Summary
异常的感官功能是内脏疼痛和其他功能性和炎症性肠道疾病的症状。本文介绍了一种在前体大鼠直肠制备中结肠传入神经的电生理记录的协议。
Abstract
结肠感觉神经功能障碍已被牵连的病理生理学的几个常见的条件, 包括功能性和炎症性肠道疾病和糖尿病。在这里, 我们描述了一个协议的体外结肠传入在大鼠的电生理特性的表征。直肠, 与完整的盆腔神经节 (PG) 连接, 从鼠身上移除;superfused 与 carbogenated 克雷布斯溶液在记录室中;和中空的口腔和肛门两端允许扩张。从 PG 中产生的细神经束被识别, 并使用吸入电极记录多传入神经活动。结肠段的扩张引起多放电的逐渐增加。对低、high-threshold 和宽动态范围传入光纤进行了主成分分析。结肠传入的化学敏感性可通过对试验化合物的浴或腔内管理进行研究。本议定书可以修改, 以适用于其他物种, 如小鼠和豚鼠, 并研究不同的电生理特性的胸腰椎/下和腰骶/盆腔传入的下降结肠正常和病理条件。
Introduction
胃肠道 (GIT) 是丰富的支配与外部传入神经, 传达感官信号从肠道到中枢神经系统, 这有助于肠道-大脑的相互作用。改变兴奋性的这些外在传入, 以及改变中央处理的传入输入, 基础内脏疼痛和其他症状的胃肠条件, 包括功能性和炎症性肠道疾病1。来自直肠的感官信息主要通过胸腰椎/下和腰骶/盆腔神经 (PN)2传达。在啮齿动物疾病模型中, 对这些初级传入纤维的电生理特性的研究有了更大的兴趣。然而,在体内啮齿类动物结肠传入的电生理记录是一个技术挑战, 需要相当多的手术技巧。此外, 血液动力学的变化, 组织运动和麻醉药也可能影响神经活动和敏感性测试刺激在体内。因此, 近年来, 越来越多的研究采用了体外(前体内) 不同物种 (包括小鼠、大鼠、豚鼠和人类) 的制剂, 来研究结肠的感觉传导机制。传入和改变的兴奋性在疾病情况下。3,4,5,6,7,8
两种类型的前体结肠准备主要报告了: "平板" 准备5,9,10和 "管" 准备3,4。"平板" 小鼠直肠准备的视频协议以前已发布11。在本协议中, 小鼠直肠, 与 PN) 或腰椎内脏神经 (LSN) 附着, 是收获和 superfused 在一个组织室。直肠纵向切开, 将神经束延伸到充满石蜡油的记录室。使用单铂铱电极记录神经活动。该协议允许通过使用无偏电刺激来识别单个传入纤维的接受场。它本地化应用化学刺激, 以及应用不同的机械刺激范式 (例如,局灶性黏膜探查和周向伸展), 以传入神经末梢。因为神经必须从组织室延伸到一个单独的室, 所以保持附着的神经相对长是至关重要的;成功的神经解剖对这种方法的新的人构成挑战。最近, Nullens et al.发布了一个视频协议, 用于在小鼠空肠和结肠段 12中进行肠系膜传入的记录。在这个 "管" 的准备, 肠段与肠系膜附着保持完好, 从而允许分级扩张和 extra-luminal 管理不同的化学品。由于肠系膜神经被记录使用吸入电极, 它可以定位于组织附近, 即使肠系膜神经相对较短, 也可以记录传入活动。然而, 肠系膜神经包括迷走神经和脊髓传入纤维的混合种群, 支配空肠或胸腰椎下。腰骶部盆腔传入支配直肠, 不能在本协议中受到歧视。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 对大鼠结肠传入的电生理记录使用 "管" 直肠制剂与完整的 PG。此方法可用于描述腰椎内脏 (下) 和腰骶盆腔传入的功能特性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这里报告的实验协议已获得上海交通大学动物伦理委员会 (SYXK2013-0050) 的批准. #160; 完整的神经节和神经直肠的解剖躯干需要至少15分钟的人在这项技术相当经验。因此, 有必要保持动物活着, 但在深麻醉下, 同时执行解剖, 以确保组织的可行性, 随后的电生理记录.
1. 灌注液和试验化合物的制备
- 准备 5 L 的克雷布斯溶液: 113 mm 氯化钠, 5.9 毫米氯化钾, 1.2 mm NaH 2 PO 4 , 1.2 mm MgSO 4 , 25 mm NaHCO 3 , 1.2 mm CaCl 2, 11.5 毫米葡萄糖。使用 95% O 2 + 5% CO 2 气体混合物饱和解决方案。预冷〜500毫升的含氧克雷布斯在冰箱.
- 在需要时, 准备等分的原料测试化合物 (1 毫米的乙醇和 10 mm 5-色 (5-HT) 中的辣椒素)。稀释的股票在克雷布斯 (用于浴应用) 和盐水 (为腔内管理) 到最后的浓度, 才使用前.
2。记录电极的制备
- 使用常规电极拉拔器从标准玻璃管中拉出无内丝 (1.5 mm 外径) 的记录电极。调整拉拔器设置的热量和拉力, 使被拉扯的电极的小腿在20和25毫米之间.
3。组织集合
- 使用戊巴比妥钠 (80 毫克/千克, ip) 深麻醉大鼠。和 #160;
- 在确保不育的同时, 通过使用手术刀在腹壁上进行中线切口来暴露腹腔。把肠系膜和其他组织拉到一旁, 露出直肠.
- 将动物置于解剖显微镜下。通过仔细解剖, 找到左 PG, 并确定 PN 和 LSN 加入它。把这些神经从 PG 上剪掉几毫米.
注: PG 位于结直肠交界处附近。通常, 3-4 PN 从腰骶脊髓和一个 LSN 项目到 PG ( 图 1 ). - 切断耻骨骨以暴露直肠。移除直肠以上的组织 ( 即, 膀胱, 等 );小心把 PG 保持原样.
- 通过静脉注射戊巴比妥过量而牺牲老鼠。在 PG 上方约3厘米的结肠横断面上, 用镊子将直肠从动物身上取出.
- 将直肠转移到填充预克雷布斯溶液的培养皿中。通过轻轻冲洗结肠来去除粪便。小心去除残留的膀胱和其他组织, 而不损害 PG.
4。结肠传入神经的解剖
- 将冒号放入记录室 (20 毫升), 并连续灌注 carbogenated 克雷布斯溶液。设置15毫升/分钟的灌注率
- Cannulate 直肠在口腔和肛门两端。开始结肠腔内灌注生理盐水的速度为10毫升/小时在口腔肛门的方向.
- 在解剖显微镜下定位主要 PG。使用昆虫引脚暴露神经节。仔细解剖后, 找到神经节发出的细枝, 向结肠跑去 ( 图 1 )。切断神经节的距离.
注意: 图 1 说明了从远端的神经分支到 PG 的记录。神经可能包含骨盆和腰椎内脏传入纤维的混合物。或者, 可以从 PN 和/或在 PG 的 LSN 上进行记录. - 打开加热浴缸并预热克雷布斯溶液以保持室温在34和 #177; 0.5 和 #176; C.
5。吸入电极的制备
- 采取 pre-pulled 玻璃吸管 (步骤 2) 并在解剖显微镜下检查。用一对镊子打破电极的尖端, 使其尺寸与要记录的神经直径相兼容.
- 将笔尖放在较亮的光晕附近, 以将其倾斜.
6。电生理记录
- 将斜面电极连接至电极支架。将10毫升注射器连接到托架上的侧面端口, 以对电极施加负或正向压力.
- 将刀柄连接至 bioamplifier 的 headstage, 并将 headstage 安装到机械手上.
- 将电极移到组织浴中, 用温和的吸力将电极克雷布斯溶液, 直到接触到支架的银线。将电极尖端靠近神经的切口端, 施加负压以将神经吸入电极。施加更多的负压, 使 ~ 1 毫米的神经被拉入电极, 形成一个紧密的密封.
- 打开 bioamplifier, 并将滤镜设置为 300-3000 Hz. 监视示波器上的信号, 并使用带有峰值数据处理的计算机记录神经信号 (20 kHz 采样率) 和腔内压力信号 (100 赫兹采样率)软件.
7。测试结肠传入敏感度
- 通过关闭插座套管上的三路水龙头, 同时连续注入 intraluminally, 从而应用结肠的斜坡扩张。监测腔内压力, 直到它达到60柱, 在这个时候打开三路水龙头的引流套管.
- 定期重复此过程15分钟. 应用药物 extra-or intraluminally 测试传入神经的化学敏感性.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图 1是为ex 体内"管" 直肠准备的实验性设置的示意图, 其中有代表从远端神经到 PG 的记录。神经可能包含骨盆和腰椎内脏传入的混合物。在正常大鼠的准备中, 结肠传入神经通常有不规则自发活动的低水平。结肠的斜坡扩张导致射击速度的逐渐增加 (图 1B)。通过绘制腔内压力-传入神经反应曲线 (图 1C) 来表示每个神经的 mechanosensory 性质。平均压力-响应曲线可以比较组之间 (即,控制与治疗), 以揭示是否治疗改变了结肠传入神经的 mechanosensory 性质 (见荣et al.有关压力传入响应曲线的详细信息, 请13 。
或者, 可以从 pn 或在 pg 上的 LSN 进行录制.图 2是一个来自 pn 束的具有代表性的记录, 它的 mechanosensory 响应与 pg 的远端包的质量类似, 如图1B.. 神经信号的主成分分析允许识别单活动。根据对扩张反应的描述, 可区分的单个单元被归类为低 (LT) 纤维、宽动态范围 (WDR) 纤维和 high-threshold (HT) 纤维。它的单位是在一个低的扩张压力下激活, 并在大约20柱的射击率达到最大。WDR 单元也在较低的膨胀压力下激活, 随着腔内压力的增加 (图 2A和C), 发射率继续增加。在膨胀压力和 #62 下激活 HT 单元; 20 柱 (请参见东et al.)4。
结肠传入的化学敏感性可通过流 (浴应用) 或腔内输液来检测。例如, 10 µM 5 羟色胺的沐浴应用引起了适度的增加, 而辣椒素在0.3 µM 诱发了盆腔传入放电的强劲增加, 其次是由于脱敏 (图 3) 而减少的活动周期。
图1。大鼠结肠传入神经的电生理记录体外。a.大鼠的体外 "管" 结肠制备示意图. 直肠, 附有 PG, 是 superfused 在录音室和空心两端。腔内输液是通过使用注射器泵和移动在口腔到肛门的方向。结肠的扩张是通过关闭插座套管上的三路分路器 (d) 来完成的。从 PG 的一个细神经分支被切割和记录使用吸入电极。还显示了一个分支的 LSN 和三分支的 PN 加入 PG。a. 一个细神经投射到结肠的近端切口。b. 神经的远端切端吸入电极。c. 两个细神经投射到膀胱的切口末端。幸存者: 腰椎内脏神经, PN: 盆腔神经。B.代表结肠传入神经信号和腔内压力的痕迹。C.此神经的压力响应曲线的图。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。有代表性的电生理记录从一个分支的盆腔神经在斜坡扩张的前体内直肠.A.两个单单位 (WDR 和 LT 单元) 的响应模式, 以及在坡道扩张期间的多 mechanosensory 响应。B.记录的神经束的示意图。幸存者: 腰椎内脏神经, PN: 盆腔神经。C.两个单个单元的叠加波形。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。在5羟色胺和辣椒素的沐浴应用中, 来自盆腔神经分支的具有代表性的电生理记录.(左)10µM 5 羟色胺的应用 (右) 0.3 µM 辣椒素的应用。请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议是一个相对简单的实验方法来评估大鼠结肠传入的电生理特性。该协议 (从组织剥离到建立神经记录) 通常需要大约2小时才能完成。组织收集 (步骤 3) 和吸入电极 (步骤 5) 的制备是关键步骤。这是至关重要的, 能够找到 PG, LSN 和 PN, 并注意不要破坏神经节和神经组织解剖。玻璃吸管的尖端必须被打破和斜面到一个大小兼容的神经束。
该制剂通常是可行的几个小时, 允许研究的 mechanosensitivity, 敏感性, 和药理剖面的结肠传入神经。与 "平板" 准备11相比, 在这种方法中, 机械刺激是通过黏膜抚摸或周向伸展来进行的, 这种 "管子" 的制备方式允许坡道或分级扩张, 其应用类似于大肠扩张 (CRD) 在麻醉或清醒的动物, 以评估内脏疼痛。使用类似的协议, 永利et al.3研究了嘌呤受体对大鼠结肠传入 mechanosensory 转导的贡献, 发现结肠传入由 ATP (P2X 和 P2Y 激动剂) 和α、β-meATP (P2X 激动剂) 的浴应用激活。P2 受体拮抗剂可减弱扩张性盆腔传入放电。最近, 我们比较了正常和链脲佐菌素 (mechanosensory) 诱导的糖尿病大鼠结肠传入的反应。与对照组比较, 我们发现糖尿病大鼠 (3-6 周后) 多传入神经对前体结肠扩张的影响显著减少。mechanosensory 在结肠传入中的反应减少, 观察到体外与糖尿病组 CRD 的 visceromotor 反应 (VMR) 的衰减一致. 单单元分析表明, LT 和 WDR 纤维的 mechanosensitivity 损伤可能是糖尿病结肠4传入中的基础。使用类似的协议, 我们也成功地记录了从小鼠结肠传入和检测显着增加结肠传入兴奋性的 DSS 诱导的 IBD 老鼠 (未发表的观察)。
直肠支配由胸腰椎/下和腰骶/盆腔传入纤维1,2。这两组原发性传入可能在其功能特性上有很大差异, 可能会信号不同的结肠刺激质量14,15,16,17.目前的协议的一个重要优势是它的潜力, 比较研究下和盆腔传入的直肠。如图 1所示, 一个腰椎内脏 (下) 神经和 3-4 的 PN 分支通过主要 PG, 然后投射到降结肠和膀胱。我们注意到, PN 束的 mechanosensory 反应与 PG 神经远端的定性相似, 推测包含混合型腰椎内脏和盆腔传入。从技术上讲, 在 PG 附近放置两个吸入电极以同时记录 LSN 和 PN, 并评估它们对机械和化学刺激的反应是否不同, 这是非常可行的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
该议定书得到了中国国家自然科学基金 (#31171066、#81270464) 和中德科学中心 (GZ919) 的研究资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
