Summary
Anormale sensorische Funktion zugrunde liegt, viszerale Schmerzen und andere Symptome von funktionellen und entzündlichen Darmerkrankungen. Ein Protokoll für die elektrophysiologische Aufzeichnung der Kolon afferenten Nerven in eine ex Vivo Ratte Colorectum Vorbereitung wird hier vorgestellt.
Abstract
Dysfunktion des Kolon Sinnesnerven hat in der Pathophysiologie von mehreren gemeinsamen Bedingungen, einschließlich funktionelle und entzündliche Darmerkrankungen und Diabetes verwickelt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die in Vitro Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon Afferenzen in Ratten. Die Colorectum mit der intakten Becken Ganglion (PG) angeschlossen, wird aus der Ratte entfernt; unterkühlte mit Carbogenated Krebs-Lösung in der Aufnahme-Kammer; und Kontrolle an den oral- und Analsex enden, um Blähungen zu ermöglichen. Eine feine Nervenbündel aus PG wird identifiziert, und die multiunit afferenten Nerven-Aktivität ist mit einer Saug-Elektrode aufgenommen. Distension des Segments Kolon entlockt allmählichen Anstieg multiunit Entlastung. Eine Hauptkomponentenanalyse wird durchgeführt, um die niedrigschwellige, die hohe Schwelle und die weiten Dynamikbereich afferenten Fasern zu unterscheiden. Chemischen Empfindlichkeit des Kolon Afferenzen kann durch die Badewanne oder Intraluminal Gabe von Testverbindungen untersucht werden. Dieses Protokoll kann geändert werden, für die Anwendung auf andere Arten, wie Mäuse und Meerschweinchen und die Unterschiede in den elektrophysiologischen Eigenschaften des Kopf/Unterbauch und lumbosakralen/Becken-Afferenzen des absteigenden Dickdarms in Normal zu studieren und pathologischen Zuständen.
Introduction
Der Magen-Darm-Trakt (GIT) ist reich mit extrinsischen afferenten Nerven innerviert, zu vermitteln, dass sensorische Signale aus dem Bauch heraus auf das zentrale Nervensystem und der Darm-Hirn-Interaktion beitragen. Veränderte Erregbarkeit des diese extrinsischen Afferenzen sowie veränderte zentrale Verarbeitung der afferenten Eingänge zugrunde liegt, viszerale Schmerzen und andere Symptome der GI-Bedingungen, einschließlich der Funktions- und entzündliche Darm-Erkrankungen-1. Sensorischer Informationen aus dem Colorectum vermittelt in erster Linie durch die Kopf/Unterbauch und lumbosakralen/Beckennerven (PN)2. Es wurde ein erhöhtes Interesse an einem Studium der elektrophysiologischen Eigenschaften dieser primären afferenten Fasern in Nagetier Krankheitsmodelle. Jedoch in Vivo elektrophysiologische Aufnahmen von Kolon Afferenzen bei Nagern ist eine technische Herausforderung und erfordert erhebliche chirurgische Fähigkeiten. Darüber hinaus können hämodynamischen Veränderungen, Gewebe Bewegung und Anästhetika auch Nerven-Aktivität und die Sensibilität für Reize in Vivozu testen auswirken. Daher haben in den letzten Jahren eine wachsende Zahl von Studien in Vitro (ex Vivo) Vorbereitungen der verschiedenen Arten, darunter Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und Menschen, zu prüfen, die Mechanismen der sensorischen Transduktion in Colon eingesetzt Afferenzen und die veränderte Erregbarkeit in Krankheitsbildern. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
In erster Linie zwei Arten von ex-Vivo Kolon Vorbereitung gemeldet wurden: die "Flat-Blatt" Vorbereitung5,9,10 und die "Tube" Vorbereitung3,4. Ein video Protokoll für die "Flat-Blatt" murinen Colorectum Vorbereitung wurde bisher erschienen11. In diesem Protokoll, die Maus Colorectum mit der PN) oder lumbale splanchnic Nerven (LSN) angeschlossen, wird geerntet und unterkühlte in einer Gewebe-Kammer. Die Colorectum ist längs aufschneiden und das Nervenbündel erstreckt sich in einem Aufnahme-Fach mit Paraffin-Öl gefüllt. Nerven-Aktivität ist eine monopolare Elektrode Platin-Iridium mit aufgenommen. Das Protokoll ermöglicht die Identifikation der rezeptiven Felder der einzelnen afferenten Fasern mittels unvoreingenommenen elektrischen Stimulation. Es lokalisiert, die Anwendung von chemischen reizen, sowie die Anwendung der verschiedenen mechanischen Stimulation Paradigmen (z.B. fokale Schleimhaut sondieren und umlaufenden Stretch), zu den afferenten Nervenendigungen. Weil der Nerv zu einer separaten Kammer aus der Gewebe-Kammer erweitert werden muss, ist es wichtig, den beigefügten Nerv relativ lange zu halten; die erfolgreiche Dissektion der Nerven stellt eine Herausforderung für die neue dieser Methodik. In jüngerer Zeit, Nullens Et Al. ein video Protokoll für die in-vitro- Aufnahme des mesenterialen Afferenzen in murinen Jejunal und Kolon Segmente12veröffentlicht. In dieser Zubereitung "Röhre" wird der Darm-Segment mit dem Mesenterium befestigt intakt, wodurch für abgestufte Blähungen und der Intra- und Extra-luminalen Verwaltung verschiedener chemischer Stoffe gehalten. Da die Mesenterium Nerven aufgezeichnet wird mit einer Absaugung Elektrode, die in der Nähe des Gewebes positioniert werden kann, kann afferenter Aktivität erfasst werden, obwohl der Mesenterium Nerv relativ kurz ist. Jedoch der Mesenterium Nerv besteht aus gemischten Populationen von vagalen und spinalen afferenten Fasern, die das Jejunum innervieren oder Kopf Unterbauch. Lumbosakralen Becken-Afferenzen innervieren die Colorectum, die in diesem Protokoll kann nicht diskriminiert zu werden. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur elektrophysiologischen Erfassung der Ratte Kolon Afferenzen mit der "Tube" Colorectum Vorbereitung mit einer intakten PG. Diese Methode kann für die Charakterisierung der funktionalen Eigenschaften der Lendenwirbelsäule splanchnic (Unterbauch) und lumbosakralen Becken-Afferenzen.
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Protocol
der experimentelle Protokoll berichtet hier genehmigt wurde, indem das Tier ethischen Ausschuss der Shanghai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). das Sezieren von Colorectum mit intakten Ganglion und Nerven Stamm dauert mindestens 15 Minuten für eine Person in dieser Technik erfahren. Es ist daher notwendig, um das Tier lebendig aber Tiefe Narkose während Sezierungen, um die Lebensfähigkeit des Gewebes für nachfolgende elektrophysiologische Aufnahme gewährleistet.
1. Vorbereitung der Perfusion Lösung und Testverbindungen
- bereiten 5 L Krebs Lösung: 113 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM Nahco3 3, 1,2 mM CaCl 2 , und 11,5 mM Glukose. Die Lösung mit 95 % O 2 + 5 % CO 2-Gas-Gemisch zu sättigen. ~ 500 mL Sauerstoff Krebs im Kühlschrank Vorkühlen.
- Vorbereiten Aliquote des Bestandes testen Verbindungen (1 mM Capsaicin in Ethanol und 10 mM 5-Hydroxytryptamine (5-HT) in Kochsalzlösung) nach Bedarf. Den Bestand im Krebs (für Bad Anwendung) und in Kochsalzlösung (für Intraluminal Verwaltung) auf die Endkonzentration nur vor Gebrauch verdünnen.
2. Vorbereitung der Aufnahme Elektrode
- ziehen die Aufnahme Elektrode aus Standardglas ohne innere Filamente (1,5 mm Außendurchmesser Rohre) mit einem herkömmlichen Elektrode Abzieher. Passen Sie die Einstellungen der Abzieher für Wärme und ziehen, so dass der Schaft der gezogenen Elektroden zwischen 20 und 25 mm.
3. Gewebe-Sammlung
- betäuben die Ratte tief mit Natrium-Pentobarbital (80 mg/kg, i.p.).
- Während der Sterilität zu gewährleisten, setzen die Bauchhöhle durch ausführen einen Mittellinie Einschnitt auf der Bauchdecke mit einem Skalpell. Ziehen Sie das Mesenterium und anderen Geweben beiseite, die Colorectum verfügbar zu machen.
- Legen Sie das Tier unter dem sezierenden Mikroskop. Lokalisieren Sie durch sorgfältige Präparation der linken PG und zu identifizieren Sie, die PN und die LSN beitreten. Schneiden Sie diese Nerven ein paar Millimeter vom PG
Hinweis: Die PG liegt in der Nähe der kolorektalen Kreuzung. In der Regel 3-4 PN aus der lumbosakralen Rückenmark und ein LSN-Projekt in den PG ( Abbildung 1). - Schneiden die After Knochen um den Mastdarm freizulegen. Entfernen Sie das Gewebe (z.B. Harnblase, etc.) über die Colorectum; die PG intakt lassen.
- Die Ratte durch die intravenöse Injektion einer Überdosierung von Pentobarbital Opfern. Transekt Dickdarm ca. 3 cm oberhalb der PG und dem Colorectum aus das Tier mit einer Pinzette entfernen.
- Übertragen die Colorectum auf einer Petrischale mit vorgekühlten Krebs-Lösung gefüllt. Entfernen Sie den Kot von sanft Spülung des Dickdarms. Entfernen Sie die Überbleibsel der Harnblase und anderen Geweben vorsichtig, ohne Kompromisse bei dem PG.
4. Dissektion der Kolon afferenten Nerven
- legen Sie den Doppelpunkt in einer Aufnahme Kammer (20 mL) und das Gewebe ständig mit Carbogenated Krebs Lösung durchspülen. Die Perfusion Rate auf 15 mL/min eingestellt
- Cannulate die Colorectum an den oral- und Analsex enden. Beginnen Sie die Intraluminal Infusion des Dickdarms mit Kochsalzlösung mit einer Rate von 10 mL/h in der Oral bis anal Richtung.
- Finden Sie die wichtigsten PG unter dem sezierenden Mikroskop. Verwenden Sie Insekten Stifte, um das Ganglion verfügbar zu machen. Finden Sie mit sorgfältiger Präparation eine feine Verzweigung der Nerven, die aus dem Ganglion und läuft auf den Dickdarm ( Abbildung 1). Schneiden Sie die Nerven in der Nähe des Ganglion.
Hinweis: Abbildung 1 zeigt eine Aufnahme von einem distalen Nerv Zweig auf dem PG. Der Nerv enthält vermutlich eine Mischung aus Becken- und Lendenbereich splanchnic afferenten Fasern. Alternativ kann eine Aufnahme aus der PN und/oder die LSN proximal zu PG hergestellt werden - Schalten Sie die Heizung Bad und Warm die Krebs-Lösung, die Temperatur bei 34 ± 0,5 ° c zu halten
5. Vorbereitung der Saug-Elektroden
- nehmen Sie eine Pre-gezogenem Glas-Pipette (Schritt 2) und unter dem sezierenden Mikroskop zu inspizieren. Die Spitze der Elektrode mit einer Zange zu brechen, so dass es kompatibel mit dem Durchmesser des Nervus aufzuzeichnende Größe.
- Abschrägung die Spitze indem man es in der Nähe von leichter Blendenflecken.
6. Elektrophysiologische Aufnahme
- Connect die abgeschrägte Elektrode der Elektrodenhalter. Verbinden Sie eine 10-mL-Spritze mit der Seitenanschluss auf dem Halter für negativen oder positiven Druck auf die Elektrode.
- Den Inhaber an der Headstage von den Bioamplifier anschließen und montieren Sie die Headstage auf einem Manipulator.
- Verschieben die Elektrode in das Gewebe Bad und füllen Sie die Elektrode mit der Krebs-Lösung durch sanfte Saugwirkung anwenden, bis es den Silberdraht des Inhabers in Kontakt. Legen Sie die Elektrodenspitze in der Nähe das abgeschnittene Ende des Nervs und negativen Druck, den Nerv in der Elektrode zu saugen. Negativeren Druck ausüben, so dass ~ 1 mm des Nervs in der Elektrode gezogen wird und einen dichten Abschluss bildet.
- Turn auf der Bioamplifier und der Filter auf 300-3.000 Hz. das Signal auf dem Oszilloskop aufzeichnen und das Nervensignal (20 kHz Sampling-Rate) und das Intraluminal Drucksignal (100-Hz-Sampling-Rate) von einem Computer mit eine Spike-Datenverarbeitung Software.
7. Die Darmspülung afferenten Empfindlichkeit testen
- anwenden Rampe Distension des Dickdarms durch den Dreiwege Hahn an der Steckdose Kanüle während der Infusion kontinuierlich Intraluminally schließen. Überwachung des Intraluminal Drucks bis 60 MmHg, zu welchem Zeitpunkt offen den Dreiwege Hahn an der Entwässerung Kanüle erreicht.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang in regelmäßigen Abständen von 15 min. anwenden Drogen extra- oder Intraluminally, die chemische Empfindlichkeit der afferenten Nerven zu testen.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus Vorbereitung Colorectum ex Vivo "Tube" mit einem Vertreter, die Aufnahme von einem distalen Nerv auf dem PG. Der Nerv enthalten vermutlich eine Mischung aus Becken- und Lendenbereich splanchnic Afferenzen. In Zubereitungen aus normalen Ratten haben Kolon afferenten Nerven in der Regel eine geringe unregelmäßige spontane Aktivität. Rampe Distension des Darms bewirkt einen allmählichen Anstieg der Feuerrate (Abbildung 1 b). Die Mechanosensory-Eigenschaft des einzelnen Nerv wird durch Plotten der Intraluminal Druck-afferenten Nerven-Response-Kurve (Abbildung 1) dargestellt. Gemittelten Druck-Wirkungs-Kurven zwischen den Gruppen verglichen werden können (z. B. Kontrolle versus behandelt) zu erkennen, ob eine Behandlung die Mechanosensory-Eigenschaft des Kolon afferenten Nerven verändert (siehe Rong Et Al. 13 für Details über die Druck-afferenten Response-Kurve).
Alternativ können Aufnahmen aus der PN oder die LSN hergestellt werden proximal zu PG Abbildung 2 ist ein Vertreter, die Aufnahme von einem PN-Bündel, das eine Mechanosensory Antwort qualitativ ähnlich wie das distale Bundle in den PG, dargestellt in Abbildung ausgestellt 1 b. wichtigste Komponente Analyse des neuronalen Signals ermöglicht die Identifikation von Monoblock-Aktivität. Diskriminierten Einzeleinheiten werden als niedrigschwellige (LT) Fasern, Wide Dynamic Range (WDR) Fasern und hoch-Schwelle (HT) Fasern, nach den Profilen der Reaktionen auf Distension klassifiziert. LT-Einheiten werden mit einem niedrigen Distension Druck aktiviert, und die Feuerrate erreicht ein Maximum bei ca. 20 MmHg. WDR-Einheiten werden auch bei einem niedrigen Distension Druck aktiviert, und die Feuerrate weiterhin zunehmender Intraluminal Druck (Abb. 2A und C) zu erhöhen. HT-Einheiten werden mit einem Distension Druck aktiviert > 20 MmHg (siehe Dong Et Al.) 4.
Die chemische Empfindlichkeit des Kolon Afferenzen kann von Superfusion (Bad Anwendung) oder Intraluminal Infusion getestet werden. Zum Beispiel verursacht die Bad-Anwendung von 10 µM 5-HT eine moderate Erhöhung während Capsaicin bei 0,3 µM robusten Anstieg der Becken-afferenten Entlastung hervorgerufen, die einen Zeitraum von verminderte Aktivität durch Desensibilisierung (Abbildung 3) folgten.
Abbildung 1. Elektrophysiologische Aufnahme der Ratte Kolon afferenten Nerven In Vitro. A. eine schematische Darstellung der ex Vivo "Röhre" Doppelpunkt Vorbereitung der Ratte. Die Colorectum mit dem beigefügten PG ist in der Aufnahme-Kammer unterkühlte und ist an beiden Enden kanülierte. Intraluminal Infusion erfolgt über eine Spritzenpumpe und bewegt sich in die Oral anal Richtung. Distension des Darms erfolgt durch schließen den Dreiwege Hahn (d) an der Steckdose-Kanüle. Ein feinen Nerven Zweig von PG wird geschnitten und mit einer Saug-Elektrode aufgenommen. Ein Zweig der LSN und drei Zweige der Beitritt der PG PN werden ebenfalls angezeigt. eine. das proximale Ende der Schnitt eines feinen Nerven projiziert auf den Dickdarm. b. Schnitt Distalende des Nervs in der Elektrode gesaugt. c. das abgeschnittene Ende des zwei feine Nerven, die Projektion auf die Harnblase. LSN: lumbale splanchnic Nerven, PN: Beckennerven. B. die repräsentative Spuren des Kolon afferenten Nerven Signal und Intraluminal Drucks. C. ein Grundstück von der Druck-Wirkungs-Kurve von dieser Nerv. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Repräsentative elektrophysiologische Aufnahme aus einem Ast der Beckennerven während Rampe Distension der Ex Vivo Colorectum. A. das Antwort-Muster aus zwei einzelnen Einheiten (WDR und LT-Einheiten), sowie die multiunit Mechanosensory Stellungnahme während der Rampe Distension. B. eine schematische Darstellung der das Nervenbündel aufgezeichnet. LSN: lumbale splanchnic Nerven, PN: Beckennerven. C. überlagert Wellenform der beiden einzelnen Einheiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Repräsentative elektrophysiologische Aufnahme aus einem Ast der Beckennerven während der Bad-Anwendung von 5-HT und Capsaicin. (Links) Anwendung von 10 µM, 5-HT. (Recht) Anwendung von 0,3 µM Capsaicin. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll ist ein relativ einfach experimentelle Methode, um die elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon Afferenzen von Ratten zu beurteilen. Das Protokoll (von Gewebe Dissektion zum Einrichten der Nerv-Aufnahme) dauert in der Regel ca. 2 Stunden in Anspruch. Gewebe-Sammlung (Schritt 3) und Vorbereitung der Saug Elektrode (Schritt 5) sind die entscheidenden Schritte. Es ist entscheidend, PG, LSN und die PN zu finden und kümmern sich nicht um das Ganglion und Nerven während Gewebe Dissektion beschädigen können. Die Glas-Pipettenspitze muss gebrochen und auf eine Größe, die kompatibel mit der Nervenbündel abgeschrägt.
Die Vorbereitung ist in der Regel lebensfähig für mehrere Stunden, so dass für die Untersuchung von der Mechanosensitivity, der Chemosensitivität und die pharmakologische Profile der kolorektalen afferenten Nerven. Im Vergleich mit dem "Flat-Blatt" Vorbereitung11, in der mechanischen Stimulation durch Schleimhaut streicheln oder umlaufende dehnen angewendet wird diese "Röhre" Vorbereitung ermöglicht eine Rampe oder geordnetes Distension in gewissem Sinne ähnlich wie bei der Anwendung der kolorektalen Distension (CRD) bei narkotisierten oder wach Tieren viszerale Schmerzen zu beurteilen. Verwenden ein ähnliches Protokoll, Wynn Et al. 3 untersucht den Beitrag der Purinergic Rezeptoren an den Mechanosensory Transduktion von Ratte Kolon Afferenzen und festgestellt, dass Darmspülungen Afferenzen von der Bad-Anwendung des ATP (P2X und P2Y Agonist) und α, β-MeATP (P2X-Agonist), aktiviert wurden Ausdehnung-induzierte Becken-afferenten Entlastung wurde von P2-Rezeptor-Antagonisten abgeschwächt. In jüngerer Zeit, verglichen wir die Mechanosensory Reaktionen der Kolon Afferenzen zwischen normalen und Streptozocin (STZ)-diabetische Ratten induziert. Wir fanden eine signifikante Abnahme der multiunit afferenten Nerven Antworten auf Rampe Distension des ex-Vivo Doppelpunkt in diabetischen Ratten (3-6 Wochen nach der Injektion der STZ) im Vergleich zu der Kontrolle Ratten. Die verminderte Mechanosensory Reaktion im Kolon Afferenzen beobachtet, dass in Vitro eine abgeschwächte visceromotor Reaktion (VMR) auf in Vivo CRD in der Diabetiker Gruppe entsprach. Monoblock-Analyse ergab, dass beeinträchtigt Mechanosensitivity LT und WDR Fasern können die afferenten Hyposensibilisierung in der diabetischen Dickdarm4zugrunde liegen. Verwenden ein ähnliches Protokoll, wir auch erfolgreich aufgezeichnet von murinen Kolon Afferenzen und deutlich erhöhte Kolon afferenten Erregbarkeit in DSS-induzierte IBD Mäuse (unveröffentlichte Beobachtungen) erkannt.
Die Colorectum ist von der Brust/Unterbauch und der lumbosakralen/Becken-afferenten Fasern1,2innerviert. Geht hervor, dass diese zwei Sätze von primären Afferenzen sich erheblich in ihrer funktionellen Eigenschaften unterscheiden und unterschiedliche Qualitäten von Kolon Reize14,15,16,17 signalisieren können . Ein wichtiger Vorteil des derzeitigen Protokolls ist das Potenzial, die Unterbauch und Beckenboden Afferenzen von der Colorectum vergleichsweise zu studieren. Wie in Abbildung 1dargestellt, eine lumbale splanchnic (Unterbauch) Nerven und 3-4 Zweige der PN großen PG durchlaufen und dann projizieren auf den absteigenden Dickdarm und der Harnblase. Wir festgestellt, dass Mechanosensory das PN-Bundle qualitativ ähnlich reagierten die Nerven distal zum PG, die vermutlich gemischte lumbale splanchnic und Becken-Afferenzen enthalten. Technisch ist es sehr gut möglich, zwei Saugelektroden in der Nähe von PG, gleichzeitig die LSN und PN aufzunehmen und zu beurteilen, ob sie anders auf mechanische und chemische Reize reagieren zu platzieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.
Acknowledgments
Dieses Protokoll wurde durch Forschung Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (#31171066, #81270464) und das Sino-German Science Center (GZ919) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
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