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Biology

Tirant des Nanotubes de la Membrane des vésicules unilamellaires géant

Published: December 7, 2017 doi: 10.3791/56086
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,4, 1,5
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR168, 2Department of Genetics and Complex Diseases, T. H. Chan School of Public Health, Harvard Medical School, 3Department of Cell Biology, Harvard Medical School, 4Sorbonne Universités, UPMC University Paris 06, 5Center for Studies in Physics and Biology, The Rockefeller University
* These authors contributed equally

Summary

Beaucoup de protéines dans la cellule détecte et induire la courbure de la membrane. Les auteurs décrivent une méthode pour extraire des nanotubes de la membrane de vésicules lipidiques pour étudier l’interaction des protéines ou de n’importe quelle molécule de courbure-active avec courbes de membranes in vitro.

Abstract

Le remodelage de la membrane cellulaire est partie intégrante de nombreux phénomènes cellulaires, tels que l’endocytose, le trafic, la formation des filopodes, etc.. Nombreuses protéines différentes associent à membranes courbés à cause de leur capacité à détecter ou induire la courbure de la membrane. En règle générale, ces processus impliquent une multitude de protéines, ce qui les rend trop complexe à étudier quantitativement dans la cellule. Les auteurs décrivent un protocole afin de reconstituer une courbe membrane in vitro, imitant une structure cellulaire courbée, comme le cou d’endocytose. Une vésicule unilamellaires géant (GUV) est utilisée comme un modèle d’une membrane de la cellule, dont la pression interne et la tension superficielle sont contrôlé avec aspiration de la micropipette. Application d’une force de traction de point sur le GUV à l’aide de pinces optiques crée un nanotube de courbure élevé lié à une membrane plate. Cette méthode a traditionnellement été utilisée pour mesurer les propriétés mécaniques fondamentales des membranes lipidiques, tels que la rigidité de flexion. Ces dernières années, il a été élargi pour étudier comment les protéines interagissent avec la courbure de la membrane et la manière dont ils affectent la forme et la mécanique des membranes. Un système combinant micromanipulation, micro-injection, pinces optiques et la microscopie confocale permet la mesure de la courbure de la membrane, la tension de la membrane et la masse surfacique des protéines, simultanément. Ces mesures, de nombreuses propriétés importantes de mécaniques et morphologiques du système protéine membranaire peuvent être déduites. En outre, nous posons un protocole de création GUVs en présence de concentration saline physiologique et une méthode de quantification de la masse surfacique des protéines sur la membrane des intensités de fluorescence des lipides et des protéines marquées.

Introduction

Nombreux processus cellulaires, tels que de l’endocytose, le trafic, la formation des filopodes, infection, etc., sont accompagnées d’un changement radical dans la forme de membranes cellulaires1,2. Dans la cellule, un certain nombre de protéines participer à ces processus en se liant à la membrane et modifier leur forme. Les exemples les plus notables sont membres de la famille des protéines amphiphysine/Bin/Rvs (BAR), contenant une caractéristique intrinsèque courbée BAR domaine3,4,5,6,7. En général, ils interagissent avec la membrane en respectant le domaine de BAR à la surface et, dans bien des cas, également très superficiellement insertion amphipathic hélices dans la bicouche. La forme, la taille et frais du domaine BAR ainsi que le nombre de spirales d’amphipathic détermine : (1) le sens de courbure de la membrane (c.-à-d., si ils vont induire des invaginations ou saillies) et (2) l’ampleur de la membrane courbure de5,8. À noter ici courbure positive est définie comme la partie bombée de la membrane courbée, c'est-à-dire, le renflement vers la particule qui interagissent et négatif sinon. En outre, des études quantitatives des barres protéines ont révélé que leur effet sur la membrane dépend d’un ensemble de paramètres physiques : grammage de protéines, la tension de la membrane et forme de membrane (plat contre tubulaire versus sphérique 7de forme). Selon ces paramètres BAR protéines peut : (1) agissent comme capteurs de courbure de la membrane, (2) Pliez les membranes ou (3) induisent la membrane scission7.

En raison de la multiplicité des composants impliqués dans la membrane remodeler dans la cellule, étudie les aspects quantitatifs des phénomènes, tels que l’endocytose, in vivo est extrêmement difficile. In vitro la reconstitution des éléments minimes imitant les membranes courbés dans la cellule permet d’acquérir une compréhension mécaniste des protéines de membrane-cintrage comment exploiter. Cet article décrit un protocole afin de reconstituer une membrane nanotube in vitro avec micromanipulation, microscopie confocale et pinces optiques. L’approche permet d’étudier, de manière quantitative, comment les protéines, lipides ou des petites molécules interagissent avec membranes incurvés. GUVs lipides sont utilisés comme modèles d’une membrane de la cellule, dont la courbure est négligeable par rapport à la taille des molécules interagissants de membrane-courber. Ils sont préparés à l’aide de la méthode d’electroformation9 dans lequel les vésicules sont formées par hydratant un film lipidique et ce gonflement dans GUVs sous un courant alternatif (AC)10. Des substrats plus courantes sur lesquelles sont cultivés GUVs sont soit semi conducteurs plaques recouvertes d’oxyde de bidon d’indium (ITO) ou des fils de platine (Pt-fils)11. Dans cet ouvrage, GUVs sont cultivées sur Pt-fils que cette méthode s’est avérée travaillent beaucoup mieux que l’alternative en faisant GUVs en présence de sels dans le tampon12. Bien que le protocole d’electroformation est décrit ici, avec suffisamment de détails pour le reproduire, nous renvoyons le lecteur aux articles précédents dans lequel similaires et d’autres méthodes de fabrication GUVs ont été décrits en détail13,14. Dans nos mains, electroformation Pt-fils a avec succès fourni GUVs d’un mélange de lipides synthétiques ou de lipides naturels extraits dans une mémoire tampon contenant ~ 100 mM NaCl. En outre, il était également possible d’encapsuler des protéines à l’intérieur de GUVs durant la croissance. Une chambre d’electroformation exemple est illustrée à la Figure 1 a; Il compose d’environ 10 cm de long deux Pt-fils insérés dans un support de polytétrafluoroéthylène (PTFE) qui peut être scellé des deux côtés avec des lamelles de verre ~ 1-2 cm de distance (Figure 1 a).

Figure 1
Figure 1 : montage expérimental. (A) l’electroformation GUV chambre avec connecteurs électriques fixés sur Pt-fils. Gauche (B) : le système expérimental montrant le microscope, la chambre expérimentale au-dessus de l’objectif et deux micropipettes (gauche et droite) attaché aux micromanipulateurs et insérée dans la chambre expérimentale pour tube en tirant et en protéines injection. A droite : une vue rapprochée de la chambre expérimentale montés au-dessus de l’objectif montrant les pointes de l’aspiration et les micropipettes injection insérées. (C), une seringue équipée d’un distributeur de mince inséré dans une micropipette à son extrémité arrière. Le fond est une vue rapprochée du distributeur à l’intérieur de la micropipette avec la ligne pointillée bleue décrivant la micropipette. Ce système est utilisé pour remplir la micropipette de caséine pour passiver la surface vitrée et aussi vers l’arrière le remplissage avec de l’huile minérale lorsque nécessaire. (D), un système utilisé pour aspirer les quantités µL de la solution de protéines. L’aiguille est reliée à une seringue et au tuyau qui est relié à la micropipette d’injection. La pointe de la micropipette est soigneusement immergée dans la solution de protéine et aspirée donc pour occuper la pointe de la micropipette. Une micropipette est puis retour remplie d’huile minérale en utilisant le système illustré par panneau C. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Un nanotube de membrane, allant de rayon de 7 nm à plusieurs centaines nm, peut être extraite d’un GUV par une force externe. Cette méthode a été initialement conçue pour mesurer les propriétés élastiques des membranes cellulaires et vésicules, par exemple la flexion rigidité15,16. Dans ses œuvres plus récentes, la méthode a été étendue afin d’étudier l’interaction des protéines avec des membranes incurvés par microinjecting des protéines près le nanotube tiré7,17. Autres méthodes ont été développées pour l’étude des protéines membranaires-courber. Dans une seule méthode, protéines sont incubés avec les liposomes différemment tailles attachées à une surface passivée. Microscopie confocale est utilisée pour mesurer la liaison aux protéines en fonction du diamètre de liposome, ce qui peut indiquer induite par la courbure tri18,19. Dans une autre méthode, les protéines sont injectés près d’un micro-aspiré GUV de mesurer leur capacité à induire spontanément des tubules20,21. La méthode décrite dans le présent protocole est particulièrement bien adaptée pour étudier la membrane-cintrage protéines impliquées dans l’endocytose, où la plupart des protéines rencontrent généralement membrane préformée nanotubes reliant l’invagination de membrane contenant des marchandises avec le membrane de plasma plate sous-jacente. En outre, dans cette méthode, contrairement à dans le dosage avec les liposomes petites piquet, le nanotube de membrane est connecté en permanence à la membrane ; par conséquent, il est en équilibre mécanique avec le GUV, une situation attendue en vivo. Par conséquent, physique de la membrane fondamentale s’applique et nous pouvons en déduire une pléthore des propriétés mécaniques de nos Mensurations22,23,24.

Pour une implémentation complète de cette méthode, le matériel nécessaire comprend un microscope confocal, pinces optiques et un ou deux micropipettes reliés à un réservoir d’eau (Figure 1 b). En combinant tous les trois, il est possible mesurer la tension de la membrane, courbure de la membrane, masse surfacique de protéines simultanément et tube force25. Micropipette aspiration est essentielle et il est facilement construit en insérant une micropipette de verre dans un support relié à un réservoir d’eau, qui, par l’intermédiaire de la pression hydrostatique, contrôle l’aspiration pression26. Une micropipette et le titulaire sont contrôlés par un micromanipulateur et, idéalement, dans une seule direction par un piezo-déclencheur pour le mouvement de précision. Pour tirer un nanotube, le microaspirated GUV est brièvement coincé à un micron taille perler puis tiré loin créant un nanotube. Dans cette implémentation, le talon est maintenu par des pinces optiques, qui peuvent être construits en suivant un protocole publié27. Il est possible de se passer des pinces optiques et tirez nanotubes de différentes façons, bien qu’au prix de mesure de la force précise. Si c’est trop difficile de construire un piège optique ou si la mesure de la force n’est pas essentielles, telles que si l'on veut simplement vérifier la préférence des protéines des membranes incurvés, un tube peut être tiré à l’aide d’un cordon aspiré à l’extrémité d’un deuxième micropipette28. Il est également possible de tirer des tubes à l’aide de la force de gravitation29 ou30,31s’écouler. En outre, la microscopie confocale n’est pas indispensable non plus ; Toutefois, il est préférable donc de mesurer la masse surfacique des protéines. Il permet également de mesurer le rayon de nanotube de l’intensité de la fluorescence des lipides dans le tube, donc indépendamment de la force de membrane et tension. INFERER tube rayon de fluorescence est particulièrement important si la relation entre ces grandeurs s’écarte des équations bien établies en raison de la présence de protéines membranaires-adhéré25. Ce qui est important, on ne peut pas distribuer du piège optique et microscopie confocale, car il ne sera pas possible de mesurer la courbure du tube.

La méthode décrite dans le présent protocole a été utilisée pour étudier le tri induite par la courbure de diverses protéines membranaires périphériques sur des nanotubes, surtout ceux de la BAR familial25,32,33,34 . On a aussi montré que le canal de potassium transmembranaire conique KvAP est enrichi sur courbé nanotubes de la même manière comme barre de protéines,35. En optimisant la méthode pour encapsuler des protéines à l’intérieur de GUVs, l’interaction des protéines, à courbure négative a été récemment étudiée bien36. En outre, cette méthode a été utilisée afin d’élucider la formation de protéines échafaudages25,37 et pour étudier le mécanisme de scission de la membrane par chaque ligne tension38, protéine dynamine39, ou BAR protéines40,41. En plus des protéines, petites molécules ou ions peuvent également induire la courbure. En utilisant cette méthode, ions calcium ont montré pour induire une courbure positive sous conditions sans sel42. Fait intéressant, il a également été démontré que les lipides peuvent subir courbure tri, mais seulement pour des compositions qui sont près d’un demixing point43,44. En somme, la méthode peut être utilisée par les chercheurs intéressés à étudier comment chaque composants membranaires intrinsèques (par exemple, lipides ou protéines transmembranaires) ou en périphérie des molécules de liaison (que ce soit à l’intérieur ou à l’extérieur GUVs) interagir avec membranes cylindrique incurvées, du point de vue mécanique et quantitatif. Il est également prévu pour ceux qui souhaitent mesurer les propriétés mécaniques de la membrane elle-même22,23,45.

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Protocol

1. préparation des GUVs par Electroformation sur Pt-fils

  1. Nettoyage de la chambre d’electroformation (voir Introduction et Figure 1 a) et les Pt-fils avec un solvant organique comme l’éthanol ou l’acétone pour nettoyer les lipides et l’eau pour laver les sels.
    NOTE : Nous vous suggérons de bien essuyer loin le résidu avec tissu imbibé d’éthanol puis sonification dans l’acétone, l’éthanol, puis l’eau, pendant 5 min.
  2. Préparer un mélange de lipides d’une composition lipidique désiré à 1 mg/mL dans le chloroforme. Le mélange doit contenir ~ 0,05 % fraction molaire d’un lipide conjugué avec de la biotine (p. ex., 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]) et ~ 0,5 % fraction molaire d’un lipide conjugué avec un fluorophore ( par exemple, BODIPY-TR-C5-céramide).
    NOTE : D’après notre expérience, il était difficile de produire GUVs à un rendement élevé, contenant plus de 30 % chargées de lipides.
    ATTENTION : Chloroforme doit être manipulé à l’intérieur d’une hotte chimique des gants appropriés.
  3. Insérez une paire de Pt-fils dans la chambre d’electroformation. Déposer le mélange de lipides sur les Pt-fils en gouttes séparées par ~ 2-3 mm (total ~ 4 µL du mélange).
  4. Sécher les fils sous vide durant 30 à 60 min à température ambiante.
  5. Sceller le fond de la chambre en respectant la lamelle au-dessus de la chambre à l’aide de graisse silicone. Remplir la chambre avec une solution tampon contenant du NaCl, saccharose et un agent tampon (par exemple, 70 mM NaCl, saccharose de 100 mM et 10 mM Tris, à pH 7,4). Ce moyen de communication sera à l’intérieur des GUVs dans l’expérience. Il est essentiel que l’osmolarité du milieu de ce match l’osmolarité du milieu expérimental au sein de ~ 10 %. Saccharose permet d’ajuster l’osmolarité. Ajouter des protéines à la solution à une concentration souhaitée si le but est de les encapsuler dans les GUVs.
    ATTENTION : Divers sels et sucres dans la mémoire tampon peuvent affecter la rigidité en flexion et la courbure spontanée des membranes24,42,46,47.
  6. Sceller la partie supérieure de la chambre en respectant un lamelle couvre-objet avec de la graisse silicone assurant minimale de l’air à l’intérieur de la chambre. Appliquer un courant sinusoïdale AC par le biais des Pt-fils à 500 Hz et 280 mV.
    Remarque : La durée de croissance et de la température doivent être optimisés selon la composition lipidique et la sensibilité de la protéine. Lorsque vous utilisez des extraits de lipides naturels et aussi lors de l’encapsulation de protéines en GUVs, le meilleur rendement a été réalisé par croissant GUVs à 4 ° C durant la nuit. En l’absence de protéines et des compositions lipidiques synthétique, croissance à température ambiante pendant ~ 2 h suffisait.

2. préparation de la chambre expérimentale et les Micropipettes

  1. Afin de préparer les micropipettes, tirer un capillaire de verre à l’aide d’un extracteur de pipette. Il est conseillé d’utiliser un capillaire de verre avec des rayons internes et externes de, respectivement, 0. 7 mm et 1 mm. Ensuite, affiner la pointe de la micropipette afin que son diamètre intérieur est de 5–7 µm, en utilisant une microforge. Si les protéines ou autres molécules seront injectés dans l’expérience, tirez un autre micropipette et affiner son extrémité à un diamètre intérieur de 8–15 µm.
  2. Aménager une chambre expérimentale en plaçant deux lamelles de microscope rectangulaire sur une base métallique tel qu’illustré à la Figure 1. Les lamelles doivent être séparés par ~ 1 mm. La chambre doit avoir des ouvertures sur les bords longs (voir Figure 1). Les côtés devraient s’adapter à la pointe de la micropipette où la pointe devrait atteindre au moins le centre de la chambre.
  3. Préparer le tampon expérimental dont l’osmolarité ne devrait pas différer de plus de 10 % de la mémoire tampon servant à la culture GUVs. Ajuster l’osmolarité avec le glucose. Un exemple d’un tampon expérimental qui a été utilisé dans l’étude de l’interaction de l’endophiline avec nanotubes est 100 mM NaCl, 40 mM de glucose, tamponné avec Tris à pH 7,4. Une combinaison de saccharose à l’intérieur / glucose extérieur assure : contraste de phase (a) suffisante pour observer GUVs au microscope à fond clair, et (b) plus forte densité à l’intérieur des GUVs qui les amène à se déposent au fond de la chambre. Ajuster la concentration en sel basée sur condition expérimentale.
    Remarque : En plus d’affecter des propriétés mécaniques de la membrane, dans notre expérience, concentration élevée de glucose (> 300 mM) affecte négativement la mise en place de liaisons de streptavidine-biotine, nécessaire pour tirer un nanotube. En outre, trop peu de sel inhibe la Streptavidine-biotine obligations, tandis que trop élevée d’une concentration écrans interactions protéine-membrane. Dans le cas d’encapsulation de protéine, à l’aide de très haute concentration de sel dans le tampon externe (par exemple, > 200 mM NaCl) peut être utilisé comme un truc pour détacher les protéines du feuillet externe36. Il est nécessaire d’expérimenter avec une gamme de concentration en sel de trouver les conditions d’une fixation optimale de la molécule d’intérêt.
  4. 30 à 60 min avant de recueillir GUVs pour l’expérience, passivation des surfaces de verre en remplissant la chambre expérimentale tant la micropipette d’aspiration avec une solution de 5 mg/mL d’une β-caséine très pure (p. ex., dissoute dans du tampon expérimentale). Β-caséine crée une couche protectrice sur les surfaces vitrées, empêchant GUVs d’adhérer trop fortement, ce qui entraînerait l’éclatement. Incubez avec β-caséine durant 30 à 60 min.
    Remarque : Il ne devrait y avoir aucune bulle à l’intérieur de la micropipette qui interférerait avec le contrôle de tension de la membrane.
    1. Pour générer un distributeur pour le remplissage des micropipettes, casser une aiguille de seringue à proximité le raccord en plastique et coller dedans un capillaire de silice fine (comme celles utilisées pour la chromatographie en phase liquide) (Figure 1).
  5. Durant l’incubation avec la β-caséine, monter la chambre sur le microscope et centrez-la au-dessus de l’objectif. Insérez la pointe d’une micropipette d’aspiration par le biais de l’ouverture le long du bord long et amener la pointe au-dessus de l’objectif de microscope. Ajuster le niveau de réservoir d’eau pour que la pression d’aspiration est proche de zéro (il ne faudrait aucun lourds flux dans ou hors de la pipette, qui peut être vu au microscope).
  6. Dans le cas où les protéines ou autres molécules seront injectés au cours de l’expérience, remplissez la micropipette d’injection avec la molécule désirée dissoute dans le tampon expérimentale à une concentration de choix, monter une micropipette à l’intérieur d’un micromanipulateur, et insérer par le biais de l’autre côté de la chambre expérimentale.
    1. Pour utiliser un minimum de protéines, remplissez seulement la pointe de la micropipette avec la protéine par aspiration. Pour cela, enroulez l’extrémité d’une aiguille attachée à une seringue avec tuyau en plastique. Insérer le tuyau dans le dos de la micropipette d’injection.
    2. Très soigneusement, plongez l’extrémité de la micropipette dans la solution de protéine et aspirer pour remplir la pointe de la micropipette.
      Remarque : Cette configuration simple est montré dans la Figure 1 et, selon notre expérience, il permet d’aspirer d’aussi peu que quelques µL de la solution de protéines.
    3. Remblayer le reste de la micropipette d’injection d’huile minérale pour empêcher le mélange de la solution de protéines et de l’eau du réservoir d’eau (à l’aide de la configuration dans la Figure 1).
    4. Prendre soin de ne pas pour introduire des bulles d’air dans la pipette d’injection, que cet acte va entraîner la pression d’injection instable. Par ailleurs, si la quantité de protéine est suffisante, remplissez la micropipette avec les protéines tout comme remplissage avec β-caséine comme indiqué au point 2.4. Ajuster le niveau de réservoir d’eau pour minimiser la pression d’aspiration dans la pipette d’injection.
      Remarque : La concentration de la molécule injectée ou ion près le nanotube va être inférieure en raison de la dilution et elle peut être estimée en mesurant la diminution d’intensité de fluorescence en fonction de la distance de la pipette sortie42. Il est toutefois plus important de connaître la densité de la bicouche liaison de la molécule injectée, ce qui peut être mesurée avec précision (voir Section 4).
  7. Après l’incubation avec la β-caséine, retirer la solution de la chambre et rincer avec le tampon expérimental plusieurs fois. Remplir avec le tampon expérimental.
  8. Arrêter electroformation de GUVs et à leur rassemblement directement à partir des Pt-fils. Ajouter quelques µL de la solution GUV de la chambre expérimentale. N’utilisez que fraîchement préparés GUVs.
  9. Ajouter quelques µL de streptavidine perles dans la chambre expérimentale à une concentration finale de perles dans la chambre à autour de 0,1 x 10−3 % (p/v) ou moins. Billes de polystyrène ~ 3 µm de diamètre sont recommandés (billes de polystyrène dans l’eau ont un contraste quasi-optimales indice de réfraction en ce qui concerne la maximisation de la force du gradient en ce qui concerne la force de diffusion dans le piège optique). La concentration en billes peut être réglée selon l’expérience : une très faible concentration, il est difficile de les trouver dans la chambre, et une concentration trop élevée risque de multiples perles tombant dans les pinces optiques.

3. tirer un Nanotube de Membrane d’une GUV

  1. Laissez les GUVs et les perles se déposent au fond de la chambre. Dégonfler les GUVs en laissant un peu de la mémoire tampon expérimentale s’évaporer, pour environ ~ 15 min. dégonfler les GUVs est essentiel pour produire certaines zones excédentaires qui peuvent être aspirés avec une micropipette. GUVs devrait visiblement ondulent (c.-à-d., apparaissent disquette) en microscopie. Si elles apparaissent tendues, permettent plus temps d’évaporation.
    Remarque : Le taux de changement d’osmolarité dépend de la surface d’évaporation, la température, etc.et doit être étroitement surveillé. En principe, la différence d’osmolarité pourrait être réglée du début en ajustant la concentration de saccharose et de glucose, cependant, il faut ne pas de provoquer un choc osmotique.
  2. Trouver une disquette GUV et il aspirer dans la pipette. La longueur de la langue d’aspiration (la partie de la membrane à l’intérieur de la pipette) doit être égal ou plus grand que le rayon de la pipette pour l’analyse théorique soit applicable15,16,22,(23 ) La figure 2). Essayez plusieurs GUVs. Si aucun de le GUVs peut être aspiré pour produire une assez longue langue, attendre quelques minutes. Si GUVs sont assez souple, passez à l’étape suivante.
  3. Sceller la chambre avec de l’huile minérale, empêchant l’évaporation de la mémoire tampon. Faire de pipetage soigneusement l’huile le long des bords ouverts de la chambre expérimentale.
  4. Pour définir la position zéro de la pression d’aspiration, tout d’abord, de rechercher une bille dans la chambre et de positionner la sortie de pipette d’aspiration près du talon. Régler la hauteur du réservoir afin que le talon est époustouflé par la pipette d’aspiration ni aspiré. Bien que l’huile minérale empêche l’évaporation et donc plus amples variations de pression à l’intérieur de la chambre, zéro la pression d’aspiration avant de mesurer chaque GUV.
  5. Trouver un GUV et aspirer à elle. Déplacer une micropipette et floue (pour garder le GUV loin de la surface où il pourrait être retirée de la pipette de contrainte de cisaillement lorsque la chambre est déplacée).
  6. Vous recherchez un cordon en tirant avec précaution autour de la chambre. Mouvements brusques peuvent éjecter le GUV. Il piège avec des pinces optiques à distance ~ 20 µm loin au fond de la chambre. Veiller à ce que la région d’intérêt est propre sans autres perles ou membranes en vue. Quoi que ce soit en tombant dans les pinces optiques autres que le talon va perturber la mesure.
  7. Ramener le GUV dans le foyer et loin de la perle avec une micropipette alignée avec le piège optique (Figure 2).
  8. Enregistrer le mouvement du talon pendant 1 à 2 min de mesurer la position d’équilibre (requise pour la mesure de la force).
  9. Réduire la pression à l’intérieur de la micropipette autant que possible sans perdre le GUV afin de diminuer la tension de la membrane. Mettre soigneusement le GUV au contact de la perle pour autour d’une seconde, établissant des liens de streptavidine-biotine, puis tirez doucement dos créant un nanotube. La motion de la GUV vers ou loin du talon doit idéalement être faite avec un piezo-actionneur pour au minimum perturber la perle dans les pinces optiques.
    Remarque : Si le nanotube ne forme pas, ça pourrait être en raison de la Streptavidine mauvais revêtement de la perle, une quantité insuffisante de lipides biotinylé dans le GUV, concentration insuffisante de sel ou excessive concentration de glucose dans le tampon expérimental, ou de la membrane tension dans le GUV est trop élevé48.
  10. Augmenter la pression d’aspiration afin de recréer la langue de l’aspiration. Aligner le tube pour se situent dans l’axe de la pipette d’aspiration et, au maximum, mettant l’accent sur le tube (Figure 2).
  11. Veiller à ce que l’Équateur GUV et le tube sont en discussion. Enregistrer le mouvement de la perle avec la microscopie lumineuse pendant quelques minutes (ici, la vitesse d’acquisition de caméra est 30 Hz). Enregistrement de la hauteur, h, de l’eau fraîche à l’égard de la position zéro. Prendre quelques images confocales du système (Figure 2).
  12. Répétez l’étape précédente à des pressions d’aspiration différents, implicitement les tensions membranaires. Gamme de tension typique est de 0,015 à 0,2 mN/m, avec une taille d’étape d’environ 0,02 mN/m.
  13. Si l’injection de protéines ou de molécules près du système, apporter une micropipette d’injection près le nanotube, veillant à ce que la perle dans le piège optique n’est pas perturbée. Injecter doucement à une pression d’environ 1 à 2 PA.
  14. Après que la liaison aux protéines a équilibrée (l’intensité de la fluorescence de la protéine injectée sur la membrane reste constant sur le GUV), répéter les mesures par étapes comme avec la membrane nue (étapes 3.11 et 3.12).
    Remarque : Étant donné que les mesures sont effectuées tout en injectant des protéines près le GUV à pression constante, la concentration en masse de la protéine reste à peu près inchangée près le GUV ; la désorption de protéines devrait donc être négligeable pendant la mesure.
    1. Alternativement, il est possible d’incuber les GUVs ainsi que les protéines avant d’effectuer des expériences en tirant le tube afin d’assurer une concentration globale de protéine constant. Étant donné que la fraction relative membranaire des protéines sur le tube et sur le GUV est mesurée, la façon dont les protéines sont n’influe pas sur le calcul du tri de courbure (voir Section 4).

Figure 2
Figure 2 : expérience tire Tube-. (A) schéma de l’expérience. (B) une image confocale d’un tube tiré comme décrit dans le présent protocole. Echelle = 2 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

4. les mesures et analyse des données

  1. Mesurer la tension de la membrane
    1. Calculer la pression hydrostatique pour chaque étape à la pression d’aspiration constante :
      ΔP = pgh
      où p est la densité de l’eau, accélération gravitationnelle g et h la hauteur de l’eau fraîche de l’étape 3.11.
    2. Des images confocales, mesurer le rayon de la GUV, rGUVet le rayon de la pipette d’aspiration, rpip (Figure 2).
    3. Calculer la tension de la membrane, σ, à l’aide équation49 de Laplace:
      Equation 1
  2. Mesure de force de la membrane
    1. Déterminer la raideur des pinces optiques, k, en utilisant l’un de plusieurs de méthodes d’étalonnage27. Dans cette configuration, mesurer k à l’aide de la méthode de traînée visqueuse27.
    2. Calculer le point d’équilibre de la perle, un0, une moyenne d’une mesure avant de retirer le tube (étape 3,8).
    3. Pour chaque mesure de tension constante, calculer la force de membrane équilibre, F, de la Loi de Hooke :
      F = k(a - 0)
      où a est la position moyenne du talon lors de cette mesure.
  3. Mesure de rayon tube
    1. Dans le cas d’une membrane nue (sans ajouté molécules membranaires-cintrage), calculer le rayon du tube, R, de la force comme :
      R = F/(4πσ)
      (références,du2223).
    2. Pour mesurer le rayon du tube en présence de molécules membranaires-cintrage et indépendamment étape 4.3.1, tout d’abord, enregistrer l’intensité de fluorescence de lipides sur la longueur du tube, j’aiunebaignoireet le long du contour GUV, j’aiGUV. Mesurer l’intensité de fluorescence moyenne d’un fluorophore dans ou liée à la membrane comme une intensité moyenne le long de la ligne plus brillants d’un tube ou un contour GUV. Sélectionnez une zone rectangulaire contenant une section horizontale de la contour GUV ou le tube et calculer la somme de l’intensité de la fluorescence de chaque ligne horizontale dans la zone.
      1. Divisez chaque somme par le nombre de pixels de la ligne horizontale (par exemple, la largeur de la boîte). Notez que, dans la zone sélectionnée, il ne devrait y avoir aucune autres membranes présents. Le profil d’intensité de fluorescence sur toute la longueur de la zone sélectionnée est obtenu.
      2. Après avoir soustrait l’intensité de l’arrière-plan, prendre l’intensité de fluorescence pixel moyen depuis la ligne de plus brillants. Le rayon du tube est linéairement lié au ratio de la fluorescence sur le pourtour du tube et de la GUV comme :
        R = Kcuvej’aibaignoire/j’aiGUV
        où Kcuve est un facteur de calibration25.
        Remarque : Cette méthode peut être utilisée pour mesurer le rayon du tube dans la gamme de 10 à 80 nm (lorsque le tube est assez étroit pour se situer dans une largeur de voxel confocal) et avec un peu plus d’incertitude dans le 80 nm et la gamme supérieure. La sensibilité de la mesure dépend de la configuration.
    3. Déterminer Kcuve en effectuant des mesures indépendantes de rayon dans les étapes 4.3.1 et 4.3.2 sur une composition de la membrane simple à l’aide de lipides sans inculpation. Cette composition simple membrane assure que le rayon et la force de la relation simple donnée à l’étape 4.3.1. Répétez l’expérience plusieurs fois et tracer R, déduite de la force (étape 4.3.1) versus j’aibaignoire/j’aiGUV (étape 4.3.2). Calculer Kcuve de l’ajustement. Dans cette configuration, Kcuve = 200 ± 50 nm en utilisant des oeufs (oeuf-PC)-α-L-phosphatidylcholine membranaire et un lipide fluorescent dont fluorescence dépend très peu de polarisation25.
      NOTE : Kcuve doit être mesurée pour différents objectifs, en raison de leurs volumes différents voxel confocale. Le fluorophore de lipides ne doit pas interagir avec les protéines/molécules injectées. Les lipides fluorescent recommandé ici, céramide BODIPY TR, ne devrait pas avoir des interactions avec les protéines. Cette hypothèse a été confirmée par des études antérieures de BAR et BAR-domaines25,36,37, qui ont montré que pour une couverture de surface riche en protéines, le rayon du tube est fixé par les protéines, indépendamment de la tension dans le GUV. Si les protéines interagissent avec le fluorophore de lipide, un appauvrissement de la couche ou l’enrichissement sans cause du fluorophore sera observée dans le tube à fractions surface variée riche en protéines.
  4. Mesure de la masse surfacique des protéines
    1. Préparer des mélanges de lipides à l’aide d’un simple lipide non chargé (par exemple, oeuf-PC) additionné d’environ cinq fractions molaires différentes d’un lipide fluorescent (de la même longueur d’onde que le colorant utilisé pour étiqueter la protéine, par exemple, BODIPY-FLC5-hexadecanoyl-phosphatidylcholine (HPC *) pour par exemple, les protéines marquées Alexa488) dans la gamme : XHPC * = 0,01 – 1 %. Préparez GUVs en saccharose de 100 mM en electroformation sur ITO plaques (suivez l’étape 1 d’une précédente publication13).
    2. GUVs de collecter et transférer vers une chambre expérimentale passivée avec β-caséine. Utilisez par exemple, 100 mM de glucose pour la solution expérimentale. Attendez quelques minutes pour les GUVs à régler.
    3. Prendre des images de GUVs confocal fluorescence et l’intensité de fluorescence moyenne le long de la GUV record des contours en fonction de la fraction molaire du lipide fluorescent (voir étape 4.3.2). Pour chaque composition, calculer la densité de la surface des lipides fluorescents, φHPC*. Par exemple, en supposant que la surface / lipides est 0,7 nm2, φHPC* = 1,43 x 106 XHPC * par feuillet. Tracer le HPC * intensité de la fluorescence dans le GUV, j’aiHPC *, GUV, par rapport à φHPC*. Fit donne la constante d’étalonnage, A, donnée par φHPC* = AIHPC *, GUV. A dépend des paramètres de microscopie, tels que la puissance du laser et la sensibilité du détecteur (c.-à-d., gain), c’est pourquoi record A pour divers couramment utilisés les paramètres de microscopie (voir exemple à la Figure 3).
    4. Préparer plusieurs solutions de HPC * dissous dans un détergent, par exemple, dodécylsulfate de sodium (SDS), à différentes concentrations de l’ordre de ~ 1 à 10 à 50 µM. enregistrer l’intensité de la fluorescence de chaque solution en vrac et de calculer la pente d’intensité par rapport à la concentration (Figure 3). Recommencez la mesure avec le fluorophore qui va être conjugué à la protéine dans une gamme de concentration similaire (Voir l’exemple avec Alexa488 à la Figure 3). Cette mesure est nécessaire pour relier les intensités de fluorescence de l’étiquettes protéines et lipides, j’aiA488, bulk / j’aiHPC *, en vrac, comme ils ne peuvent pas nécessairement émettre de la même manière à la même concentration en vrac.
    5. Mesurer le nombre de fluorophores par molécule de protéine à l’aide d’un fluorospectromètre. Par exemple, dans le cas de Alexa488, le nombre de molécules Alexa488 par protéine, nA488, peut être calculé en utilisant la relation suivante :
      n A488 = (A494/εA488) / ((A280 - 0,11A494) / εprot)
      où A494 et A280 sont les valeurs d’absorbance par unité de longueur à 494 nm et 280 nm, respectivement, et εA488 et εprot sont les coefficients d’absorption moléculaire de Alexa488 et la protéine, respectivement.
    6. Calculer la masse surfacique de la protéine sur le GUV, φprot, GUV, selon la formule suivante :
      Equation 2
      Gardez à l’esprit l’état de polymérisation de la protéine. Par exemple, barres protéines dimériser, donc la densité calculée sera celui du monomère BAR par surface si vous utilisez le coefficient d’extinction de la forme monomère.

Figure 3
Figure 3 : exemple d’étalonnage de masse surfacique de protéine. Mesurés sont l’HPC * lipides intensité de fluorescence en vrac (à gauche) et en GUVs (Centre). Aussi, mesurés sont l’intensité de fluorescence en vrac de Alexa488 (lié à un domaine BAR) (à droite). Intensité de la fluorescence augmentent linéairement avec concentration. Mesures indiquées sont pour le gain de détection spécifique et laser puissance de sortie. Parcelles généré selon les données de référence37. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

L’expérience de tirage de tube peut donner des informations vitales de mécaniques sur la membrane. En l’absence de protéines ou autres molécules qui force de couple avec la courbure de la membrane, la membrane et le rayon du tube peut être liée avec la tension de la membrane en appliquant l’hamiltonien Canham-Helfrich équation dans un tube a tiré un GUV50,51

Equation 3(Équation 1)

où Equation 4 est la membrane l’énergie libre du tube, membrane K flexion rigidité, r et R0 sont, respectivement, la moyenne et spontanées rayons de courbure, la tension de membrane σ, A la portion du tube, L la longueur du tube et f la point force exercée par le tube sur le talon. A l’équilibre, r est le rayon du tube, noté R, et f est la force de rappel du tube, F, c'est-à-dire, la force d’équilibre par lequel le tube est en tirant le talon dans le piège optique. Pour calculer F et R, nous minimisons Equation 4 en ce qui concerne L et r, ce qui donne22,23

Equation 5(Équation 2)

Equation 6(Équation 3)

R 0 est négligée si les deux feuillets de la membrane ont la même composition, même si il est spéculé que d’autres facteurs, tels que frais répulsions peuvent induire une courbure spontanée42. Mesures de force et le rayon sur tubes tirés 100 % DOPC GUVs sont en excellent accord avec les prédictions théoriques dans l’équation 2 et 3 de l’équation (Figure 4). Les deux mesures sont indépendantes, la force est mesurée à partir du déplacement de la perle dans le piège optique et le rayon de l’intensité de la fluorescence, fournissant donc deux façons de calculer la membrane rigidité de flexion. Montage de l’équation 2 et 3 de l’équation pour les rendements de données indiqué : K = (25,1 ± 1,4) (moyenne ± et) kBT et (22,1 ± 1,5) kBT, respectivement, comme précédemment mesurée42 .

Si l’expérimentation avec courbure-couplage des protéines, il est suggéré d’utiliser le plus sophistiqué équation du hamiltonien que celui dans l’équation 1, comme l’équation 1 ne représente qu’une courbure spontanée efficace et ne tient pas compte de la effet des protéines de la membrane des propriétés mécaniques ou des interactions protéine-protéine possible. Voir, par exemple,25,35,36,52,53. Bien que les modèles théoriques avancées sont essentielles à une compréhension approfondie d’un système de membrane protéique spécifique, sans avoir recours à eux, il est toujours possible d’obtenir des informations très utiles de la méthode de tirage de tube.

Par exemple, pour vérifier si les protéines sentiment de courbure, l’intensité relative des protéines sur le tube est mesurée par rapport à la GUV, qui est considéré comme plat. L’interaction avec une courbure positive est étudiée en injectant les protéines près du tube avec le deuxième micropipette25. L’interaction avec la courbure négative ou le comportement des protéines transmembranaires est étudiée par encapsulation ou reconstituer les protéines au cours de la formation de GUV35,36. L’enrichissement relatif des BAR et KvAP des protéines sur les tubes de la membrane sur les sous-jacent GUVs indique qu’ils préfèrent les membranes courbes (Figure 5). Pour être plus quantitative, cet enrichissement peut être calculé selon un coefficient de tri, S, selon :

Equation 7(Équation 4)

où j’aiprot, baignoire et j’aiprot, GUV sont les intensités de fluorescence des protéines sur le tube et sur le GUV, respectivement, et j’ailip, baignoire et j’ailalèvre, GUV sont les intensités de fluorescence des les lipides sur le tube et le GUV, respectivement.

Un autre exemple consiste à mesurer la force de tube comme la protéine se lie à la membrane. Figure 5 b, C qui montre un endophiline de protéine N-BAR qu'a2 a progressivement réduit la force de tube, réduisant à zéro, ce qui indique qu’il a formé une structure tridimensionnelle qui maintient le tube stable, ce qui est appelée un échafaudage. Ces structures jouent un rôle important dans l’endocytose, par le rayon du tube de fixation, mais aussi pour permettre la scission7,41. Mesure de S, ainsi que les effets mécaniques et morphologiques qu’imposent des protéines sur les membranes fournit des renseignements importants sur leur mode de fonctionnement dans les phénomènes de membrane-flexion dans la cellule.

Figure 4
Figure 4 : résultats représentatifs des mesures mécaniques en l’absence de protéines. Sont linéarisée force et dépendance rayon tube sur la tension de la membrane pour une membrane DOPC de 100 %, de trois mesures indépendantes, publié précédemment42. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : résultats représentatifs de formation courbure de télédétection et d’échafaudage par BAR protéines. (A) courbure de détection de la protéine-BAR IRSp53. La protéine détecte la courbure négative membrane et est liée à l’intérieur de la GUV, avec une quantité négligeable de protéine présente sur le feuillet de la membrane externe. Echelle = 5 µm. réimprimé à partir de36, aux termes de la licence de Creative Commons CC-BY, Copyright 2015, Nature Publishing Group. (B) formant un échafaudage de protéine par l’endophiline de protéine N-BAR. Les protéines sont injectés près du tube et sont par conséquent tenus sur le feuillet de la membrane externe. Comme décrit dans37, endophiline se lie à la base du tube et forme un échafaudage qui pousse continuellement le long du tube de la GUV vers le piège optique (OT, cercle blanc). (C), un kymogram de croissance d’échafaudage endophiline de la GUV à la perle, avec les canaux de lipides et de protéines superposées. Le graphique montre la force de tube, F, en fonction du temps t. Les délais dans le kymogram et l’intrigue sont les mêmes (x-axe est partagé). B et C, échelle bar = 2 µm. reproduit avec la permission de référence37, droit d’auteur (2016) de l’Académie nationale des Sciences. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La méthode d’extraction des tubes depuis GUVs donne riche d’informations sur le système de la protéine de la membrane, comme il n’est pas seulement des moyens de mesurer les propriétés mécaniques fondamentales de la membrane, mais il est utile de faire la lumière sur le couplage entre les protéines et les membranes courbure. Tel que mentionné dans l’Introduction, il existe des autres techniques pour mesurer les effets des protéines membranaires-courber, soit en incubant les protéines avec les liposomes sub-micronique, attachés à une surface passivé18,19 , ou en observant la formation spontanée des tubules GUVs micropipette atmosphérique sur l’injection d’une protéine20,21. La méthode décrite ici fournit une connexion géométrique directe d’endocytose et est unique en fournissant les mesures physiques importantes du système dans le même temps, tels que la densité de protéine, tension de la membrane et la force de la membrane.

Une limitation importante de la méthode est qu’il n’est pas trivial de construire et d’étalonner toutes les composantes impliquées dans l’analyse. Cependant, qu’un mélange de microscopie confocale, pinces optiques et micromanipulation renseigne maximale, certains composants peuvent être remplacés, comme indiqué dans l’Introduction, selon les informations qu’il faut apprendre au sujet de la système. Les composants minimes requis pour sonde avec succès le couplage de la courbure d’une protéine, ou n’importe quel autre potentiel courbure couplé molécule, sont un aspirateur d’une micropipette et un microscope confocal, avec les pinces optiques étant superflue. Ce qui est important, beaucoup d'entre les étalonnages (tels que l’étalonnage pour rayon tube membrane et pour déterminer la densité de surface de protéines) sont généralement seulement nécessaires pour être exécutée une fois. Une autre limite de la méthode est qu’il peut mesurer seul GUV à la fois, pour un montant de deux ou trois GUVs par heure (avec pratique) ; Toutefois, chaque mesure fournit une multitude de données.

Pour les mesures de débit plus élevés ou s’il est essentiel d’étudier l’interaction des protéines avec des géométries sphériques et pas tubulaires, autres tests devront être explorées ou mis au point. Les efforts futurs seront consacrées à : (1) conception d’un système de débit supérieur dans lequel plusieurs tubes (à partir de multiples GUVs) pourraient être tirés et mesurés en même temps et (2) intégrant la microscopie de Super-résolution alors pour étudier les détails de l’échafaudage de protéine qui s’inscrit sur les nanotubes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur et Gil Toombes pour leurs contributions essentielles à mettre en place la méthode de nanotube dans le groupe. Le groupe de P.B. appartient au consortium CNRS CellTiss et à la Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038), Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai a été financée par l’EMBO bourse à long terme (Fota 1527-2014) et les actions Marie Curie (H2020-ACEM-IF-2014, projet membrane-ezrin-actine). M.S. est Junior Fellow de la Society of Fellows de Simons.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC) Avanti 850375 Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin] Avanti 880129 biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide Molecular Probes (ThermoFisher) D7540 fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*) Molecular Probes (ThermoFisher) fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC) Avanti 840051 used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%) Sigma Aldrich C6905 used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose Sigma Aldrich S7903
D(+) glucose Sigma Aldrich G7021
NaCl Sigma Aldrich S7653
Tris Sigma Aldrich 10708976001
osmometer Loser n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure Goodfellow USA PT005139 used for GUV electroformation
function generator n/a used to create current for GUV electroformation
putty sealant Vitrex (from CML France) CRIT 140013 used to seal the electroformation chamber
bath sonicator n/a useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany) an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively) Harvard apparatus 30-0036
micropipette puller Sutter Instrument P-2100
microforge Narishige MF-800
piezoelectric actuator Physik Instrumente n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm) Spherotech SVP-30-5

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