشية وطريقة تأثيرها على الشكل والميكانيكا الأغشية. نظام الجمع بين ميكرومانيبوليشن و microinjection وملاقط بصرية، والفحص المجهري [كنفوكل] يسمح قياس انحناء الغشاء والغشاء التوتر والكثافة السطحية للبروتينات، وفي نفس الوقت. من هذه القياسات، يمكن الاستدلال على العديد من الخصائص الميكانيكية والمورفولوجية الهامة نظام غشاء البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، نحن وضع بروتوكول لإنشاء جوفس حضور تركيز الملح الفسيولوجي، وطريقة لقياس الكثافة السطحية للبروتينات في الغشاء من شدة الأسفار المسماة البروتينات والدهون.

Introduction

ويرافق العديد من العمليات الخلوية، مثل الالتقام، الاتجار، وتشكيل فيلوبوديا، والعدوى، إلخ، تغييرا جذريا في شكل أغشية الخلية1،2. في الخلية، يشارك عدد من البروتينات في هذه العمليات بملزمة للغشاء وتغيير شكلها. أبرز الأمثلة من أعضاء الأسرة البروتين بن/أمفيفيسين/رفس (بار)، والتي تحتوي على سمة من سمات منحنى عضويا بار المجال3،،من45،،من67. بشكل عام، أنها تتفاعل مع الغشاء بالتقيد بالمجال بار على السطح، وفي كثير من الحالات، لوالب amphipathic إدراج أيضا شالوولي بيلايير. يحدد الشكل والحجم، والمسؤول عن المجال بار جنبا إلى جنب مع عدد لوالب أمفيباثيك: (1) باتجاه انحناء غشاء (أيما إذا كانت ستؤدي إينفاجينيشنز أو نتوءات)، و (2) ضخامة الغشاء انحناء5،8. الملاحظة، هنا انحناء إيجابية يعرف الجانب المحدب الغشاء المنحنى، أي، الإنتفاخ تجاه الجسيمات المتفاعلة، والسلبية خلاف ذلك. وعلاوة على ذلك، كشفت الدراسات الكمية لبار البروتينات أن تأثيرها على الغشاء الذي يعتمد على مجموعة من البارامترات الفيزيائية: سطح الكثافة من البروتينات والتوتر الغشاء شكل غشاء (شقة مقابل أنبوبي مقابل كروية الشكل)7. اعتماداً على هذه المعلمات بار البروتينات يمكن أن: (1) العمل كأجهزة استشعار لانحناء غشاء، (2) ثني الأغشية، أو (3) الحث على انفصال الغشاء7.

نظراً لضخامة عدد من العناصر المشتركة في إعادة تشكيل غشاء في الخلية، دراسة الجوانب الكمية من الظواهر، مثل الالتقام، في فيفو صعبة للغاية. في المختبر إعادة تشكيل لأدنى مكونات محاكاة أغشية منحنى في الخلية يوفر وسيلة لفهم كيف التقويس غشاء بروتينات تعمل آليا. توضح هذه المقالة بروتوكول إعادة تشكيل غشاء أنبوب نانوي في المختبر باستخدام ميكرومانيبوليشن، والفحص المجهري [كنفوكل]، وملاقط بصرية. يمكن استخدام النهج للدراسة، بطريقة كمية، كيفية تفاعل البروتينات، والدهون، أو الجزيئات الصغيرة مع أغشية منحنية. دهن جوفس تستخدم كنماذج لغشاء الخلية، انحناء التي تكاد لا تذكر مقارنة بحجم الجزيئات المتفاعلة غشاء التقويس. أنهم مستعدون باستخدام أسلوب اليكتروفورميشن9 التي تتشكل الحويصلات بترطيب فيلما دهن وتورم في جوفس تحت تيار المتردد (AC)10. ركائز الأكثر شيوعاً التي تزرع جوفس أما لوحات شبه موصلة المغلفة مع الإنديوم أكسيد القصدير (إيتو) أو أسلاك البلاتين (Pt-أسلاك)11. في هذا العمل، تزرع جوفس في Pt-الأسلاك كما تبين هذا الأسلوب في العمل أفضل بكثير من البديل في صنع جوفس حضور أملاح في المخزن المؤقت12. على الرغم من أن يتم وصف البروتوكول اليكتروفورميشن هنا بتفصيل كاف لإنتاجه، نشير للقارئ إلى المواد السابقة التي قد وصف أساليب مماثلة وأخرى من صنع جوفس في التفصيل13،14. في أيدينا، اليكتروفورميشن في Pt-الأسلاك بنجاح حقق جوفس من مزيج الدهون الاصطناعية أو من الدهن الطبيعية مقتطفات في المخزن مؤقت الذي يحتوي على ~ 100 ملم كلوريد الصوديوم. وعلاوة على ذلك، كان أيضا من الممكن لتغليف البروتينات داخل جوفس أثناء النمو. دائرة اليكتروفورميشن مثال لهو مبين في الشكل 1 (أ)؛ وهي تتألف من طوله ~ 10 سم Pt-سلكين إدراج حامل من تترافلوروايثيلين (PTFE) التي يمكن أن تكون مختومة في كلا الجانبين مع الزجاج كوفيرسليبس ~ 1-2 سم عن بعضها البعض (الشكل 1A).

Figure 1
رقم 1: الإعداد التجريبية. (أ) اليكتروفورميشن جيوف الدائرة مع إرفاقه Pt-أسلاك الموصلات الكهربائية. (ب) اليسار: النظام التجريبي عرض المجهر، الدائرة التجريبية أعلاه الهدف وهما ميكروبيبيتيس (اليمين واليسار) يعلق على ميكرومانيبولاتورس وإدراجها في قاعة تجريبية لسحب الأنبوب والبروتين حقن. حق: عرض عن قرب للدائرة التجريبية المركبة أعلاه هدف عرض النصائح من التطلع وميكروبيبيتيس حقن إدراج. (ج) ألف حقنه مزودة بموزع رقيقة إدراجها في ميكروبيبيتي على ظهره لهذه الغاية. الأسفل عرض عن قرب للموزع داخل ميكروبيبيتي مع الخط المنقط الأزرق تبين ميكروبيبيتي. ويستخدم هذا النظام لملء في ميكروبيبيتي مع الكازين تخميل سطح الزجاج، وأيضا أن تسد مع الزيوت المعدنية عند الحاجة. (د) نظام يستخدم لنضح كميات ميليلتر من الحل البروتين. متصل الإبرة حقنه والأنابيب التي يتم توصيلها إلى ميكروبيبيتي حقن. نصيحة ميكروبيبيتي بعناية منغمسين في حل البروتين ويستنشق ذلك لملء هذه المعلومة ميكروبيبيتي. ميكروبيبيتي ثم العودة مليئة الزيوت المعدنية باستخدام النظام هو مبين في لوحة جيم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

أنبوب نانوي غشاء، تمتد في دائرة نصف قطرها من 7 شمال البحر الأبيض المتوسط إلى عدة مئات شمال البحر الأبيض المتوسط، يمكن أن يتم سحبها من جيوف بقوة خارجية. هذا الأسلوب في البداية صمم لقياس خصائص مرونة أغشية الخلية وحويصلات، مثل صلابة الانحناء15،16. في الأعمال الأخيرة، مددت الطريقة لدراسة تفاعل البروتينات مع الأغشية منحنية بالبروتينات القرب من أنبوب نانوي سحبت7،17ميكروينجيكتينج. وقد وضعت أساليب أخرى لدراسة البروتينات الغشاء التقويس. في أسلوب واحد، هي المحتضنة البروتينات الدهنية بطريقة مختلفة الحجم المربوطة إلى سطح تخميلها ب. [كنفوكل] مجهرية يستخدم لقياس ملزمة البروتين كدالة للقطر الحويصلية، التي يمكن أن تشير إلى18،الفرز التي يسببها انحناء19. في أسلوب آخر، يتم حقن البروتينات بالقرب جيوف يستنشق الدقيقة لقياس قدرتها على حمل الأنابيب20،21عفويا. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول مناسبة فريدة لدراسة البروتينات الغشاء التقويس المشاركة في الالتقام، حيث تواجه معظم البروتينات عادة الأنابيب النانوية غشاء بريفورميد الاتصال invagination الغشاء المحتوية على بضائع مع الكامنة وراء غشاء البلازما المسطحة. وعلاوة على ذلك، في هذا الأسلوب، خلافا في المقايسة مع الدهنية الصغيرة المربوطة، أنبوب نانوي الغشاء بشكل مستمر متصل بالغشاء؛ ولذلك، من توازن الميكانيكية مع جيوف، وضع المتوقع في فيفو. ومن ثم يطبق الفيزياء الغشاء الأساسية ويمكننا أن نستنتج عدد كبير الخواص الميكانيكية من لدينا قياسات22،،من2324.

لتنفيذ كامل لهذا الأسلوب، يشمل المعدات اللازمة مجهر [كنفوكل]، وملاقط بصرية، وواحد أو اثنين من ميكروبيبيتيس متصل بخزان لمياه (الشكل 1B). من خلال الجمع بين الثلاثة، فمن الممكن في الوقت نفسه قياس التوتر الغشاء، انحناء غشاء، الكثافة السطحية للبروتينات، وأنبوب القوة25. ضروري تطلع ميكروبيبيتي وأنها هي التي شيدت بسهولة عن طريق إدراج ميكروبيبيتي زجاج إلى حامل متصل بخزان مياه، والتي، عن طريق الضغط الهيدروليكي، يتحكم الضغط تطلع26. يتم التحكم في ميكروبيبيتي وصاحب ميكرومانيبولاتور، ومن الناحية المثالية، في اتجاه واحد قبل بيزو المشغل الميكانيكي لحركة الدقة. لسحب أنبوب نانوي، ميكرواسبيراتيد جيوف عالق بإيجاز إلى الحجم ميكرون حبة ثم سحبها بعيداً إنشاء أنبوب نانوي. في هذا التنفيذ، هو عقد حبة بملاقط بصرية، التي يمكن بناؤها باتباع بروتوكول منشورة27. من الممكن الاستغناء عن ملاقط بصرية وسحب الأنابيب النانوية بطرق مختلفة، على الرغم من أن حساب قياسات دقيقة القوة. إذا أنها صعبة جداً لبناء إعلام بصري أو إذا قياسات القوة ضرورية لا، كما هو الحال إذا كان أحد يريد ببساطة للتحقق من تفضيل البروتينات للأغشية المنحنى، ويمكن سحب أنبوب استخدام حبة ويستنشق في تلميح ميكروبيبيتي الثانية28. من الممكن أيضا سحب الأنابيب باستخدام قوة الجاذبية29 أو30،31التدفق. وعلاوة على ذلك، الفحص المجهري [كنفوكل] ليست ضرورية أما؛ ومع ذلك، ومن المفضل حتى لقياس الكثافة السطحية للبروتينات. كما أنه يتيح قياس نصف قطر أنبوب نانوي من الأسفار كثافة الدهون في الأنبوب، وبالتالي صرف النظر عن التوتر وقوة الغشاء. استنتاج نصف قطر الأنبوب من الأسفار مهم بشكل خاص إذا كانت العلاقة بين هذه الكميات ينحرف عن معادلات راسخة بسبب الوجود بروتينات الغشاء انضمت25. الأهم من ذلك، واحدة لا يمكن الاستغناء عن كل من فخ بصري والفحص المجهري [كنفوكل]، كما أنه لا يمكن قياس انحناء الأنبوب.

وقد استخدمت الأسلوب كما هو موضح في هذا البروتوكول للدراسة التي يسببها انحناء فرز مختلف البروتينات الغشاء المحيطي في الأنابيب النانوية، الذين معظمهم من شريط الأسرة25،،من3233،34 . وتبين أيضا أن القناة على شكل كونيكالي البوتاسيوم transmembrane كفاب أثري في منحنى الأنابيب النانوية بنفس الطريقة كما بار البروتينات35. عن طريق تحسين طريقة لتغليف البروتينات داخل جوفس، تفاعل البروتينات مع انحناء سلبي التحقيق مؤخرا ك جيدا36. وعلاوة على ذلك، تم استخدام هذا الأسلوب لتوضيح تشكيل البروتين السقالات25،37 ودراسة إليه انفصال الغشاء بأي خط التوتر38، البروتين دينامين39، أو بواسطة شريط البروتينات40،41. بالإضافة إلى البروتينات، والجزيئات الصغيرة أو الأيونات يمكن أن يستحث أيضا انحناء. باستخدام هذا الأسلوب، قد أظهرت أيونات الكالسيوم للحث على انحناء إيجابية تحت ظروف خالية من الملح42. من المثير للاهتمام، فإنه أيضا قد ثبت أن الدهون يمكن الخضوع لانحناء الفرز، على الرغم من أن فقط للمؤلفات التي بالقرب نقطة ديميكسينج43،44. وخلاصة القول، الطريقة التي يمكن استخدامها من قبل الباحثين المهتمين بالتحقيق في كيفية أما مكونات الغشاء لا يتجزأ (مثلالدهون أو البروتينات transmembrane) أو محيطيا ملزمة جزيئات (سواء داخل أو خارج جوفس) تتفاعل مع الأغشية] منحنى، من وجهتي نظر الميكانيكية والكمية. من المعتزم أيضا للراغبين في قياس الخواص الميكانيكية للغشاء نفسه22،،من2345.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد جوفس اليكتروفورميشن في Pt-أسلاك

  1. تنظيف قاعة اليكتروفورميشن (انظر مقدمة و الشكل 1A) وحزب العمال-الأسلاك مع مذيب عضوي مثل الإيثانول أو الأسيتون ليغسل الدهون والماء ليغسل الأملاح.
    ملاحظة: نحن نقترح دقة المسح بعيداً من البقايا مع الأنسجة غارقة في الإيثانول، ثم سونيكاتينج في الأسيتون، الإيثانول، ثم الماء، كل منهما لمدة 5 دقائق.
  2. إعداد خليط دهن من تركيبة الدهون المرغوب في 1 ملغ/مل في كلوروفورم. وينبغي أن تحتوي على المزيج ~ الكسر المولى 0.05% دهن مترافق مع البيوتين (مثلاً، 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]) و ~ 0.5% الكسر المولى دهن مترافق مع (fluorophore مثلاً، بوديبي-أون-C5-السيراميد).
    ملاحظة: في تجربتنا، كان من الصعب على إنتاج جوفس في عالية غلة التي تحتوي على أكثر من 30% اتهم الدهون.
    تنبيه: ينبغي التعامل مع كلوروفورم داخل غطاء كيميائية ارتداء القفازات المناسبة.
  3. إدراج زوج من الأسلاك Pt في قاعة اليكتروفورميشن. إيداع خليط الدهن على Pt-الأسلاك في قطرات مفصولة ~ 2-3 مم (مجموع ~ 4 ميليلتر من المزيج).
  4. الجاف للأسلاك تحت الفراغ لمدة 30 – 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. ختم الجزء السفلي من الدائرة بالالتزام ساترة على الدائرة باستخدام الشحوم سيليكون. ملء الدائرة مع محلول مخزنة بشكل مؤقت يحتوي على كلوريد الصوديوم، السكروز، وعامل التخزين مؤقت (مثلاً، 70 مم كلوريد الصوديوم، السكروز 100 مم و 10 مم تريس، على درجة الحموضة 7.4). وستكون هذه الوسيلة داخل جوفس في التجربة. فمن الضروري تطابق الاسموليه هذا المتوسط الاسموليه المتوسطة التجريبية داخل ~ 10%. استخدام السكروز لضبط في الاسموليه. إضافة البروتينات إلى الحل بتركيز المطلوب إذا كان الهدف تغليف لهم في جوفس.
    تنبيه: مختلف الأملاح والسكريات في المخزن المؤقت الذي يمكن أن يؤثر على صلابة الانحناء والانحناء العفوية للأغشية24،42،،من4647.
  6. ختم الجزء العلوي من الدائرة بالالتزام ساترة مع الشحوم سيليكون ضمان الحد الأدنى من الهواء داخل الدائرة. تطبيق جيب التيار المتردد الحالي عن طريق Pt-الأسلاك في 500 هرتز و 280 mV.
    ملاحظة: وقت النمو ودرجة الحرارة يجب أن يكون الأمثل اعتماداً على تكوين الدهن والحساسية من البروتين. عند استخدام مقتطفات الدهون الطبيعية، وأيضا عند تغليف البروتينات في جوفس، تحقق عائد أفضل بتزايد جوفس في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. نظراً لغياب البروتينات، والدهون الاصطناعية التراكيب، النمو في درجة حرارة الغرفة ل ~ ح 2 كان كافياً.

2-إعداد قاعة تجريبية وفي ميكروبيبيتيس

  1. لإعداد ميكروبيبيتيس، سحب شعري زجاج استخدام ساحبة ماصة. ويقترح استخدام شعري زجاج مع إنصاف أقطار داخلية وخارجية، على التوالي، 0.7 و 1 ملم. ثم صقل غيض ميكروبيبيتي حيث يكون قطرها الداخلي 5–7 ميكرومتر، باستخدام ميكروفورجي. إذا كان سيتم حقن البروتينات أو جزيئات أخرى في التجربة، سحب آخر ميكروبيبيتي وصقل طرفها إلى قطرها داخلي من 8–15 ميكرون.
  2. بناء تشكيل غرفة تجريبية من خلال وضع اثنين كوفيرسليبس المجهري مستطيلة على قاعدة معدنية كما هو مبين في الشكل 1. يجب أن تكون مفصولة كوفيرسليبس ~ 1 مم. يجب أن يكون الدائرة الفتحات على طول حواف طويلة (انظر الشكل 1). يجب أن تناسب الجانبين فتح غيض ميكروبيبيتي حيث الطرف ينبغي أن تصل على الأقل مركز الدائرة.
  3. إعداد المخزن المؤقت التجريبي الاسموليه التي ينبغي أن لا تختلف بأكثر من 10% من المخزن المؤقت المستخدم لتنمو جوفس. ضبط الاسموليه مع الجلوكوز. مثال على وجود مخزن التجريبي الذي تم استخدامه في دراسة تفاعل اندوفيلين مع الأنابيب النانوية 100 ملم كلوريد الصوديوم، الجلوكوز 40 مم، مخزنة مع تريس على درجة الحموضة 7.4. مزيج من السكروز داخل/يضمن الجلوكوز خارج: التباين المرحلة (أ) كافية لمراقبة جوفس مع الحقل مشرق الفحص المجهري، والكثافة (ب) أعلى داخل جوفس الذي يسبب لهم لتسوية على الجزء السفلي من الدائرة. ضبط تركيز الملح على أساس الاحتياجات التجريبية.
    ملاحظة: بالإضافة إلى التأثير على الخواص الميكانيكية للغشاء، في تجربتنا، تركيز الجلوكوز عالية (> 300 ملم) يؤثر سلبا على إنشاء سندات streptavidin-البيوتين، اللازمة لسحب أنبوب نانوي. وعلاوة على ذلك، القليل جداً من الملح يمنع سندات streptavidin-البيوتين، بينما مرتفعة للغاية من تركيز شاشات تفاعلات البروتينات الغشاء. في حالة تغليف البروتين، باستخدام تركيز الملح عالية جداً في المخزن المؤقت للخارجية (مثلاً، > 200 ملم كلوريد الصوديوم) يمكن استخدامها كخدعة لفصل البروتينات من النشرة الخارجي36. من الضروري أن التجربة مع طائفة من تركيز الملح إيجاد شروط الربط الأمثل من الجزيء الفائدة.
  4. 30 – 60 دقيقة قبل جمع جوفس للتجربة، تخميل أسطح الزجاج بملء قاعة التجريبية وميكروبيبيتي تطلع مع حل 5 ملغ/مل نقي جداً β-الكازين (مثلاً، حلت في المخزن المؤقت التجريبي). Β-الكازين ينشئ طبقة واقية على الأسطح الزجاجية، منع جوفس التقيد أيضا بشدة، التي سوف تؤدي إلى انفجار. احتضان مع β-الكازين لمدة 30 – 60 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك لا فقاعات داخل ميكروبيبيتي الذي يتعارض مع السيطرة على التوتر الغشاء.
    1. بناء موزع لملء ميكروبيبيتيس، كسر إبرة حقنه قريبة من الموصل البلاستيك والصق فيه شعري والسليكا رقيقة (مثل تلك المستخدمة اللوني السائل) (الشكل 1).
  5. أثناء الاحتضان مع β-الكازين، جبل الدائرة على المجهر وأنها مركز فوق الهدف. إدراج غيض ميكروبيبيتي تطلع من خلال فتح على طول الحافة الطويلة وإحضار التلميح أعلاه الهدف المجهر. ضبط مستوى خزان المياه حيث أن الضغط تطلع بالقرب من الصفر (ينبغي أن يكون هناك أي تدفق الثقيلة داخل أو خارج الماصة، التي يمكن رؤيتها تحت المجهر).
  6. في حالة البروتينات أو جزيئات أخرى سوف يكون حقن خلال التجربة، ملء ميكروبيبيتي حقن مع جزيء المطلوب حله في المخزن المؤقت التجريبي بتركيز الاختيار، جبل ميكروبيبيتي داخل ميكرومانيبولاتور، و إدراج من خلال الجانب الآخر من قاعة التجريبية.
    1. استخدام الحد أدنى من البروتينات، تعبئة سوى غيض ميكروبيبيتي بالبروتين بالطموح. للقيام بذلك، التفاف نهاية إبرة تعلق بحقنه بالأنابيب البلاستيكية. أدخل الأنبوب في الجزء الخلفي ميكروبيبيتي الحقن.
    2. بعناية فائقة تزج غيض من ميكروبيبيتي في حل البروتين ونضح لملء غيض من ميكروبيبيتي.
      ملاحظة: هذا الإعداد بسيطة ويرد في الشكل 1 ، وفي تجربتنا، أنها تسمح يسفط من ميليلتر قليلة أقل قدر من الحل البروتين.
    3. الردم بقية ميكروبيبيتي حقن مع الزيوت المعدنية لمنع الاختلاط حل البروتين والماء من خزان المياه (باستخدام برنامج الإعداد في الشكل 1).
    4. رعاية لا لإدخال فقاعات الهواء إلى ماصة الحقن، كما أنه سيتم حمل ضغط الحقن غير مستقرة. وبدلاً من ذلك، إذا كانت كمية البروتين كافية، ملء ميكروبيبيتي مع البروتينات بنفس طريقة ملء مع β-الكازين كما هو موضح في الخطوة 2، 4. قم بضبط مستوى خزان المياه لتقليل الضغط تطلع في ماصة حقن.
      ملاحظة: ستكون أقل بسبب تخفيف تركيز حقن جزيء أو أيون قرب أنبوب نانوي ويمكن تقدير بقياس انخفاض كثافة الأسفار كدالة للمسافة من خروج ماصة42. من المهم مع ذلك أكثر معرفة كثافة بلير زمنياً للجزيء حقن والتي يمكن قياس دقة (انظر القسم 4).
  7. وبعد الحضانة مع β-الكازين، إزالة الحل من الدائرة وشطف مع المخزن المؤقت التجريبية عدة مرات. ملء مع المخزن المؤقت التجريبي.
  8. إيقاف اليكتروفورميشن جوفس وجمعها مباشرة من حزب العمال-الأسلاك. إضافة بضعة ميليلتر من الحل جيوف إلى الدائرة التجريبية. استخدم فقط طازج جوفس.
  9. إضافة ميليلتر عدد قليل من حبات المغلفة ستريبتافيدين إلى الدائرة التجريبية لتركيز نهائي من الخرز في قاعة في حوالي 0.1 × 10−3% (w/v) أو أقل. ويوصي بالخرز البوليسترين ~ 3 ميكرومتر في القطر (الخرز البوليسترين في الماء يكون على النقيض إنكسار قرب أمثل فيما يتعلق بتحقيق أقصى قدر من القوة التدرج فيما يتعلق بالقوة ونثر في فخ بصري). ويمكن تعديل تركيز حبة استناداً إلى التجربة: بتركيز منخفض جداً يجعل من الصعب العثور عليها في الدائرة، وتركيز عال جداً تواجه خطر حبات متعددة الوقوع في ملاقط بصرية.

3-سحب أنبوب نانوي غشاء من جيوف

  1. واسمحوا جوفس والخرز تسوية على الجزء السفلي من الدائرة. تنكمش جوفس عن طريق السماح بقليل من المخزن المؤقت التجريبية تتبخر، لحوالي ~ 15 دقيقة نزع فتيل جوفس ضروري لإنتاج بعض المساحة الزائدة التي يمكن أن يستنشق مع ميكروبيبيتي. واضح أن undulate جوفس (أي، تظهر المرنة) تحت المجهر الخفيفة. إذا كانت تبدو متوترة، السماح لمزيد من الوقت التبخر.
    ملاحظة: معدل تغير الاسموليه يعتمد على مساحة السطح يتبدد، ودرجات الحرارة، إلخ، وينبغي أن ترصد عن كثب. من حيث المبدأ، يمكن تحديد الفرق الاسموليه من البداية عن طريق ضبط تركيز الغلوكوز/السكروز، ومع ذلك، ينبغي الحرص لا للحث على حدوث صدمة ناضح.
  2. العثور جيوف مرنة ونضح أنه إلى الماصة. ينبغي أن يكون طول اللسان تطلع (الجزء من الغشاء داخل الماصة) مساوية أو أكبر من دائرة نصف قطرها ماصة للتحليل النظري لتكون تنطبق15،،من1622،23 ( الشكل 2). حاول جوفس عدة. إذا كان أي من جوفس يمكن أن يستنشق لإنتاج لسان طويل بما يكفي، انتظر بضع دقائق إضافية. إذا جوفس المرنة ما يكفي، تابع إلى الخطوة التالية.
  3. ختم الدائرة مع الزيت المعدني، لمنع المزيد من التبخر من المخزن المؤقت. القيام بذلك بعناية بيبيتينج النفط على طول حواف الدائرة التجريبية المفتوحة.
  4. لتعيين موضع الصفر من الضغط تطلع، أولاً، ابحث عن حبة في الدائرة وموضع خروج ماصة تطلع قرب حبة. ضبط ارتفاع خزان المياه حيث أن حبة لا امتص لا مهب ماصة الطموح. على الرغم من أن زيت معدني يمنع التبخر وذلك مزيد من التغييرات الضغط داخل الدائرة، صفر الضغط تطلع قبل قياس كل جيوف.
  5. العثور جيوف ونضح عليه. الانتقال ميكروبيبيتي أعلى وخارج التركيز (للحفاظ جوف بعيداً عن السطح حيث أنها قد تكون انسحبت من الماصة بإجهاد القص عند نقل الدائرة).
  6. ابحث عن حبة بعناية يتحرك في الدائرة. يمكن إخراج التحركات المفاجئة في جوف. اعتراض عليه مع ملاقط بصرية على مسافة ~ 20 ميكرومتر بعيداً عن الجزء السفلي من الدائرة. ضمان أن المنطقة التي تهم نظيفة مع أي الخرز أو الأغشية في الأفق. سيتم تعطيل أي شيء الوقوع في ملاقط بصرية خلاف حبة القياس.
  7. يعود في جوف في التركيز، وبعيدا عن حبة مع ميكروبيبيتي محاذاة مع فخ البصرية (الشكل 2).
  8. تسجيل حركة حبة لمدة 1 – 2 دقيقة لقياس موقف التوازن (مطلوب لقياسات القوة).
  9. تخفيض الضغط داخل ميكروبيبيتي إلى أقصى حد ممكن دون أن تفقد في جوف ذلك خفض التوتر الغشاء. جلب بعناية في جوف على اتصال بحبه لحوالي ثانية، إنشاء سندات streptavidin-البيوتين، ثم سحب بلطف مرة أخرى إنشاء أنبوب نانوي. من الناحية المثالية ينبغي أن الاقتراح بجوف نحو أو بعيداً عن حبة مع وحدة تشغيل بيزو لتعطيل الحد الأدنى حبة في ملاقط بصرية.
    ملاحظة: إذا كان لا يشكل أنبوب نانوي، يمكن أن يعود طلاء ستريبتافيدين الفقيرة من حبة، كمية غير كافية من الدهون بيوتينيلاتيد في جيوف، عدم كفاية تركيز تركيز الملح أو المفرطة من الجلوكوز في المخزن المؤقت التجريبي، أو الغشاء من التوتر في جيوف مرتفعا48.
  10. زيادة الضغط تطلع حتى لإعادة اللسان الطموح. قم بمحاذاة الأنبوب يكمن في محور ماصة التطلع وأقصى تركيز في الأنبوب (الشكل 2).
  11. التأكد من أن خط الاستواء جيوف والانبوب في التركيز. تسجيل حركة حبة مع الحقل مشرق الفحص المجهري لمدة دقائق قليلة (هنا، هو سرعة اقتناء كاميرا 30 هرتز). سجل الارتفاع، ح، خزان المياه فيما يتعلق بموضع صفر. اتخاذ عدد قليل من الصور [كنفوكل] للنظام (الشكل 2).
  12. كرر الخطوة السابقة في تطلعات مختلف الضغوط، ضمناً غشاء التوترات. مجموعة نموذجية من التوتر هو 0.015 – 0.2 mN/m، مع حجم خطوة حوالي 0.02 mN/m.
  13. إذا كان الحقن البروتينات أو جزيئات قرب النظام، جلب ميكروبيبيتي الحقن بالقرب من أنبوب نانوي، التأكد من أن حبة في فخ بصري لا تشعر بالقلق. حقن بلطف عند ضغط حوالي 1 – 2 السلطة الفلسطينية.
  14. بعد ربط البروتين قد اكويليبراتيد (كثافة البروتين المحقون على الغشاء يبقى ثابت على جيوف الأسفار)، كرر القياسات تدريجي كما هو الحال مع الغشاء العارية (الخطوات 3.11 و 3.12).
    ملاحظة: نظراً للقياسات تتم أثناء الحقن البروتينات قرب جيوف عند ضغط ثابت، تركز الجزء الأكبر من البروتين يبقى دون تغيير تقريبا قرب جيوف؛ وبالتالي، ينبغي أن يكون البروتين الامتزاز ضئيلة أثناء أخذ القياس.
    1. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن لاحتضان جوفس جنبا إلى جنب مع البروتينات قبل إجراء تجارب سحب الأنبوب لضمان تركيز معظم بروتين مستمر. ونظرا لأن الكسر النسبي غشاء من البروتينات في الأنبوب وعلى جيوف يقاس، الطريقة التي يتم تسليم البروتينات لا تؤثر على حساب انحناء الفرز (انظر القسم 4).

Figure 2
رقم 2: تجربة سحب الأنبوب. (أ) الخطط للتجربة. (ب) صورة [كنفوكل] من أنبوب عضلي كما هو موضح في هذا البروتوكول. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

4-قياس وتحليل البيانات

  1. قياس التوتر الغشاء
    1. حساب الضغط الهيدروليكي لكل خطوة في الضغط تطلع ثابتة:
      ΔP = لبغ
      حيث p هو كثافة المياه وتسارع الجاذبية g h ارتفاع خزان الماء من الخطوة 3.11.
    2. من الصور [كنفوكل]، قياس نصف قطر جيوف، rجيوف، ودائرة نصف قطرها ماصة الطموح، rpip (الشكل 2).
    3. حساب التوتر الغشاء، σ، باستخدام معادلة لابلاس49:
      Equation 1
  2. قياس قوة الغشاء
    1. تحديد صلابة ملاقط بصرية، ك، باستخدام واحدة من عدة طرق المعايرة27. في هذا الإعداد، قياس k باستخدام أسلوب السحب اللزج27.
    2. حساب التوازن موضع حبة، 0،كمتوسط من قياس قبل سحب الأنبوب (الخطوة 3، 8).
    3. لكل قياس التوتر المستمر، حساب القوة غشاء التوازن، و، من القانون Hooke:
      F = k( - 0)
      حيث هو متوسط موقف حبة خلال هذا القياس.
  3. قياس نصف قطر الأنبوب
    1. في حالة غشاء عارية (لا إضافة غشاء التقويس جزيئات)، حساب نصف قطر الأنبوب، البحث والتطوير، من القوة ك:
      R = F/(4πσ)
      (مراجع،من2223).
    2. لقياس نصف قطر الأنبوب حضور جزيئات الغشاء التقويس وصرف النظر عن الخطوة 4.3.1، أولاً، سجل كثافة fluorescence الدهن على طول أنبوب، أناالحوض، وعلى طول الخطوط الكونتورية جيوف، أناجيوف. قياس كثافة fluorescence متوسط fluorophore في أو منضم للغشاء كمتوسط كثافة على طول خط أنبوب أو محيط جيوف ألمع. حدد مربع مستطيل يحتوي على مقطع أفقي كفاف جيوف أو الأنبوب وحساب مجموع شدة الأسفار لكل خط أفقي في المربع.
      1. تقسيم كل المبلغ حسب عدد وحدات البكسل للخط الأفقي (أي، عرض مربع). لاحظ أن في المربع المحدد، ينبغي أن يكون هناك لا الأغشية الأخرى الحالية. يتم الحصول على الشخصية كثافة الأسفار على طول المربع المحدد.
      2. بعد طرح كثافة الخلفية، تأخذ بكسل متوسط كثافة الأسفار من سطر ألمع. نصف قطر الأنبوب يرتبط خطيا بنسبة للأسفار على طول كفاف الأنبوب وجيوف ك:
        R = Kالحوضأناالحوض/أناجيوف
        حيث كالحوض هو معامل معايرة25.
        ملاحظة: يمكن استخدام هذا الأسلوب لقياس نصف قطر الأنبوب في نطاق 10 – 80 نانومتر (عند ضيقة بما يكفي تقع داخل أحد فوكسل [كنفوكل] عرض الأنبوب) ومع أكبر إلى حد ما من عدم يقين في شمال البحر الأبيض المتوسط ونطاق أعلى 80. حساسية القياس يعتمد على الإعداد.
    3. تحديد كالحوض عن طريق إجراء قياسات الشعاع مستقلة في الخطوات 4.3.1 و 4.3.2 على تكوين غشاء بسيط باستخدام الدهون بدون تهمة. يضمن تكوين غشاء بسيطة مثل هذه أن نصف القطر والقوة العلاقة بسيطة في خطوة 4.3.1. تكرار التجربة عدة مرات، وارسم R، يستنتج من هذه القوة (الخطوة 4.3.1) مقابل أناالحوض/أناجيوف (الخطوة 4.3.2). حساب كالحوض من الاحتواء. في هذا الإعداد، كالحوض = 200 بيضة ± 50 نانومتر باستخدام غشاء L-α-فوسفاتيديلتشوليني (البيض-الكمبيوتر) ودهن فلورسنت الأسفار التي تعتمد الحد الأدنى على استقطاب25.
      ملاحظة: يجب أن تقاس كالحوض لأهداف مختلفة، بسبب أحجامها المختلفة فوكسل [كنفوكل]. لا ينبغي أن تتفاعل fluorophore الدهن مع حقن البروتينات/الجزيئات. دهن الفلورسنت الموصى بها هنا، السيراميد "آر بوديبي"، لا يتوقع لها أي تفاعلات مع البروتينات. وتم تأكيد هذا الافتراض بالدراسات السابقة لشريط وهو ثابت-بار المجالات25،36،37، التي أظهرت أن في التغطية السطحية نسبة عالية من البروتين، ونصف قطر الأنبوب بالبروتينات، وبغض النظر عن التوتر في جيوف. إذا البروتينات تتفاعل مع fluorophore الدهن، نضوب أو الإثراء فلوروفوري سيتبع في الأنبوب في كسور سطحية متنوعة نسبة عالية من البروتين.
  4. قياس الكثافة السطحية للبروتينات
    1. إعداد يمزج الدهن باستخدام بسيطة دون توجيه تهمة إليه المادة الدهنية (مثلاً، البيض-PC) تستكمل مع الكسور الخلد مختلفة عن خمسة دهن الفلورسنت (من نفس الموجه كصبغة تستخدم لتسمية البروتين، مثلاً، BODIPY-FLC5-hexadecanoyl-phosphatidylcholine (HPC *) على سبيل المثال، البروتين المسمى Alexa488) في النطاق: XHPC * = 0.01 – 1%. إعداد جوفس في السكروز 100 مم من اليكتروفورميشن على إيتو لوحات (اتبع الخطوة 1 من المنشور السابق13).
    2. جمع جوفس ونقل إلى غرفة تجريبية تخمل مع β-الكازين. استخدم مثلاً، الجلوكوز 100 مم للحل التجريبي. انتظر لبضع دقائق جوفس تسوية.
    3. التقاط صور الأسفار [كنفوكل] من جوفس وسجل كثافة fluorescence متوسط طول جيوف ملامح كدالة للكسر الخلد دهن الفلورسنت (راجع الخطوة 4.3.2). لكل تكوين، حساب كثافة المنطقة دهن الفلورسنت، φHPC*. على سبيل المثال، بافتراض أن المنطقة الواحدة والدهن هو 0.7 نانومتر2، φHPC* = 1.43 × 106 XHPC * لكل منشور. ارسم HPC * كثافة fluorescence في جيوف، أناHPC *، جيوف، مقابل φHPC*. صالح يعطي ثابت المعايرة، A، قدمها φHPC* = منظمة العفو الدوليةHPC *، جيوف. أ يعتمد على إعدادات الفحص المجهري، مثل قوة الليزر وحساسية الكاشف (أيمكسب)، ولذلك سجل A لمختلف ويشيع استخدام إعدادات الفحص المجهري (راجع المثال في الشكل 3).
    4. إعداد عدة حلول للحوسبة عالية الأداء * حله في المنظفات، مثلاً، دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، بتركيزات مختلفة في النطاق من ~ 1 إلى 10-50 ميكرومتر. سجل كثافة الأسفار كل حل بالجملة وحساب منحدر كثافة مقابل تركيز (الشكل 3). كرر القياس مع فلوروفوري الذي سوف يضاف إلى البروتين في نطاق تركيز مماثل (انظر على سبيل المثال مع Alexa488 في الشكل 3). مطلوب هذا القياس تتعلق بكثافات fluorescence تسمية البروتين والدهن التسمية، أناA488، والجزء الأكبر / أناHPC *، والأكبر، كما أنهم قد لا يصدر بالضرورة بنفس الطريقة في نفس تركيز الجزء الأكبر.
    5. قياس عدد fluorophores كل جزيء البروتين باستخدام فلوروسبيكتروميتير. على سبيل المثال، في حالة Alexa488، عدد الجزيئات Alexa488 كل البروتين، نA488، يمكن حساب باستخدام العلاقة التالية:
      n A488 = (/ε494ألفألف488)/((ألف280 -0.11494)/اليوروبروت)
      A494 و ألف280 فيها قيم امتصاص كل وحدة طول في 494 نانومتر و 280 نانومتر، على التوالي، وهي اليوروA488 واليوروبروت معاملات الامتصاص الجزيئي ل Alexa488 و البروتين، على التوالي.
    6. حساب الكثافة السطحية من البروتين في جيوف، φبروت، جيوف، وفقا للصيغة التالية:
      Equation 2
      ضع في اعتبارك الدولة البلمرة من البروتين. على سبيل المثال، شريط البروتينات ديميريزي، ولذلك الكثافة المحسوبة وسوف يكون من مونومر بار كل منطقة إذا استخدام معامل الانقراض شكل أحادي.

Figure 3
الشكل 3: مثال لمعايرة كثافة سطح البروتين. قياس هي HPC * دهن fluorescence كثافة سائبة (يسار) وفي جوفس (وسط). قياس هي أيضا، كثافة fluorescence الجزء الأكبر من Alexa488 (منضم إلى مجال بار) (على اليمين). جداول شدة الأسفار خطيا مع التركيز. أظهرت قياسات لتحقيق مكاسب محددة الكشف وليزر لإنتاج الطاقة. المؤامرات التي تم إنشاؤها استناداً إلى بيانات من مرجع37. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن أن تعطي هذه التجربة أنبوب سحب المعلومات الميكانيكية الحيوية حول الغشاء. نظراً لغياب البروتينات أو جزيئات أخرى أن الزوجين مع انحناء غشاء، الغشاء قوة ونصف قطر الأنبوب يمكن أن ترتبط مع التوتر الغشاء عن طريق تطبيق "هاميلتون" Helfrich كانام سحب المعادلة إلى أنبوب من جيوف50،51

Equation 3(المعادلة 1)

حيث Equation 4 هو غشاء الطاقة الحرة من الأنبوب، غشاء ك الانحناء الصلابة، r و R0 ، على التوالي، الوسط وإنصاف أقطار العفوية لانحناء، σ التوتر الغشاء، منطقة الأنبوب، L طول أنبوب، و واو نقطة القوة التي تمارسها الأنبوب على حبة. في التوازن، r هو نصف قطر الأنبوب، تتم الإشارة إليها ك البحث والتطوير، ويصبح و قوة سحب الأنبوب، F، أي، توازن القوة الذي سحب الأنبوب حبة في فخ بصري. لحساب F و R، نستطيع تقليل Equation 4 فيما يتعلق ب L و r، مما أسفر عن22،23

Equation 5(المعادلة 2)

Equation 6(المعادلة 3)

R 0 أهملت إذا منشورات كلا من الغشاء لها نفس التكوين، على الرغم من أن هناك تكهنات بأن العوامل الأخرى، مثل ريبولسيونس تهمة يمكن حمل بعض انحناء عفوية42. قياسات القوة ونصف قطرها على أنابيب انسحبت من "جوفس دوبك" 100% في اتفاق ممتازة مع التنبؤات النظرية في المعادلة 2 و 3 المعادلة (الشكل 4). القياسات اثنين مستقلة كما يتم قياس القوة من تشريد حبة في فخ بصري وفي دائرة نصف قطرها من شدة الأسفار، وبالتالي توفير طريقتين لحساب الغشاء الانحناء الصلابة. تركيب المعادلة 2 و 3 المعادلة لغلة أظهرت البيانات: K = (25.1 ± 1.4) (يعني ± SD) كبر و (22.1 ± 1.5) كبر، على التوالي، كما سبق قياس42 .

إذا تجارب مع انحناء-اقتران البروتينات، يقترح استخدام الأكثر تطورا معادلة هاميلتون لمن واحد في المعادلة 1، كحسابات المعادلة 1 فقط لانحناء عفوية فعالية ولا تراعي تأثير البروتينات على الخواص الميكانيكية للغشاء أو تفاعلات البروتين البروتين ممكن. انظر، مثلاً،25،35،36،،من5253. على الرغم من أن نماذج نظرية متقدمة ضرورية لفهم متعمق لنظام غشاء بروتين معين، دون اللجوء إليها، أنها لا تزال ممكنة للحصول على معلومات مفيدة جداً عن طريقة سحب الأنبوب.

على سبيل المثال، اختبار ما إذا كان معنى البروتينات انحناء، يتم قياس الكثافة النسبية من البروتينات على الأنبوب جوف، التي تعتبر ثابتة بالمقارنة. هو درس التفاعل مع انحناء إيجابية عن طريق حقن البروتينات القرب من الأنبوب مع ميكروبيبيتي الثانية25. هو درس التفاعل مع انحناء سلبي أو سلوك البروتينات ترانسميمبراني بتغليف أو إعادة تشكيل البروتينات خلال جيوف تشكيل35،36. الإثراء النسبي لبار والبروتينات كفاب على غشاء أنابيب عبر جوفس الأساسي يشير إلى أنهم يفضلون الأغشية المنحنى (الشكل 5). أن تكون أكثر من الكمية، يمكن أن يحسب هذا الإثراء كمعامل فرز، S، استناداً إلى:

Equation 7(المعادلة 4)

حيث أنابروت، والحوض و أنابروت، جيوف كثافات الأسفار من البروتينات في الأنبوب وعلى جيوف، على التوالي، و أناالشفة، والحوض و أناشفة، جيوف كثافات الأسفار من الدهون في الأنبوب وفي جوف، على التوالي.

مثال آخر هو قياس قوة الأنبوب كما يربط البروتين للغشاء. الشكل 5B، يبين أن ج اندوفيلين بروتين N-شريط A2 يقلل تدريجيا قوة الأنبوب، تتناقص إلى الصفر، مما يشير إلى أنه قد شكلت بنية ثلاثية الأبعاد التي تحافظ على أنبوب مستقرة، الذي يطلق على سقالة. هذه الهياكل تلعب أدواراً هامة في الالتقام، عن طريق تحديد نصف قطر الأنبوب ولكن أيضا في تمكين انفصال7،41. قياس S، فضلا عن التأثيرات الميكانيكية والمورفولوجية التي تفرض البروتينات في أغشية يوفر معلومات هامة عن كيف تعمل في الظواهر الانحناء غشاء في الخلية.

Figure 4
الشكل 4: نتائج ممثلة من القياسات الميكانيكية في الغياب البروتينات. أظهرت قوة خطية وأنبوب شعاع الاعتماد على التوتر الغشاء لغشاء دوبك 100%، من ثلاثة مقاييس مستقلة، نشرت سابقا42. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: نتائج تمثيلية من تشكيل انحناء الاستشعار والسقالة ببار البروتينات. (أ) انحناء الاستشعار بالبروتين بار IRSp53. البروتين الحواس انحناء غشاء السلبية وهي ملزمة في الداخل جيوف، مع كمية ضئيلة من البروتين الحالية في النشرة الغشاء الخارجي. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. ريبرينتيد من36، تحت الإبداعي العموم نسخة من الرخصة، حقوق الطبع والنشر عام 2015، طبيعة مجموعة النشر. (ب) تشكيل سقالة بروتين اندوفيلين البروتين N-بار. يتم حقن بالقرب من الأنبوب البروتينات وملزمة لذلك في النشرة الغشاء الخارجي. كما هو موضح في37، اندوفيلين بربط قاعدة للأنبوب وأشكال سقالة التي تنمو بشكل مستمر على طول الأنبوب من جوف نحو فخ الضوئية (OT، دائرة بيضاء). (ج) كيموجرام اندوفيلين سقالة النمو من جوف إلى حبة، مع قنوات الدهن والبروتين مضافين. يظهر المؤامرة أنبوب القوة، و، كدالة للزمن، تي. المقاييس الزمنية في كيموجرام والأرض هي نفسها (x-محور مشترك). ب ج، مقياس بار = 2 ميكرومتر. Reprinted بإذن من المرجع37، حقوق الطبع والنشر (2016) الأكاديمية الوطنية للعلوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طريقة سحب أنابيب من جوفس يعطي معلومات غنية عن نظام بروتين غشائي، كما أنها ليست سوى وسيلة لقياس الخواص الميكانيكية الأساسية للغشاء، ولكنه يساعد على تسليط الضوء على اقتران بين البروتينات والأغشية انحناء. كما ورد في المقدمة، توجد تقنيات أخرى لقياس آثار البروتينات الغشاء التقويس، تفرخ البروتينات مع الدهنية الفرعية ميكرون المربوطة إلى سطح تخميلها18،19 أو مراقبة تشكيل عفوية من الأنابيب جوفس يستنشق ميكروبيبيتي على حقن البروتين20،21. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر اتصال مباشر الهندسي الالتقام وهي فريدة من نوعها في تقديم قياسات مادية هامة للنظام في الوقت نفسه، مثل كثافة البروتين والتوتر الغشاء غشاء القوة.

قيداً هاما للأسلوب أنه من غير تافهة لتشييد ومعايرة جميع العناصر المشاركة في الفحص. ولكن حين مزيجاً من الفحص المجهري [كنفوكل]، ملاقط بصرية، وميكرومانيبوليشن يوفر معلومات القصوى، يمكن أن يكون محل بعض المكونات كما ورد في المقدمة، اعتماداً على المعلومات التي يحتاج إلى أن يكون علم النظام. المكونات الحد الأدنى المطلوب للتحقيق بنجاح في اقتران انحناء من بروتين، أو أي الأخرى المحتملة إلى جانب انحناء الجزيء وهي المضخة ميكروبيبيتي ومجهر [كنفوكل]، مع ملاقط الضوئية التي يمكن الاستغناء عنها. الأهم من ذلك، العديد من التحديدات (مثل المعايرة بنصف قطر الأنبوبة غشاء وتحديد كثافة البروتين السطحي) عادة ما يلزم فقط لتتم مرة واحدة. قيد آخر من الأسلوب أنه يمكن قياس جيوف واحد فقط في كل مرة، تصل إلى اثنين إلى ثلاثة جوفس ساعة (مع الممارسة)؛ ومع ذلك يوفر كل قياس ثروة بيانات.

قياسات الإنتاجية أعلى أو إذا كان من الضروري دراسة تفاعل البروتينات مع الهندسات كروية ولا أنبوبي، سوف يلزم فحوصات أخرى استكشاف أو المتقدمة. ستكرس الجهود مستقبلا إلى: (1) تصميم نظام أعلى من الناتج الذي يمكن سحب أنابيب متعددة (من جوفس متعددة) ويقاس في نفس الوقت، و (2) دمج مجهرية فائقة القرار حتى لدراسة تفاصيل سقالة البروتين أن الأشكال في الأنابيب النانوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون سوري بينوا، داميان كوفيلير، ناسوي بيير، فرانسوا كويمينيور، وتومبس جيل لمساهماتهم الأساسية بإنشاء الأسلوب أنبوب نانوي في المجموعة. مجموعة P.B. ينتمي إلى الكونسورتيوم يزار سيلتيس سيلتيسفيبيو لابيكس (ANR-11-LABX0038)، وباريس العلوم والآداب (ANR-10-معرض أيدكس-0001-02). واو-جيم "تساي" مولت التطريز زمالة طويلة الأجل (التف 1527-2014) والإجراءات ماري كوري (H2020-مسكاً-لو-2014، المشروع غشاء-ezrin-أكتين). م. س. وهو "زميل جونيور المجتمع سيمونز ل" الزملاء.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC) Avanti 850375 Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin] Avanti 880129 biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide Molecular Probes (ThermoFisher) D7540 fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*) Molecular Probes (ThermoFisher) fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC) Avanti 840051 used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%) Sigma Aldrich C6905 used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose Sigma Aldrich S7903
D(+) glucose Sigma Aldrich G7021
NaCl Sigma Aldrich S7653
Tris Sigma Aldrich 10708976001
osmometer Loser n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure Goodfellow USA PT005139 used for GUV electroformation
function generator n/a used to create current for GUV electroformation
putty sealant Vitrex (from CML France) CRIT 140013 used to seal the electroformation chamber
bath sonicator n/a useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany) an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively) Harvard apparatus 30-0036
micropipette puller Sutter Instrument P-2100
microforge Narishige MF-800
piezoelectric actuator Physik Instrumente n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm) Spherotech SVP-30-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Johannes, L., Wunder, C., Bassereau, P. Bending "on the rocks"--a cocktail of biophysical modules to build endocytic pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
  3. Dawson, J. C., Legg, J. A., Machesky, L. M. Bar domain proteins: a role in tubulation, scission and actin assembly in clathrin-mediated endocytosis. Trends Cell Biol. 16 (10), 493-498 (2006).
  4. Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends Biochem Sci. 37 (12), 526-533 (2012).
  5. Qualmann, B., Koch, D., Kessels, M. M. Let's go bananas: revisiting the endocytic BAR code. EMBO J. 30 (17), 3501-3515 (2011).
  6. Rao, Y., Haucke, V. Membrane shaping by the Bin/amphiphysin/Rvs (BAR) domain protein superfamily. Cell Mol Life Sci. 68 (24), 3983-3993 (2011).
  7. Simunovic, M., Voth, G. A., Callan-Jones, A., Bassereau, P. When Physics Takes Over: BAR Proteins and Membrane Curvature. Trends Cell Biol. 25 (12), 780-792 (2015).
  8. Safari, F., Suetsugu, S. The BAR Domain Superfamily Proteins from Subcellular Structures to Human Diseases. Membranes (Basel). 2 (1), 91-117 (2012).
  9. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Progress in Colloid and Polymer Science Vol. 89: Trends in Colloid and Interface Science VI. Helm, C., Lösche, M., Möhwald, H. 89, Steinkopff. Ch. 29 127-131 (1992).
  10. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  11. Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
  12. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophys J. 70 (3), 1112-1121 (1996).
  13. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  14. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281 (2015).
  15. Hochmuth, R. M., Evans, E. A. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. I. Analysis. Biophys J. 39 (1), 71-81 (1982).
  16. Hochmuth, R. M., Wiles, H. C., Evans, E. A., McCown, J. T. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. II. Experiment. Biophys J. 39 (1), 83-89 (1982).
  17. Bassereau, P., Sorre, B., Levy, A. Bending lipid membranes: experiments after W. Helfrich's model. Adv Colloid Interface Sci. 208, 47-57 (2014).
  18. Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature chemical biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  19. Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO J. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  20. Shi, Z., Baumgart, T. Membrane tension and peripheral protein density mediate membrane shape transitions. Nat Commun. 6, 5974 (2015).
  21. Chen, Z., Shi, Z., Baumgart, T. Regulation of membrane-shape transitions induced by I-BAR domains. Biophys J. 109 (2), 298-307 (2015).
  22. Cuvelier, D., Derenyi, I., Bassereau, P., Nassoy, P. Coalescence of membrane tethers: experiments, theory, and applications. Biophys J. 88 (4), 2714-2726 (2005).
  23. Derenyi, I., Julicher, F., Prost, J. Formation and interaction of membrane tubes. Phys Rev Lett. 88 (23), 238101 (2002).
  24. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Adv Colloid Interface Sci. 208, 225-234 (2014).
  25. Sorre, B., et al. Nature of curvature coupling of amphiphysin with membranes depends on its bound density. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 173-178 (2012).
  26. Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Phys Rev Lett. 64 (17), 2094-2097 (1990).
  27. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  28. Capraro, B. R., Yoon, Y., Cho, W., Baumgart, T. Curvature sensing by the epsin N-terminal homology domain measured on cylindrical lipid membrane tethers. J Am Chem Soc. 132 (4), 1200-1201 (2010).
  29. Bo, L., Waugh, R. E. Determination of bilayer membrane bending stiffness by tether formation from giant, thin-walled vesicles. Biophys J. 55 (3), 509-517 (1989).
  30. Rossier, O., et al. Giant Vesicles under Flows: Extrusion and Retraction of Tubes. Langmuir. 19 (3), 575-584 (2003).
  31. Borghi, N., Rossier, O., Brochard-Wyart, F. Hydrodynamic extrusion of tubes from giant vesicles. EPL (Europhysics Letters). 64 (6), 837 (2003).
  32. Zhu, C., Das, S. L., Baumgart, T. Nonlinear sorting, curvature generation, and crowding of endophilin N-BAR on tubular membranes. Biophys J. 102 (8), 1837-1845 (2012).
  33. Ramesh, P., et al. FBAR syndapin 1 recognizes and stabilizes highly curved tubular membranes in a concentration dependent manner. Sci Rep. 3, 1565 (2013).
  34. Knorr, R. L., et al. Membrane morphology is actively transformed by covalent binding of the protein Atg8 to PE-lipids. PLoS One. 9 (12), e115357 (2014).
  35. Aimon, S., et al. Membrane shape modulates transmembrane protein distribution. Dev Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
  36. Prévost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. , (2015).
  37. Simunovic, M., et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  38. Allain, J. M., Storm, C., Roux, A., Ben Amar, M., Joanny, J. F. Fission of a multiphase membrane tube. Phys Rev Lett. 93 (15), 158104 (2004).
  39. Morlot, S., et al. Membrane shape at the edge of the dynamin helix sets location and duration of the fission reaction. Cell. 151 (3), 619-629 (2012).
  40. Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
  41. Simunovic, M., et al. Friction Mediates Scission of Tubular Membranes Scaffolded by BAR Proteins. Cell. 170 (1), 172-184 (2017).
  42. Simunovic, M., Lee, K. Y., Bassereau, P. Celebrating Soft Matter's 10th anniversary: screening of the calcium-induced spontaneous curvature of lipid membranes. Soft Matter. 11 (25), 5030-5036 (2015).
  43. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5622-5626 (2009).
  44. Heinrich, M., Tian, A., Esposito, C., Baumgart, T. Dynamic sorting of lipids and proteins in membrane tubes with a moving phase boundary. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7208-7213 (2010).
  45. Dasgupta, R., Dimova, R. Inward and outward membrane tubes pulled from giant vesicles. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (28), 282001 (2014).
  46. Vitkova, V., Genova, J., Mitov, M. D., Bivas, I. Sugars in the aqueous phase change the mechanical properties of lipid mono- and bilayers. Molecular Crystals and Liquid Crystals. 449, 95-106 (2006).
  47. Bouvrais, H. Mechanical properties of giant vesicle membranes investigated by flickering technique. , University of Southern Denmark. (2011).
  48. Koster, G., Cacciuto, A., Derenyi, I., Frenkel, D., Dogterom, M. Force barriers for membrane tube formation. Phys Rev Lett. 94 (6), 068101 (2005).
  49. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophys J. 35 (3), 637-652 (1981).
  50. Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 28 (11), 693-703 (1973).
  51. Canham, P. B. The minimum energy of bending as a possible explanation of the biconcave shape of the human red blood cell. J Theor Biol. 26 (1), 61-81 (1970).
  52. Marcerou, J. P., Prost, J., Gruler, H. Elastic Model of Protein-Protein Interaction. Nuovo Cimento Della Societa Italiana Di Fisica D-Condensed Matter Atomic Molecular and Chemical Physics Fluids Plasmas Biophysics. 3 (1), 204-210 (1984).
  53. Leibler, S. Curvature Instability in Membranes. J Phys-Paris. 47 (3), 507-516 (1986).

Tags

علم الأحياء المجهرية، 130 قضية، انحناء غشاء، غشاء أنبوب نانوي، الفيزياء الحيوية، حويصلة، ملاقط بصرية، مجهرية [كنفوكل]، وانحناء الفرز، وإعادة تشكيل في المختبر ، بار البروتينات، الالتقام
سحب الأنابيب النانوية الأغشية من الحويصلات أونيلاميلار العملاقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prévost, C., Tsai, F. C.,… More

Prévost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (130), e56086, doi:10.3791/56086 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter