Summary
Unormal sensoriske funktion bag viscerale smerter og andre symptomer på funktionelle og inflammatoriske tarmsygdomme. En protokol til den elektrofysiologiske optagelse af Colon afferente nerver i en ex vivo rotte colorectum forberedelse præsenteres her.
Abstract
Dysfunktion af Colon sensoriske nerver har været impliceret i Patofysiologi af flere fælles betingelser, herunder funktionelle og inflammatoriske tarmsygdomme og diabetes. Her, beskriver vi en protokol til in vitro- karakterisering af de elektrofysiologiske egenskaber af Colon afferenter i rotter. Colorectum, med den intakte bækken ganglion (PG) knyttet til, er fjernet fra rotte; superfused med carbogenated Krebs løsning i optagelse kammer; og kanylerede i de mundtlige og anal ender til giver mulighed for udspiling. Et fint nerve bundt stammer fra PG er identificeret, og den multiunit afferente nerve aktivitet registreres ved hjælp af en suge elektrode. Udspiling af Colon segmentet fremkalder gradvise stigninger i multiunit decharge. En principal komponent analyse er udført for at differentiere lav-tærskel, høj-tærskel og wide-dynamic range afferente fibre. Kemisk følsomhed af Colon afferenter kan studeres gennem bad eller intraluminal administrationen af testen forbindelser. Denne protokol kan ændres for anvendelse til andre arter, som mus og marsvin, og at studere forskellene i de elektrofysiologiske egenskaber af thoracolumbale/hypogastric og lumbosacral/bækken afferenter af den faldende kolon i normal og patologiske tilstande.
Introduction
Mave-tarmkanalen (GIT) er rigt innerveres med extrinsic afferente nerver at formidle sensoriske signaler fra tarmen til centralnervesystemet og at bidrage til den gut-hjerne interaktion. Ændrede ophidselse af disse ydre afferenter, samt ændrede centrale behandling af afferente indgange, ligger til grund for viscerale smerter og andre symptomer på GI betingelser, herunder funktionelle og inflammatoriske tarm sygdomme1. Sensorisk information fra colorectum formidles hovedsagelig gennem den thoracolumbale/hypogastric og lumbosacral/bækken nerver (PN)2. Der har været en øget interesse i at studere de elektrofysiologiske egenskaber af disse primære afferente fibre i gnavere sygdomsmodeller. Men, i vivo elektrofysiologiske optagelser af den Colon afferenter i gnavere er en teknisk udfordring og kræver betydelige kirurgiske færdigheder. Derudover kan hæmodynamiske ændringer, væv bevægelse og narkose også påvirke nerve aktivitet og følsomhed til at teste stimuli i vivo. Derfor, i de senere år et stigende antal studier har ansat i vitro (ex vivo) præparater af forskellige arter, herunder mus, rotter, marsvin og mennesker, til at undersøge mekanismerne af sensoriske transduktion i Colon afferenter og ændrede ophidselse i sygdomstilstande. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
To typer af ex vivo Colon forberedelse er primært blevet rapporteret: "flat-ark" forberedelse5,9,10 og "tube" forberedelse3,4. En video protokol for "flat-ark" murine colorectum forberedelse har været tidligere udgivet11. I denne protokol, mus-colorectum med PN) eller lumbal splanknisk nerver (LSN) fastgjort, er fældet og superfused i et væv kammer. Colorectum er skåret åben på langs, og nerve bundt er udvidet til en optagelse rum fyldt med paraffinolie. Nerve aktivitet registreres ved hjælp af en monopolære platinum-iridium elektrode. Protokollen giver mulighed for identifikation af de receptive felter af individuelle afferente fibre ved hjælp af uvildige elektrisk stimulation. Det lokaliserer anvendelsen af kemiske stimuli, samt anvendelse af forskellige mekaniske stimulation paradigmer (fx fokale slimhinde sondering og omkredsen stretch), at afferent nerveender. Fordi nerve skal udvides til at omfatte en separat kammer fra væv kammer, er det afgørende at holde den vedlagte nerve relativt lang; den succesfulde dissektion af nerverne udgør en udfordring for de nye til denne metode. For nylig, Nullens et al. offentliggjort en video protokol til in vitro- optagelse af den mesenteriallymfeknuderne afferenter i murine jejunal og Colon segmenter12. I denne "tube" forberedelse holdes gut segment med mesenterium knyttet intakt, således at for sorterede udspiling og intra - og ekstra-luminale administration af forskellige kemikalier. Da mesenterium nerve er registreret ved hjælp af en suge elektrode, som kan være placeret tæt på væv, kan afferente aktivitet registreres, selv om mesenterium nerve er forholdsvis kort. Dog mesenterium nerve består af blandede bestande af vagus og spinal afferente fibre, der innerverer jejunum eller thoracolumbale hypogastric. Lumbosacral bækken afferenter innerverer de colorectum, som ikke kan blive udsat for i denne protokol. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for den elektrofysiologiske optagelse af rotte Colon afferenter ved hjælp af "tube" colorectum forberedelse med en intakt PG. Denne metode kan give mulighed for karakterisering af de funktionelle egenskaber af lumbal splanknisk (hypogastric) og lumbosacral bækken afferenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
forsøgsplan rapporteret her er blevet godkendt af de dyre etiske udvalg af Shanghai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). dissektion af colorectum med intakt ganglion og nerve stammen tager mindst 15 minutter for en person, der er ret erfarne i denne teknik. Det er derfor nødvendigt at holde de dyr i live men under dyb anæstesi, mens udføre dissektioner, for at sikre levedygtigheden af væv til efterfølgende elektrofysiologiske optagelse.
1. forberedelse af Perfusion løsning og Test forbindelser
- forberede 5 L af Krebs løsning: 113 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO 3, 1,2 mM CaCl 2 , og 11,5 mM glukose. Mætte løsningen med en 95% O 2 + 5% CO 2 gasblandingen. Pre cool iltet Krebs i køleskabet ~ 500 mL.
- Forbered delprøver af stock teste forbindelser (1 mM capsaicin i ethanol og 10 mM 5-hydroxytryptamin (5-HT) i saltvand) efter behov. Fortyndes bestanden i Krebs (for bad ansøgning) og saline (for intraluminal administration) til den endelige koncentration lige før anvendelsen.
2. Forberedelse af optagelse elektrode
- Pull optagelse elektrode fra standard glas rør uden indre filamenter (1,5 mm ydre diameter) ved hjælp af en konventionel elektrode puller. Justere indstillingerne aftrækker for varme og træk, så skaft til trak elektroderne er mellem 20 og 25 mm.
3. Væv indsamling
- Anaesthetize rotte dybt ved hjælp af natrium pentobarbital (80 mg/kg, i.p.).
- Samtidig sikre sterilitet, udsætte bughulen ved at udføre en midterlinjen indsnit på bugvæggen ved hjælp af en skalpel. Trække mesenterium og andre væv udtaget til at afsløre colorectum.
- Placere dyret under dissekere mikroskop. Gennem omhyggelig dissektion, lokalisere den venstre PG og identificere PN og LSN sammenføjning det. Skære disse nerver et par millimeter fra PG.
Bemærk: PG ligger tæt på kolorektal krydset. Typisk 3-4 PN fra lumbosacral rygmarven og en LSN projekt til PG ( figur 1). - Skære symphysis knoglen for at udsætte endetarmen. Fjern væv (dvs., urinblæren, osv.) over colorectum; Vær forsigtig med at lade PG intakt.
- Ofre rotten ved intravenøs injektion af en overdosis af pentobarbital. Transekttællinger colon omkring 3 cm over PG og fjerne colorectum fra dyret ved hjælp af pincet.
- Overførsel af colorectum til en petriskål, fyldt med pre afkølede Krebs løsning. Fjern afføring ved forsigtigt skylle kolonet. Fjerner rest urinblæren og andre væv omhyggeligt, uden at kompromittere PG.
4. Dissektion af Colon afferente nerver
- sted i tyktarmen i en optagelse kammer (20 mL) og perfuse væv løbende med carbogenated Krebs løsning. Indstille perfusion sats på 15 mL/min.
- Kanyleres colorectum i både mundtlige og anal enderne. Start intraluminal infusion af tyktarmen med saltvand med en hastighed på 10 mL/h i mundtligt til anal retning.
- Find de store PG dissekere mikroskopet. Brug insekt pins til at udsætte ganglion. Med omhyggelig dissektion, finde en fin gren af nerve stammer fra ganglion og kører mod kolon ( figur 1). Skære nerve tæt på ganglion.
Bemærk: Figur 1 illustrerer en optagelse fra en nerve gren distale til PG. Nerven indeholder formentlig en blanding af bækken og lumbal splanknisk afferente fibre. Alternativt, en optagelse kan foretages fra PN og/eller LSN proksimalt for PG. - Tænd for varme badekar og varm Krebs løsning til at holde kammertemperaturen på 34 ± 0,5 ° C.
5. Forberedelse af sugning elektrode
- tage en pre trak glas pipette (trin 2) og inspicere det dissekere mikroskopet. Bryde spidsen af elektrode med et par pincet, så det er af en størrelse, der er kompatibel med diameteren af nerven der skal rekorderes.
- Facet spidsen ved at placere det tæt på en lettere flare.
6. Elektrofysiologiske optagelse
- Tilslut den skrå elektrode til elektrode indehaveren. Tilslut en 10-mL sprøjte til side porten på indehaveren at anvende negative eller positive pres på elektroden.
- Tilsluttes headstage af bioamplifier indehaveren og montere headstage på en manipulator.
- Flytte elektrode til væv bad og udfylde elektrode med Krebs løsning ved at anvende blide suge indtil det kontakter sølvtråd af indehaveren. Placer elektrode tip tæt snit af nerve og anvende negativt pres at sutte nerven i elektroden. Anvende mere undertryk, så ~ 1 mm af nerve er trukket ind i elektroden og danner en tæt forsegling.
- Tur på bioamplifier og sæt filteret til 300-3.000 Hz. overvåge signal på oscilloskopet og registrere nerve signal (20 kHz samplingfrekvens) og intraluminal pres signal (100 Hz samplingfrekvens) ved hjælp af en computer med en spike databehandling software.
7. Test af Colon afferente følsomhed
- Anvend rampe udspiling af tyktarmen ved at lukke de tre-vejs tap på outlet kanyle mens løbende infusion af intraluminally. Overvåge intraluminal pres, indtil den når 60 mmHg, hvorefter åbne tre-vejs tap på afdrypning kanylen.
- Gentag denne procedure med regelmæssige intervaller på 15 min. Anvend narkotika ekstra- eller intraluminally til at teste de afferente nerver kemisk følsomhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 er en skematisk illustration af eksperimentel opsætning for ex vivo "tube" colorectum forberedelse, med en repræsentant optagelse fra en nerve distale til PG. Nerven indeholdt formentlig en blanding af bækken og lumbal splanknisk afferenter. I præparater fra normale rotter har Colon afferente nerverne typisk et lavt niveau af uregelmæssig spontan aktivitet. Rampe udspiling af tyktarmen inducerer en gradvis stigning i fyring sats (figur 1B). Egenskaben mechanosensory for hver nerve er repræsenteret ved plotte intraluminal pres-afferente nerve responskurve (figur 1 c). Gennemsnit pres-respons-kurver kan sammenlignes mellem grupper (dvs. kontrol versus behandlet) til at afsløre, om en behandling ændrer egenskaben mechanosensory af Colon afferente nerver (Se Rong et al. 13 for detaljer på pres-afferente respons kurven).
Alternativt, optagelser kan foretages fra PN eller LSN proksimalt for PG. figur 2 er en repræsentant optagelse fra en PN bundle, der udstillet et mechanosensory svar kvalitativt svarer til den distale bundle til PG, vist i figur 1b. Principal komponent analyse af de neurale signal giver mulighed for identifikation af enkelt-enhed aktivitet. De forskelsbehandlede enkelt enheder er klassificeret som lav-tærskel (LT) fibre, wide-dynamisk omfang (WDR) fibre og høj-tærskel (HT) fibre, efter profiler af reaktionerne på udspiling. LT enheder er aktiveret på en lav udspiling pres, og fyring sats når et maksimum på ca. 20 mmHg. WDR enheder er også aktiveret på en lav udspiling pres, og fyring sats fortsætter med at stige som intraluminal trykket stiger (figur 2A og C). HT enheder er aktiveret på en udspiling pres > 20 mmHg (Se Dong et al.) 4.
Kemisk følsomhed af Colon afferenter kan testes ved superfusion (bad ansøgning) eller intraluminal infusion. For eksempel forårsaget bad anvendelsen af 10 µM 5-HT en beskeden stigning, mens capsaicin på 0,3 µM fremkaldte robust stigninger i bækken afferente decharge, der blev fulgt af en periode med nedsat aktivitet på grund af desensibilisering (figur 3).
Figur 1. Elektrofysiologiske optagelse af rotte Colon afferente nerver In Vitro. A. en skematisk illustration af ex vivo "tube" kolon forberedelse af rotten. Colorectum, med den vedlagte PG, er superfused i salen, optagelse og er kanylerede i begge ender. Intraluminal infusion er opnået ved hjælp af en sprøjte pumpe og flyttes til anal retning i mundtligt. Udspiling af tyktarmen sker ved at lukke tre-vejs hane (d) på outlet kanyle. En fin nerve gren fra PG er skåret og registreres ved hjælp af en suge elektrode. En gren af LSN og tre grene af PN tiltræder PG er også vist. en. den proksimale cut ende af en fin nerve projektering til tyktarmen. b. den distale afskårne ende af nerve suget ind elektrode. c. cut slutningen af to fine nerver projektering til urinblæren. LSN: lumbal splanknisk nerver, PN: bækken nerver. B. de repræsentative spor af Colon afferente nerve signal og intraluminal pres. C. et plot af pres-respons kurve af denne nerve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative elektrofysiologiske optagelse fra en gren af bækken nerver under rampe udspiling af Ex Vivo Colorectum. A. svar mønstret af to enkelt enheder (WDR og LT enheder), samt multiunit mechanosensory svar under rampe udspiling. B. en skematisk illustration af nerve pakke i at blive optaget. LSN: lumbal splanknisk nerver, PN: bækken nerver. C. overlejret bølgeform af de to enkelte enheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative elektrofysiologiske optagelse fra en gren af bækken nerver under bad anvendelsen af 5-HT og Capsaicin. (Venstre) Anvendelse af 10 µM 5-HT. (højre) anvendelse af 0,3 µM capsaicin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her er en forholdsvis ligetil Eksperimentel metode til at vurdere de elektrofysiologiske egenskaber af den Colon afferenter af rotter. Protokol (fra væv dissektion at opsætte nerve optagelse) tager normalt omkring 2 timer at fuldføre. Væv samling (trin 3) og forberedelse af de suge elektrode (trin 5) er de kritiske trin. Det er afgørende at kunne finde PG, LSN og PN og passe på ikke for at beskadige ganglion og nerver i løbet af væv dissektion. Spidsen af glas pipette skal brudt og skrå til en størrelse, der er kompatibel med nerve bundt.
Forberedelse er normalt levedygtige i flere timer, giver mulighed for undersøgelse af mechanosensitivity, for chemosensitivity og de farmakologiske profiler af kolorektal afferente nerver. Sammenlignet med den "flat-ark" forberedelse11, hvor mekanisk stimulation anvendes gennem slimhinden strøg eller omkredsen stretching, denne "tube" forberedelse giver mulighed for rampe eller sorterede udspiling i en måde, der svarer til anvendelsen af kolorektal udspiling (CRD) i bedøvede eller vågen dyr at vurdere viscerale smerter. Ved hjælp af en lignende protokol, Wynn et al. 3 studerede bidrag af purinergic receptorer til mechanosensory transduktion af rotte Colon afferenter og fundet at Colon afferenter blev aktiveret af Bad anvendelsen af ATP (P2X og P2Y agonist) og α, β-meATP (P2X agonist) og der udspilning-induceret bækken afferente decharge var svækket af P2 receptor antagonister. På det seneste har vi sammenlignet mechanosensory svar af Colon afferenter mellem normal og streptozotocin (STZ)-induceret diabetisk rotter. Vi fandt en betydelig nedgang i multiunit afferente nerve reaktioner på rampen udspiling af ex vivo kolon i diabetisk rotter (3-6 uger efter STZ injektion) i forhold til kontrol rotter. Nedsat mechanosensory svar i Colon afferenter observeret i in vitro var i overensstemmelse med en svækket visceromotor reaktion (VMR) til i vivo CRD i gruppen diabetisk. Single-enhed analyse viste at nedsat mechanosensitivity af LT og WDR fibre kan ligge til grund for den afferente hyposensitivity i diabetisk kolon4. Ved hjælp af en lignende protokol, vi også med held optaget fra murine Colon afferenter og påvist signifikant øget Colon afferente ophidselse i DSS-induceret IBD mus (upublicerede observationer).
Colorectum er innerveres af den thoracolumbale/hypogastric og lumbosacral/bækken afferente fibre1,2. Det viser sig, at disse to sæt af primære afferenter kan variere betydeligt i deres funktionelle egenskaber og kan være tegn på forskellige kvaliteter af Colon stimuli14,15,16,17 . En vigtig fordel af den nuværende protokol er dets potentiale til at forholdsvis studere hypogastric og bækken afferenter af colorectum. Som illustreret i figur 1, en lumbal splanknisk (hypogastric) nerve og 3-4 grene af PN passere gennem den store PG og derefter projekt til den faldende kolon og urinblæren. Vi bemærkede, at PN bundt mechanosensory reaktion var kvalitativt svarer til at af nerve distalt for PG, der formentlig indeholdt blandet lumbal splanknisk og bækken afferenter. Teknisk set er det meget muligt at placere to suge elektroder nær PG samtidig registrere LSN og PN og vurdere, om de reagerer forskelligt på mekaniske og kemiske stimulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne protokol blev støttet af forskningstilskud fra National Natural Science Foundation of China (#31171066, #81270464) og Sino-tysk Science Center (GZ919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
