Summary
Unormal sensoriske funksjonen ligger under visceral smerter og andre symptomer av funksjonelle og inflammatorisk tarm sykdommer. En protokoll for elektrofysiologiske innspillingen av colonic afferente nerver i en ex vivo rotte colorectum-forberedelse er presentert her.
Abstract
Dysfunksjon av colonic sensoriske nerver har vært innblandet i Patofysiologien ved flere vanlige betingelser, inkludert funksjonelle og inflammatorisk tarm sykdommer og diabetes. Her beskriver vi en protokoll for i vitro karakterisering av elektrofysiologiske egenskapene colonic afferente i rotter. Colorectum, med det intakt bekken ganglion (PG) knyttet, fjernes fra rotta; superfused med carbogenated Krebs løsning i innspillingen kammeret; og cannulated i muntlig og anal endene å tillate distensjon. En fin nerve bunt kommer fra PG er identifisert, og multiunit afferente nerve aktiviteten er registrert ved hjelp av et inntaks elektroden. Distensjon av colonic segmentet utløser gradvis økning i multiunit utslipp. En viktigste komponenten analyse er gjennomført for å skille lavterskeltilbud, høy-terskelen og bred drivkraft omfang afferente fibrene. Kjemisk sensitivitet colonic afferente kan studeres gjennom badekar eller intraluminal administrasjonen av testen forbindelser. Denne protokollen kan endres for andre arter, som mus og marsvin, og å studere forskjeller i egenskapene elektrofysiologiske thoracolumbar/hypogastric og lumbosacral/bekken afferente i synkende tykktarmen i normal bruk og patologiske forhold.
Introduction
Fordøyelsessystemet (GIT) er rikt innerveres med ytre afferente nerver som formidle sensoriske signaler fra tarmen til sentralnervesystemet og som bidrar til gut-hjerne samhandling. Endret excitability av disse ytre afferente og endret sentral behandling av afferente innganger, ligger under visceral smerter og andre symptomer på GI betingelser, inkludert funksjonelle og inflammatorisk tarm sykdommer1. Sensoriske informasjonen fra colorectum formidles primært gjennom den thoracolumbar/hypogastric og lumbosacral/bekken nerver (PN)2. Det har vært en økt interesse i å studere elektrofysiologiske egenskapene til disse primære afferente fibrene i gnager sykdom modeller. Men i vivo elektrofysiologiske opptak colonic afferente i gnagere er en teknisk utfordring og krever betydelig kirurgiske ferdigheter. I tillegg kan hemodynamic endringer, vev bevegelse og bedøvelse også påvirke nerve aktivitet og følsomheten å teste stimuli i vivo. Derfor de siste årene, har et økende antall studier ansatt i vitro (ex vivo) forberedelser av ulike arter, inkludert mus, rotter, marsvin og mennesker, å undersøke mekanismer for sensorisk signaltransduksjon i colonic afferente og endret excitability under sykdom forhold. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
To typer ex vivo colonic forberedelse primært er rapportert: "flat ark" forberedelse5,9,10 og "rør" forberedelse3,4. En video protokoll "flat ark" murine colorectum forberedelse er tidligere utgitt11. I denne protokollen, mus-colorectum, med PN) eller lumbal splanchnic nerver (LSN) knyttet, er høstet og superfused i en vev kammer. Colorectum er kuttet åpne langs og nerve bunt er utvidet til et opptak rom fylt med parafinolje. Nerve aktivitet registreres ved hjelp av en monopolar platina-iridium elektrode. Protokollen tillater identifikasjon av feltene mottakelig for individuelle afferente fiber ved hjelp av upartiske elektrisk stimulering. Det regionaliserer bruk av kjemiske stimuli og anvendelse av ulike mekanisk stimulering paradigmer (f.eks fokal mucosal undersøkelser og omkrets strekk), til afferente nerve avslutninger. Fordi nerve utvides til en separat kammer fra vev kammer, er det avgjørende å holde vedlagte nerve relativt lang; den vellykkede Disseksjon av nerver utgjør en utfordring for de ny til denne metodikken. Flere nylig, Nullens et al. publisert en video protokoll for in vitro -opptak hvem afferente i murine jejunal og colonic segmenter12. I denne "rør" forberedelse holdes gut segmentet med mesentery knyttet intakt, slik at for gradert distensjon og intra - og ekstra-luminal administrasjonen av ulike kjemikalier. Siden mesentery nerve er registrert ved hjelp av et inntaks elektrode, som kan plasseres nær vevet, kan afferente aktivitet registreres selv om mesentery nerve er relativt kort. Men mesentery nerve består av blandet bestander av vagal og spinal afferente fibre som innervate jejunum eller thoracolumbar hypogastric. Lumbosacral bekken afferente innervate colorectum, som ikke kan bli diskriminert i denne protokollen. Her presenterer vi en detaljert protokoll for elektrofysiologiske innspillingen rotte colonic afferente "rør" colorectum utarbeidelse med en intakt PG. Denne metoden kan for karakterisering av funksjonelle egenskaper lumbale splanchnic (hypogastric) og lumbosacral bekken afferente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
eksperimentell protokollen rapporterte her er godkjent av det dyr etiske komité i Shanghai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). Disseksjon av colorectum med intakt ganglion og nerve bagasjerommet tar minst 15 minutter for en person som er ganske erfaren i denne teknikken. Det er derfor nødvendig å holde dyr i live men under dyp anestesi mens utføre disseksjoner, for å sikre levedyktighet av vev for påfølgende elektrofysiologiske opptak.
1. forberedelse av perfusjon løsning og Test forbindelser
- forberede 5 L Krebs løsning: 113 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 1.2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO 3, 1.2 mM CaCl 2 , og 11,5 mM glukose. Mette løsningen med en 95% O 2 + 5% CO 2 gassblanding. Pre cool ~ 500 mL oksygenrikt Krebs i kjøleskapet.
- Forberede dele lager teste forbindelser (1 mM capsaicin i etanol og 10 mM 5-hydroxytryptamine (5-HT) i saltvann) etter behov. Fortynne aksjen Krebs (for bad programmet) og saltvann (for intraluminal administrasjon) til den endelige konsentrasjonen bare før å bruke.
2. Utarbeidelse av opptak elektroden
- trekk opptak elektroden fra standard glass rør uten indre filamenter (1,5 mm ytre diameter) ved hjelp av en konvensjonell elektrode avtrekker. Justere avtrekker for varme og dra slik at skaft av trakk elektrodene er mellom 20 og 25 mm.
3. Vev samling
- Anaesthetize rotta dypt med natrium pentobarbital (80 mg/kg, IP).
- Samtidig sterilitet, utsette bukhulen ved å utføre en midtlinjen snitt på bukveggen ved hjelp av en skalpell. Trekk til mesentery og andre vev av å avsløre colorectum.
- Plasser dyret under dissecting mikroskop. Gjennom forsiktig disseksjon, Finn venstre PG og identifisere PN og LSN bli den. Kutte disse nervene noen millimeter unna s.
Merk: PG ligger nær colorectal krysset. Vanligvis 3-4 PN lumbosacral ryggmargen og et LSN-prosjekt til side ( figur 1). - Kuttet symphysis bein å avsløre endetarmen. Fjerne vev (dvs. urinblæren, etc.) over colorectum; Pass på å forlate PG intakt.
- Ofre rotta for intravenøs injeksjon av en overdose av pentobarbital. Mudderbunn kolon ca 3 cm over PG og fjerne colorectum fra dyret ved hjelp av pinsett.
- Overføring av colorectum til en Petriskål fylt med pre-avkjølt Krebs løsning. Fjerne avføring av mildt rødme kolon. Fjerne rest urinblæren og andre vev nøye, uten at s.
4. Disseksjon av Colonic afferente nerver
- plasserer kolon i en innspilling kammer (20 mL) og perfuse vev kontinuerlig med carbogenated Krebs løsning. Angi perfusjon hastigheten på 15 mL/min.
- Cannulate colorectum i både muntlig og anal endene. Starte intraluminal infusjonen av kolon med saltvann med en hastighet på 10 mL/t i muntlig anal retning.
- Finn store PG under dissecting mikroskop. Bruk insekt pinner for å avsløre ganglion. Med forsiktig disseksjon, finne en fin gren av nerve kommer fra ganglion og kjører mot kolon ( figur 1). Kutte nerve nær ganglion.
Merk: Figur 1 illustrerer en innspilling fra en nerve gren distale til PG. Nerve antagelig inneholder en blanding av bekken og lumbar splanchnic afferente fibre. Eventuelt et opptak gjøres fra PN og/eller LSN proksimale til s. - Slå på varme bad og varm Krebs løsningen å holde kammertemperaturen på 34 ± 0,5 ° C.
5. Utarbeidelse av sugekraft elektroden
- ta en pre trakk glass pipette (trinn 2) og inspisere det under dissecting mikroskop. Bryte spissen av elektroden med en tang slik at det er et omfang diameteren på nerve til å registreres.
- Skråkant spissen ved å plassere den nær en lettere fakkel.
6. Elektrofysiologiske opptak
- Koble skrå elektroden til elektrodeholderen. Koble en 10 mL sprøyte siden porten på innehaver å legge negative eller positive trykk elektroden.
- Koble holderen til headstage av bioamplifier og montere headstage på en manipulator.
- Flytte elektroden til vev badekaret og fyll elektroden med Krebs løsningen ved å bruke skånsom før det kontakter sølv wire av holderen. Plassere elektroden nær det kutte slutten av nerve og bruke negative trykket å suge nerve i elektroden. Bruk negative trykk slik at ~ 1 mm i nerve trekkes inn elektroden og danner en tett forsegling.
- Tur på bioamplifier og sett filteret til 300-3000 Hz. overvåke signal på oscilloskop og registrere nerve signalet (20 kHz samplingsfrekvens) og intraluminal press signalet (100 Hz samplingsfrekvens) bruker en datamaskin med en topp databehandling programvare.
7. Testing Colonic afferente følsomheten
- Bruk rampen distensjon i tykktarmen ved å lukke treveis Trykk på uttak kanyle under infusjonen kontinuerlig intraluminally. Overvåke intraluminal presset til den når 60 mmHg, da åpne treveis Trykk på drenering kanyle.
- Gjenta dette med jevne mellomrom 15 min. Bruk narkotika ekstra - eller intraluminally å teste kjemisk følsomhet av afferente nerver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 er skjematisk illustrasjon av eksperimentelle oppsettet for ex vivo "rør" colorectum utarbeidelse, med en representant for innspilling fra en nerve distale til PG. Nerve antagelig inneholdt en blanding av bekken og lumbale splanchnic afferente. I preparater fra vanlig rotter har colonic afferente nervene vanligvis et lavt nivå av uregelmessig spontan aktivitet. Rampen distensjon i tykktarmen induserer en gradvis økning i brenning hastighet (figur 1B). Egenskapen mechanosensory for hver nerve er representert ved plotting intraluminal press-afferente nerve svar kurven (figur 1 c). Gjennomsnitt press-svar kurver kan sammenlignes mellom grupper (dvs. kontroll versus behandlet) å avsløre om en behandling endrer egenskapen mechanosensory for colonic afferente nerver (se Rong et al. 13 for detaljer om trykk-afferente respons kurve).
Alternativt opptak gjøres fra PN eller LSN proksimale til s. figur 2 er en representant innspilling fra en PN bunt som utstilt mechanosensory svar kvalitativt lik som bunten distale til side, vises i figur 1B. viktigste komponenten analyse av neural signal gir mulighet for identifisering av enheter aktivitet. Diskriminert enkelt enhetene er klassifisert som lavterskel (LT) fiber, bred drivkraft omfang (WDR) fiber og høy-terskel (HT) fibre, ifølge profiler av svar distensjon. LT enheter aktiveres ved lav distensjon trykk, og brenning hastighet når maksimalt 20 mmHg. WDR enheter aktiveres også ved lave distensjon trykk og brenning hastighet fortsetter å øke som intraluminal trykket øker (figur 2A og C). HT enheter aktiveres ved distensjon trykk > 20 mmHg (se Dong et al.) 4.
Kjemisk følsomhet colonic afferente kan testes ved superfusion (bad programmet) eller intraluminal infusjon. For eksempel forårsaket bad anvendelsen av 10 µM 5-HT en beskjeden økning, mens capsaicin på 0,3 µM utløste robust økningen i bekken afferente utslipp som ble etterfulgt av en periode med redusert aktivitet på grunn av desensitization (Figur 3).
Figur 1. Elektrofysiologiske opptak av rotte Colonic afferente nerver In Vitro. A. en skjematisk illustrasjon av ex vivo "rør" kolon utarbeidelse av rotte. Colorectum, med den tilknyttede sider, er superfused i innspillingen kammeret og er cannulated i begge ender. Intraluminal infusjon oppnås ved hjelp av en sprøytepumpe og beveger seg i muntlig anal retning. Distensjon i tykktarmen er tegnet ved å lukke treveis trykk (d) på uttak kanyle. En fin nerve gren fra PG er kuttet og registrert ved hjelp av et inntaks elektroden. En gren av LSN og tre grener av PN med PG vises også. en. proksimale kutt slutten av en fin nerve prosjektering til tykktarmen. b. den kutte distale nerve sugd inn elektroden. c. det kutte slutten av to fine nerver prosjektering til urin blæren. LSN: lumbale splanchnic nerver, PN: bekken nerver. B. representant spor av den colonic afferente nerve signaler og intraluminal. C. et plott av press-svar kurven av denne nerve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representant elektrofysiologiske opptak fra en gren av bekken nervene under rampen distensjon av Ex Vivo Colorectum. A. svaret mønster av to single enheter (WDR og LT enheter), sammen med multiunit mechanosensory svaret under rampen distensjon. B. en skjematisk illustrasjon av nerve bunten registreres. LSN: lumbale splanchnic nerver, PN: bekken nerver. C. Superimposed bølgeform til de to eneste enhetene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representant elektrofysiologiske opptak fra en gren av bekken nervene under bad anvendelse av 5-HT og Capsaicin. (Venstre) Anvendelse av 10 µM 5-HT. (høyre) av 0,3 µM capsaicin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen presenteres her er relativt enkelt eksperimentell metode for å vurdere elektrofysiologiske egenskapene colonic afferente rotter. Protokollen (fra vev disseksjon oppsett nerve innspillingen) tar vanligvis ca 2 timer å fullføre. Vev samling (trinn 3) og utarbeidelse av inntaks elektroden (trinn 5) er viktige skritt. Det er viktig å kunne finne PG, LSN og PN og ta vare ikke for å skade ganglion og nervene under vev disseksjon. Spissen av glass pipette må være brutt og skrå til en størrelse som er kompatibel med nerve bunten.
Forberedelsene er vanligvis levedyktig i flere timer, muliggjør studiet av mechanosensitivity, chemosensitivity og farmakologiske profiler av colorectal afferente nerver. Sammenlignet med den "flat ark" forberedelse11, som mekanisk stimulering brukes gjennom mucosal strøk eller omkrets stretching, denne "rør" forberedelse gir rampe eller gradert distensjon på samme måte som å innlede colorectal distensjon (CRD-fil) i bedøvet eller våken dyr å vurdere visceral smerte. Bruke en lignende protokoll, Wynn et al. 3 studerte bidrag av purinergic reseptorer til mechanosensory signaltransduksjon rotte colonic afferente og fant at colonic afferente ble aktivert ved bad anvendelse av ATP (P2X og P2Y Agonistiske) og α, β-meATP (P2X Agonistiske) og at oppblåsthet-indusert bekken afferente utslipp ble oppveid av P2 reseptor antagonister. Nylig vi sammenlignet mechanosensory svarene colonic afferente mellom normal og streptozotocin (STZ)-indusert diabetiker rotter. Vi fant en signifikant nedgang i multiunit afferente nerve svar å rampen distensjon av den ex vivo kolon i diabetiker rotter (3-6 uker etter STZ injeksjon) sammenlignet med kontrollen rotter. Redusert mechanosensory svaret i colonic afferente observert i vitro var i samsvar med en dempes visceromotor respons (VMR) i vivo CRD i gruppen diabetiker. Enheter analyse indikerte at svekket mechanosensitivity LT og WDR Fibre kan ligger i afferente hyposensitivity i diabetiker kolon4. Bruker en lignende protokoll, vi også lykkes innspilt fra murine colonic afferente og oppdaget betydelig økt colonic afferente excitability i DSS-indusert IBD mus (upubliserte observasjoner).
Colorectum er innerveres av den thoracolumbar/hypogastric og lumbosacral/bekken afferente fiber1,2. Det framgår at disse to settene primære afferente kan variere betydelig i deres funksjonelle egenskaper og kan tyde på ulike kvaliteter colonic stimuli14,15,16,17 . En viktig fordel med gjeldende protokollen er dens potensial relativt studere hypogastric og bekkenet afferente av colorectum. Som illustrert i figur 1, en lumbale splanchnic (hypogastric) nerve og 3-4 grener av PN passerer gjennom den store PG og da prosjektet synkende tykktarmen og urinblæren. Vi bemerket at mechanosensory svar PN bunten var kvalitativt lik at av nerve distale til PG, som antagelig inneholdt blandet lumbale splanchnic og bekkenet afferente. Teknisk, det er svært mulig å plassere to sugekraft elektroder nær PG samtidig opp LSN og PN og vurdere om de reagerer forskjellig på mekanisk og kjemisk stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklære noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne protokollen ble støttet av forskningsmidler fra National Natural Science Foundation av Kina (#31171066, #81270464) og Sino-tysk Science Center (GZ919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
