Summary
感覚機能の異常は、内臓の痛みや機能および炎症性腸病気の他の症状に基づいています。に備えて、前のヴィヴォラット大腸結腸求心性神経の電気生理学的記録のためのプロトコルを次に示します。
Abstract
大腸の感覚神経の機能不全は、いくつかの一般的な条件、機能と炎症性腸疾患、糖尿病などの病態に関与しています。ここでは、ラットの結腸求心性神経の電気生理学的特性の in vitro評価プロトコルについて述べる。アタッチすると、そのまま骨盤神経節 (PG) と、大腸がラット;隔 carbogenated 録音室でクレブス ソリューション膨満感を許可する口腔と肛門の端に ● キャニュレイテッド。PG から発せられる細かい神経束が識別され、吸引電極を用いたニューロン求心性神経活動が記録されます。大腸のセグメントの膨満は、ニューロンの放電の漸進的な増加を引き出します。主成分分析は、低閾値、高しきい値、広ダイナミック レンジの求心性線維を区別するために行われています。テスト混合物のバスタブまたは腔内投与による結腸求心性神経の化学物質過敏症を学ぶことができます。このプロトコルは、他の種、マウスやモルモットなどと正常で下行結腸の胸腰椎/下腹と腰仙部/骨盤求心性神経の電気生理学的特性の差異を検討するためにアプリケーションで変更できるし、病理学の条件。
Introduction
消化管 (GIT の)、豊かな中枢神経系に腸からの感覚信号を伝えることと、腸と脳との対話に貢献する外因性の求心性神経で支配されています。これらの外因性求心性神経の変更された興奮性および求心性入力の変更された中央処理内臓痛と機能と炎症性腸疾患1を含む GI 条件の他の症状に基づいています。大腸からの感覚情報は、主に胸腰椎/下腹と腰仙部/骨盤神経 (PN)2を通じて伝達されます。齧歯動物疾患モデルでこれらの一次求心性線維の電気生理学的性質の研究に関心の高まりがあった。しかし、齧歯動物で結腸求心性神経の電気生理学的記録体内は技術的な課題は、手術のかなりのスキルが必要です。さらに、血行動態、組織の動き、および麻酔薬も影響を与えます神経活動と体内の刺激テストする感度。したがって、近年、研究の増加する数は生体外で(前のヴィヴォ) 準備人間、モルモット、マウス、ラットなど種の結腸における感覚情報伝達のメカニズムを調べるを採用しました。求心性神経と病気の条件に変更された興奮性。3,4,5,6,7,8
前のヴィヴォ下部消化管手術の 2 種類が主に報告されている:「フラット シート」準備5,9,10 「チューブ」準備3,4。「フラット シート」マウス大腸準備のためビデオ プロトコルは、以前に発行された11をされています。このプロトコルはマウス大腸、pn) で接続、腰部の内臓神経 (LSN) は収穫と隔組織の商工会議所または。大腸は縦、切り開かれ、神経束は、パラフィン オイルが充填された記録のコンパートメントに拡張されます。モノポーラ プラチナ イリジウム電極を用いた神経活動が記録されます。プロトコルは個々 の求心性線維の受容野の同定のため公平な電気刺激によることができます。それは化学的刺激のアプリケーションだけでなく、異なる機械的刺激パラダイムのアプリケーションをローカライズする (例えば、焦点粘膜プロービングと円周方向引張)、求心性神経終末へ。神経は、組織室から別の部屋に拡張する必要があります、ので比較的長い; 添付の神経を維持する重要です。神経の正常解剖この方法に新しいものに問題が生じます。最近では、Nullensらは、マウスの腸と大腸セグメント12求心系の腸間膜の培養記録用ビデオ プロトコルを公開しました。この「チューブ」準備の添付腸間膜を持つ腸セグメントはそのままに、こうして傾斜膨満感と異なる化学物質の内、余分な内腔の管理を可能にする保持されます。組織の近くに置くことができる、吸引電極を用いた腸間膜神経が記録されますので、腸間膜神経は比較的短いにもかかわらず、求心性活動を記録できます。しかし、腸間膜神経が腸を支配する迷走神経および脊髄の求心性線維の混合集団の構成や胸腰椎下腹。腰部骨盤求心性神経は、このプロトコルで差別されることはできませんが大腸を刺激する.ここでは、そのままのページで「チューブ」大腸製剤を用いたラット結腸求心性神経の電気生理学的記録のための詳しいプロトコルを提案します。この方法は内臓腰椎の機能特性の評価ができる (下腹) と腰仙部骨盤求心性神経。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ここで報告した実験的なプロトコルは、動物倫理委員会の上海交通大学医学部 (# SYXK2013-0050) によって承認されているそのまま神経節と神経大腸の解剖。トランクは、この手法ではかなり経験豊富な人のため 15 分の最小値を取る。それ以降の電気生理学的記録のための組織の生存を確保するため、解剖を実行しながら深麻酔下で動物の生きているが、維持が必要です
。1 灌流液の準備とテスト混合物
- クレブス ソリューションの準備 5 L
- : 113 mM の NaCl、KCl、1.2 mM NaH 2 PO 4、1.2 mM MgSO 4、5.9 mM NaHCO 3、25 mM 1.2 mM CaCl 2。 と 11.5 mM グルコース。95% O 2 + 5% CO 2 ガス混合ソリューションを飽和させます。冷蔵庫の中に酸素のクレブスの ~ 500 mL をあらかじめ冷たい 。 必要に応じて、株式の
- 準備因数は化合物 (エタノールと 10 mM 5-ヒドロキシトリプタミン (セロトニン) 生理食塩水での 1 mM カプサイシン) をテストします。クレブス (お風呂用) 及び (腔内管理) 用生理食塩水のストックを最終濃度使用する直前に希釈します 。
2。記録電極の作製
- プル標準的なガラスから記録電極チューブ内部のフィラメント (1.5 mm 外径) 従来の電極の引き手を使用してなし。熱のための引き手設定を調整し、引き出し、引っ張られた電極のシャンクは 20 と 25 mm.
3。組織コレクション
- Anaesthetize ラット深くペントバルビ タール ナトリウム (80 mg/kg, i. p.) を使用します。
- 無菌性を確保しながらメスを使用して腹壁の正中切開を実行することによって腹腔内を公開します。腸と大腸を公開する他の組織は脇をプルします 。
- は、解剖顕微鏡の下で動物を配置します。慎重な郭清を左の PG を探し、PN とそれに参加する LSN を識別します。これらの神経の項から数ミリをカット
注: PG は大腸の交差点近くにあります。PG ( 図 1) を腰仙部脊髄および LSN プロジェクトから通常、3-4 PN 。
- は、直腸を公開する恥骨の骨をカットしました。大腸; 上記組織 (すなわち 膀胱等) を削除します。PG をそのまま残すように注意してください 。
- は、ペントバルビ タールの過量の静脈内注入によるラットを犠牲します。トランセクト コロン PG の上約 3 cm と鉗子を用いた動物から大腸を削除します 。
- は、予冷のクレブス液でいっぱいペトリ皿に大腸を転送します。糞便を削除するには、コロンを優しく洗浄します。残尿膀胱や他の組織を項を損なうことがなく、慎重に削除
4。結腸求心性神経の解剖
- 記録室 (20 mL) にコロンを配置し、carbogenated クレブス ソリューションを継続的に組織を灌流します。15 mL/分で灌流率を設定
- は、口腔と肛門の両端に大腸を cannulate します。アナル方向に口頭で 10 mL/h の速度で生理食塩水で結腸腔内注入を開始します 。
- は、解剖顕微鏡の下で主要な PG を探します。昆虫ピンを利用して、神経節を公開します。慎重な郭清を伴う神経神経節から発せられるとコロン ( 図 1) に向かって実行しているの良い枝を見つけます。神経節の近くに神経をカットします
。 注: 図 1 に示します、PG に末梢神経の枝からの録音神経おそらく骨盤と腰椎の内臓求心性線維が混在しています。PN や、PG に近位の LSN から録音が可能また、 - 熱浴と暖かい 34 ± 0.5 ° C でチャンバー内の温度を保つためにクレブス ソリューションをオン
5。吸引電極の作製
- 予ガラス ピペット (手順 2) を取るし、解剖顕微鏡の下で検査します。鉗子のペアで電極の先端を破る記録される神経の径と互換性のあるサイズのだ 。
- 軽くフレアの近くに配置することによって先端の面取りします 。
6。電気生理学的記録
- 接続電極ホルダーに斜め電極。10 mL のシリンジを電極に正または負の圧力を適用するホルダー側ポートに接続します 。
- ホルダーを bioamplifier のパッチアンプ用アダプターに接続し、マニピュレーターにパッチアンプ用アダプターをマウントします 。
- は、組織お風呂に電極を移動し、ホルダーの銀線接触するまで穏やかな吸引を適用することによってクレブス ソリューションと電極を入力します。神経の断端に近い電極を置き、電極に神経を吸うため否定的な圧力を適用します。否定的な圧力を適用して神経の 〜 1 mm の電極に引かれ、タイトなシールを形成します 。
- ターン bioamplifier とセットのフィルター 300 3,000 Hz。 オシロ スコープで信号を監視し、神経信号 (20 kHz のサンプリング レート) とスパイク データの処理にコンピューターを使用して管腔内圧力信号 (100 Hz サンプリング レート) を記録ソフトウェアします 。
7。結腸求心性感受性検定
継続的に intraluminally を注入しながらコンセント カニューレの 3 ウェイ タップを閉じることによってコロンの- 適用ランプ膨満。排水のカニューレに 3 ウェイ タップ オープン時 60 mmHg に到達するまでに内圧を監視します 。
- 15 分適用薬余分な - または求心性神経の化学物質過敏症をテストする intraluminally の一定の間隔でこの手順を繰り返します 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 1は、前のヴィヴォ「チューブ」大腸の準備に、PG に遠位神経から記録担当者と実験装置の模式図神経は、骨盤、腰椎の内臓求心性神経の混合物をおそらく含まれています。正常ラットから標本、結腸求心性神経は通常不規則な自発活動の低レベルを持ってください。コロンのランプを膨満感は、発火率 (図 1 b) の緩やかな増加を誘発します。それぞれの神経の機械刺激受容プロパティは、腔圧求心性神経応答曲線 (図 1) をプロットによって表されます。平均圧力応答曲線グループ間で比較することができます (すなわち、対コントロール治療) 治療が「栄ら結腸求心性神経の機械刺激受容プロパティを変更どうかを明らかにするには13圧力求心性応答曲線の詳細については)。
PN または LSN から録音が可能また、図に示すように、PG に質的バンドルの遠位のそれのような機械刺激受容応答を展示した PN バンドルから記録代表である図 2 、PG に近位1B. 主要神経信号の分析により、単一ユニットの活動を識別するため。判別共用シングル ユニットは、膨満感レスポンスのプロフィールによると高しきい値 (HT) 繊維、ワイド ダイナミック レンジ (WDR) 繊維、低閾値 (LT) 繊維に分類されます。LT ユニットは低膨圧で活性化し、発射速度約 20 mmHg で最大に達する。WDR ユニットも低膨圧に作動しているし、発火率は内圧が増加 (図 2 aおよびC) を増加し続けています。HT 台は膨圧で活性化 > 20 mmHg (東らを参照)4。
スパーフュー ジョン法 (浴適用) または管腔内注入によって結腸求心性神経の化学物質過敏症をテストできます。たとえば、0.3 μ M でカプサイシン誘発脱感作 (図 3) のための減らされた活動の期間が続いていた骨盤の求心性発射の堅牢な増加に対し、10 μ M 5 HT の風呂アプリケーションは緩やかな増加を発生します。
図 1。ラット結腸求心性神経の in Vitroの電気生理学的記録。A.ラットの前のヴィヴォ「チューブ」コロン準備の模式図。添付の PG で、大腸は、記録室で隔、両端 cannulated。腔内注入シリンジ ポンプを使用して実現され、口腔肛門方向に移動します。3 ウェイのタップ (d) アウトレット カニューレを閉じることによって大腸の膨満感が行われます。PG から細かい神経の枝は切り取って吸引電極を使用して記録が。LSN の支店と PG に参加する PN の 3 つの枝も表示されます。. 結腸に投影する細かい神経の近位断端。b. 神経の遠位断端は、電極に吸い込ま。c. 膀胱へ投影する 2 つの細かい神経の断端。LSN: 腰内臓神経、PN: 骨盤神経。B.大腸の求心性神経信号と管腔内の圧力の代表的な痕跡。C.この神経の圧力応答曲線のプロット。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。Ex Vivo大腸のランプを膨満感の中に骨盤神経の枝から代表的な電気生理学的記録。A.ランプ膨満中に機械刺激受容ニューロン応答と共に 2 つの単一ユニット (WDR および LT 単位) の応答パターン。B.記録されて神経束の模式図。LSN: 腰内臓神経、PN: 骨盤神経。C.は、2 つの単一ユニットの波形を重ね合わせた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。5 HT の風呂アプリケーションおよびカプサイシン時に骨盤神経の枝から代表的な電気生理学的記録。(左)10 μ M 5 のアプリケーション-HT。 (右) 0.3 μ m カプサイシンのアプリケーション。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで提示されたプロトコルは、ラットの結腸求心性神経の電気生理学的特性を評価するために比較的簡単な実験です。(神経記録を設定する組織郭清) からプロトコルを完了する約 2 時間がかかります。組織コレクション (ステップ 3) 吸引電極 (手順 5) の作成は、重要なステップ。PG、LSN、PN を特定し、組織解剖時に神経節と神経を損傷しないように注意することが重要です。ガラス ピペットの先端を壊れたし、神経束と互換性のあるサイズに傾斜する必要があります。
準備はいくつかの時間、通常実行可能な骨、抗癌剤感受性、および大腸の求心性神経の薬理学的プロファイルの研究を可能にします。「フラット シート」準備11、機械的刺激が粘膜をなでるまたは円周方向ストレッチを適用されていると比較してこの「チューブ」準備ランプは、または傾斜のアプリケーションと同様の方法で膨満感大腸の拡張 (CRD) 内臓の痛みを評価するために, 麻酔下または目がさめている動物。同様のプロトコル、ウィンらを使用してください。3ラット結腸求心系の機械刺激受容伝達するプリン受容体の貢献を学び、結腸求心性神経が ATP (P2X および P2Y アゴニスト) と α, β-meATP (P2X アゴニスト) のお風呂のアプリケーションがアクティブにことを発見膨満感による骨盤求心性放電は、P2 受容体拮抗薬によって減衰だった。最近では、我々 は結腸求心系のノーマルとストレプトゾトシン (STZ) の間の機械刺激受容応答を比較して-誘発糖尿病ラット。コロン コントロール群に比較して糖尿病ラット (STZ 投与後 3-6 週) でニューロン求心性神経、前のヴィヴォのランプを膨満感レスポンスの大幅な減少を見つけました。結腸求心性神経の減少機械刺激受容応答観察体外体内CRD 糖尿病群で弱毒観た (VMR) の応答と一致していた。シングル ユニットの分析示されるその障害骨 LT と WDR の繊維が糖尿病の大腸4求心性 hyposensitivity 根底にあります。同様のプロトコルを使用して、我々 はまた正常にマウスの結腸求心性神経から記録し、IBD の DSS 誘発マウス (未発表の観察) で大幅に増加した結腸求心性興奮性を検出します。
大腸は、胸腰椎/下腹と腰仙部/骨盤の求心性線維の1,2によって支配されています。それは一次求心性神経のこれらの 2 つのセットが機能のプロパティで大幅に異なる場合があります、大腸刺激14,,,151617 の異なる資質を信号が出てくる.現在のプロトコルの重要な利点は、その潜在的な大腸の下腹と骨盤の求心性を比較検討します。図 1に示すように、3-4、腰部の内臓 (下腹) 神経分枝 PN の主要な PG を通過し、下行結腸、膀胱にプロジェクトします。我々 は、PN バンドルの機械刺激受容応答は、PG の遠位の神経のおそらく含まれている混合の腰椎と骨盤内臓求心性神経に質的類似指摘しました。技術的には、LSN と PN を同時に記録するため、彼らは異なる機械的、化学的刺激に応答を評価する PG に近い 2 つの吸引電極を配置することは可能です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
このプロトコルは、国家自然科学基金、中国の (#31171066 #81270464) と中国とドイツ科学センター (GZ919) からの研究補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
