Summary
Fonction sensorielle anormale sous-tend la douleur viscérale et autres symptômes de maladies intestinales inflammatoires et fonctionnelle. Un protocole pour l’enregistrement électrophysiologique des nerfs afférents coliques dans une préparation de rectum ex vivo rat est présenté ici.
Abstract
Dysfonction des nerfs sensitifs du côlon a été impliquée dans la pathophysiologie de plusieurs conditions communes, notamment le diabète et les maladies intestinales inflammatoires et fonctionnelle. Nous décrivons ici un protocole pour la caractérisation in vitro des propriétés électrophysiologiques des afférences coliques chez le rat. Le rectum, avec le ganglion pelvien intact (PG), attaché, on retire le rat ; superfusés avec carbogenated une solution de Krebs dans la chambre d’enregistrement ; et canulés aux extrémités afin de permettre une distension orale et anales. Un faisceau de nerfs fine émanant de la PG est identifié et l’activité nerveuse afférente principe est enregistrée à l’aide d’une électrode d’aspiration. Distension du segment colique provoque des augmentations progressives en principe décharge. Une analyse en composantes principales est menée pour différencier le bas seuil, le seuil haut et les fibres afférentes de gamme grande dynamique. Sensibilité chimique des afférences du côlon peut être étudiée par l’administration bain / intraluminale des composés d’essai. Ce protocole peut être modifié pour l’application à d’autres espèces, telles que la souris et le cobaye et d’étudier les différences dans les propriétés électrophysiologiques des afférences hypogastrique/thoraco-lombaire et lombo-sacrée/pelvienne du côlon descendant dans des conditions normales et certaines pathologies.
Introduction
Le tractus gastro-intestinal (TGI) est richement innervé par les nerfs afférents extrinsèques qui transmettent des signaux sensoriels de l’intestin vers le système nerveux central et qui contribuent à l’interaction cerveau-intestin. Excitabilité altérée de ces afférences extrinsèques, ainsi qu’altération Centre de traitement des entrées afférentes, sous-tend la douleur viscérale et autres symptômes de GI conditions, y compris fonctionnels et inflammatoires de l’intestin maladies1. L’information sensorielle de la rectum est véhiculée principalement par le biais de la thoraco-lombaire/hypogastrique et les nerfs lombo-sacrée/pelvienne (PN)2. Il y a eu un intérêt accru en étudiant les propriétés électrophysiologiques des ces fibres afférentes primaires dans les modèles de maladies rongeurs. Cependant, in vivo des enregistrements électrophysiologiques des afférences du côlon chez les rongeurs est un défi technique et requiert des compétences chirurgicales considérables. En outre, les modifications hémodynamiques, le mouvement du tissu et anesthésiques peuvent également avoir des répercussions l’activité nerveuse et sensibilité pour tester des stimuli en vivo. Par conséquent, ces dernières années, un nombre croissant d’études ont employé in vitro (ex vivo) préparations de différentes espèces, y compris les souris, rats, cobayes et l’homme, pour étudier les mécanismes de transduction sensorielle en colique afférences et l’excitabilité altérée dans les états pathologiques. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Ont principalement deux types d’ex vivo la préparation colique : la préparation de « plat-feuille »5,9,10 et le « tube » préparation3,4. Un protocole vidéo pour la préparation de rectum murin « plat-feuille » a été publiée précédemment11. Dans le présent protocole, le rectum de souris, avec le PN) ou des nerfs splanchniques lombaires (LSN) attachés, est récolté et superfusée dans une chambre de tissu. Le rectum est découpé longitudinalement, et le faisceau de nerfs se prolonge dans un compartiment d’enregistrement rempli d’huile de paraffine. L’activité nerveuse est enregistrée à l’aide d’une électrode de platine-iridium monopolaire. Le protocole permet l’identification des champs réceptifs des fibres afférentes individuels en utilisant non biaisée de la stimulation électrique. Elle localise à la demande des stimuli chimiques, ainsi que l’application des paradigmes différents de stimulation mécanique (p. ex., focale muqueuse sonder et circonférentielle stretch), à des terminaisons nerveuses afférentes. Parce que le nerf doit être étendu à une chambre séparée de la chambre de tissu, il est essentiel de garder le nerf ci-joint relativement long ; la dissection réussie des nerfs pose un défi à ceux nouvelle à cette méthodologie. Plus récemment, Nullens et coll. publié un protocole vidéo pour l’enregistrement in vitro des afférences mésentériques murine jéjunale et segments du côlon12. Dans cette préparation « tube », le segment de l’intestin avec le mésentère attaché est gardé intact, permettant ainsi de distension graduée et l’administration intra - et extra-luminale de différents produits chimiques. Depuis le nerf du mésentère est enregistré à l’aide d’une électrode d’aspiration, qui peut être positionnée à proximité du tissu, activité afférente peut être enregistrée, même si le nerf du mésentère est relativement court. Toutefois, le nerf du mésentère se compose de peuplements mixtes de vagales et la colonne vertébrale des fibres afférentes qui innervent le jéjunum ou thoraco-lombaire hypogastrique. Lombo-sacrée afférences pelviens innervant le rectum, qui ne peuvent pas être distinguée dans le présent protocole. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’enregistrement électrophysiologique des afférences colique de rat à l’aide de la préparation du rectum « tube » avec un PG intact Cette méthode peut permettre la caractérisation des propriétés fonctionnelles des lombaires splanchnique (hypogastrique) et lombo-sacrée afférences pelvienne.
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Protocol
le protocole expérimental rapporté ici a été approuvé par l’Animal éthique Comité de Shanghai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). la dissection du rectum avec ganglion intacte et du système nerveux tronc prend un minimum de 15 minutes pour une personne assez expérimentée dans cette technique. Il est donc nécessaire de garder l’animal vivant, mais sous anesthésie profonde tout en effectuant des dissections, afin d’assurer la viabilité des tissus pour les enregistrement électrophysiologique.
1. préparation de la Solution de Perfusion et des composés d’essai
- préparer 5 L de solution de Krebs : 113 mM NaCl, KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 5,9 mM 25 mM NaHCO 3, 1,2 mM CaCl 2 et 11,5 mM de glucose. Saturer la solution avec un 95 % O 2 + 5 % CO 2 mélange de gaz. Refroidir préalablement ~ 500 mL de Krebs oxygénée dans le réfrigérateur.
- Préparer des aliquotes de stock essais composés (capsaïcine de 1 mM dans l’éthanol et 10 mM 5-hydroxytryptamine (5-HT) dans une solution saline) selon les besoins. Diluer le stock dans Krebs (pour application de bain) et dans une solution saline (pour administration intraluminale) à la concentration finale juste avant l’utilisation.
2. Préparation de l’électrode d’enregistrement
- tirer l’électrode d’enregistrement standard en verre tubes sans filaments internes (diamètre extérieur de 1,5 mm) à l’aide d’un extracteur classique électrode. Ajuster les paramètres de l’extracteur de chaleur et tirez pour que la tige des électrodes tirés est compris entre 20 et 25 mm.
3. Collection de tissus
- anesthésier le rat profondément à l’aide de pentobarbital de sodium (80 mg/kg, i.p.).
- Tout en assurant la stérilité, exposer la cavité abdominale en effectuant une incision médiane sur la paroi abdominale à l’aide d’un scalpel. Tirez le mésentère et autres tissus côté pour exposer le rectum.
- Placer l’animal sous le microscope à dissection. Par dissection minutieuse, localiser le PG gauche et identifier le PN et affectez le NSE se joindre à elle. Couper ces nerfs de quelques millimètres de la PG.
Remarque : Le PG se trouve à proximité de la jonction colorectal. En général, 3-4 PN de la moelle lombo-sacrée et un projet LSN à la PG ( Figure 1). - Couper l’os de la symphyse pubienne pour exposer le rectum. Enlever les tissus (p. ex., vessie, etc.) au-dessus du rectum ; Veillez à laisser le PG intact.
- Sacrifier le rat par l’injection intraveineuse d’une dose létale de pentobarbital. Transect le côlon environ 3 cm au-dessus de la PG et enlever le rectum de l’animal à l’aide de forceps.
- Transférer le rectum dans une boîte de Pétri remplie avec une solution de Krebs refroidie. Enlever les matières fécales en rinçant doucement le côlon. Enlever la vessie reste et autres tissus soigneusement, sans compromettre le p.
4. Dissection des nerfs afférents colique
- Placer le côlon dans une chambre d’enregistrement (20 mL) et perfuse le tissu en permanence avec carbogenated une solution de Krebs. Fixer le taux de perfusion à 15 mL/min.
- Canule dans le rectum aux extrémités par voie orale et anales. Commencer la perfusion intraluminale du côlon avec une solution saline à raison de 10 mL/h à l’oral à direction anale.
- Localiser le grand PG sous le microscope à dissection. Utilisez des broches insectes pour exposer le ganglion. Avec dissection minutieuse, trouver une fine branche du nerf émanant du ganglion et courir vers le côlon ( Figure 1). Couper le nerf à proximité du ganglion.
Remarque : La Figure 1 illustre un enregistrement d’une branche nerveuse distale à la p. Le nerf contient probablement un mélange de fibres afférentes splanchniques pelviennes et lombaires. Par ailleurs, un enregistrement peut être fait de la PN ou le NSE proximal à la p. - Mettez le bain chauffant et chaud la solution de Krebs pour maintenir la température de la chambre à 34 ± 0,5 ° C.
5. Préparation de l’électrode d’aspiration
- prendre une pipette de verre préalablement tiré (étape 2) et l’examiner sous le microscope à dissection. Briser la pointe de l’électrode avec une paire de pinces pour qu’il soit d’une taille compatible avec le diamètre du nerf à figurer.
- La pointe du biseau en le plaçant à proximité d’une briquet torche.
6. Enregistrement électrophysiologique
- connecter l’électrode biseautée sur le porte-électrode. Connecter une seringue de 10 mL à l’orifice latéral sur le support à appliquer une pression négative ou positive à l’électrode de.
- Connecter le titulaire à la tête de la bioamplifier et monter la tête sur un manipulateur.
- Déplacer l’électrode à la préparation tissulaire et remplir l’électrode avec la solution de Krebs en appliquant légère succion jusqu'à ce qu’il touche le fil d’argent du titulaire. Placez la pointe de l’électrode à proximité de l’extrémité coupée du nerf et appliquer une pression négative pour aspirer le nerf dans l’électrode. Appliquer une pression plus négative pour que ~ 1 mm du nerf est aspiré dans l’électrode et forme un joint étanche.
- Tourner le bioamplifier et positionner le filtre à 300-3 000 Hz. surveiller le signal sur l’oscilloscope et d’enregistre le signal nerveux (taux d’échantillonnage de 20 kHz) et le signal de la pression intraluminale (taux d’échantillonnage de 100 Hz) à l’aide d’un ordinateur avec une informatique de pointe logiciel.
7. Tester la sensibilité des afférences colique
- appliquer une distension rampe du côlon en fermant le robinet trois voies sur la canule de sortie tout en insufflant constamment intraluminales. Surveiller la pression intraluminale jusqu'à ce qu’il atteigne 60 mmHg, moment auquel ouvert le robinet trois voies sur la canule drainant.
- Répéter cette procédure à intervalles réguliers de drogues d’appliquer 15 min. extra - ou intraluminales pour tester la sensibilité chimique des nerfs afférents.
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Representative Results
La figure 1 présente l’illustration schématique de la montage expérimental pour la préparation de rectum ex vivo « tube », avec un représentant d’enregistrement à partir d’un nerf distal à la p. Le nerf contenue vraisemblablement un mélange des afférences splanchniques pelviennes et lombaires. Dans les préparations des rats normaux, les nerfs afférents du côlon ont généralement un faible niveau d’activité spontanée irrégulière. La distension du côlon rampe induit une augmentation progressive du taux de décharge (Figure 1 b). La propriété mécanosensoriels de chaque nerf est représentée en traçant la courbe de réponse nerveuse afférente à la pression intraluminale (Figure 1). Courbes de réponse de la pression moyenne peuvent être comparés entre les groupes (c.-à-d. contrôle versus traité) de révéler si un traitement modifie la propriété mécanosensoriels des nerfs afférents du côlon (voir Rong et al. 13 pour plus de détails sur la courbe pression-afférente).
Alternativement, les enregistrements peuvent être faites du PN ou le NSE proximale à la p. Figure 2 représente un enregistrement à partir d’un ensemble de PN qui manifestent une réaction mécanosensoriels qualitativement semblable à celle du faisceau distal à la PG, illustrée à la Figure de 1 b. Principal analyse des composantes du signal neuronal permet d’identifier des activité unitaires. Les unités simples discriminées sont qualifiées de bas seuil (LT) fibres, fibres de grande dynamique range (WDR) et fibres de seuil haut (HT), selon les profils des réponses à la distension. Unités LT sont activées à une pression de distension faible et le taux de décharge atteint un maximum à environ 20 mm de mercure. Unités WDR sont également activées à une pression de distension faible et le taux de décharge ne cesse d’augmenter car la pression intraluminale augmente (Figure 2 a et C). Les appareils HT sont actionnés avec une pression de distension > 20 mmHg (voir Dong et al.) 4.
La sensibilité chimique des afférences du côlon peut être testée en surfusion (application de bain) ou perfusion intraluminale. Par exemple, l’application de bain de 10 µM 5-HT a provoqué une augmentation modeste, tandis que la capsaïcine à 0,3 µM évoquée par augmentation robuste pelvien décharge afférente qui ont été suivies d’une période de diminution de l’activité en raison de la désensibilisation (Figure 3).
La figure 1. Enregistrement électrophysiologique des nerfs afférents colique Rat In Vitro. A. une illustration schématique de la préparation du côlon ex vivo « tube » du rat. Le rectum, avec le PG ci-jointe, est superfusé dans la chambre d’enregistrement et est canulé aux deux extrémités. Intraluminale infusion est réalisée à l’aide d’un pousse-seringue et se déplace dans l’oral anal direction. Distension du côlon s’effectue en fermant le robinet trois voies (d) sur la canule de sortie. Une branche de nerf fine de la PG est coupée et enregistrées à l’aide d’une électrode d’aspiration. Une branche de la LSN et trois branches de la PN rejoindre le PG sont également indiqués. a. l’extrémité coupée proximale d’un nerf fine projection pour le côlon. b. l’extrémité coupée distale du nerf aspiré dans l’électrode. c. l’extrémité coupée des deux nerfs fines, projetant à la vessie. LSN : nerfs splanchniques lombaires, PN : nerfs pelviens. B. les traces représentatives de la pression de signal et intraluminale colique nerveuse afférente. C. une parcelle de la courbe de réponse de la pression de ce nerf. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Enregistrement électrophysiologique représentative d’une branche des nerfs pelviens lors de Distension de la rampe de l’Ex Vivo rectum. A. le modèle de réponse de deux unités (unités WDR et LT), ainsi que la réponse de principe mécanosensoriels durant la distension de la rampe. B. une illustration schématique de la botte de nerf en cours d’enregistrement. LSN : nerfs splanchniques lombaires, PN : nerfs pelviens. C. superposées de forme d’onde des deux unités simples. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Enregistrement électrophysiologique représentative d’une branche des nerfs pelviens lors de l’Application de bain de la 5-HT et de la capsaïcine. (Gauche) Application de 10 µM 5-HT. (droit) Application de 0,3 capsaïcine µM. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole présenté ici est une méthode expérimentale relativement simple pour évaluer les propriétés électrophysiologiques des afférences du côlon de rats. Le protocole (à partir de la dissection des tissus à mettre en place l’enregistrement de nerf) dure environ 2 h pour terminer. Prélèvement tissulaire (étape 3) et la préparation de l’électrode d’aspiration (étape 5) sont des opérations critiques. Il est crucial de pouvoir localiser le PG, le NSE et le PN et à prendre soin de ne pas pour endommager les nerfs et le ganglion au cours de la dissection des tissus. L’embout de la pipette de verre doit être cassé et biseauté à une taille compatible avec le faisceau de nerfs.
La préparation est généralement viable pendant plusieurs heures, ce qui permet l’étude de la mechanosensitivity, la chimiosensibilité et les profils pharmacologiques des nerfs afférents colorectal. Par rapport à la préparation « plat-feuille »11, dans laquelle une stimulation mécanique est appliquée à travers la muqueuse caressant ou allongement circonférentiel, cette préparation « tube » permet pour rampe ou classé distension d’une manière similaire à l’application de distension colorectal (CRD) chez les animaux anesthésiés ou éveillés pour évaluer la douleur viscérale. À l’aide d’un protocole similaire, Wynn et al. 3 étudie la contribution des récepteurs purinergiques à la transduction mécanosensoriels des afférences du côlon de rat et constaté que des afférences du côlon ont été actionnés par l’utilisation de bain de l’ATP (agoniste P2X et P2Y) et α, β-meATP (P2X agoniste) et qui induite par la distension pelvien décharge afférente a été atténuée par les antagonistes des récepteurs P2. Plus récemment, nous avons comparé les réponses mécanosensoriels des afférences coliques entre normal et par la streptozotocine (STZ)-induced rats diabétiques. Nous avons constaté une baisse significative dans les réponses de principe nerveuse afférente à la distension de la rampe de l' ex vivo du colon chez le rat diabétique (3 à 6 semaines après l’injection de STZ) par rapport aux rats témoins. La réponse de mécanosensoriels une diminution dans les afférences coliques observée in vitro était compatible avec une réponse viscéromotrice atténuée (VMR) à in vivo CRD dans le groupe de diabétique. Unitaires analyse a indiqué que mechanosensitivity ayant une déficience de LT et WDR fibres peuvent sous-tendre l’hyposensibilité afférente au côlon diabétique4. À l’aide d’un protocole similaire, également avec succès enregistrés à partir des afférences coliques murins et détecté excitabilité des afférences colique significativement accrue chez les souris induite par le DSS l’IBD (inédites).
Le rectum est innervé par le thoraco-lombaire/hypogastrique et les fibres afférentes lombo-sacrée/pelvienne1,2. Il ressort que ces deux séries d’afférences primaires peuvent différer significativement dans leurs propriétés fonctionnelles et peuvent aussi signaler les différentes qualités de stimuli colique14,15,16,17 . Un avantage important du protocole actuel réside dans son potentiel à étudier comparativement les afférences hypogastrique et pelviennes du rectum. Tel qu’illustré à la Figure 1, lombaire nerf splanchnique (hypogastrique) et 3-4 branches de la PN passent par le grand PG et puis projettent vers le côlon descendant et la vessie. Nous avons constaté que la réponse de mécanosensoriels du faisceau PN était qualitativement similaire à que du nerf distal à la PG, qui contenait probablement mixtes afférences splanchniques et pelviennes lombaires. Techniquement, il est très possible de placer les deux électrodes d’aspiration près du PG pour enregistrer simultanément le NSE et le PN et d’évaluer s’ils réagissent différemment à la stimulation mécanique et chimique.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce protocole a été soutenu par des subventions de recherche de la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (#31171066, #81270464) et du centre de Science de Sino-allemand (GZ919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
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