Summary
Anormale funzione sensoriale è alla base di dolore viscerale e altri sintomi delle malattie intestinali infiammatorie e funzionali. Un protocollo per la registrazione elettrofisiologica dei nervi afferenti colici in una preparazione di colorectum del ratto ex vivo è presentato qui.
Abstract
Disfunzione dei nervi sensoriali colici è stata implicata in patofisiologia di parecchi termini comuni, compreso il diabete e le malattie intestinali infiammatorie e funzionali. Qui, descriviamo un protocollo per la caratterizzazione in vitro delle proprietà elettrofisiologiche delle afferenze colica in ratti. Colorectum, con il ganglio pelvico intatto (PG) collegato, viene rimosso dal ratto; superfusi con carbogenated soluzione di Krebs nella camera di registrazione; e cannulate alle estremità orale e anale per consentire per distensione. Un fascio di nervi bene che emana dal PG viene identificato, e l'attività nervose afferenti multiunit viene registrata utilizzando un elettrodo di aspirazione. Distensione del segmento colico suscita aumenti graduali in scarico multiunit. Un'analisi delle componenti principali è condotto per distinguere la bassa soglia, l'alto-soglia e le fibre afferenti del largo-gamma dinamica. Sensibilità chimica delle afferenze colica può essere studiata attraverso la vasca o intraluminal somministrazione di sostanze da testare. Questo protocollo può essere modificato per applicazione ad altre specie, come topi e porcellini d'India e di studiare le differenze nelle proprietà elettrofisiologiche delle afferenze toracolombare/hypogastric e lombosacrale/pelvica del colon discendente in normale e condizioni patologiche.
Introduction
Tratto gastrointestinale (GIT) è riccamente innervato con estrinseci nervi afferenti che trasmettono segnali sensoriali dall'intestino al sistema nervoso centrale e che contribuiscono all'interazione di intestino-cervello. Alterata eccitabilità di queste afferenze estrinseca, come pure alterata elaborazione centrale degli input afferente, è alla base di dolore viscerale e altri sintomi di GI condizioni, tra cui funzionali e infiammatorie intestinali malattie1. Informazioni sensoriali da colorectum viene trasmesso principalmente attraverso il toracolombare/hypogastric e i nervi lombosacrale/pelvici (PN)2. C'è stato un crescente interesse nello studiare le proprietà elettrofisiologiche di queste fibre afferenti primarie nei modelli del roditore del morbo. Tuttavia, in vivo le registrazioni elettrofisiologiche delle afferenze colica nei roditori è una sfida tecnica e richiede una notevole abilità chirurgica. Inoltre, i cambiamenti emodinamici, il movimento del tessuto e anestetici possono incidere anche l'attività del nervo e la sensibilità per testare gli stimoli in vivo. Di conseguenza, negli ultimi anni, un numero crescente di studi è impiegate preparazioni in vitro (ex vivo) di specie diverse, tra cui topi, ratti, cavie e gli esseri umani, di esaminare i meccanismi di trasduzione sensoriale a Colico afferenze e l'eccitabilità alterata in condizioni di malattia. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Due tipi di ex vivo preparazione colica principalmente sono stati segnalati: il "piatto-foglio" preparazione5,9,10 e il "tubo" preparazione3,4. Un video protocollo per la preparazione di colorectum murino "piatto-foglio" è stato pubblicato in precedenza11. In questo protocollo, colorectum del mouse, con il PN) o Nervi Splancnici lombari (LSN) collegati, è raccolto e superfusi in una camera di tessuto. Colorectum è tagliati longitudinalmente, e il pacco del nervo viene esteso in un vano di registrazione riempito con olio di paraffina. L'attività del nervo viene registrata utilizzando un elettrodo di platino-iridio monopolare. Il protocollo consente l'identificazione dei campi ricettivi di singole fibre afferenti tramite stimolazione elettrica imparziale. Localizza l'applicazione di stimoli chimici, così come l'applicazione di paradigmi diversi stimoli meccanici (ad es., focale della mucosa sondaggio e tratto della circonferenza), per le terminazioni nervose afferenti. Poiché il nervo deve essere estesa a una camera separata dalla camera del tessuto, è fondamentale per mantenere il nervo collegato relativamente lungo; la dissezione successo dei nervi rappresenta una sfida per quelli nuovi a questa metodologia. Più recentemente, Nullens et al pubblicato un video di protocollo per la registrazione in vitro delle afferenze mesenterica murino digiunale e segmenti colici12. In questa preparazione di "tubo", il segmento di intestino con il mesentere attaccato è mantenuto intatto, consentendo in tal modo graduale distensione e la somministrazione intra - ed extra-luminale di diverse sostanze chimiche. Poiché il nervo mesentere viene registrato utilizzando un elettrodo di aspirazione, che può essere posizionato in prossimità del tessuto, attività afferente possono essere registrati anche se il nervo mesentere è relativamente breve. Tuttavia, il nervo di mesentere costituito da popolazioni miste di fibre afferenti vagali e spinali che innervano il digiuno o toracolombare hypogastric. Afferenze pelvici lombosacrale innervano colorectum, che non possono essere discriminati in questo protocollo. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la registrazione elettrofisiologica delle afferenze colica ratto usando la preparazione del colon-retto "a tubo" con un PG intatto. Questo metodo potrebbe consentire per la caratterizzazione delle proprietà funzionali di lombare splancnico (hypogastric) e lombosacrale pelvico afferenze.
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Protocol
il protocollo sperimentale riportato qui è stato approvato dall'animale etico Comitato di Shanghai Jiaotong University School of Medicine (n # SYXK2013-0050). la dissezione del colorectum con ganglio intatto e nervo tronco richiede un minimo di 15 minuti per una persona abbastanza esperta in questa tecnica. Pertanto è necessario mantenere l'animale in vita ma in anestesia profonda quando si esibiva le dissezioni, per garantire la vitalità del tessuto per la successiva registrazione elettrofisiologica.
1. preparazione della soluzione di perfusione e residui della prova
- preparare 5 L di soluzione di Krebs: 113 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 25mm NaHCO 3, 1,2 mM CaCl 2 e 11,5 millimetri di glucosio. Saturare la soluzione con un 95% O 2 + 5% CO 2 miscela di gas. Pre-raffreddare ~ 500 mL di Krebs ossigenata in frigo.
- Preparare aliquote di stock testare composti (capsaicina 1 mM in etanolo e 10 mM 5-idrossitriptamina (5-HT) in soluzione salina) come necessario. Diluire il brodo in Krebs (per applicazione di bagno) e in soluzione salina (per l'amministrazione di intraluminal) alla concentrazione finale appena prima dell'uso.
2. Preparazione dell'elettrodo di registrazione
- tirare l'elettrodo di registrazione da vetro standard tubi senza filamenti interni (1,5 mm di diametro esterno) utilizzando un estrattore di elettrodo convenzionale. Regolare le impostazioni di estrattore per calore e tirare in modo che il gambo degli elettrodi tirati è compreso tra 20 e 25 mm.
3. Raccolta di tessuto
- anestetizzare il ratto profondamente utilizzando sodio pentobarbital (80 mg/kg, i.p.).
- Garantendo la sterilità, esporre la cavità addominale eseguendo un'incisione del midline sulla parete addominale usando un bisturi. Tirare il mesentere e altri tessuti da parte di esporre colorectum.
- Metti l'animale sotto il microscopio per dissezione. Attraverso la dissezione attenta, individuare il PG sinistro e identificare il PN e il numero LSN hanno aderito. Tagliare questi nervi pochi millimetri dal PG.
Nota: Il PG si trova vicino allo svincolo del colon-retto. In genere, 3-4 PN da midollo spinale lombosacrale e un progetto LSN per il PG ( Figura 1). - Tagliare l'osso della sinfisi per esporre il retto. Rimuove i tessuti (cioè, vescica urinaria, ecc.) sopra il colorectum; fare attenzione a lasciare intatto il PG.
- Sacrificare il ratto dell'iniezione endovenosa di una dose eccessiva del pentobarbital. Transetto del colon circa 3 cm sopra il PG e rimuovere colorectum dall'animale usando il forcipe.
- Trasferimento colorectum in una capsula Petri riempito con soluzione di Krebs pre-raffreddata. Rimuovere le feci lavando delicatamente il colon. Rimuovere la vescica urinaria residuo e altri tessuti con attenzione, senza compromettere il PG.
4. Dissezione dei nervi afferenti colica
- inserire i due punti in una camera di registrazione (20 mL) e irrorare il tessuto continuamente con carbogenated soluzione di Krebs. Impostare la frequenza di aspersione a 15 mL/min
- Incannulare colorectum a entrambe le estremità orale e anale. Iniziare l'infusione di intraluminal del colon con soluzione fisiologica ad un tasso di 10 mL/h l'orale anale direzione.
- Individuare il PG principale sotto il microscopio per dissezione. Utilizzare spilli entomologici per esporre il ganglio. Con dissezione accurata, trovare un bel ramo del nervo che emana dal ganglio e correndo verso il colon ( Figura 1). Tagliare il nervo vicino il ganglio.
Nota: La figura 1 illustra una registrazione da un ramo del nervo distale a PG. Il nervo presumibilmente contiene una miscela di fibre afferenti splancnica lombare e pelviche. In alternativa, una registrazione può essere fatta dal PN e/o il numero LSN prossimale a PG. - Accendere il riscaldamento vasca e caldo la soluzione di Krebs per mantenere la temperatura della camera a 34 ± 0,5 ° C.
5. Preparazione dell'elettrodo aspirazione
- prendere una pipetta di vetro pre-stirato (passaggio 2) ed esaminarlo al microscopio per dissezione. Rompere la punta dell'elettrodo con un paio di pinze, in modo che è di dimensioni compatibili con il diametro del nervo per essere registrato.
- Smusso la punta collocandolo vicino un leggero chiarore.
6. Registrazione elettrofisiologica
- Connetti l'elettrodo smussato a pinza porta elettrodo. Collegare una siringa 10 mL alla porta laterale del supporto per applicare pressione negativa o positiva all'elettrodo.
- Collegare il titolare per l'headstage della bioamplifier e montare l'headstage su un manipolatore.
- Spostare l'elettrodo al bagno del tessuto e riempire l'elettrodo con la soluzione di Krebs applicando leggera aspirazione fino a quando non si mette in contatto il filo d'argento del titolare. Posizionare la punta dell'elettrodo vicino l'estremità tagliata del nervo e applicare una pressione negativa a succhiare il nervo nell'elettrodo. Applicare pressione negativa affinché ~ 1 mm del nervo è tirato nell'elettrodo e forma una guarnizione stretta.
- Disabilita sullo bioamplifier e impostate il filtro a 300-3.000 Hz. monitorare il segnale sull'oscilloscopio e registrare il segnale del nervo (frequenza di campionamento 20kHz) e il segnale di pressione intraluminal (frequenza di campionamento di 100 Hz) utilizzando un computer con un'elaborazione dei dati di spike software.
7. Test della sensibilità afferente colica
- applica distensione di rampa del colon chiudendo il rubinetto a tre vie sulla cannula Saldi infondendo continuamente intraluminally. Monitorare la pressione intraluminal fino a raggiungere 60 mmHg, momento in cui aprire il rubinetto a tre vie sulla cannula drenante.
- Ripetere questa procedura ad intervalli regolari di 15 min. applica farmaci extra - o intraluminally per testare la sensibilità chimica dei nervi afferenti.
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Representative Results
La figura 1 rappresenta l'illustrazione schematica dell'apparato sperimentale per la preparazione di colorectum ex vivo "tubo", con un rappresentante di registrazione da un nervo distale a PG. Il nervo presumibilmente conteneva una miscela di afferenze splancnico lombare e pelvica. Nelle preparazioni da ratti normali, i nervi afferenti colici in genere hanno un basso livello di attività spontanea irregolare. Distensione di rampa del colon induce un graduale aumento del tasso di infornamento (Figura 1B). La proprietà mechanosensory di ogni nervo è rappresentata tracciando la curva di risposta di nervose afferenti a pressione intraluminal (Figura 1). Curve di media pressione-risposta possono essere confrontate tra gruppi (cioè il controllo contro trattati) per rivelare se un trattamento altera la proprietà mechanosensory dei nervi afferenti colici (Vedi Rong et al. 13 per maggiori dettagli sulla curva pressione-afferente risposta).
In alternativa, è possibile essere registrazioni dal PN o il numero LSN prossimale a PG. nella figura 2 è un rappresentante di registrazione da un fascio PN che ha esibito una risposta che mechanosensory qualitativamente simile a quello del bundle distale per il PG, mostrato in figura 1b. principali analisi delle componenti del segnale neurale consente l'identificazione dell'unità singola attività. Le singole unità discriminate sono classificate come fibre di bassa soglia (LT), wide dynamic range (WDR) fibre e fibre di alto-soglia (HT), secondo i profili delle risposte alla distensione. Unità LT sono attivate ad una pressione di distensione basso, e il tasso di infornamento raggiunge un massimo a circa 20 mmHg. WDR unità sono attivate anche ad una pressione di distensione basso, e il tasso di infornamento continua ad aumentare man mano che aumenta la pressione intraluminale (Figura 2A e C). HT unità vengono attivate a una pressione di distensione > 20 mmHg (Vedi Dong et al.) 4.
La sensibilità chimica delle afferenze colica può essere testata di superfusione (applicazione di vasca) o infusione di intraluminal. Ad esempio, l'applicazione di vasca di 10 µM 5-HT ha causato un aumento modesto, considerando che la capsaicina a 0,3 µM evocata aumenti robusti in scarica afferente pelvica sono stati seguiti da un periodo di attività in diminuzione a causa di desensibilizzazione (Figura 3).
Figura 1. Registrazione elettrofisiologica di nervi afferenti colica del ratto In Vitro. R. un'illustrazione schematica della preparazione ex vivo "tubo" del colon del ratto. Colorectum, con l'annesso PG, è superfusi nella camera di registrazione ed è cannulati ad entrambe le estremità. Intraluminal infusione viene raggiunto utilizzando una pompa a siringa e sposta in orale anale direzione. Distensione del colon avviene chiudendo il rubinetto a tre vie (d) sulla cannula saldi. Un ramo del nervo bene dal PG viene tagliato e registrato utilizzando un elettrodo di aspirazione. Un ramo di LSN e tre rami del PN unendo il PG sono mostrati. a. l'estremità prossimale di taglio di un nervo bene la proiezione di due punti. b. l'estremità di taglio distale del nervo risucchiato l'elettrodo. c. tagliato due nervi a fini proiezione alla vescica urinaria. LSN: Nervi Splancnici lombari, PN: nervi pelvici. B. le tracce rappresentative della pressione segnale e intraluminal coliche nervose afferenti. C. un complotto della curva pressione-risposta di questo nervo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Rappresentante registrazioni elettrofisiologiche da un ramo dei nervi pelvici durante la distensione di rampa del Colorectum Ex Vivo . R. il modello di risposta di due singole unità (unità WDR e LT), insieme con la risposta che mechanosensory multiunit durante la distensione di rampa. B. un'illustrazione schematica del pacco del nervo in fase di registrazione. LSN: Nervi Splancnici lombari, PN: nervi pelvici. C. forma d'onda sovrapposta delle due singole unità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Registrazione elettrofisiologica rappresentativo da un ramo dei nervi pelvici durante l'applicazione di vasca di 5-HT e capsaicina. (Sinistra) Applicazione di 10 µM 5-HT (destra) applicazione di capsaicina di 0,3 µM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo presentato qui è un metodo relativamente semplice sperimentale per valutare le proprietà elettrofisiologiche delle afferenze colica dei ratti. Il protocollo (da dissezione del tessuto per impostare la registrazione del nervo) di solito ci vogliono circa 2 ore per completare. Raccolta di tessuto (passaggio 3) e la preparazione dell'elettrodo aspirazione (passo 5) sono i punti critici. È fondamentale essere in grado di individuare il PG, il numero LSN e il PN e fare attenzione a non per danneggiare il ganglio e nervi durante la dissezione del tessuto. La punta della pipetta di vetro deve essere rotta e smussata a una dimensione compatibile con il fascio nervoso.
La preparazione è solitamente valida per diverse ore, consentendo per lo studio della mechanosensitivity, la chemiosensibilità e i profili farmacologici dei nervi afferenti del colon-retto. Confrontato con il "piatto-foglio" preparazione11, in cui lo stimolo meccanico è applicato attraverso carezze mucoso o stiramento della circonferenza, questa preparazione di "tubo" consente di rampa o classificata distensione in un modo simile all'applicazione delle distensione del colon-retto (CRD) negli animali anestetizzati o svegli per valutare il dolore viscerale. Utilizzando un protocollo simile, Wynn et al. 3 studiato il contributo dei recettori purinergici per la trasduzione mechanosensory di ratto colica afferenze e trovato che afferenze colici sono stati attivati mediante l'applicazione di vasca di ATP (P2X e P2Y agonista) e α, β-meATP (P2X agonista) e che Scarica afferente pelvico distensione-indotta è stata attenuata da antagonisti P2. Più recentemente, abbiamo confrontato le risposte che mechanosensory di coliche afferenze tra normale e streptozotocin (STZ)-ratti diabetici indotti. Abbiamo trovato una diminuzione significativa nelle risposte multiunit nervose afferenti alla distensione di rampa del ex vivo del colon in ratti diabetici (3-6 settimane dopo l'iniezione di STZ) rispetto ai ratti di controllo. La risposta che mechanosensory in diminuzione in Colico afferenze osservata in vitro era costante con una risposta attenuata di visceromotor (VMR) in vivo CRD nel gruppo diabetico. Unità singola analisi ha indicato che mechanosensitivity alterata di LT e WDR fibre possono essere alla base del hyposensitivity del afferente in diabetici del colon4. Utilizzando un protocollo simile, anche con successo registrato da afferenze Colico murino e rilevato significativamente aumentata eccitabilità afferente colica in topi DSS indotta IBD (osservazioni non pubblicate).
Colorectum è innervata dal toracolombare/hypogastric e le fibre afferenti lombosacrale/pelvica1,2. Risulta che questi due insiemi delle afferenze primarie possono differire significativamente in loro proprietà funzionali e possono segnalare diverse qualità di stimoli Colico14,15,16,17 . Un importante vantaggio del protocollo attuale è il suo potenziale per studiare comparativamente le afferenze hypogastric e pelvica del colorectum. Come illustrato nella Figura 1, un lombare nervo splancnico (hypogastric) e 3-4 rami del PN passano attraverso il PG principale e quindi il progetto per il colon discendente e la vescica urinaria. Abbiamo notato che la risposta che mechanosensory del bundle PN era qualitativamente simile a che del nervo distale per il PG, che presumibilmente contenuto misto lombare afferenze splancnica e pelvico. Tecnicamente, è altamente possibile posizionare due elettrodi aspirazione vicino il PG per registrare simultaneamente il numero LSN e il PN e valutare se essi rispondono in modo diverso alla stimolazione meccanica e chimica.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo protocollo è stato sostenuto da borse di ricerca da National Foundation Natural Science of China (#31171066, #81270464) e il centro di scienza di Sino-tedesco (GZ919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
