Summary
Onormal sensorisk funktion ligger bakom visceral smärta och andra symtom på funktionella och inflammatoriska tarmsjukdomar. Ett protokoll för elektrofysiologiska inspelning av kolon afferenta nerver i en kolorektum ex vivo råtta förberedelse presenteras här.
Abstract
Dysfunktion av kolon sensoriska nerver har varit inblandad i patofysiologin bakom flera gemensamma villkor, inklusive funktionella och inflammatoriska tarmsjukdomar och diabetes. Här beskriver vi ett protokoll för in vitro- karakterisering av elektrofysiologiska egenskaper colonic afferenter hos råttor. Kolorektum, med intakt bäcken ganglion (PG) fäst, bort från råtta; superfused med carbogenated Krebs lösning i inspelning kammaren. och kanylerade orala och anala ändar att möjliggöra buk. En fin nerv bunt som härrör från PG identifieras och nervaktiviteten multiunit afferenta registreras med en sug elektrod. Buk för segmentet colonic framkallar gradvisa ökningar av multiunit ansvarsfrihet. En principalkomponentanalys bedrivs för att skilja lågtröskelvård, hög-tröskeln och wide-dynamiskt omfång afferenta fibrerna. Kemisk känslighet av kolon afferenter kan studeras genom badkar eller intraluminal förvaltning av test föreningar. Detta protokoll kan ändras för ansökan till andra arter, såsom möss och marsvin, och att studera skillnader i torakolumbala/hypogastric och lumbosakrala/bäcken afferenter i fallande tjocktarmen i normal elektrofysiologiska egenskaper och sjukdomstillstånd.
Introduction
Mag-tarmkanalen (GIT) är rikt innerverade med extrinsic afferenta nerver som förmedlar sensoriska signaler från tarmen till centrala nervsystemet och som bidrar till gut-brain interaktionen. Förändrad retbarhet av dessa extrinsic afferenter, liksom förändrad central behandling av afferenta ingångarna, ligger bakom visceral smärta och andra symtom på GI villkor, inklusive funktionella och inflammatorisk tarm sjukdomar1. Sensorisk information från kolorektum förmedlas främst genom den torakolumbala/hypogastric och den lumbosakrala/bäcken nerver (PN)2. Har man ett ökat intresse för att studera dessa primära afferenta fibrer i gnagare sjukdomsmodeller elektrofysiologiska egenskaper. Dock i vivo elektrofysiologiska inspelningar av den kolon afferenter i gnagare är en teknisk utmaning och kräver betydande kirurgiska färdigheter. Dessutom kan hemodynamiska förändringar, vävnad rörelse och bedövningsmedel också påverka nervaktiviteten och känslighet att testa stimuli i vivo. Därför, under de senaste åren har ett ökande antal studier anställda i vitro (ex vivo) beredningar av olika arter, inklusive möss, råttor, marsvin och människor, att undersöka mekanismer för sensorisk transduktion i kolon afferenter och förändrad retbarhet i sjukdomstillstånd. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Två typer av ex vivo colonic förberedelse har främst rapporterats: den ”plan ark” förberedelse5,9,10 och ”tube” beredning3,4. En video protokoll för ”platt ark” murina kolorektum beredning har funnits tidigare publicerade11. I detta protokoll, den musen kolorektum, med PN) eller ländryggen splanchnic nerver (LSN) fäst, är skördade och superfused i en vävnad kammare. Kolorektum är uppskuren längdriktningen och nerv bunten förlängs i en inspelning fack fyllda med paraffinolja. Nervaktivitet är inspelade med en monopolär platina-iridium-elektrod. Protokollet tillåter för identifiering av de receptiva fälten av enskilda afferenta fibrer med hjälp av opartisk elektrisk stimulering. Det lokaliserar tillämpningen av kemiska stimuli, samt tillämpningen av olika mekanisk stimulering paradigm (t.ex. fokala slemhinnor sondering och omkretsriktningen stretch), till afferenta nervändar. Eftersom nerven måste utvidgas till en separat kammare från vävnad kammaren, är det viktigt att hålla den bifoga nerven relativt lång; framgångsrika dissektion av nerverna är en utmaning för de nya till denna metod. Nullens et al. publicerade nyligen en video protokoll för in vitro- inspelning av den mesenteriska afferenter murina jejunal och colonic segment12. I denna ”tube” förberedelse hålls gut segmentet med krös fäst intakt, vilket möjliggör graderade buk och intra - och extra-luminala administrationen av olika kemikalier. Eftersom krös nerven är inspelade med en sug elektrod, som kan placeras nära vävnaden, kan afferenta aktivitet registreras även om krös nerven är relativt kort. Men krös nerv består av blandade populationer av vagala och spinal afferenta fibrer som innerverar jejunum eller torakolumbala hypogastric. Lumbosakrala bäcken afferenter innerverar den kolorektum, som inte kan diskrimineras i detta protokoll. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för elektrofysiologiska inspelning av råtta kolon afferenter med ”tube” kolorektum preparatet med en intakt PG. Denna metod kan tillåta för karakterisering av ländryggen funktionella egenskaper splanchnic (hypogastric) och lumbosakrala bäcken afferenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
den experimentellt protokoll som redovisas här har godkänts av den djur etiska kommittén av Shanghai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). dissektion av kolorektum med intakt ganglion och nerv trunk tar minst 15 minuter för en person som är ganska erfaren i denna teknik. Det är därför nödvändigt att hålla djur vid liv men under djup anestesi samtidigt utför dissektionerna, för att säkerställa bärkraften av vävnad för efterföljande elektrofysiologiska inspelning.
1. beredning av Perfusion lösning och Test föreningar
- förbereda 5 L Krebs lösning: 113 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO 3, 1,2 mM CaCl 2 , och 11,5 mM glukos. Mätta lösningen med en 95% O 2 + 5% CO 2 gasblandning. Pre cool ~ 500 mL syresatt Krebs i kylskåpet.
- Förbered alikvoter av lager testa föreningar (1 mM capsaicin i etanol och 10 mM 5-hydroxytryptamin (5-HT) i saltlösning) som behövs. Späd beståndet i Krebs (för bad ansökan) och i saltlösning (för intraluminal administration) till slutliga koncentration precis före användning.
2. Beredning av inspelning elektroden
- Pull inspelning elektroden från standard glas rör utan inre filament (1,5 mm yttre diameter) med hjälp av konventionella elektrod avdragare. Justera inställningarna för avdragare för värme och dra så att skaftet av drog elektroderna är mellan 20 och 25 mm.
3. Vävnaden samling
- bedöva råtta djupt använder natrium pentobarbital (80 mg/kg, i.p.).
- Samtidigt som sterilitet, exponera bukhålan genom att utföra en mittlinjen snitt på den buk-väggen med en skalpell. Dra krös och andra vävnader undan att exponera kolorektum.
- Placera djuret under mikroskopet dissekera. Genom noggrann dissektion, leta upp den vänstra PG och identifiera PN och LSN sidofloderna. Skär dessa nerver några millimeter ifrån PG.
Obs: Till PG ligger nära korsningen kolorektal. Normalt 3-4 PN från lumbosakrala ryggmärgen och ett LSN-projekt till till PG ( figur 1). - Skär bäckenbensfogen benet för att exponera ändtarmen. Ta bort vävnaderna (dvs, urinblåsan, etc.) ovanför kolorektum; var noga med att lämna till PG intakt.
- Offra råtta genom intravenös injektion av en överdos av pentobarbital. Transekt kolon ca 3 cm ovanför PG och ta bort kolorektum från djuret med hjälp av pincett.
- Överför kolorektum till en petriskål fylld med nedkylda Krebs lösning. Ta bort avföring genom att försiktigt spola kolon. Ta bort kvarleva urinblåsan och andra vävnader försiktigt, utan att kompromissa med PG.
4. Dissektion av Colonic afferenta nerver
- Placera kolonet i en inspelning kammare (20 mL) och BEGJUTA vävnaden kontinuerligt med carbogenated Krebs lösning. Fastställa perfusion skattesatsen till 15 mL/min.
- Hål i kolorektum i både de orala och anala ändarna. Starta intraluminal infusion i kolon med saltlösning i en takt av 10 mL/h i muntligen anal riktning.
- Leta upp till stora PG under mikroskopet dissekera. Använda insekt pins för att exponera ganglion. Med noggrann dissektion, hitta en fin gren av nerv som härrör från ganglion och kör mot tjocktarmen ( figur 1). Skär nerven nära ganglion.
Obs: Figur 1 illustrerar en inspelning från en nerv gren distala till PG. Nerven innehåller förmodligen en blandning av bäcken och ländrygg splanchnic afferenta fibrer. Alternativt en inspelning kan göras från PN eller LSN proximalt till PG. - Slå på värme bad och varm Krebs lösningen att hålla kammaren temperaturen vid 34 ± 0,5 ° C.
5. Beredning av sug elektroden
- ta pre drog glas pipett (steg 2) och inspektera den under mikroskopet dissekera. Bryta spetsen av elektroden med en pincett så att den är av en storlek som är kompatibel med diametern på nerven som ska registreras.
- Avfasning spetsen genom att placera den nära en lättare utflytning.
6. Elektrofysiologiska inspelning
- Connect avfasade elektroden till elektrodhållare. Ansluta en 10 mL spruta till sidoingången på hållaren för att använda negativa eller positiva påtryckningar på elektroden.
- Ansluta innehavaren till headstage av bioamplifier och montera headstage på en manipulator.
- Flytta elektroden till vävnad badet och fyll elektroden med Krebs lösningen genom att tillämpa skonsam sugkraft tills det kontakter silver tråd av innehavaren. Placera elektroden spetsen nära den skurna änden av nerv och negativa tryck att suga nerven till elektroden. Applicera mer undertryck så att ~ 1 mm av nerven är drog in elektroden och bildar en tät förslutning.
- Tur på bioamplifier och ange filtret till 300-3000 Hz. övervaka signalen på oscilloskopet och registrera den nerv signalen (20 kHz samplingsfrekvens) och intraluminal trycket signalen (100 Hz samplingsfrekvens) använder en dator med en spike databehandling programvara.
7. Testning Colonic afferenta känslighet
- tillämpa ramp buk i tjocktarmen genom att stänga tre sätt kranen på outlet kanylen samtidigt kontinuerligt infundera intraluminally. Övervaka intraluminal trycket tills den når 60 mmHg, då öppen trevägs kranen på dränerande kanylen.
- Upprepa proceduren regelbundet av 15 min. Applicera droger extra- eller intraluminally att testa kemisk känslighet av afferenta nerver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 är en Schematisk illustration av experimentella setup för ex vivo ”tube” kolorektum beredning, med en representant för inspelning från en nerv distala till PG. Nerven innehöll förmodligen en blandning av bäcken och ländrygg splanchnic afferenter. I preparat från normala råttor har colonic afferenta nerver vanligtvis en låg nivå av oregelbundna spontan aktivitet. Ramp buk i tjocktarmen inducerar en gradvis ökning av eldhastighet (figur 1B). Egenskapen mechanosensory för varje nerv representeras av plottning intraluminal tryck-afferenta nerv svar kurvan (figur 1 c). I genomsnitt tryck-responskurvor kan jämföras mellan grupper (dvs. reglering kontra behandlas) att avslöja huruvida en behandling ändrar egenskapen mechanosensory för kolon afferenta nerver (se Rong o.a. 13 för information om tryck-afferenta svar kurvan).
Alternativt, inspelningar kan göras från PN eller LSN proximalt på PG. bild 2 är en representant inspelning från en PN bunt som uppvisade ett mechanosensory svar kvalitativt liknar den distala bunten till PG, visas i figur 1b. Principal Komponentanalys av neurala signalen möjliggör identifiering av enstaka aktivitet. De diskriminerade enstaka enheterna klassificeras som låg tröskel (LT) fibrer, wide-dynamic range (WDR) fibrer och hög tröskel (HT) fibrer, enligt profilerna av svaren på buk. LT enheter aktiveras vid ett tryck som låg buk, och eldhastighet når ett maximum på ca 20 mmHg. WDR enheter aktiveras även vid ett tryck som låg buk, och eldhastighet fortsätter att öka när intraluminal trycket ökar (figur 2A och C). HT-enheter aktiveras vid en buk tryck > 20 mmHg (se Dong et al.) 4.
Den kolon afferenter kemisk känslighet kan testas genom superfusion (bad ansökan) eller intraluminal infusion. Till exempel orsakat bad tillämpningen av 10 µM 5-HT en blygsam ökning, medan capsaicin på 0,3 µM frammanade robust ökningar i bäcken afferenta ansvarsfrihet som följdes av en period med minskad aktivitet på grund av hyposensibilisering (figur 3).
Figur 1. Elektrofysiologiska inspelning av råtta kolon afferenta nerver In Vitro. A. en Schematisk illustration av ex vivo ”tube” kolon utarbetandet av råtta. Kolorektum, med den bifogade PG, är superfused i inspelning kammaren och är kanylerade i båda ändar. Intraluminal infusion uppnås med hjälp av en sprutpumpen och flyttar in muntligen anal riktning. Utspändhet i tjocktarmen sker tre sätt kranen (d) på outlet kanylen. En fin nerv gren från PG skärs och inspelade med en sug elektrod. En gren av LSN och tre grenar av den PN som ansluter sig till PG visas också. en. den proximala skurna änden av en fin nerv projicera till tjocktarmen. b. den distala skurna änden av nerv sugs in elektroden. c. skär slutet av två fina nerver projicera till urinblåsan. LSN: ländryggen splanchnic nerver, PN: bäcken nerver. B. representativa tracesna av kolon afferenta nerv signal och intraluminal trycket. C. en tomt den tryck-responskurvan av denna nerv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa elektrofysiologiska inspelning från en gren av bäcken nerverna under rampen buk av de Ex Vivo kolorektum. A. svar mönstret två enda enheter (WDR och LT-enheter), tillsammans med multiunit mechanosensory svaret under rampen buk. B. en Schematisk illustration av nerv bunt registreras. LSN: ländryggen splanchnic nerver, PN: bäcken nerver. C. ovanpå vågform av de två enda enheterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa elektrofysiologiska inspelning från en gren av bäcken nerverna under bad tillämpningen av 5-HT och Capsaicin. (Vänster) Tillämpningen av 10 µM 5-HT. (rätt) tillämpningen av 0,3 µM capsaicin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som presenteras här är en relativt okomplicerad experimentell metod för att bedöma den kolon afferenter av råttor elektrofysiologiska egenskaper. Protokollet (från vävnad dissektion till att inrätta nerv inspelningen) vanligtvis tar cirka 2 timmar att slutföra. Vävnaden samling (steg 3) och beredning av sug elektroden (steg 5) är de kritiska steg. Det är viktigt att kunna lokalisera till PG, LSN och PN och ta hand inte kommer för att skada de ganglion och nerver under vävnad dissektion. Spetsen på pipetten glas måste brytas och avfasade till en storlek som är kompatibel med nerv bundle.
Preparatet är oftast lönsamt i flera timmar, vilket möjliggör studier av mekanosensitivitet, chemosensitivity och de farmakologiska profilerna av kolorektal afferenta nerver. Jämfört med ”platt ark” förberedelse11, där mekanisk stimulering appliceras genom slemhinnor strök eller omkretsriktningen stretching, detta ”tube” preparat möjliggör ramp eller graderade buk på ett sätt som liknar tillämpningen av kolorektal buk (CRD) sövda eller vaket djur att bedöma visceral smärta. Med en liknande protokoll, Wynn o.a. 3 studerade bidrag av purinergic receptorer till den mechanosensory transduktion av råtta kolon afferenter och fann att colonic afferenter aktiverades genom bad tillämpning av ATP (P2X och P2Y agonist) och α, β-meATP (P2X-agonist) och som dilatation-inducerad bäcken afferenta ansvarsfrihet var försvagade av P2-receptorantagonister. Mer nyligen, Vi jämförde mechanosensory svaren från kolon afferenter mellan normal och streptozotocin (STZ)-inducerad diabetiska råttor. Vi fann en signifikant minskning av multiunit afferenta nerv Svaren till ramp buk av den ex vivo kolon i diabetiska råttor (3-6 veckor efter STZ injektion) jämfört med kontroll råttor. Den minskade mechanosensory svaren i kolon afferenter observerades i vitro överensstämde med ett försvagat visceromotor svar (VMR) i vivo CRD i gruppen diabetiker. Enstaka analys indikerade att nedsatt mekanosensitivitet LT och WDR fibrer kan ligga bakom den afferenta hyposensitivity i diabetiker kolon4. Använder ett liknande protokoll, vi också framgångsrikt inspelade från murina colonic afferenter och avsevärt ökad colonic afferenta retbarhet i DSS-inducerad IBD möss (opublicerade observationer).
Kolorektum är innerveras av den torakolumbala/hypogastric och lumbosakrala/bäcken afferenta fibrer1,2. Det visar sig att dessa två uppsättningar av primära afferenter kan avvika avsevärt i sin funktionella egenskaper och kan signalera olika kvaliteter av kolon stimuli14,15,16,17 . En viktig fördel av det nuvarande protokollet är dess potential att jämförelsevis studera den hypogastric och bäcken afferenter av kolorektum. Som illustreras i figur 1, en lumbal splanchnic (hypogastric) nerv och 3-4 grenar av PN passera genom de stora PG och sedan projektet till det fallande kolonet och urinblåsan. Vi konstaterade att mechanosensory svar av PN bunt kvalitativt liknar att av nerv distalt till PG, som antagligen innehöll blandade ländryggen splanchnic och bäcken afferenter. Tekniskt sett är det mycket möjligt att placera två sug elektroderna nära till PG att samtidigt registrera LSN och PN och bedöma om de reagerar olika på mekanisk och kemisk stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta protokoll stöds av forskningsanslag från den National Natural Science Foundation Kina (#31171066, #81270464) och den kinesisk-tyska Science Center (GZ919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
