Summary
Descriviamo un protocollo per la visualizzazione di esocitosi di insulina in isolotti intatti usando pHluorin, una proteina fluorescente verde sensibili al pH. Gli isolotti isolati sono infettati con l'adenovirus codifica pHluorin accoppiato per il vescicola carico neuropeptide Y. Questo consente il rilevamento degli eventi di fusione granello dell'insulina mediante microscopia confocale.
Abstract
La secrezione dell'insulina svolge un ruolo centrale nell'omeostasi del glucosio in condizioni fisiologiche normali così come nella malattia. Attuali approcci per lo studio di esocitosi di granuli di insulina che utilizzare elettrofisiologia o microscopia accoppiato all'espressione di reporter fluorescenti. Tuttavia la maggior parte di queste tecniche sono stata ottimizzata per linee cellulari clonale o richiedono dissociando isolotti pancreatici. Al contrario, il metodo presentato qui consente per la visualizzazione in tempo reale di esocitosi di granuli dell'insulina in isolotti pancreatici intatti. In questo protocollo, descriviamo in primo luogo l'infezione virale di isolotti pancreatici isolati con l'adenovirus che codifica una pH sensibili proteina fluorescente verde (GFP), pHluorin, accoppiata al neuropeptide Y (NPY). In secondo luogo, descriviamo la rappresentazione confocale di isolotti di cinque giorni dopo l'infezione virale e come monitorare la secrezione di granuli di insulina. Brevemente, gli isolotti infetti sono collocati su un vetrino coprioggetto su una camera di imaging e imaged sotto un microscopio confocale laser-scanner verticale pur essendo continuamente irrorati con soluzione extracellulare contenente vari stimoli. Immagini confocal spanning 50 µm dell'isolotto sono acquisiti come Time-lapse registrazioni usando uno scanner veloce-risonante. La fusione dei granuli di insulina con la membrana plasmatica può essere seguita nel tempo. Questa procedura permette di testare una batteria di stimoli in un singolo esperimento è compatibile con sia il mouse che isolotti umani e possa essere combinata con vari coloranti per l'imaging funzionale (ad es., coloranti di calcio citosolico o potenziale di membrana).
Introduction
L'insulina è prodotta dalle cellule beta delle isole pancreatiche ed è un regolatore chiave di glucosio metabolismo1. Morte o disfunzione delle cellule beta disturba l'omeostasi del glucosio e porta a diabete2. L'insulina è confezionato in granelli del denso-centro che vengono rilasciati in Ca2 +-modo dipendente3. Delucidamento com'è regolata la esocitosi di granuli di insulina è essenziale per comprendere appieno ciò che determina la secrezione di insulina e apre nuove strade per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici per il trattamento del diabete.
Esocitosi di insulina è stato studiato estesamente utilizzando approcci elettrofisiologici, come le misure di capacità di membrana e approcci al microscopio in combinazione con molecole fluorescenti. Misure di capacità di membrana hanno una buona risoluzione temporale e consentono registrazioni singola cella. Tuttavia, variazioni della capacità riflettono il netto cambiamento di superficie della cella e non acquisire gli eventi di fusione individuale o distinguere fusione di granello di insulina da altre vescicole secretorie non insulino-3. Approcci al microscopio, come microscopia di fluorescenza (TIRF) di riflessione interna totale o due fotoni in combinazione con sonde fluorescenti e proteine cargo della vescicola, forniscono ulteriori dettagli. Queste tecniche catturano singoli eventi esocitotico e anche le fasi pre- e post-esocitotico e possono essere utilizzate per studiare i modelli esocitotico in popolazioni di cellule3.
Reporter fluorescenti possono essere di tre tipi: 1) extracellulare, 2) citoplasmatici o 3) vescicolare. 1) extracellulare reporter sono elementi traccianti polari (ad es., destrani, solforodamina B (SRB), Lucifero giallo, pyranine) che possono essere introdotto attraverso l' ambiente extracellulare4. L'impiego di traccianti polari consente per l'indagine del poro di fusione in una popolazione delle cellule e cattura varie strutture intercellulari quali i vasi sanguigni. Tuttavia, non segnalano il comportamento del carico della vescicola. 2) citoplasmiche reporter sono sonde fluorescenti accoppiati a proteine di membrana-collegato che affrontano il citoplasma e sono coinvolte nella docking station ed esocitosi. Esempi includono i membri della famiglia di solubile N- ethylmaleimide-sensibile fattore allegato proteina recettore (rullante) che sono stati utilizzati con successo in Neuroscienze per lo studio del neurotrasmettitore release5. Tali proteine hanno più partner di legame e non insulina-granuli specifici. 3) vescicolare reporter sono sonde fluorescenti fuse a proteine cargo vescicolare che permettono per l'indagine del comportamento di carico specifico della vescicola. Insulina-granello carico specifiche proteine includono insulina, c-peptide, polipeptide amiloide dell'isolotto e NPY tra gli altri6,7. NPY è presente solo in insulina contenente granuli ed è co-pubblicato con l'insulina, che lo rende un ottimo partner per un reporter fluorescente8.
La fusione di diverse proteine fluorescenti di NPY è stato precedentemente impiegata per studiare vari aspetti dell'esocitosi in cellule neuroendocrine, quali il requisito di synaptotagmin specifiche isoforme9,10 e come la corso di tempo di rilascio dipende dal citoscheletro di actina e miosina II11,12. In questo studio, abbiamo scelto pHluorin come il reporter fluorescente, che è un GFP modificate che è non fluorescente a pH acido all'interno del nucleo denso granuli ma diventa brillantemente fluorescente sopra l'esposizione al pH neutro extracellulare13. Granuli di insulina matura hanno un pH acido inferiore a 5.5. Una volta che il granello si fonde con la membrana plasmatica e si apre, il carico è esposto al pH neutro extracellulare di 7,4, che consente di utilizzare il pHluorin di proteine pH sensibili come reporter7,14.
In considerazione della natura sensibile del pH di pHluorin e l'espressione selettiva di NPY nei granuli di insulina, il costrutto di fusione di NPY-pHluorin consente di studiare le varie proprietà di esocitosi di granuli di insulina. La consegna virale del costrutto fusione assicura efficienza di trasfezione alta e lavora sul primarie beta cellule o linee cellulari e isolotti isolati. Questo metodo utilizzabile anche come linea guida per lo studio di esocitosi in qualsiasi altro tipo di cellula con vescicole contenenti NPY. Può anche essere combinato con qualsiasi modello di topo transgenico per studiare gli effetti di determinate condizioni (atterramenti, sovraespressione, ecc.) su esocitosi. Questa tecnica è stato precedentemente utilizzata per caratterizzare i modelli spaziali e temporali del granello della secrezione dell'insulina in popolazioni di cellule beta in isolotti umani15.
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Protocol
il Comitato di etica animale dell'Università di Miami ha approvato tutti gli esperimenti.
1. virale infezione di intatto isolato umano o isolotti pancreatici del topo
- cultura dell'isolotto: preparare il terreno di coltura dell'isolotto: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS e 2 mM L-glutammina.
- Umani di isole pancreatiche sono ottenuti dal programma di distribuzione integrata per isolotto (NIDDK, NIH). All'arrivo, trasferimento gli isolotti (~ 500 equivalenti di isolotto) a 35 mm non-tessuto cultura trattati Petri con terreni di coltura CMRL 2 mL a 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2 per 24 h prima dell'infezione virale.
- Mouse isolotti pancreatici possono essere isolati seguendo protocolli precedentemente stabiliti 16. A seguito di isolamento, cultura ~ 200 equivalenti di isolotto in 35 mm non-tessuto cultura trattati Petri con terreni di coltura CMRL 2 mL a 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2 per 24 h prima dell'infezione virale.
Nota: Evitare l'uso di topi transgenici con reporter GFP o YFP espresso sugli isolotti per evitare la sovrapposizione di fluorescenza con NPY-pHluorin.
- Preparazione di virus
Nota: la fusione di NPY-pHluorin è stata clonata nel vettore pcDNA3 10 e subclonata in un vettore adenovirale per produzione adenoviral [dell'adenovirus sierotipo 5 (DE1/E3)] da un adenovirus ricombinante società di produzione. Il virus è stato aliquotati e conservati a-80 ° C. Lo stock virale è fornito dalla società a titoli di 10 12 10 13 particelle virali (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- Per in vitro l'infezione dell'isolotto, uso 10 6 PFU/mL, risultante in una molteplicità di entità approssimativa dell'infezione (MOI) di circa 2 (Vedi discussione per dettagli)
- Infezione virale degli isolotti pancreatici
Attenzione: Lavorare con gli adenovirus richiede procedure di certificazione e livello 2 di biosicurezza (BSL2). Verifica con l'ufficiale di biosicurezza istituzionale per orientamento e formazione sulle procedure di BSL2.- Preparare umani/mouse isolotti come descritto sopra.
- Aggiungere 5-10 µ l di virus stock per ogni scatola di Petri 35 mm contenente isolotti umani/topo in 2 mL di terreno di coltura CMRL (con 10% FBS e 2 mM L-Glutammina).
Nota: Regolare il volume del virus impiegato secondo il titolo virale come previsto dal foglio dati società. - Cultura gli isolotti in contenenti virus media presso 37 °C/5% CO 2 per 24 h.
- Dopo 24 h, aspirare i supporti contenenti virus e sostituire con 2 mL di coltura CMRL (con 10% FBS e 2 mM L-Glutammina).
- Cultura gli isolotti per 4-6 giorni a 37 °C/5% CO 2, sostituendo i media ogni 3 giorni.
- Dopo 4 - 6 giorni di coltura, si aspettano circa 30% delle cellule dell'isolotto di essere infetti. Isolotti possono quindi essere utilizzati per esperimenti dal vivo imaging.
2. Confocale Imaging di infettati isolotti
Nota: fare riferimento alla Tabella materiali per i materiali e le attrezzature necessarie per l'imaging confocale.
- Reagente preparazione e messa a punto sperimentale
- preparare soluzione extracellulare: aggiungere 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1mm MgCl 2, 25mm HEPES, 0.1% BSA, pH 7.4, sterile filtrata.
Nota: Questo buffer è normalmente preparato senza glucosio e possa essere conservato a 4 ° C per fino a 1 mese. Il glucosio è aggiunto il giorno dell'esperimento per raggiungere la concentrazione finale desiderata.- Medio basale del glucosio (3 mM) preparazione: aggiungere 75 µ l di brodo glucosio 2m a 50 mL di soluzione extracellulare.
- Hyperglycemic (16 mM) medio: aggiungere 400 µ l di brodo glucosio 2m a 50 mL di soluzione extracellulare
- Diluire qualsiasi ulteriore stimolo (per esempio, KCl o l'adenosina trifosfato (ATP)) in soluzione extracellulare contenente glucosio di 3 mM.
- Prima di iniziare un esperimento, pretrattare i coprioggetti con poli-D-lisina aggiungendo 30 µ l di soluzione di poli-D-lisina (1 mg/mL) per il coprioggetto per 1 h e risciacquare accuratamente con H 2 O.
Nota: Le lamelle di poli-lisina rivestito possono essere conservate a temperatura ambiente fino a 6 mesi. - Almeno 1 h prima dell'esperimento, utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire gli isolotti in una capsula Petri 35 mm contenente soluzione extracellulare con 3 millimetri di glucosio. Mantenere gli isolotti a 37 ° C e 5% CO 2.
Nota: Se necessario, la membrana plasmatica può essere etichettata in questo passaggio. Per etichettare la membrana plasmatica, è possibile aggiungere 2 µM di-8-ANEPP colorante alla soluzione extracellulare con glucosio a 3 mM. Incubare le isolette nella soluzione colorante per 1 h a 37 °C/5% CO 2. La tintura di membrana plasmatica può essere eccitata a 488 nm e rilevato a 620 nm. - min prima di iniziare un esperimento, fissare il vetrino coprioggetto alla camera di imaging sigillando con grasso al silicone vuoto. Difficoltà la camera di imaging per la piattaforma di imaging. Utilizzando una pipetta, inserire 20-30 isolotti sulla zona poli-D-lisina-trattati del vetrino coprioggetto e lasciare che gli isolotti aderiscono alla superficie per 20 min.
Nota: È importante non far asciugare completamente per evitare danni dell'isolotto coprivetrino. - Mentre gli isolotti sono aderenti per il vetrino coprioggetto, preparare il sistema di perfusione risciacquando abbondantemente con acqua. Aggiungere ogni soluzione a un canale diverso: 3 millimetri di glucosio (canale 1), 16 millimetri di glucosio (canale 2), 16 millimetri di glucosio con 100 µM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) e 10 µM forskolin (canale 3), 25 mM KCl in 3 millimetri di glucosio (canale 4), 10 µM ATP in 3 mM glucosio ( Canale 5). Rimuovere tutte le bolle dal sistema aprendo ogni canale separatamente e lasciare che il flusso di soluzione per pochi minuti e assicurarsi che il flusso è coerente (0,5 mL/min) e il tubo non perde.
- Collegare il riscaldatore di soluzione single inline per il tubo di uscita di aspersione e regolare la temperatura del buffer outflowing a 37 ° C.
- Preparare la pompa di aspirazione. Rimuovere tutte le bolle dal sistema e assicurarsi che il flusso è coerenza e il tubo non perde.
- Una volta che gli isolotti aderiscano alla superficie del vetrino coprioggetto, riempire delicatamente la camera di imaging con la soluzione extracellulare contenente glucosio di 3 mM. Evitare di lavare gli isolotti lontano dalla superficie del coprivetrino.
- Mettere la piattaforma di imaging con gli isolotti sul palco microscopio e collegarlo alla pompa di aspirazione e sistema di perfusione.
- Disabilita sul flusso e costantemente irrorare le isolette con la soluzione extracellulare di 3G. Il sistema è ora pronto per l'imaging confocale.
- preparare soluzione extracellulare: aggiungere 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1mm MgCl 2, 25mm HEPES, 0.1% BSA, pH 7.4, sterile filtrata.
- Imaging confocale
- individuare gli isolotti nel campo microscopio con ingrandimento minore. Una volta messo a fuoco sugli isolotti, passare a più alti obiettivi di ingrandimento (per es., 63 obiettivo a immersione in acqua X (63 X / 0,9 NA)).
- Aprire l'acquisizione utilizzando software (Tabella materiali) e attivare la modalità scanner risonante.
- Selezionare la modalità di imaging XYZT e configurare le impostazioni di acquisizione come segue:
- girare su Argon laser e il laser a 488 nm linea e regolare la potenza del laser al 50% per l'eccitazione di pHluorin.
- Raccogliere emissione a 505-555 nm.
- Scegliere una risoluzione di 512 x 512 pixel. Premere il " Live " per avviare imaging e regolare i livelli di guadagno (guadagno tipico è intorno a 600 V).
- Impostare l'inizio e fine dello z-stack: concentrarsi sulla parte superiore l'isolotto e scegliere " begin " e spostarsi all'ultimo piano che può essere focalizzata e sceglie " fine ". Utilizzare una dimensione di z-passaggio di 5 µm. Il software calcolerà automaticamente il numero di aerei confocale.
- Impostare l'intervallo di tempo per l'acquisizione di ogni stack di z nei pressi di 1.5-2 s e scegliere l'opzione " acquisire deve essere interrotta " per l'imaging continuo.
- Premere il " inizio " pulsante per inizializzare.
- Utilizzare diversi protocolli di stimolazione per indurre esocitosi di granuli irrorando gli isolotti con gli stimoli desiderati. Protocolli di stimolazione possono essere personalizzati per soddisfare lo scopo scientifico desiderato (Vedi sotto).
- Protocolli di stimolazione
Nota: In ogni protocollo di stimolazione, iniziare registrando almeno 2 min delle attività in background dell'isolotto durante l'aspersione costante con soluzione extracellulare contenente glucosio di 3 mM. Irrorare con uno stimolante per il periodo di tempo desiderato. L'ordine di stimolanti, durata della stimolazione così come durata delle registrazioni possono essere personalizzati per soddisfare le finalità scientifiche desiderate. Assicurarsi di lavare accuratamente gli isolotti con soluzione extracellulare contenente glucosio 3 mM prima di iniziare un nuovo stimolo. Qui di seguito trovare i protocolli di stimolazione di campione che sono stati utilizzati per illustrare le funzionalità di metodo.- Stimolare con cloruro di ammonio (NH 4 Cl) come controllo positivo per pHluorin pH sensibilità ed efficacia di infezione virale ( Figura 3): 3 millimetri di glucosio (2 min) → 50mm NH 4 Cl (2 min) in glucosio di 3 mM → 3 millimetri di glucosio (2 min)
Nota: In the NH 4 Cl soluzione, sostituire NaCl su una base equimolare. - Esocitosi di granuli di insulina stimolano aumentando la concentrazione di glucosio ( Figura 5 e Figura 6): 3 millimetri di glucosio (2 min) → 16 millimetri di glucosio (15-30 min) → 3 millimetri di glucosio (2 min
Nota: Al fine di vedere parecchi scoppi di attività, irrorare gli isolotti continuamente con la soluzione di 16 G per almeno 15 min.
Nota: Al fine di aumentare la coerenza delle risposte secretiva 17, utenti possono aggiungere agenti di sensibilizzazione cAMP (100 µM IBMX e 10 µM forskolin) alle soluzioni 3G e 16 G. Questo non cambia i pattern temporali della secrezione del granello. Per informazioni dettagliate vedere 15 e discussione.
- Stimolare con cloruro di ammonio (NH 4 Cl) come controllo positivo per pHluorin pH sensibilità ed efficacia di infezione virale ( Figura 3): 3 millimetri di glucosio (2 min) → 50mm NH 4 Cl (2 min) in glucosio di 3 mM → 3 millimetri di glucosio (2 min)
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Representative Results
L'intero flusso di lavoro della tecnica è illustrata nella Figura 1. Brevemente, mouse o isolotti umani possono essere infettati con l'adenovirus codifica NPY-pHluorin e ripreso, dopo pochi giorni a cultura, sotto un microscopio confocale. Come granuli si fondono con la membrana plasmatica e Apri, un aumento di fluorescenza è osservato e possono essere quantificato (Figura 1). Per determinare se NPY-pHluorin è infatti uno strumento adatto per monitorare insulina granello dinamiche, isolotti infetti immunostained con gli anticorpi contro GFP e l'isolotto diversi ormoni insulina, somatostatina o glucagone. La maggior parte delle cellule che esprimono NPY-pHluorin (GFP positivo) erano cellule beta come hanno inoltre manifestato l'insulina (~ 90%; Figura 2A, 2B). Solo poche cellule alfa glucagone-positive o cellule delta di somatostatina-positivi erano GFP-etichettato (Figura 2B). D'importanza, nelle cellule infettate, la fusione di NPY colocalized con insulina (coefficiente di correlazione di Pearson di 0.61 ± 0,04 per GFP e insulina vs 0,21 ± 0.05 per GFP e glucagone e 0,07 ± 0.01 per GFP e somatostatina).
Abbiamo dimostrato che pHluorin è un sensore di pH efficace, come aumentando il pH intracellulare con 50mm NH4Cl ha provocato un > aumento del 500% la fluorescenza intracellulare (Figura 3A, 3B, Video 1). Il pH all'interno del granello aumenta al momento della fusione con la membrana plasmatica e l'apertura del poro di fusione, granuli contenenti NPY-pHluorin diventano visibili sulle condizioni che stimolano esocitosi di insulina come la depolarizzazione della membrana con KCl (Figura 4, video 2).
Singoli eventi secretivi in beta cellule all'interno di isolotti intatti possono essere visualizzati con imaging confocale time-lapse di isolotti di NPY-pHluorin infettata. Questi si verificano in risposta alla depolarizzazione della membrana diretto con KCl o parecchi altri stimoli fisiologici (Figura 4 e Figura 7, vedi sotto). La concentrazione di glucosio basale extracellulare (3 mM), poca attività secretiva è osservato. Tuttavia, la fusione di granuli con la membrana plasmatica viene attivato in risposta alla stimolazione con alto glucosio (16 mM) (Figura 5A, Video 3). Posizionando il ROIs con diverse dimensioni e in diversi settori, la cinetica della risposta dei granuli secretori possa essere paragonata che di singole celle o gruppi di cellule nelle immediate vicinanze (cluster) (figura 5B). Questo tipo di analisi attivato stabilito che: 1) i singoli eventi secretori sono molto sincronizzata e secrete entro pochi secondi dalla risposta media delle celle, e 2) le cellule beta in prossimità formare gruppi funzionali dell'attività sincronizzata.
Secrezione di insulina nel corpo si verifica in maniera pulsatile. Stimolando gli isolotti di NPY-pHluorin-infettati con la concentrazione di glucosio elevato per periodi prolungati (15-20 min) ha dato luogo a più impulsi (o burst) della secrezione (Figura 6, Video 4). Durante ogni impulso, singoli granuli si fondono con la membrana di plasma in modo sincronizzato come mostrato prima (Figura 5). Scoppi di attività secretiva possono essere visto ogni 3-4 min.
Aumenti transitori in fluorescenza in NPY-pHluorin contenenti granuli anche ha potuto essere osservati in risposta per l'agonista purinergico ATP (10 µM) o l'acetilcolina agonista muscarinico (ACh, 10 µM) (Figura 7), entrambi dei quali sono noti gli stimolatori di secrezione dell'insulina in isolotti umani. Come previsto, la depolarizzazione di membrana con KCl (30 mM) anche innescato esocitosi di granuli di insulina (Figura 5). Diversi stimoli possono essere applicati alla stessa preparazione dell'isolotto, purché gli isolotti sono lavati bene tra stimoli. Assicurarsi di modificare l'ordine di applicazione quando si ripete l'esperimento.
Figura 1. Uno schema che illustra l'analisi sviluppata. L'adenovirus che codifica un pH sensibili GFP (pHluorin) accoppiato al NPY furono prodotte e utilizzate per infettare mouse o isolotti pancreatici umani. Quattro-sei giorni dopo l'infezione, gli isolotti sono stati disposti su un vetrino coprioggetto e imaged sotto un microscopio confocale scansione laser verticale. Il costrutto di NPY-pHluorin è espresso in granuli di insulina in cellule beta. La fluorescenza è temprato a pH acido dei granelli insulina matura ma diventa luminoso su fusione di granuli con la membrana plasmatica e l'esposizione al pH neutro extracellulare di 7,4.
Figura 2. Il NPY Fusion costruire è espressa in granuli di insulina. (A) immagini Confocal di intatti isolotti umani infettati con NPY-pHluorin, immunostained per GFP (verde) e l'insulina (pannello di sinistra, rosso), somatostatina (medio, rosso) o glucagone (destra, rosso). I nuclei cellulari sono mostrati in blu (DAPI etichettato). Barre di scala = 10 µm. (B) quantificazione della frazione di cellule GFP-positive che contengono anche insulina (Ins), somatostatina (Soma) o glucagone (Glu). Indicato sono la media ± SEM, n = 5 isolotti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. NPY-pHluorin è un sensore un efficace pH. (A) proiezione massima delle immagini confocal di un isolotto del mouse infettati con NPY-pHluorin in soluzione extracellulare contenente glucosio 3mm prima (pannello superiore, 3G) e in presenza di 50mm NH4Cl (pannello inferiore). Barra della scala = 100 µm. (B) traccia mostrando il cambiamento nell'intensità media di fluorescenza (unità arbitrarie) nell'intero isolotto indotta da NH4cl. Dashed line indica NH4Cl applicazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Granuli contenenti NPY-pHluorin diventano visibili una volta che si fondono con la membrana plasmatica e Open. Isletsinfected umana con l'adenovirus NPY-pHluorin erano incubated con la membrana plasmatica tingere di-8-ANEPP (rosso). Stimolazione dell'isolotto con KCl (30 mM) ha attivato una comparsa improvvisa e transitoria di fluorescente granuli alla superficie delle cellule (mostrata in verde). Immagini confocal di cellule all'interno di un isolotto umana vengono visualizzati nella prima risposta esocitotico (t = 0), durante (t = 3-9 s) e dopo (t = 12 s). Contrasto è stato regolato per rimuovere la fluorescenza di fondo verde. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Alto glucosio innesca NPY-pHluorin fusione con la membrana plasmatica. (A) massima proiezione delle immagini confocal di un isolotto umano intatto infettato NPY-pHluorin nella concentrazione basale del glucosio (glucosio 3G - 3 mM, pannello sinistro) o in alto glucosio (glucosio 16g - 16 mM, pannello di destra). Extracellulare soluzioni contenevano l'accampamento alzando agenti forskolin e IBMX (Vedi protocollo per dettagli). Barra della scala = 10 µm. (B) le tracce che mostra i cambiamenti nell'intensità media di fluorescenza (unità arbitrarie) nel verde del canale in ROIs collocato intorno singoli eventi secretivi (rosso, granello), cellule (verde) o ammassi cellulari (blu). Elevati del glucosio è stato applicato per 5 min dopo ~ 2,5 min in 3G. Valori di fluorescenza sono stati normalizzati al valore iniziale di fluorescenza (linea di base). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. Eventi secretivi generano impulsi discreti della secrezione su alto glucosio. Tracce che mostra i cambiamenti nel dire l'intensità di fluorescenza (unità arbitrarie) in ROIs collocato intorno diverse celle all'interno di un isolotto umana intatta durante la stimolazione sostenuta con 16 millimetri di glucosio. Ogni colore rappresenta una singola cella. Burst di attività secretiva può essere visto ogni 3-4 min. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Fusione di NPY-pHluorin con la membrana plasmatica è innescato da noto stimolatori della secrezione dell'insulina. Tracce che mostra cambiamenti nell'intensità media di fluorescenza (unità arbitrarie) in ROIs collocato intorno secretivi singoli eventi in celle all'interno intatti isolotti umani indotti da KCl (30 mM), ATP (10 µM), alto glucosio (16G, 16 mM) e acetilcolina (Ach, 10 µM). KCl e ATP sono stati applicati nella concentrazione basale del glucosio (3 mM). Linee nere mostrano il granello medio e linee grigie riflettono valori SEM. Le tracce verdi mostrano la risposta delle cellule corrispondenti. Scala temporale orizzontale (2 min) si applica a tutti i grafici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1. NPY-pHluorin Adenovirus efficientemente infettare le cellule dell'isolotto e variazioni di pH di senso.
Isolotti del topo sono stati infettati per 4 giorni con l'adenovirus codifica NPY-pHluorin. Isolotti infetti sono stati disposti su un vetrino coprioggetto e montati sulla camera di imaging. Per aumentare il pH intracellulare, gli isolotti sono stati irrorati con 50mm NH4Cl aggiunto alla soluzione extracellulare contenente glucosio di 3 mM. Un veloce e forte aumento di fluorescenza può essere visto su NH4Cl applicazione. Barra della scala = 100 µm. Movie velocità = 5 fps. Durata totale del film è 90 s. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 2. Granuli contenenti NPY-pHluorin diventano visibili una volta che si fondono con la membrana plasmatica e aperta.
Isolotti umani infettati con l'adenovirus NPY-pHluorin sono stati incubati con la membrana plasmatica della tintura di-8-ANEPP. Stimolazione dell'isolotto con KCl (30 mM) ha attivato un'apparenza improvvisa e transitoria di granuli fluorescenti alla superficie delle cellule. Una proiezione massima di aerei confocale è mostrata. Contrasto è stato regolato per rimuovere la fluorescenza di fondo verde. Barra della scala = 20 µm. Movie velocità = 5 fps. Durata totale del film è di 60 s. per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 3. Alto glucosio trigger esocitosi dei granuli che contengono NPY-pHluorin.
Fusione di NPY-pHluorin contenenti granuli viene attivato in risposta alla stimolazione con alto glucosio (16 mM). Nella concentrazione basale del glucosio extracellulare (3 mM), poca attività secretiva è osservato. Tuttavia, al momento di alto glucosio, granelli insulina transitoriamente appaiono sulla membrana plasmatica di cellule differenti in un isolotto in modo sincronizzato. Elevati del glucosio è stato applicato dopo ~ 2,5 min in 3G (16G etichetta viene visualizzata). Una proiezione massima di aerei confocale è mostrata. Barra della scala = 20 µm. Movie velocità = 10 fps. Durata totale del film è 7 minuti Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 4. La stimolazione prolungata con alto glucosio attiva diverse raffiche di esocitosi.
Prolungata stimolazione con alto glucosio dà origine a molteplici impulsi di isolotti di secrezione, durante il quale compaiono transitoriamente granuli. Gli impulsi di attività secretiva possono essere visto ogni ~ 3-4 min aereo Confocal di un umano dell'isolotto è mostrato. Una combinazione di pseudocolor è stato applicato per l'intensità di fluorescenza. Barra della scala = 20 µm. Movie velocità = 30 fps. Durata totale del film è 20 min Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Questo manoscritto descrive una tecnica che può essere utilizzata per visualizzare esocitosi dei granuli di insulina in cellule beta all'interno intatti isolotti pancreatici mediante microscopia confocale. Utilizza NPY-pHluorin come il reporter fluorescente clonato in adenovirus per garantire un'efficienza di trasfezione alta.
Anche se il metodo è altamente efficiente nelle nostre mani, anche se potrebbe richiedere alcune modifiche che dipendono principalmente da due parametri: 1) la qualità della preparazione dell'isolotto e 2) il titolo di stock virali con ottimizzazione delle condizioni di infezione. Prima l'infezione virale di isolotti, consentire la preparazione dell'isolotto recuperare dallo stress isolamento e trasporto durante la notte a 37 ° C. Ispezionare la morfologia dell'isolotto sotto un microscopio chiaro durante tutto il periodo di infezione/espressione e controllare per i segni di vitalità in diminuzione come le cellule che sporge dalla superficie dell'isolotto o presenza di cellule ipossiche (cellule più scure) nel centro dell'isolotto18 . Ogni stock virali possono variare in termini di efficienza titolo ed infezione. Assicurarsi di regolare il volume del virus impiegato secondo il titolo virale e il tempo della cultura prima l'analisi di microscopia. Il punto più critico è l'ottimizzazione delle condizioni di infezione (ad es., numero di particelle virali, tempo della coltura prima del dosaggio) affinché abbastanza del reporter è espressa e l'integrità dell'isolotto e reattività sono mantenuti. Quando si ottimizza il protocollo di infezione e con ogni nuovo lotto di virale, raccogliere alcuni isolotti in diversi momenti e controllare se esocitosi può essere suscitata con KCl (30 mM) e/o alto glucosio (16 mM). Abbiamo trovato che il test funziona meglio e rimangano in buona salute le cellule dell'isolotto e glucosio reattivo quando il MOI è bassa (circa 2) e il tempo della coltura è estesa (circa 5 giorni) per aumentare i livelli di espressione del costrutto fusione. I nostri risultati sono in linea con un precedente studio che dimostra che espressione efficiente dei prodotti del gene può essere realizzato meglio a concentrazioni più basse di transfezione del vettore adenoviral preservando isolotto funzione19.
La tecnica ha, tuttavia, alcune limitazioni. Uno è che utilizzando NPY-pHluorin come reporter, granuli non possono essere visualizzati prima che si fondono con la membrana plasmatica e si apre il poro di fusione. Per studiare l'insulina granello traffico invece di esocitosi, l'adenovirus codifica NPY-eGFP può essere utilizzato invece. Un'altra limitazione è che, in misura inferiore, NPY-pHluorin possono essere mirate ai granuli contenenti del non-insulina. Tuttavia, la maggior parte delle cellule che sono stati infettati con NPY-pHluorin espresso anche insulina e meno del 10% del glucagone cellule espresse o somatostatina. Infatti, la dipendenza di glucosio di secrezione del granello, suo modello pulsatile e co-localizzazione con insulina, indicato che più secretivi eventi rappresentano carico rilascio dai granuli di insulina. Per garantire un controllo dell'insulina è in corso l'esocitosi, il dosaggio deve essere effettuato in condizioni tali da stimolano la secrezione di insulina (ad es., alto glucosio). Tuttavia, per migliorare la specificità di espressione delle cellule beta, NPY-pHluorin potrebbe essere messo sotto il controllo di un promotore più selettivo come il promotore dell'insulina del ratto. Un'altra limitazione della tecnica è che richiede espressione di proteine esogene nei granuli di insulina, che possono perturbare il loro biogenesi e/o comportamento20. Questo dovrebbe essere considerato quando si interpretano i risultati degli esperimenti e, se possibile, le conclusioni devono essere convalidate utilizzando altre proteine cargo granello di insulina (ad es., C-peptide, polipeptide amiloide dell'isolotto) come reporter.
Questo protocollo raccomanda, inoltre, compresi gli agenti di sensibilizzazione cAMP (IBMX e forskolin) per potenziare gli effetti di alto glucosio su esocitosi di granuli di insulina. Questo protocollo di stimolazione imita l'attivazione di vie di amplificazione fisiologicamente rilevanti (attivato da incretine o paracrina e molecole di segnalazione neurale) che rafforzano la secrezione di insulina aumentando il campo nelle cellule beta del pancreas. Tuttavia, in assenza di campo agenti lievitanti, alto glucosio (16 mM) suscita anche esocitosi di granuli, ma il numero di eventi secretivi osservati è inferiore. Granuli ancora verranno visualizzate in modalità burst, discreti, sono sincronizzati con la risposta delle cellule medio e periodi simili a raffica: 1.4-6,6 min in alto glucosio più IBMX/forskolin vs 1,5-10 min in alto glucosio da solo.
Il test descritto qui è significativo per quanto riguarda i metodi esistenti, in quanto ha sufficiente risoluzione spaziale e temporale per visualizzare eventi di fusione singola in tempo reale in beta cellule all'interno di isolotti intatti. Per esempio, ha rivelato la sincronizzazione alta con cui l'insulina granuli vengono rilasciati in isolotti umani su stimolo del glucosio. Inoltre, se gli isolotti sono ben ancorati al vetrino coprioggetto, essi possono essere imaged per periodi prolungati (almeno 15-20 min). Questo è stato usato per mostrare che in isolotti umani esocitosi si verifica nei bursts distinti che appaiono nei periodi simili a quelli della secrezione di insulina pulsatile in vivo . Il dosaggio consente inoltre di verificare l'effetto di parecchi stimoli su esocitosi di insulina utilizzando isolotti murini o umani. Inoltre, perché non richiede la dissociazione delle cellule dell'isolotto come altri metodi, può essere applicato per studiare il comportamento delle popolazioni di cellule beta all'interno di un isolotto. Infatti, abbiamo osservato che le cellule beta vicine formare ammassi di ~ 5-10 celle in cui l'attività è sincronizzata. Cellule beta dal cluster stesso probabilmente sono accoppiate da gap junction canali fatti di connessina 3621. La loro risposta sincronizzato illustra la connettività delle cellule beta che è essenziale per l'insulina corretta secrezione22.
In futuro, questa tecnica può essere combinata con altri coloranti fluorescenti per l'imaging funzionale per visualizzare in tempo reale come cambiamenti nel calcio citosolico o potenziale di membrana, per esempio, correlano con esocitosi di granuli in beta cellule. In particolare, come nuove pH sensibile rosso fluorescente proteine stanno diventando disponibili14,23 e possono essere fuso a NPY o altre proteine cargo granello di insulina, coloranti verde per l'imaging funzionale possono essere utilizzati. Inoltre, questa tecnica può essere combinata con un modello di topo per l'imaging in vivo di vascularized isolotti trapiantati in camera anteriore dell' occhio del mouse24. Isolotti possono essere infettati con adenovirus 48-72 h prima di trapianto nell'occhio. Topi deficienti di immuni devono essere utilizzati se vengono trapiantati isolotti umani. Utilizzando questo modello, il modello spaziale subcellulare granello della secrezione dell'insulina può essere correlato con arrangiamenti vascolare25.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Marcia Boulina dalla funzione di memoria per un aiuto con i microscopi di imaging e DRI. Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), DK111538 R01, R33 ES025673 e R56 DK084321 (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
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