Summary
비정상적인 감각 기능 내장 고통 및 다른 증상 기능 및 염증 성 대 장 질환의 기초. 프로토콜에는 비보 전 쥐 colorectum 저 승 구심 성 신경의 electrophysiological 녹음에 대 한 여기에 제공 됩니다.
Abstract
저 승 감각 신경의 기능 장애 이상 기능 및 염증 성 대 장 질환과 당뇨병을 포함 하 여 몇 가지 일반적인 조건에 연루 되었습니다. 여기, 우리가 쥐에 있는 저 승 afferents의 electrophysiological 속성 생체 외에서 특성에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그대로 골반 신경 절 (PG),와 함께 colorectum; 쥐에서 제거 carbogenated 녹음 실;에서 Krebs 솔루션으로 superfused 그리고 팽창 수 있도록 구강과 항문 끝 cannulated. PG에서 나오는 미세 신경 번들을 식별 하 고 multiunit 구심 성 신경 활동 흡입 전극을 사용 하 여 기록 됩니다. 저 승 세그먼트의 팽창 multiunit에 점진적 증가 elicits. 주성분 분석은 낮은 임계값, 높은 임계값 및 넓은 동적 범위 구심 섬유 차별화 위해 수행 됩니다. 저 승 afferents의 화학 감도 시험 화합물의 목욕 또는 intraluminal 관리를 통해 공부 될 수 있다. 이 프로토콜은 다른 종, 쥐, 기니 피그, 등과 정상에서 하강 콜론의 thoracolumbar/하복 및 lumbosacral/골반 afferents의 electrophysiological 속성의 차이 연구 하는 응용 프로그램에 대 한 수정할 수 및 병 적인 조건입니다.
Introduction
위장 지역 (GIT) 풍부한 외부 구심 성 신경 중앙 신 경계를 용기에서 감각 신호를 전달 하 고 창 자-두뇌 상호 작용에 기여 innervated입니다. 이러한 외부 afferents의 변경 된 흥분 뿐만 아니라 구심 성 입력의 변경 된 중앙 처리 기본 내장 고통 및 다른 증상 기를 포함 한 조건 기능과 염증 성 장 질환1. 감각 정보는 colorectum에서 주로 thoracolumbar/하복과 lumbosacral/골반 신경 (PN)2를 통해 전달 됩니다. 공부 하는 설치류 질병 모델에서 이러한 기본 구심 성 섬유의 electrophysiological 속성에 대 한 관심 증가 되었습니다. 그러나, 설치류에 저 승 afferents의 비보에 electrophysiological 녹음 기술 도전 이며 상당한 수술 기술이 필요 합니다. 또한, hemodynamic 변화, 조직 운동, 그리고 마 취약 떨어질 수 있습니다 또한 신경 활동과 감도 비보에자극 테스트를. 따라서, 최근 몇 년 동안, 연구의 증가 고용 체 외에서 (ex vivo) 준비의 다른 종, 포함 쥐, 쥐, 기니 피그, 및 인간, 저 승에서 감각 전달의 메커니즘을 검토 하 afferents와 질병 상태에서 변경 된 흥분입니다. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
두 가지 유형의 저 승 준비 비보 전 주로 보고 되었습니다: "플랫 시트" 준비5,,910 고 "튜브" 준비3,4. "플랫 시트" murine colorectum 준비를 위한 비디오 프로토콜11이전에 게시 되었습니다. 이 프로토콜은 PN과 마우스 colorectum), 요 추 splanchnic 신경 (LSN) 조직 챔버에 수확 하 고 superfused 또는. colorectum 경도, 오픈 절단 그리고 신경 번들 파라핀 기름을 가득 녹음 구획으로 확장 됩니다. 신경 활동 monopolar 백 금-이리듐 전극을 사용 하 여 기록 됩니다. 프로토콜 편견된 전기 자극을 사용 하 여 개별 구심 성 섬유의 수용 필드의 식별에 대 한 수 있습니다. 그것은 localizes 화학 자극의 응용 프로그램 뿐만 아니라 다른 기계적 자극 패러다임의 응용 프로그램 (예를 들어, 초점 점 막 프로 빙 및 원주 스트레치), 구심 신경 엔딩. 그것은 비교적 긴; 연결 된 신경 유지 하는 중요 한 신경 조직 약 실에서 별도 챔버를 확장 해야 합니다, 때문에 신경의 성공적인 절 개 그 도전이이 방법론에 새로운 포즈. 더 최근에, Nullens 그 외 여러분 murine jejunal에 저 승 세그먼트12mesenteric afferents의 생체 외에서 녹화를 위한 비디오 프로토콜을 출판. 이 "튜브" 준비에 연결 된 mesentery와 창 자 세그먼트 등급된 팽창 및 다른 화학 제품의 내부 및 추가 luminal 관리 되므로 그대로 유지 됩니다. Mesentery 신경 조직 가까이 배치 될 수 있습니다, 흡입 전극을 사용 하 여 기록 됩니다 이후 mesentery 신경은 상대적으로 짧은 하더라도 성의 활동을 기록할 수 있습니다. 그러나, mesentery 신경 자극 공장 vagal 및 척수 구심 섬유의 혼합된 인구 구성 또는 thoracolumbar 하복. Lumbosacral 골반 afferents 자극이 프로토콜에 차별 수 없습니다 colorectum. 여기, 선물이 electrophysiological 쥐 저 승 afferents "튜브" colorectum 준비는 그대로 페이지와 함께 사용 하 여 녹음에 대 한 자세한 프로토콜 이 방법은 splanchnic 요 추의 기능 특성의 특성에 대 한 수 있습니다 (하복) 및 lumbosacral 골반 afferents.
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Protocol
여기에서 보고 된 실험 프로토콜은 동물 윤리 위원회의 상하이 교통 대학의과 대학 (# SYXK2013-0050)에 의해 승인 되었습니다. 그대로 신경 절 및 신경 colorectum의 해 부 트렁크는이 기술에 아주 경험 있는 사람에 대 한 최소 15 분 걸립니다. 그것은 깊은 마 취 동물 살아 있지만 해 electrophysiological 기록에 대 한 조직의 생존을 보장 하기 위해 수행 하는 동안 유지 하는 데 필요한 따라서.
1. 관류 솔루션의 준비 및 시험 화합물
- 준비 5 L 크레브스 솔루션의: 113 mM NaCl, 5.9 m m KCl, 1.2 m m NaH 2 포 4, 1.2 m m MgSO 4, 25 m m NaHCO 3, 1.2 m m CaCl 2 , 및 11.5 m m 포도 당. 95% O 2 + 5% CO 2 가스 혼합 솔루션을 포화. 미리 냉장고에 산소 Krebs의 ~ 500 mL를 냉각.
- 준비 aliquots 재고의 필요에 따라 화합물 (에탄올과 10 m m 5-hydroxytryptamine (5-HT) 염 분에에서 1 mM capsaicin)를 테스트 합니다. 그냥 사용 하기 전에 최종 농도에 Krebs (목욕 용)와 염 분 (intraluminal 관리)에 대 한 재고 희석.
2. 기록 전극의 준비
- 표준 유리에서 기록 전극 없이 기존의 전극 끌어당기는 사람을 사용 하 여 내부 필 (1.5 m m 외부 직경) 튜브 풀. 열에 대 한 끌어당기는 설정을 조정 하 고 당기는 가져온된 전극의 칼 20 사이 25 m m.
3. 조직 컬렉션
- Anaesthetize 나트륨 pentobarbital (80 mg/kg, i.p.)를 사용 하 여 깊이 쥐.
- 무 균을 보장 하면서 메스를 사용 하 여 복 부 벽에 midline 절 개를 수행 하 여 복 부 구멍을 노출. mesentery 및 옆으로 colorectum를 폭로 다른 조직.
- 해 현미경 동물을 배치합니다. 조심 해 부를 통해 왼쪽된 PG 찾아서는 PN과 합류 하는 LSN을 식별 합니다. 이 신경은 페이지 멀리 몇 밀리미터 잘라
참고: PG 장 교차점에 가까운 속 인 다. 일반적으로 3-4 PN lumbosacral 척수 및 LSN 프로젝트에서 PG ( 그림 1)를. - 항문 노출 관절 뼈를 잘라. Colorectum; 위의 조직 (즉, 오 줌 방광, 등) 제거 PG를 그대로 조심.
- 는 Pentobarbital의 과다 복용의 정 맥 주입 하 여 쥐를 희생. 콜론 세 위에 약 3cm transect 고 집게를 사용 하 여 동물에서 제거 하는 colorectum.
- 사전 냉각된 Krebs 솔루션으로 가득 페 트리 접시에는 colorectum를 전송 합니다. 부드럽게 콜론을 플러시하는 배설물을 제거 합니다. 남은 오 줌 방광 및 다른 조직에 페이지를 손상 없이 신중 하 게, 제거
4. 저 승 구심 성 신경의 해 부
- 콜론 녹음 챔버 (20 mL)로 놓고 perfuse carbogenated Krebs 솔루션을 지속적으로 조직. 15 mL/분에서 관류 속도 설정
- 구강과 항문 끝에 colorectum cannulate. 염 분에서 항문 방향으로 구두 10 mL/h의 속도로 콜론의 intraluminal 주입 시작.
- 해 현미경 주요 PG를 찾습니다. 곤충 핀을 사용 하 여 노출 된 신경 절. 조심 해 부, 신경은 신경 절에서 유출 하 고 콜론 ( 그림 1)으로 실행의 좋은 지점을 찾을. 가까이 신경 절의 신경 절단.
참고: 그림 1에 나와 있는 페이지에 말 초 신경 지점에서 녹음 신경은 골반과 요 추 splanchnic 구심 성 섬유의 혼합물을 아마도 포함 되어 있습니다. 또는, 녹음은 PN 및 LSN 인접 하는 페이지에서 만들어질 수 있다 - 난방 목욕과 따뜻한 34 ± 0.5 ° c.에 챔버 온도 유지에 Krebs 솔루션 설정
5. 흡입 전극의 준비
- 미리 가져온된 유리 피 펫 (2 단계) 하 고 해 현미경 검사. 그것은 호환 기록 신경의 직경 크기의 집게의 쌍 전극의 팁을 부.
- 라이터 플레어 가까이 배치 하 여 팁을 경사.
6. Electrophysiological 녹음
- 연결 전극 홀더를 경사진된 전극. 측면 포트 전극에 부정적 또는 긍정적인 압력을 적용 하려면 소유자에 10 mL 주사기를 연결.
- 소유자는 bioamplifier의 headstage에 연결 하 고 조작자에 headstage를 탑재.
- 조직 목욕 전극 이동한 소유자의 실버 와이어 연결 될 때까지 부드러운 흡입을 적용 하 여 전극 Krebs 솔루션을 작성 합니다. 신경의 절단된 끝 가까이 전극 팁 놓고 신경 전극으로 빨 아 부정적인 압력을 적용 합니다. ~ 1 m m는 신경의 전극으로 당겨 하 고 단단한 물개를 형성 더 부정적인 압력을 적용.
- 회전 설정 필터 300 3000 Hz. 하 고 bioamplifier에 오실로스코프에 신호를 모니터링 하 고 기록 신경 신호 (20 kHz 샘플링 속도) 및 스파이크 데이터 처리와 컴퓨터를 사용 하 여 intraluminal 압력 신호 (100 Hz 샘플링 속도) 소프트웨어.
7. 저 승 성의 감도 테스트
지속적으로 intraluminally를 일으키는 동안 콘센트 정에 3 방향 탭을 닫아서 콜론의- 적용 램프 팽창. 그것에 도달할 때까지 60 mmHg, 오픈 시간에 배출 정에 3 방향 탭 intraluminal 압력 모니터링.
- 15 분 적용 약물 추가-또는 intraluminally의 구심 성 신경 화학 감도 테스트를 정기적으로이 절차를 반복.
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Representative Results
그림 1 은 비보 전 "튜브" colorectum 준비는 페이지에 말 초 신경에서 기록 하는 대표에 대 한 실험적인 체제의 구조 그림 신경은 아마도 골반과 요 추 splanchnic afferents의 혼합물을 포함. 정상 쥐에서 준비, 저 승 구심 성 신경은 일반적으로 불규칙 한 자발적인 활동의 저수준이 있다. 콜론의 램프 팽창 발사 속도 (그림 1B)에 있는 점진적 증가 유도합니다. 각 신경의 mechanosensory 속성은 intraluminal 압력 구심 신경 응답 곡선 (그림 1C)를 그려서 표시 됩니다. 평균된 압력-응답 곡선 그룹 사이 비교 될 수 있다 (즉, 제어 대 취급) 여부는 치료 (참조 룽 외. 저 승 구심 성 신경의 mechanosensory 속성을 변경 하는 것을 13 압력 성의 응답 곡선에 대 한 자세한 내용은).
또한, 녹화는 PN 또는 LSN에서 만들어질 수 있다 인접 하는 페이지는 그림 2 페이지, 그림에에서 표시 된 원심 번들의 질적으로 유사한 mechanosensory 응답을 전시 하는 PN 번들에서 녹음 대표 1B. 주 신경 신호 구성 요소 분석 단일 단위 활동의 식별에 대 한 수 있습니다. 분간된 단일 단위 팽창에 대 한 응답의 프로필에 따라 낮은 임계값 (LT) 섬유, 넓은 동적 범위 (WDR) 섬유, 그리고 높은 임계값 (HT) 섬유로 분류 됩니다. LT 단위 낮은 팽창 압력에 활성화 되 고 발사 속도 약 20 mmHg에서 최대에 도달. WDR 단위는 또한 낮은 팽창 압력에 활성화 되 고 발사 intraluminal 압력 증가 (그림 2A 와 C) 증가 하 고는. HT 단위 팽창 압력에 활성화 된다 > 20 mmHg (동 외.참조) 4.
저 승 afferents의 화학 감도 superfusion (목욕 응용 프로그램) 또는 intraluminal 주입에 의해 테스트할 수 있습니다. 예를 들어 10 µ M 5-HT의 목욕 응용 0.3 µ M에서 capsaicin 갖는 둔감 (그림 3) 때문에 감소 활동의 기간에 선행 되었다 골반 입성에 강력한 증가 하는 반면 겸손 한 증가 발생 합니다.
그림 1입니다. 쥐 저 승 구심 성 신경에 체 외에서의 electrophysiological 기록. A. 는 쥐의 비보 전 "튜브" 콜론 준비의 회로도 그림. 연결 된 페이지와 colorectum superfused 녹음 실에서 이며 양쪽 끝에 cannulated. Intraluminal 주입 주사기 펌프를 사용 하 여 달성 되 고는 구강에서 항문 방향으로 이동. 콜론의 팽창 콘센트 정에 3 방향 탭 (d)를 폐쇄 하 여 영향 이다. PG에서 좋은 신경 분기 잘라내어 흡입 전극을 사용 하 여 기록. LSN의 분기 및 합류 PG PN의 3 분기도 표시 됩니다. 가. 콜론으로 프로젝션 잘 신경의 근 위 컷된 끝. b. 신경의 원심 컷된 끝 전극에 빨려. c. 방광에 투영 두 잘 신경의 절단된 끝. LSN: 요 추 splanchnic 신경, PN: 골반 신경. B. 자취 저 승 구심 성 신경 신호 및 intraluminal 압력의 대표. C. 이 신경의 압력 응답 곡선의 줄거리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. Ex Vivo Colorectum의 램프 팽창 하는 동안 골반 신경의 지점에서 대표적인 Electrophysiological 녹음. A. 두 단일 단위 (WDR 및 LT 단위), 경사로 팽창 하는 동안 multiunit mechanosensory 응답 함께 응답 패턴입니다. B. 기록 되 고 신경 다발의 도식 적인 그림. LSN: 요 추 splanchnic 신경, PN: 골반 신경. C. 단일 단위의 두 가지 파형 겹쳐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 5-HT 목욕 애플리케이션과 Capsaicin 동안 골반 신경의 지점에서 대표적인 Electrophysiological 녹음. (왼쪽) 10 µ M 5의 응용 프로그램-HT. (오른쪽) 0.3 µ M capsaicin의 응용 프로그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 제시 된 프로토콜 쥐의 저 승 afferents의 electrophysiological 속성을 평가 하기 위해 비교적 간단한 실험 방법입니다. (신경 녹음을 설정 하 고 조직 해 부)에서 프로토콜 일반적으로 완료 하는 데 약 2 시간 걸립니다. 조직 컬렉션 (3 단계) 및 흡입 전극 (5 단계)의 준비는 중요 한 단계가 있습니다. 그것은 PG, LSN와 PN 주의 하지 신경 절 및 신경 조직의 해 부 동안에 손상 수 있을 중요 합니다. 유리 피 펫의 끝은 깨진 고 크기 신경 다발과 호환을 입체 해야 합니다.
준비는 일반적으로 실행 가능한 몇 시간 동안은 mechanosensitivity, chemosensitivity, 및 대 장 구심 성 신경의 약리 프로필의 연구에 대 한. "플랫 시트" 준비11, 기계적 자극 점 막 쓰 다듬어 또는 원주 스트레칭 통해 적용에 비해이 "튜브" 준비 램프에 대 한 허용 또는 팽창의 응용 프로그램에 유사한 방식으로 등급 내장 통증을 평가 하기 위해 마 취 또는 깨어 동물에서 대 장 팽만 (CRD). 사용 하 여 비슷한 프로토콜, 윈 외. 3 쥐 저 승 afferents mechanosensory 변환에 purinergic 수용 체의 기여를 공부 하 고 저 승 afferents ATP (P2X, P2Y 주 작동 근)와 α, β-meATP (P2X 주 작동 근)의 목욕 응용 프로그램에 의해 활성화 되었다 발견 팽창 유발 골반 구심 방전 P2 수용 체 길 항 근에 의해 감쇠 했다. 최근에, 우리는 보통 및 streptozotocin (STZ) 사이 저 승 afferents의 mechanosensory 응답 비교-당뇨병 쥐를 유도. 우리 제어 쥐에 비해 당뇨병 쥐 (STZ 주입 후 3-6 주)에서 콜론은 ex vivo의 램프 팽창 multiunit 구심 성 신경 응답에 상당한 감소를 발견. 저 승 afferents에서 감소 mechanosensory 응답 관찰 생체 외에서 vivo에서 CRD 당뇨병 그룹에서 하는 감쇠 visceromotor 응답 (VMR)와 일치 했다. 단일 단위 분석 표시는 장애인된 mechanosensitivity LT 및 WDR의 섬유 당뇨병 콜론4성의 hyposensitivity 기초가 될 수 있습니다. 유사한 프로토콜을 사용 하 여, 우리 또한 성공적으로 murine 저 승 afferents에서 기록 하 고 DSS 유도 IBD 쥐 (관찰 되지 않은)에서 크게 증가 저 승 성의 흥분을 감지.
colorectum thoracolumbar/하복과 lumbosacral/골반 구심 섬유1,2에 의해 innervated입니다. 이 두 기본 afferents 그들의 기능적 속성에 크게 다를 수 있습니다 고 저 승 자극14,,1516,17의 다른 자질을 신호 수 있습니다 나온다 . 현재 프로토콜의 중요 한 장점은 비교적 하복 및 골반 afferents는 colorectum의 연구 잠재력 이다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 허리 splanchnic (하복) 신경, 3-4 가지는 PN의 주요 PG을 통과 다음 내림차순 결 장 및 방광에 프로젝트. 우리는 PN 번들의 mechanosensory 응답은 질적으로 유사한 하는 PG에 말 초 신경의 어떤 아마도 포함 된 혼합된 요 추 및 골반 splanchnic afferents 지적 했다. 기술적으로, 그것은 매우 PG 동시에 PN LSN을 기록 하 고 그들은 다르게 기계적, 화학적 자극에 응답을 평가 하기 위해 근처 두 흡입 전극 배치 가능 합니다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
이 프로토콜은 국가 자연 과학 재단의 중국 (#31171066, #81270464)와 중국-독일어 과학 센터 (GZ919)에서 연구 보조금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
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