Summary
Många proteiner i cellen känsla och inducera membran krökning. Vi beskriver en metod för att dra membranet nanorör från lipid blåsor att studera samspelet mellan proteiner eller någon krökning-aktiva molekylen med böjda membran in vitro.
Abstract
En ny utformning av cellmembranet är en integrerad del av många cellulära fenomen, såsom endocytos, människohandel, bildandet av filopodia, etc. Många olika proteiner associera med böjda membran på grund av deras förmåga att känna eller framkalla membran krökning. Vanligtvis, dessa processer omfattar en mängd proteiner att göra dem alltför komplex för att studera kvantitativt i cellen. Här beskriver vi ett protokoll för att rekonstituera en böjd membran i vitro, härma en böjd cellstruktur, såsom endocytic halsen. En jätte unilamellar vesikler (GUV) används som en modell av ett cellmembran, vars inre tryck och ytspänning kontrolleras med mikropipett aspiration. Tillämpa en punkt dragkraft på GUV använder optisk pincett skapar en nanotube av hög krökning ansluten till en platt membran. Denna metod har traditionellt använts för att mäta de grundläggande mekaniska egenskaperna av lipid membran, såsom bockning styvhet. Under de senaste åren har det utökats för att studera hur proteiner interagerar med membran krökning och hur de påverkar formen och mekanik av membran. Ett system som kombinerar mikromanipulation, Mikroskop, optisk pincett och konfokalmikroskopi tillåter mätning av membran krökning, membran spänning och Ytors av proteiner, samtidigt. Från dessa mätningar, kan många viktiga mekaniska och morfologiska egenskaper av protein-membran systemet utläsas. Dessutom lägger vi ut ett protokoll för att skapa GUVs i närvaro av fysiologiska salt koncentration, och en metod för att kvantifiera Ytors av proteiner på membranet från fluorescens stödnivåer märkta proteiner och lipider.
Introduction
Många cellulära processer, såsom endocytos, människohandel, bildandet av filopodia, infektion, etc., åtföljs av en dramatisk förändring i form av cellmembran1,2. I cellen delta ett antal proteiner i dessa processer genom att binda till membranet och att ändra sin form. De mest kända exemplen är medlemmar av proteinfamiljen Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR), som innehåller en egenskap som egensäkra böjd BAR domän3,4,5,6,7. Vanligtvis interagerar de med membranet genom att följa BAR domänen till ytan och, i många fall också grunt infoga amfipatiska spiraler i lipidens. Form, storlek och kostnad av domänen BAR tillsammans med antalet amfipatiska spiraler avgör: (1) riktningen av membran krökning (dvs.om de kommer att framkalla invaginations eller utskjutande delar), och (2) omfattningen av membran krökning5,8. Notera definieras här positiva krökning som den konvexa sidan av böjda membranet, dvs, bucklan mot samverkande partikeln, och negativa annars. Kvantitativa studier av BAR proteiner visade dessutom att deras effekt på membranet är beroende av en uppsättning fysiska parametrar: surface täthet av proteiner, membran spänning och membran form (platta kontra tubulär kontra sfäriska form)7. Beroende på dessa parametrar BAR proteiner kan: (1) fungerar som sensorer av membran krökning, (2) böja membran eller (3) inducera membran scission7.
På grund av det stora antalet komponenter inblandade i membran omforma i cellen, studera de kvantitativa aspekterna av fenomen, såsom endocytos, är i vivo extremt utmanande. In vitro beredning av minimal komponenter härma böjda membran i cellen ger möjlighet att få en mekanistisk förståelse av hur membran-svängda proteiner fungerar. I artikeln beskrivs ett protokoll för att rekonstituera en membran nanotube i vitro med mikromanipulation, konfokalmikroskopi, och optisk pincett. Metoden kan användas för att studera, på ett kvantitativt sätt, hur proteiner, lipider eller små molekyler interagerar med böjda membran. Lipid GUVs används som modeller för ett cellmembran, vars krökning är försumbar jämfört med storleken på samverkande membran-svängda molekyler. De är beredda med electroformation metod9 där blåsor bildas av återfuktande en lipid film och svullnad det in GUVs under en växelström (AC)10. Vanligaste substrat som GUVs odlas är antingen halvledande plattor belagda med indium tinoxiden (ITO) eller platinum ledningar (Pt-trådarna)11. I detta arbete odlas GUVs på Pt-trådar som denna metod har visat sig fungera mycket bättre än alternativet att göra GUVs i närvaro av salter i buffert12. Även om protokollet electroformation beskrivs här utförligt återge det, hänvisar vi läsaren till tidigare artiklar där liknande och andra metoder för att göra GUVs har beskrivits i detalj13,14. I våra händer, har electroformation på Pt-trådar framgångsrikt gett GUVs från en blandning av syntetiska lipider eller naturliga lipid extrakt i en buffert som innehåller ~ 100 mM NaCl. Dessutom var det också möjligt att kapsla in proteiner inuti GUVs under tillväxt. En exempel electroformation kammare visas i figur 1A; Den består av två ~ 10-cm-lång Pt-trådarna infogats i en hållare tillverkad av polytetrafluoreten (PTFE) som kan förseglas på båda sidor med glas coverslips ~ 1-2 cm mellanrum (figur 1A).
Figur 1: Experimental setup. (A) den GUV electroformation kammare med elektriska kontakter knutna till Pt-trådar. (B) vänster: experimentell systemet visar mikroskopet, experimentell kammare ovanför målet och två Mikropipetter (vänster och höger) bifogas micromanipulators och infogas i den experimentella avdelningen för röret att dra och protein injektion. Höger: en närbild på experimentella avdelningen monterade ovanför målet visar tips av strävan och de injektion Mikropipetter införas. (C), en spruta försedd med en tunn dispenser som infogas i en mikropipett på dess bakre änden. Botten är en närbild av dispensern inuti mikropipett med den blå streckade linjen beskriver mikropipett. Detta system används för att fylla mikropipett med kasein passiverande glasytan och även tillbaka fyllning med mineralolja när det behövs. (D) ett system används för att aspirera µL mängder protein lösningen. Nålen är ansluten till en spruta och slang som är ansluten till den injektion mikropipett. Mikropipett spetsen är noggrant nedsänkt i protein lösningen och aspirerade så för att fylla mikropipett spetsen. Mikropipett fylls sedan tillbaka med mineralolja använder systemet visas i panelen C. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
En membran nanotube, varierar i radie från 7 nm till flera hundra nm, kan dras från en chef av en extern kraft. Denna metod var ursprungligen avsedd att mäta de elastiska egenskaperna hos cellmembran och blåsor, såsom den böjande styvhet15,16. I den senaste verk förlängdes metoden för att studera samspelet mellan proteiner med böjda membran av microinjecting proteiner nära den drog nanotube7,17. Andra metoder har utvecklats för att studera membran-svängda proteiner. I en metod inkuberas proteiner med olika stora liposomer bundna till en passiverad yta. Konfokalmikroskopi används för att mäta bindningen som en funktion av Liposom diameter, vilket kan indikera krökning-inducerad sortering18,19. I en annan metod injiceras proteiner nära en mikro-aspirerade GUV att mäta sin förmåga att spontant framkalla tubuli20,21. Den metod som beskrivs i detta protokoll är unikt lämpade att studera membran-svängda proteinerna som är inblandade i endocytos, där de flesta proteiner normalt möter förformade membran nanorör ansluta den last-innehållande membran invagination med den underliggande platt plasma membran. Dessutom i denna metod ansluten till skillnad från i analysen med uppbundna små liposomer, den membran nanotube kontinuerligt till membranet; Därför är det i mekaniska jämvikt med GUV, en situation som förväntat i vivo. Därför grundläggande membran fysik gäller och vi kan härleda en uppsjö av mekaniska egenskaper från våra mätningar22,23,24.
För en fullständig implementering av denna metod inkluderar nödvändig utrustning confocal Mikroskop, optisk pincett och en eller två Mikropipetter ansluten till en vattentank (figur 1B). Genom att kombinera alla tre, är det möjligt att samtidigt mäta spänning membran, membran krökning, Ytors av proteiner och tube kraft25. Mikropipett aspiration är viktigt och den är enkelt uppbyggd genom att infoga en glas mikropipett i en hållare som är ansluten till en vattentank, som, via hydrostatiskt tryck, kontrollerar den aspiration tryck26. Mikropipett och innehavaren styrs av en micromanipulator och helst i en riktning av en piezo-ställdon för precision rörelse. Att dra en nanotube, den microaspirated GUV kort fastnar till en micron stora pärla sedan drog bort skapar en nanotube. I detta genomförande hålls kornet av optisk pincett, som kan konstrueras genom att följa en publicerade protokoll27. Det är möjligt att avstå från optisk pincett och pull nanorör på olika sätt, men på bekostnad av korrekt kraft mätningar. Om det är alltför utmanande att bygga en optisk fälla eller om kraft mätningar är inte nödvändiga, såsom om man bara vill kontrollera inställningen av proteiner för böjda membran, en tub kan dras med en pärla som aspirerade på spetsen av en andra mikropipett28. Det är också möjligt att dra rören med hjälp av gravitationskraften29 eller flöde30,31. Konfokalmikroskopi är dessutom inte nödvändigt heller; dock är det att föredra så att mäta Ytors av proteiner. Det gör också mäta nanotube radien från fluorescensintensiteten hos lipider i röret, således oberoende av membran kraft och spänning. Inferring tube radie från fluorescens är särskilt viktigt om förhållandet mellan dessa kvantiteter avviker från väletablerade ekvationer på grund av förekomsten av membran-följs proteiner25. Ännu viktigare, en kan inte avstå från både optisk fälla och konfokalmikroskopi, eftersom det inte är möjligt att mäta tube krökning.
Metoden som beskrivs i detta protokoll har använts för att studera krökning-inducerad sortering av olika perifera membranproteiner på nanorör, främst de från BAR familj25,32,33,34 . Det visade också att den koniskt formade transmembrana kaliumkanal som KvAP är berikad på böjda nanorör på samma sätt som BAR proteiner35. Genom att optimera metoden för att kapsla in proteiner inuti GUVs, har samspelet mellan proteiner med negativ krökning nyligen undersökts som väl36. Dessutom, denna metod har använts att belysa bildandet av protein ställningar25,37 och att studera mekanismen av membran scissionen av antingen linje spänning38, protein dynamin39, eller BAR proteiner40,41. Förutom proteiner, kan små molekyler eller joner också inducera krökning. Med den här metoden visades kalciumjoner att framkalla positiva krökning enligt saltfri villkor42. Intressant, har det också visat att lipider kan genomgå krökning sortering, men endast för kompositioner som är nära en demixing punkt43,44. Sammanfattningsvis metoden kan användas av forskare som är intresserade av att undersöka hur antingen integrerad membran komponenter (t.ex., lipider eller transmembrana proteiner) eller perifert bindande molekyler (antingen inuti eller utanför GUVs) samverkar med cylindriskt böjda membran, mekaniska och kvantitativ synvinkel. Det är också avsett för dem som är intresserade av att mäta de mekaniska egenskaperna av membranet sig22,23,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av GUVs av Electroformation på Pt-trådar
- Rengör electroformation kammaren (se Inledning och figur 1A) och Pt-kablarna med ett organiskt lösningsmedel som etanol eller aceton till att tvätta bort lipider och vatten att tvätta bort salter.
Obs: Vi föreslår noggrant torka bort återstoden med etanol-indränkt vävnad och sonicating i aceton, etanol, vatten, var och en för 5 min sedan. - Förbereda en lipid blandning av en önskad lipid sammansättning vid 1 mg/mL i kloroform. Blandningen ska innehålla ~ 0,05% molar bråkdel av en lipid konjugerat med biotin (t.ex., 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]) och ~ 0,5% molar bråkdel av en lipid konjugerat med en fluorophore ( t.ex., BODIPY-TR-C5-ceramid).
Obs: Vår erfarenhet var det svårt att producera GUVs på en hög avkastning som innehåller mer än 30% laddat lipider.
FÖRSIKTIGHET: Kloroform skall hanteras inuti en kemisk huva med lämpliga handskar. - Infoga ett par av Pt-trådarna i electroformation kammare. Deponera lipid mixen på Pt-trådarna i droppar åtskilda av ~ 2-3 mm (totalt ~ 4 µL av blandningen).
- Torra trådarna under vakuum för 30 – 60 min i rumstemperatur.
- Täta botten av kammaren genom att följa täckglaset över kammare med silikonfett. Fyll i kammaren med en buffrad lösning innehållande NaCl, sackaros och en buffring agent (t.ex., 70 mM NaCl, 100 mM sackaros och 10 mM Tris, vid pH 7,4). Detta medium kommer vara inne på GUVs i experimentet. Det är viktigt att detta medium osmolaritet matchar osmolaritet experimentella mediet inom ~ 10%. Använd sackaros för att justera osmolaritet. Lägga till proteiner i lösningen vid en önskad koncentration om målet är att kapsla in dem i GUVs.
FÖRSIKTIGHET: Olika salter och socker i bufferten kan påverka böjande styvhet och spontana krökning av membran24,42,46,47. - Försegla toppen av kammaren genom att följa ett täckglas med silikonfett som säkerställer minsta luft inne i kammaren. Tillämpa en sinus AC ström genom Pt-trådarna på 500 Hz och 280 mV.
Obs: Tillväxt tid och temperatur måste optimeras beroende på lipid sammansättning och känsligheten av protein. När du använder naturliga lipid extrakt, och även när encapsulating proteiner i GUVs, bästa avkastning uppnåddes genom växande GUVs vid 4 ° C över natten. I avsaknad av proteiner och för syntetiska lipid kompositioner, tillväxt i rumstemperatur för ~ 2 h var tillräcklig.
2. beredning av den experimentella kammaren och Mikropipetter
- För att förbereda Mikropipetter, dra en glas kapillär med hjälp av pipett avdragare. Det föreslås för att använda en glas kapillär med inre och yttre radier, respektive, 0,7 mm och 1 mm. Sedan, förfina spetsen av en mikropipett så att dess inre diameter är 5–7 µm, med hjälp av en microforge. Om proteiner eller andra molekyler kommer att injiceras i experimentet, dra en annan mikropipett och förfina dess spets till en inre diameter av 8–15 µm.
- Konstruera en experimentell kammare genom att placera två rektangulära mikroskopi coverslips på en metallisk bas som visas i figur 1. Coverslips ska avgränsas med ~ 1 mm. Kammaren bör ha öppningar längs långsidorna (se figur 1). Öppna sidorna bör passa spetsen av en mikropipett där spetsen bör nå åtminstone mitten av kammaren.
- Förbereda experimentella bufferten vars osmolaritet inte bör avvika med mer än 10% från bufferten brukade odla GUVs. Justera osmolaritet med glukos. Ett exempel på en experimentell buffert som användes för att studera interaktionen mellan endophilin och nanorör är 100 mM NaCl, 40 mM glukos, buffras med Tris till pH 7,4. En kombination av sackaros inuti / glukos utanför sörjer: a tillräcklig faskontrast att observera GUVs med ljusa fält mikroskopi och (b) högre densitet inuti GUVs som orsakar dem att bosätta sig på botten av kammaren. Justera salt koncentration baserat på experimentella krav.
Obs: Utöver påverkar membranets mekaniska egenskaper, enligt vår erfarenhet, hög glukos koncentration (> 300 mM) negativt påverkar inrättandet av streptividin-biotin obligationer, krävs för att dra en nanotube. Dessutom för lite salt hämmar streptividin-biotin obligationer, medan för hög av en koncentration skärmar protein-membran interaktioner. Vid protein inkapsling, med mycket hög saltkoncentration i externa bufferten (t.ex., > 200 mM NaCl) kan användas som ett trick för att lossa proteinerna från den yttersta bipacksedel36. Det är nödvändigt att experimentera med en rad salt koncentration att hitta de optimala bindande villkor av molekylen av intresse. -
30 – 60 min innan samla GUVs för experimentet, passiverande glasytor genom att fylla både experimentella kammaren och den strävan mikropipett med en 5 mg/mL lösning av ett högt rena β-kasein (t.ex., upplöst i experimentell bufferten). Β-kasein skapar ett skyddande lager på glasytor, hindrar GUVs att ansluta sig alltför starkt, som skulle få dem att brista. Inkubera med β-kasein för 30 – 60 min.
Obs: Det bör finnas inga bubblor inuti den mikropipett som skulle störa styra membranet spänning.- För att bygga en dispenser för att fylla Mikropipetter, bryta en sprutans nål nära kopplingen plast och limma in en tunn kiseldioxid kapillär (till exempel de som används för vätskekromatografi) (figur 1 c).
- Under inkubation med β-kasein, montera kammaren på mikroskopet och centrera den ovanför målet. Sätt spetsen på den aspiration mikropipett genom öppningen längs långsidan och föra tipset ovan syftet mikroskopet. Justera tank vattennivån så att aspiration trycket är nära noll (det bör inga tunga flöde i eller ur pipetten, vilket kan ses i Mikroskop).
-
I fall proteinerna eller andra molekyler kommer att injiceras under experimentet, fyll den injektion mikropipett med önskad molekylen upplöst i experimentell bufferten vid en koncentration på val, montera mikropipett inuti en micromanipulator, och sätt genom motsatt sida av den experimentella avdelningen.
- För att använda ett minimum av proteiner, Fyll bara mikropipett toppen med protein genom aspiration. För att göra det, Linda i slutet av en nål som bifogas en spruta med plaströr. Sätt slangen på baksidan av den injektion mikropipett.
- Mycket noggrant doppa spetsen av en mikropipett i protein lösningen och aspirera för att fylla mikropipett spets.
Obs: Denna enkla inställning visas i figur 1 d och i vår erfarenhet, det gör att aspirera från så lite som bara några mikroliter av protein lösningen. - Återfyllning resten av den injektion mikropipett med mineralolja att förhindra blandning av protein-lösningen och vattnet från vattentanken (med hjälp av setup i figur 1 c).
- Se till att inte införa luftbubblor i injektion pipetten, eftersom det kommer att framkalla instabil insprutningstryck. Alternativt om protein kvantiteten räcker, fylla mikropipett med proteiner på samma sätt som fyllning med β-kasein enligt steg 2,4. Justera vatten tank för att minimera aspiration trycket i injektion pipetten.
Obs: Koncentrationen av den injicerade molekyl eller Jon nära nanotube kommer att vara lägre på grund av utspädning och det kan uppskattas genom att mäta fluorescens intensitet minskade som en funktion av avståndet från det pipett avfart42. Det är dock viktigare att veta lipidens-bundet tätheten av injicerade molekylen, som kan mätas exakt (se avsnitt 4).
- Efter inkubation med β-kasein, ta bort lösningen från kammaren, och skölj med experimentella bufferten flera gånger. Fyll med experimentella bufferten.
- Stoppa electroformation av GUVs och samla in dem direkt från Pt-trådarna. Tillsätt några µL av GUV lösningen till den experimentella avdelningen. Använd bara nyberedda GUVs.
- Tillsätt några µL av streptividin-belagda pärlor till experimentella avdelningen till en slutlig koncentration av pärlor i kammaren på runt 0,1 x 10−3% (w/v) eller mindre. Polystyren pärlor ~ 3 µm i diameter rekommenderas (polystyren pärlor i vatten har en nära-optimal brytningsindex kontrast när det gäller maximera gradient kraft med avseende på spridning kraft i optiska fällan). Bead koncentrationen kan justeras baserat på experimentet: en mycket låg koncentration gör det svårt att hitta dem i kammaren, och en alltför hög koncentration löper risk att flera pärlor falla i optiska pincetten.
3. Dra en membran Nanotube från en chef
- Låt GUVs och pärlor bosätta sig till botten av kammaren. Tömma GUVs genom att låta lite experimentell buffertens avdunsta, för ca ~ 15 min. deflatera GUVs är viktigt att producera några överskott område som kan vara aspirerade med en mikropipett. GUVs bör synbart bölja (dvsvisas diskett) under mikroskopet ljus. Om de visas spänd, möjliggör mer avdunstning tid.
Obs: Andelen osmolaritet förändring beror på den avdunstande yta, temperatur, etc., och bör följas noggrant. I princip osmolaritet skillnaden kan ställas in från början genom justering av koncentrationen, sackaros/glukos, men försiktighet bör iakttas att inte framkalla en osmotiska chock. - Hitta en diskett GUV och sug upp det i pipetten. Längden av aspiration tungan (delen av membranet släpper pipetten) bör vara lika med eller större än pipett radien för den teoretiska analysen vara tillämpliga15,16,22,()23 (Se figur 2). Prova flera GUVs. Om ingen av GUVs kan vara aspirerade för att producera en tillräckligt lång tunga, vänta några minuter. Om GUVs är nog plumsa, Fortsätt till nästa steg.
- Försegla kammaren med mineralolja, att förhindra ytterligare avdunstning av bufferten. Göra det genom noggrant pipettering oljan längs öppna kanterna på experimentella avdelningen.
- Ställ nollpunkt av aspiration trycket genom först leta efter en pärla i kammaren och placera avfarten aspiration pipetten nära pärla. Justera höjden på vattenbehållaren så att Pärlan är varken sög eller blåses bort av aspiration pipetten. Även om mineralolja förhindrar avdunstning och därför ytterligare tryckförändringar inne i kammaren, noll aspiration trycket innan du mäter varje GUV.
- Hitta en GUV och aspirera det. Flytta mikropipett upp och ut ur fokus (att hålla GUV bort från ytan där det kan dras ur pipetten av shear stress när kammaren flyttas).
- Leta efter en sträng genom att försiktigt flytta runt kammaren. Plötsliga rörelser kan mata ut GUV. Fånga det med optisk pincett på distans ~ 20 µm från kammaren underdelen. Se till att regionen av intresse är ren utan andra pärlor eller membran i sikte. Något faller i optiska pincetten än kornet kommer att störa mätningen.
- Återföra GUV i fokus, och bort från pärla med en mikropipett i linje med optisk fällan (figur 2).
- Spela in rörelsen av kornet för 1 – 2 min att mäta det equilibrium placerar (krävs för kraft mätningar).
- Minska trycket inuti mikropipett så mycket som möjligt utan att förlora GUV så för att minska membran spänningen. Försiktigt föra GUV kontakt med pärla för runt en sekund, om inrättande av streptividin-biotin obligationer, sedan dra försiktigt tillbaka skapar en nanotube. Rörelse i GUV mot eller bort från pärla bör helst göras med en piezo-ställdon minimalt störa pärlan i optiska pincetten.
Obs: Om nanotube inte bildar, det kan bero på dålig streptividin beläggning av pärlan, otillräcklig mängd biotinylerade lipider i GUV, otillräcklig koncentration av salt eller överdriven koncentration av glukos i experimentell bufferten eller membranet spänningen i GUV är för hög48. - Öka aspiration trycket så att återskapa aspiration tungan. Justera röret för att ligga i axeln av aspiration pipett och maximally fokusera på tuben (figur 2).
- Säkerställa att GUV ekvatorn och röret är i fokus. Spela in rörelsen av pärla med ljusa fält mikroskopi för några min (här kamera förvärv hastighet är 30 Hz). Spela in höjden, h, vattentank med avseende på nollpunkt. Ta några confocal bilder av systemet (figur 2).
- Upprepa det föregående steget vid olika aspiration tryck, implicit membran spänningar. Typiska spänningar är 0,015 – 0,2 mN/m, med en stegstorlek på cirka 0,02 mN/m.
- Om injicera proteiner eller molekyler nära systemet, ta den injektion mikropipett nära den nanotube, att se till att är pärlan i optiska fällan inte orolig. Injicera försiktigt vid ett tryck på runt 1 – 2 Pa.
-
Efter proteinbindningen har jämviktas (fluorescensintensiteten hos proteinet injiceras på den membran är konstanten på GUV), upprepa stegvis mätningarna som med kala membranet (steg 3.11 och 3.12).
Obs: Eftersom mätningarna utförs medan du injicerar proteiner nära GUV vid konstant tryck, bulk koncentrationen av protein är ungefär oförändrad nära GUV; protein desorption bör således vara försumbar under mätningen.- Alternativt är det möjligt att Inkubera i GUVs tillsammans med proteiner innan du utför tube-pulling experiment för att säkerställa en konstant proteinkoncentration bulk. Med tanke på att den relativa membran fraktionen av proteiner på tuben och på GUV mäts, det sätt proteiner levereras påverkar inte beräkningen krökning-sortering (se avsnitt 4).
Figur 2: Tube-pulling experiment. (A) scheman över experimentet. (B) en confocal bilden av en drog tub som beskrivs i detta protokoll. Skalstapeln = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
4. mätningar och analys av Data
- Mäta membran spänning
- Beräkna det hydrostatiska trycket för varje steg vid konstant strävan tryck:
ΔP = pgh
där p är den vatten densitet, g gravitationsacceleration och h höjden av vattenbehållaren från steg 3.11. - Från confocal bilder, Mät radien av GUV, rGUV, och radien av aspiration pipetten, rpip (figur 2).
- Beräkna den membran spänningen, σ, med Laplaces ekvation49:
- Beräkna det hydrostatiska trycket för varje steg vid konstant strävan tryck:
- Mäta membran kraft
- Avgöra styvheten i optiska pincetten, k, med hjälp av en av flera kalibrering metoder27. I den här installationen mäta k med trögflytande drar metod27.
- Beräkna jämvikt position pärlan, en0, som ett genomsnitt från en mätning innan du drar röret (steg 3.8).
- För varje konstant spänning mätning, beräkna jämvikt membran kraft, F, från Hookes lag:
F = k(en - 0)
där en är den genomsnittliga positionen av pärlan under denna mätning.
- Mäta tube radie
- När det gäller en bare membran (inga extra membran-svängda molekyler), beräkna tube radie, R, från kraften som:
R = F/(4πσ)
(referenser22,23). - För att mäta tube radien i närvaro av membran-svängda molekyler och oberoende av steg 4.3.1, först registrera lipid fluorescensintensiteten längs röret, Ibadkaret, och längs GUV kontur, jagGUV. Mäta genomsnittlig fluorescensintensiteten hos en fluorophore i eller bundna till membranet som en genomsnittlig intensitet längs ljusaste ett rör eller en GUV kontur. Välj en rektangulär låda som innehåller en horisontell sektion av GUV kontur eller röret och beräkna summan av fluorescens stödnivåerna varje vågrät rad i rutan.
- Dela varje summan av antalet pixlar av den horisontella linjen (dvs., box bredd). Observera att i den markerade rutan, det bör inga andra membran som är närvarande. Fluorescens intensitet profilen längs den markerade rutan erhålls.
- Efter att subtrahera bakgrunden intensiteten, ta genomsnittliga pixel fluorescensintensiteten från ljusaste linjen. Tube radien är linjärt relaterad till förhållandet mellan fluorescens längs konturen av röret och GUV som:
R = Ktubjagbadkaret/jagGUV
där Kbadkar är en kalibrering faktor25.
Obs: Denna metod kan användas för att mäta tube radien i intervallet 10 – 80 nm (när röret är smal nog att ligga inom en confocal voxel bredd) och med en något större osäkerhet i 80 nm och högre område. Känsligheten för mätning beror på inställningen.
- Bestämma Kbadkar genom att utföra oberoende radie mätningar i steg 4.3.1 och 4.3.2 på en enkel membran sammansättning med oladdade lipider. Sådana enkla membran sammansättning garanterar att radien och kraft har enkla förhållandet i steg 4.3.1. Upprepa experimentet flera gånger och rita R, härledas från kraften (steg 4.3.1) kontra jagbadkaret/jagGUV (steg 4.3.2). Beräkna Kbadkar från passformen. I den här installationen Kbadkar = 200 ± 50 nm med hjälp av ägg L-α-fosfatidylkolin (ägg-PC) membran och en fluorescerande lipid vars fluorescens minimalt beror på polarisering25.
Obs: Kbadkar måste mätas för olika mål, på grund av deras olika confocal voxel-volymer. Lipid fluorophore bör inte interagera med de injicerade proteiner/molekylerna. Den fluorescerande lipid som rekommenderas här, BODIPY TR ceramide, förväntas inte ha några interaktioner med proteinerna. Denna hypotes bekräftades med tidigare studier av BAR och jag-BAR domäner25,36,37, som har visat att på proteinrik yttäckning, tube radien fastställs av proteiner, oavsett den spänningar i GUV. Om proteiner interagerar med lipid fluorophore, observeras en utarmning eller anrikning av fluorophore i röret på varierad proteinrik ytan fraktioner.
- När det gäller en bare membran (inga extra membran-svängda molekyler), beräkna tube radie, R, från kraften som:
- Mäta Ytors av proteiner
- Förbereda lipid mixar med hjälp av en enkel oladdade lipid (t.ex., ägg-PC) kompletteras med cirka fem olika mole fraktioner av en fluorescerande lipid (av samma våglängd som färgämnet används för att märka proteinet, t.ex. BODIPY-FLC5-hexadecanoyl-Phosphatidylcholine (HPC *) för t.ex., Alexa488-märkt proteinet) i intervallet: XHPC * = 0,01 – 1%. Förbereda GUVs i 100 mM sackaros genom electroformation på ITO plattor (Följ steg 1 i en tidigare publikation13).
- Samla GUVs och överför till en experimentell kammare passiviseras med β-kasein. Använd t.ex., 100 mM glukos för experimentell lösningen. Vänta några minuter för GUVs sedimentera.
- Ta confocal fluorescens bilder av GUVs och spela in genomsnittliga fluorescensintensiteten längs GUV konturer som en funktion av molbråket för den fluorescerande lipid (se punkt 4.3.2). För varje komposition, beräkna området densiteten av de fluorescerande lipid, φHPC*. Till exempel genom förutsatt att området per lipid är 0,7 nm2, φHPC* = 1,43 x 106 XHPC * per bipacksedel. Rita HPC * fluorescensintensiteten i GUV, IHPC *, GUV, kontra φHPC*. Passformen ger kalibrering konstanten, A, ges av φHPC* = AIHPC *, GUV. A beror på inställningen för mikroskopi, som maktens laser och detektorkänslighet (dvsvinst), därför registrera A för olika vanliga mikroskopi inställningar (se exempel i figur 3).
- Förbereda flera lösningar av HPC * upplöst i tvättmedel, t.ex., sodium dodecyl-sulfat (SDS), vid olika koncentrationer i intervallet från ~ 1 till 10-50 µM. registrera fluorescensintensiteten hos varje lösning i bulk och beräkna lutningen på intensitet kontra koncentration (figur 3). Upprepa mätningen med fluorophore som kommer vara konjugerat till proteinet i ett liknande koncentrationsintervall (se exemplet med Alexa488 i figur 3). Denna mätning krävs att relatera fluorescens stödnivåerna i protein och märkningen på lipid, jagA488, bulk / jagHPC *, bulk, så de inte kan nödvändigtvis avger på samma sätt på samma bulk koncentration.
- Mäta antalet fluorophores per proteinmolekyl med en fluorospectrometer. Exempelvis för fall av Alexa488, kan antalet Alexa488 molekyler per protein, nA488, beräknas med följande förhållande:
n A488 = (A494/εA488) / ((A280 - 0.11en494) / εprot)
där A494 och A280 är absorbansvärdena per längdenhet på 494 nm och 280 nm respektive och εA488 och εprot är molekylär absorption koefficienter av Alexa488 och proteinet, respektive. - Beräkna ytan densiteten av proteinet på GUV, φprot, GUV, enligt följande formel:
Tänk på tillståndet polymerisation av protein. Till exempel BAR proteiner dimerize, därför beräknade tätheten är att BAR monomeren per område om den utdöende på utjämningskoefficient monomera form.
Figur 3: exempel på protein Ytors kalibrering. Mätt är HPC * lipid fluorescensintensiteten i bulk (vänster) och GUVs (center). Även mätt är bulk fluorescensintensiteten hos Alexa488 (bundna till en BAR domän) (höger). Fluorescensintensiteten skalas linjärt med koncentration. Mätningarna visas för specifika upptäckt vinning och laser uteffekt. Tomter genereras baserat på data från referens37. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tube-pulling experimentet kan ge viktig mekanisk information om membranet. I avsaknad av proteiner eller andra molekyler som par med membran krökning, membranet kraft och tube radie kan relateras med membran spänning genom att tillämpa den Canham-Helfrich Hamiltonsk drog ekvationen till ett rör från en GUV50,51
(Ekvation 1)
där 
är membran gratis energi av röret, K membran bockning styvhet, r och R0 är, respektive, medelvärdet och spontana krökningsradien, σ membran spänning, A området i röret, L längden på röret, och f punkt kraft utövas av röret på kornet. Vid jämvikt, r är tube radien, betecknas som R, och f blir tube-dementi kraften, F, dvs, den jämvikt kraft som röret drar pärla i optiska fällan. För att beräkna F och R, minimerar vi med avseende på L och r, framställning av22,23
(Ekvation 2)
(Ekvation 3)
R 0 är försummad om båda broschyrer av membranet har samma sammansättning, även om det är spekulerade att andra faktorer, såsom kostnad repulsions kan framkalla vissa spontana krökning42. Kraft och RADIUS-mätningar på rör drog från 100% DOPC GUVs är utmärkt överens med teoretiska förutsägelser i ekvation 2 och ekvation 3 (figur 4). De två mätningarna är oberoende kraft är mätt från förskjutningen av kornet i optiska fällan och radie från fluorescensintensiteten, därför tillhandahåller två sätt att beräkna membranet bockning styvhet. Passande ekvation 2 och ekvation 3 att visas data avkastningarna: K = (25,1 ± 1,4) (medelvärde ± SD) kBT och (22,1 ± 1,5) kBT, respektive, som tidigare mätt42 .
Om experimentera med krökning-koppling proteiner, det föreslås att använda mer sofistikerade Hamiltonsks ekvation än det i ekvation 1, som ekvation 1 enda konton för en effektiv spontana krökning och tar inte hänsyn till den effekt av proteiner på membranets mekaniska egenskaper eller möjliga protein-protein interaktioner. Se, t.ex.,25,35,36,52,53. Även om avancerade teoretiska modeller är väsentliga för en fördjupad förståelse av ett visst protein-membran system, utan att tillgripa dem, är det fortfarande möjligt att få mycket användbar information från tube-dra-metoden.
Till exempel för att testa om proteiner känna krökning, mäts proteiner på tuben relativ intensitet jämfört med GUV, som anses vara platt. Samspelet med positiva krökning studeras genom att injicera proteinerna nära röret med andra mikropipett25. Samspelet med negativ krökning eller beteendet hos transmembrana proteiner studeras genom inkapsling eller beredning proteiner under GUV bildandet35,36. Den relativa anrikningen av BAR och KvAP proteiner på membranet rör över de underliggande GUVs anger att de föredrar böjda membran (figur 5). För att vara mer kvantitativ, denna berikning kan beräknas som en sortering koefficient, S, enligt:
(Ekvation 4)
där jagprot, badkar och jagprot, GUV är fluorescens stödnivåerna proteiner på tuben och på GUV, respektive, och jagläpp, badkar och jagläpp, GUV är fluorescens stödnivåerna lipider på tuben och på GUV, respektive.
Ett annat exempel är att mäta den tube kraften eftersom proteinet binder till membran. Figur 5B, C visar att en N-BAR protein endophilin A2 gradvis minskar den tube kraften, minskar det till noll, vilket indikerar att det har bildats en tredimensionell struktur som håller röret stabil, som kallas en byggnadsställning. Sådana strukturer spelar viktiga roller i endocytos, genom att fastställa tube radien men också möjliggöra scission7,41. Mätning av S, liksom de mekaniska och morfologiska effekter som proteiner ålägga membran ger viktiga insikter i hur de fungerar i membran-bockning fenomenen i cellen.
Figur 4: representativa resultat mekaniska mätningar i avsaknad av proteiner. Visas är linearized kraft och tube radie beroende på membran spänning för en 100% DOPC membran, från tre oberoende mätningar, tidigare publicerade42. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa resultat av krökning avkänning och byggnadsställning bildandet av BAR proteiner. (A) krökning avkänning av proteinet jag-BAR IRSp53. Proteinet känner negativ membran krökning och binds på insidan av GUV, med försumbar mängd protein närvarande yttre membranet på bipacksedeln. Skalstapeln = 5 µm. Reprinted från36, under Creative Commons CC-BY license, Copyright 2015, Nature Publishing Group. (B) bildar en protein byggnadsställning av den N-BAR protein endophilin. Proteiner injiceras nära röret och är därför bundna i yttre membranet på bipacksedeln. Som beskrivs i37, endophilin binder till rörets base och bildar en byggnadsställning som kontinuerligt växer längs röret från GUV mot optiska fällan (OT, vit cirkel). (C) en kymogram endophilin byggnadsställning tillväxt från GUV till pärlan, med lipider och protein kanaler överlagras. Handlingen visar tube kraft, F, som en funktion av tiden, t. Tidsramarna som i kymogram och tomten är samma (x-axeln är delad). I B och C, skala bar = 2 µm. Reprinted med tillstånd från referens37, Copyright (2016) National Academy of Sciences. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden för att dra rör från GUVs ger rik information om membranprotein systemet, det är inte bara medel för att mäta de grundläggande mekaniska egenskaperna av membranet, men den hjälper till att belysa kopplingen mellan proteiner och membran krökning. Som diskuterats i inledningen, finns andra tekniker för att mäta effekterna av membran-svängda proteiner, antingen genom ruvning proteinerna med sub micron liposomer bundna till en passiverad yta18,19 eller genom att observera den spontan bildning av tubuli i mikropipett, konventionell GUVs vid injektion av ett protein20,21. Den metod som beskrivs här ger geometriska direktanslutning till endocytos och är unik i att ge de viktiga fysiska mätningarna av systemet samtidigt, såsom protein densitet, membran spänning och membran kraft.
En viktig begränsning för metoden är att det inte är trivialt att konstruera och kalibrera alla komponenter inblandade i analysen. Men samtidigt en kombination av konfokalmikroskopi, optisk pincett och mikromanipulation ger maximal information, vissa komponenter kan ersättas som diskuterats i inledningen, beroende på vilken information som måste läras om den systemet. Minimal komponenter som behövs för att framgångsrikt söka krökning kopplingen av ett protein, eller några andra potentiella krökning-kopplade molekyl, är en mikropipett insugningsventil och confocal Mikroskop, med optiska pincetten som dispensable. Viktigast av allt, behövs många av kalibreringar (såsom kalibrering för membran tube radie och bestämma protein Ytors) endast vanligen utföras en gång. En annan begränsning för metoden är att den kan mäta endast en chef på en gång, uppgående till två till tre GUVs per timme (med praxis). men varje mätning ger en mängd data.
För högre genomströmning mätningar eller om det är nödvändigt att studera samspelet mellan proteiner med sfäriska och inte tubulär geometrier, kommer att andra analyser behöva vara utforskade eller utvecklas. Framtida insatser kommer att ägnas åt: (1) utforma ett högre dataflöde system där flera rör (från flera GUVs) kunde dras och mätt samtidigt, och (2) att integrera super-resolution mikroskopi så för att studera detaljer i protein ställningen som bildar på nanorör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur, och Gil Toombes för deras väsentliga bidrag för att etablera metoden nanotube i gruppen. P.B. gruppen tillhör CNRS konsortiet CellTiss, att den Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038), och till Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai finansierades av EMBO långsiktiga fellowship (ALTF 1527-2014) och Marie Curie-åtgärderna (H2020-behöriga myndigheters-om-2014, projektet membran-ezrin-aktin). M.S. är Junior Fellow Simons samhället av stipendiaterna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti | 850375 | Example lipid used in data for Figure 3 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin] | Avanti | 880129 | biotinylated lipid |
| BODIPY-TR-C5-ceramide | Molecular Probes (ThermoFisher) | D7540 | fluorescent lipid |
| BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*) | Molecular Probes (ThermoFisher) | fluorescent lipid for protein density calibration | |
| egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC) | Avanti | 840051 | used for calibrating the tube radius constant |
| β-casein from bovine milk (>99%) | Sigma Aldrich | C6905 | used for passivating the micropipette and the experimental chamber |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| D(+) glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Tris | Sigma Aldrich | 10708976001 | |
| osmometer | Loser | n/a | |
| Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure | Goodfellow USA | PT005139 | used for GUV electroformation |
| function generator | n/a | used to create current for GUV electroformation | |
| putty sealant | Vitrex (from CML France) | CRIT 140013 | used to seal the electroformation chamber |
| bath sonicator | n/a | useful to clean the electroformation chamber, but not crucial | |
| Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany) | an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers | ||
| micromanipulators | n/a | ||
| borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively) | Harvard apparatus | 30-0036 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-2100 | |
| microforge | Narishige | MF-800 | |
| piezoelectric actuator | Physik Instrumente | n/a | |
| polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm) | Spherotech | SVP-30-5 |
References
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Johannes, L., Wunder, C., Bassereau, P. Bending "on the rocks"--a cocktail of biophysical modules to build endocytic pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Dawson, J. C., Legg, J. A., Machesky, L. M. Bar domain proteins: a role in tubulation, scission and actin assembly in clathrin-mediated endocytosis. Trends Cell Biol. 16 (10), 493-498 (2006).
- Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends Biochem Sci. 37 (12), 526-533 (2012).
- Qualmann, B., Koch, D., Kessels, M. M. Let's go bananas: revisiting the endocytic BAR code. EMBO J. 30 (17), 3501-3515 (2011).
- Rao, Y., Haucke, V. Membrane shaping by the Bin/amphiphysin/Rvs (BAR) domain protein superfamily. Cell Mol Life Sci. 68 (24), 3983-3993 (2011).
- Simunovic, M., Voth, G. A., Callan-Jones, A., Bassereau, P. When Physics Takes Over: BAR Proteins and Membrane Curvature. Trends Cell Biol. 25 (12), 780-792 (2015).
- Safari, F., Suetsugu, S. The BAR Domain Superfamily Proteins from Subcellular Structures to Human Diseases. Membranes (Basel). 2 (1), 91-117 (2012).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Progress in Colloid and Polymer Science Vol. 89: Trends in Colloid and Interface Science VI. Helm, C., Lösche, M., Möhwald, H. 89, Steinkopff. Ch. 29 127-131 (1992).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Montes, L. R., Alonso, A., Goni, F. M., Bagatolli, L. A. Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions. Biophys J. 93 (10), 3548-3554 (2007).
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophys J. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281 (2015).
- Hochmuth, R. M., Evans, E. A. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. I. Analysis. Biophys J. 39 (1), 71-81 (1982).
- Hochmuth, R. M., Wiles, H. C., Evans, E. A., McCown, J. T. Extensional flow of erythrocyte membrane from cell body to elastic tether. II. Experiment. Biophys J. 39 (1), 83-89 (1982).
- Bassereau, P., Sorre, B., Levy, A. Bending lipid membranes: experiments after W. Helfrich's model. Adv Colloid Interface Sci. 208, 47-57 (2014).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature chemical biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO J. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Shi, Z., Baumgart, T. Membrane tension and peripheral protein density mediate membrane shape transitions. Nat Commun. 6, 5974 (2015).
- Chen, Z., Shi, Z., Baumgart, T. Regulation of membrane-shape transitions induced by I-BAR domains. Biophys J. 109 (2), 298-307 (2015).
- Cuvelier, D., Derenyi, I., Bassereau, P., Nassoy, P. Coalescence of membrane tethers: experiments, theory, and applications. Biophys J. 88 (4), 2714-2726 (2005).
- Derenyi, I., Julicher, F., Prost, J. Formation and interaction of membrane tubes. Phys Rev Lett. 88 (23), 238101 (2002).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Adv Colloid Interface Sci. 208, 225-234 (2014).
- Sorre, B., et al. Nature of curvature coupling of amphiphysin with membranes depends on its bound density. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 173-178 (2012).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Phys Rev Lett. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Capraro, B. R., Yoon, Y., Cho, W., Baumgart, T. Curvature sensing by the epsin N-terminal homology domain measured on cylindrical lipid membrane tethers. J Am Chem Soc. 132 (4), 1200-1201 (2010).
- Bo, L., Waugh, R. E. Determination of bilayer membrane bending stiffness by tether formation from giant, thin-walled vesicles. Biophys J. 55 (3), 509-517 (1989).
- Rossier, O., et al. Giant Vesicles under Flows: Extrusion and Retraction of Tubes. Langmuir. 19 (3), 575-584 (2003).
- Borghi, N., Rossier, O., Brochard-Wyart, F. Hydrodynamic extrusion of tubes from giant vesicles. EPL (Europhysics Letters). 64 (6), 837 (2003).
- Zhu, C., Das, S. L., Baumgart, T. Nonlinear sorting, curvature generation, and crowding of endophilin N-BAR on tubular membranes. Biophys J. 102 (8), 1837-1845 (2012).
- Ramesh, P., et al. FBAR syndapin 1 recognizes and stabilizes highly curved tubular membranes in a concentration dependent manner. Sci Rep. 3, 1565 (2013).
- Knorr, R. L., et al. Membrane morphology is actively transformed by covalent binding of the protein Atg8 to PE-lipids. PLoS One. 9 (12), e115357 (2014).
- Aimon, S., et al. Membrane shape modulates transmembrane protein distribution. Dev Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Prévost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. , (2015).
- Simunovic, M., et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), 11226-11231 (2016).
- Allain, J. M., Storm, C., Roux, A., Ben Amar, M., Joanny, J. F. Fission of a multiphase membrane tube. Phys Rev Lett. 93 (15), 158104 (2004).
- Morlot, S., et al. Membrane shape at the edge of the dynamin helix sets location and duration of the fission reaction. Cell. 151 (3), 619-629 (2012).
- Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
- Simunovic, M., et al. Friction Mediates Scission of Tubular Membranes Scaffolded by BAR Proteins. Cell. 170 (1), 172-184 (2017).
- Simunovic, M., Lee, K. Y., Bassereau, P. Celebrating Soft Matter's 10th anniversary: screening of the calcium-induced spontaneous curvature of lipid membranes. Soft Matter. 11 (25), 5030-5036 (2015).
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Heinrich, M., Tian, A., Esposito, C., Baumgart, T. Dynamic sorting of lipids and proteins in membrane tubes with a moving phase boundary. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7208-7213 (2010).
- Dasgupta, R., Dimova, R. Inward and outward membrane tubes pulled from giant vesicles. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (28), 282001 (2014).
- Vitkova, V., Genova, J., Mitov, M. D., Bivas, I. Sugars in the aqueous phase change the mechanical properties of lipid mono- and bilayers. Molecular Crystals and Liquid Crystals. 449, 95-106 (2006).
- Bouvrais, H. Mechanical properties of giant vesicle membranes investigated by flickering technique. , University of Southern Denmark. (2011).
- Koster, G., Cacciuto, A., Derenyi, I., Frenkel, D., Dogterom, M. Force barriers for membrane tube formation. Phys Rev Lett. 94 (6), 068101 (2005).
- Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophys J. 35 (3), 637-652 (1981).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 28 (11), 693-703 (1973).
- Canham, P. B. The minimum energy of bending as a possible explanation of the biconcave shape of the human red blood cell. J Theor Biol. 26 (1), 61-81 (1970).
- Marcerou, J. P., Prost, J., Gruler, H. Elastic Model of Protein-Protein Interaction. Nuovo Cimento Della Societa Italiana Di Fisica D-Condensed Matter Atomic Molecular and Chemical Physics Fluids Plasmas Biophysics. 3 (1), 204-210 (1984).
- Leibler, S. Curvature Instability in Membranes. J Phys-Paris. 47 (3), 507-516 (1986).
