Summary
Función sensorial anormal subyacente visceral del dolor y otros síntomas de enfermedad intestinal inflamatoria y funcional. Aquí se presenta un protocolo para el registro electrofisiológico de los nervios aferentes colónicos en una preparación de colon ex vivo rata.
Abstract
Disfunción de los nervios sensoriales colónicas ha sido implicada en la fisiopatología de varias condiciones comunes, incluyendo la diabetes y las enfermedades de intestino inflamatorias y funcional. Aquí, describimos un protocolo para la caracterización en vitro de las propiedades electrofisiológicas de los aferentes de colon en ratas. El colon, con el ganglio pélvico intacto (PG) adjuntado, se retira de la rata; sobrefundido con carbogenated solución de Krebs en la sala de grabación; y canulado en los extremos orales y anales para permitir la distensión. Se identifica un paquete del nervio fino que emana de la PG, y la actividad reciente del nervio aferente se registra utilizando un electrodo de succión. Distensión del segmento colónico provoca aumentos graduales en descarga multiunit. Se realiza un análisis de componentes principales para diferenciar el bajo umbral, el umbral alto y las fibras aferentes de rango dinámico ancho. Sensibilidad química de los aferentes colónicos puede ser estudiada a través de la administración baño o intramural de prueba compuestos. Este protocolo puede modificarse para su aplicación a otras especies, tales como ratones y conejillos de Indias y para estudiar las diferencias en las propiedades electrofisiológicas de los aferentes hipogástrica/toracolumbar y lumbosacra pélvica del colon descendente en normal y condiciones patológicas.
Introduction
El tracto gastrointestinal (TGI) es ricamente inervado con nervios aferentes extrínsecos que trasmiten las señales sensoriales del intestino al sistema nervioso central y que contribuyen a la interacción del intestino-cerebro. Excitabilidad alterada de estos aferentes extrínsecas, así como procesamiento central alterada de las entradas aferentes, es la base visceral del dolor y otros síntomas de afecciones GI, incluyendo enfermedades de intestinos inflamatoria y funcional1. Información sensorial desde el colon se transmite principalmente a través de toracolumbar/hipogástrico y los nervios sacrolumbares pélvica (PN)2. Ha habido un creciente interés en el estudio de las propiedades electrofisiológicas de estas fibras aferentes primarias en modelos de roedores de la enfermedad. Sin embargo, en vivo grabaciones electrofisiológicas de los aferentes colon en los roedores es un desafío técnico y requiere considerables habilidades quirúrgicas. Además, cambios hemodinámicos, el movimiento de tejido y anestésicos también pueden afectar actividad del nervio y sensibilidad a la prueba estímulos en vivo. Por lo tanto, en los últimos años, un creciente número de estudios ha empleado en vitro (ex vivo) preparados de diferentes especies, incluyendo ratones, ratas, conejillos de Indias y los seres humanos, a examinar los mecanismos de transducción sensorial en colon aferentes y la excitabilidad alterada en condiciones de enfermedad. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Principalmente se han reportado dos tipos de ex vivo de colon preparación: la preparación de la "hoja plana"5,9,10 y el "tubo" preparación3,4. Un video protocolo para la preparación de colon murino "hoja plana" ha sido previamente publicado11. En el presente Protocolo, el colon de ratón, con el PN) o los nervios esplácnicos lumbares (LSN) Unidos, es cosechada y sobrefundido en una cámara de tejido. El colon es abrir longitudinalmente, y el paquete del nervio que se extiende en un compartimiento de grabación llenado de aceite de parafina. Actividad del nervio es registrada mediante un electrodo monopolar de platino-iridio. El protocolo permite la identificación de los campos receptivos de las fibras aferentes individuales mediante el uso de estimulación eléctrica imparcial. Localiza la aplicación de estímulos químicos, así como la aplicación de paradigmas de estimulación mecánica diferentes (por ejemplo, focal mucosa sondeo y estiramiento circunferencial), a las terminaciones nerviosas aferentes. Debido a que el nervio debe ampliarse a una cámara separada de la cámara de tejido, es crítico para mantener el nervio conectado relativamente largo; la disección exitosa de los nervios plantea un desafío a los nuevos a esta metodología. Más recientemente, Nullens et al. publicó un protocolo de vídeo para la grabación en vitro de los aferentes mesentéricas yeyunal murino y segmentos colónicos12. En la preparación de este "tubo", el segmento de intestino con el mesenterio Unido se mantiene intacto, lo que permite la distensión gradual y la administración intra y extra luminal de diferentes productos químicos. Puesto que el nervio del mesenterio se registra utilizando un electrodo de succión, que puede colocarse cerca del tejido, se puede grabar actividad aferente a pesar de que el nervio del mesenterio es relativamente corto. Sin embargo, el nervio de mesenterio consiste en poblaciones mixtas de fibras aferentes vagales y espinales que inervan el yeyuno o toracolumbar hipogástrica. Lumbosacra pélvicos aferentes inervan el colon, que no puede ser discriminado en el presente Protocolo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el registro electrofisiológico de aferentes colon de rata mediante la preparación de colon "tubo" con un PG intacto Este método puede permitir la caracterización de las propiedades funcionales de lumbar esplácnico (hipogástrica) y aferentes pélvico lumbosacra.
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Protocol
el protocolo experimental divulgado aquí ha sido aprobado por el Animal ético Comité de Shangai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). la disección del colon con intacto ganglio y el nervio tronco tiene un mínimo de 15 minutos para una persona de bastante experiencia en esta técnica. Por lo tanto es necesario mantener el animal vivo pero bajo anestesia profunda y realizar disecciones, para asegurar la viabilidad del tejido para posterior grabación electrofisiológica.
1. preparación de la solución de perfusión y compuestos de prueba
- preparar 5 L de solución de Krebs: 113 mM NaCl, KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM de MgSO 4, de 5,9 mM 25 mM NaHCO 3, 1,2 mM CaCl 2 y 11,5 mM de glucosa. Saturar la solución con un 95% O 2 + 5% CO 2 gas mezcla. Pre-enfriar ~ 500 mL de oxigenada Krebs en la nevera.
- Preparar alícuotas de stock prueba compuestos (capsaicina de 1 mM en etanol y 10 mM 5-hidroxitriptamina (5-HT) en solución salina) según sea necesario. Diluir el caldo en Krebs (para aplicación de baño) y en solución salina (para administración intraluminal) a la concentración final justo antes del uso.
2. Preparación del electrodo de grabación
- tire el electrodo de vidrio estándar de grabación tubos sin filamentos internos (1,5 mm de diámetro externo) utilizando un extractor de electrodo convencional. Ajustar la configuración del extractor de calor y tirar de modo que la caña de los electrodos tirados es entre 20 y 25 mm.
3. Colección de tejido
- anestesie la rata profundamente utilizando pentobarbital sódico (80 mg/kg, i.p.).
- Garantizando esterilidad, exponer la cavidad abdominal al realizar una incisión de línea media de la pared abdominal usando un bisturí. Tire el mesentery y otros tejidos a un lado para exponer la colon.
- Colocar el animal con el microscopio de disección. Mediante disección cuidadosa, localice la izquierda PG e identifique el PN y el LSN lo a. Cortar estos nervios unos milímetros de la pág.
Nota: El PG se encuentra cerca de la Unión colon. Por lo general, 3-4 PN de la médula lumbosacra y un proyecto LSN a PG ( figura 1). - Cortar el hueso sínfisis para exponer el recto. Eliminar los tejidos (es decir, vejiga urinaria, etc.) sobre el colon; Tenga cuidado de dejar intacta la PG.
- Sacrificio de la rata por la inyección intravenosa de una sobredosis de pentobarbital. Transecto de colon unos 3 cm por encima de la PG y quitar el colon del animal usando fórceps.
- Transferir el colon a una placa de Petri con solución de Krebs previamente enfriado. Eliminar las heces enjuagándolo suavemente el colon. Quitar la vejiga remanente y otros tejidos cuidadosamente, sin comprometer la pág.
4. Disección de los nervios aferentes colon
- el colon en una cámara de grabación (20 mL) y perfusión del tejido continuamente con carbogenated solución de Krebs. Ajustar la velocidad de perfusión en 15 mL/min
- Canule el colon en los extremos orales y anales. Comience la infusión intraluminal del colon con solución salina a razón de 10 mL por hora en oral anal dirección.
- Localizar la PG principal bajo el microscopio de disección. Utilizar insectos pasadores para exponer el ganglio. Con disección cuidadosa, encontrar una fina rama del nervio que emana desde el ganglio y corriendo hacia el colon ( figura 1). Cortar el nervio cerca del ganglio.
Nota: La figura 1 muestra una grabación de una rama del nervio distal a la PG El nervio contiene probablemente una mezcla de fibras aferentes esplácnicos pélvicas y lumbares. Alternativamente, se puede hacer una grabación de la PN o el LSN proximal a la pág. - A su vez en el baño de calor y caliente la solución de Krebs para mantener la temperatura de la cámara 34 ± 0.5 ° C.
5. Preparación del electrodo de succión
- tomar una pipeta de vidrio pre-tirado (paso 2) y examine bajo el microscopio de disección. Romper la punta del electrodo con un par de pinzas para que sea de un tamaño compatible con el diámetro del nervio a grabarse.
- La punta en bisel colocando cerca de una encendedor de la llamarada.
6. Grabación electrofisiológica
- Conecte el electrodo del electrodo al portaelectrodo biselado. Conecte una jeringa de 10 mL al puerto lateral en el soporte para aplicar presión positiva o negativa al electrodo de.
- Conecte el soporte a la headstage de la bioamplifier y montar el headstage en un manipulador de.
- Mover el electrodo hasta el baño del tejido y llenar el electrodo con la solución de Krebs aplicando una succión suave, hasta que toque el alambre de plata del titular. Coloque la punta del electrodo cerca del extremo cortado del nervio y aplicar presión negativa para succionar el nervio en el electrodo. Aplicar presión más negativa para que ~ 1 mm del nervio se tira en el electrodo y forma un sello apretado.
- Vuelta en el bioamplifier y el filtro de 300-3.000 Hz. monitorizar la señal en el osciloscopio y graba la señal del nervio (frecuencia de muestreo de 20 kHz) y la señal de presión intraluminal (frecuencia de muestreo de 100 Hz) utilizando un ordenador con un procesamiento de datos de punto software.
7. Determinar la sensibilidad aferente colon
- aplicar distensión de rampa del colon por cerrar el grifo de tres vías en la cánula de salida al mismo tiempo continuamente intraluminally. Monitorear la presión intramural hasta 60 mmHg, momento en el que abrir el grifo de tres vías en la cánula de drenaje.
- Repetir este procedimiento cada 15 minutos aplicar medicamentos adicionales o intraluminally para probar la sensibilidad química de los nervios aferentes.
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Representative Results
La figura 1 es la ilustración esquemática de la disposición experimental para la preparación de colon ex vivo "tubo", con un representante de la grabación de un nervio distal a la PG El nervio contiene probablemente una mezcla de aferentes esplácnicos pélvicos y lumbares. En preparaciones de ratas normales, los nervios aferentes colon suelen tienen un bajo nivel de actividad espontánea irregular. Distensión de la rampa del colon provoca un aumento gradual en la tasa de disparo (figura 1B). La propiedad de mechanosensory cada nervio está representada mediante el trazado de la curva de respuesta de nervio aferente de la presión intraluminal (figura 1). Curvas de respuesta a la presión promedio pueden ser comparadas entre los grupos (es decir, control versus tratados) para revelar si un tratamiento altera la propiedad de mechanosensory de los nervios aferentes colónicas (véase Rong et al. 13 para más detalles sobre la curva de respuesta presión aferente).
Alternativamente, se pueden hacer grabaciones de la PN o el LSN proximal a la pág. figura 2 es un representante de la grabación de un paquete PN que exhiben una respuesta de mechanosensory cualitativamente similar a la del paquete distal a la PG, se muestra en la figura de 1B. Principal análisis de componentes de la señal neuronal permite la identificación de la actividad de una sola unidad. Las unidades individuales discriminadas se clasifican como fibras de bajo umbral (LT), rango de nivel dinámico (WDR) fibras y fibras de alto umbral (HT), según los perfiles de las respuestas a la distensión. Unidades LT se activan a una presión de distensión bajo, y la tasa de disparo alcanza un máximo en cerca de 20 mmHg. Unidades WDR también se activan a una presión de distensión bajo, y la tasa de disparo sigue aumentando la presión intraluminal aumenta (figura 2A y C). Unidades de HT se activan a una presión de distensión > 20 mmHg (véase Dong et al.) 4.
La sensibilidad química de los aferentes colónicas puede ser probada por superfusion (aplicación de baño) o infusión intraluminal. Por ejemplo, la aplicación de baño de 10 μm 5-HT había causada un aumento modesto, mientras que la capsaicina de 0.3 μm evocados robusto aumenta en descarga aferente pélvica que fueron seguido por un período de disminución de la actividad debido a la desensibilización (figura 3).
Figura 1. Registro electrofisiológico de los nervios aferentes colon de rata In Vitro. A. una ilustración esquemática de la preparación de colon ex vivo "tubo" de la rata. El colon, con la página adjunta, es sobrefundido en la cámara de grabación y canulado en ambos extremos. Infusión intraluminal se consigue utilizando una bomba de jeringa y se mueve en el oral en dirección anal. Distensión del colon se efectúa cerrando la llave de tres vías (d) la cánula de salida. Una rama del nervio fino de la PG es corte y grabado con un electrodo de succión. También se muestra una rama de la LSN y tres ramas de la PN a la PG. a. el corte extremo proximal de un nervio fino proyectando a los dos puntos. b. el extremo cortado distal del nervio aspirado en el electrodo. c. el extremo cortado de dos nervios finos proyectando a la vejiga urinaria. LSN: nervios esplácnicos lumbares, PN: los nervios pélvicos. B. los rastros representativos de la presión colónica del nervio aferente señal e intramural. C. una parcela de la curva de respuesta a la presión de este nervio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Grabación electrofisiológica representativa de una rama de los nervios pélvicos durante la distensión de la rampa de la colon Ex Vivo . A. el patrón de respuesta de dos unidades (unidades WDR y LT), junto con la respuesta de mechanosensory reciente durante la distensión de la rampa. B. una ilustración esquemática del paquete del nervio que está grabando. LSN: nervios esplácnicos lumbares, PN: los nervios pélvicos. C. onda superpuestos de las dos unidades individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Representante grabación electrofisiológica de una rama de los nervios pélvicos durante la aplicación del baño de 5-HT y capsaicina. (Izquierda) Aplicación de 10 μm 5-HT (derecho) aplicación de capsaicina μm 0.3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo presentado aquí es un método experimental relativamente sencillo para determinar las propiedades electrofisiológicas de las aferentes colon de ratas. El protocolo (de disección del tejido para configurar la grabación de nervio) generalmente toma aproximadamente 2 horas para completar. Tejido (paso 3) y preparación de la toma de aspiración (paso 5) son los pasos críticos. Es crucial para poder localizar el PG, el LSN y el PN y tenga cuidado de no para dañar el ganglio y nervios durante la disección del tejido. La punta de la pipeta de vidrio debe ser rota y biselada a un tamaño compatible con el paquete del nervio.
La preparación es generalmente viable durante varias horas, permitiendo el estudio de la mechanosensitivity, la quimiosensibilidad y los perfiles farmacológicos de los nervios aferentes colorrectales. En comparación con la preparación de la "hoja plana"11, en que estímulo mecánico se aplica a través de la mucosa acariciando o estiramiento circunferencial, esta preparación de "tubo" permite la rampa o gradual distensión de una manera similar a la aplicación de distensión colorrectal (CRD) en animales anestesiados o despiertos para evaluar el dolor visceral. Utilizando un protocolo similar, Wynn et al. 3 estudiaron la contribución de los receptores purinérgicos en la transducción de mechanosensory de aferentes colon de rata y que colon aferentes se activaron por la aplicación del baño de ATP (P2X y P2Y agonista) y α, β-meATP (P2X agonista) y que descarga aferente pélvica inducida por la distensión fue atenuada por antagonistas de los receptores P2. Más recientemente, se compararon las respuestas de mechanosensory de aferentes colónicas entre normal y streptozotocin (STZ)-indujo ratas diabéticas. Encontramos una disminución significativa en las respuestas del nervio aferente reciente distensión de la rampa de la ex vivo de colon en ratas diabéticas (3-6 semanas después de la inyección de STZ) en comparación con las ratas control. La respuesta de mechanosensory disminución en aferentes colónicas observada en vitro era constante con una respuesta atenuada visceromotor (MPC) en vivo CRD en el grupo diabético. Análisis unitarios indicó que deteriorada mechanosensitivity de LT y WDR fibras pueden subyacer el hyposensitivity aferente en el diabético de colon4. Utilizando un protocolo similar, también con éxito había grabado de aferentes colónicos murinos y había detectado significativamente mayor excitabilidad aferente colon en los ratones de la enfermedad inflamatoria intestinal inducida por DSS (observaciones no publicadas).
El colon es inervada por toracolumbar/abdominal y sacrolumbar pélvica fibras aferentes de1,2. Se ve que estos dos conjuntos de los aferentes primarios pueden diferir considerablemente en sus propiedades funcionales y pueden señalar diferentes calidades de estímulos colon14,15,16,17 . Una ventaja importante del protocolo actual es su potencial para estudiar comparativamente los aferentes hipogástricos y pélvicos de la colon. Como se ilustra en la figura 1, un nervio (hipogástrico) esplácnico lumbar 3-4 ramas de la PN pasan a través de la Página principal y después del proyecto para el colon descendente y la vejiga urinaria. Observamos que la respuesta de mechanosensory del paquete PN fue cualitativamente similar a la que del nervio distal a la PG, que presumiblemente contenía mezclados aferentes esplácnicos y pélvicos lumbares. Técnicamente, es muy factible colocar dos electrodos de succión cerca de la PG para grabar de manera simultánea la LSN y el PN y evaluar si ellos responden de manera diferente a la estimulación mecánica y química.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este protocolo fue apoyado por becas de investigación de la Ciencia Natural la Fundación de China nacional (#31171066, #81270464) y el centro de Ciencias de China-alemán (GZ919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
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