Summary
Аномальные сенсорные функции лежит в основе висцеральной боли и других симптомов заболеваний, функциональных и воспалительных кишечника. Протокол для электрофизиологических записи кишечных афферентных нервов в ex vivo подготовки colorectum крыса представлен здесь.
Abstract
Дисфункции кишечника сензорных нервах был вовлечен в патофизиологии ряд общих условий, включая функциональные и воспалительных кишечника заболевания и диабет. Здесь мы описываем протокол для характеризации в vitro электрофизиологических свойств толстой афферентов крыс. Colorectum, с нетронутым таза ганглии (PG) прилагается, удаляется из крыса; superfused с carbogenated Кребс решение в зале записи; и канюлированной на устные и анальный концах для растяжение. Тонкой нерва расслоение, вытекающих из PG идентифицируется, и состоящих из нескольких единиц афферентных нервов активность регистрируется с помощью всасывания электрода. Растяжение сегмента кишечника вызывает постепенное увеличение разряда, состоящих из нескольких единиц. Чтобы дифференцировать низкого порога, порог высокий и широкий динамический диапазон афферентных волокон проводится анализ главных компонент. Химические чувствительность толстой афферентов могут быть изучены через администрацию Ванна или внутрипросветная испытания соединений. Этот протокол может быть изменен для применения других видов, например мышей и морских свинок и изучить различия в электрофизиологических свойств грудо/подчревной и пояснично-крестцового/таза афферентов нисходящей ободочной кишки в нормальных и патологических состояний.
Introduction
Желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) богато иннервируются с внешние афферентные нервы, передать сенсорные сигналы от кишечнике центральной нервной системы и содействуют взаимодействию кишки мозг. Изменены возбудимости эти внешние афферентов, а также изменены центральной обработки афферентных входов, лежит в основе висцеральной боли и других симптомов GI условий, включая функциональные и воспалительных кишечника болезни1. Сенсорную информацию от colorectum передается главным образом через грудо/подчревной и пояснично-крестцового/тазовых нервов (PN)2. Наблюдается повышенный интерес к изучению электрофизиологических свойств этих первичных афферентных волокон в моделях грызунов болезни. Однако в естественных условиях электрофизиологических записи толстой афферентов грызунов технической задачей и требует значительных хирургических навыков. Кроме того изменения гемодинамики, движения ткани и анестетики могут также влиять нерва активности и чувствительности для тестирования раздражителей в естественных условиях. Таким образом в последние годы все большее число исследований использовали в пробирке (ex vivo) препараты разных видов, в том числе мышей, крыс, морских свинок, и людей, изучить механизмы сенсорных трансдукции в толстой афферентов и изменены возбудимости в условиях заболевания. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Главным образом были зарегистрированы два типа ex vivo толстой подготовки: «квартира лист» подготовка5,9,10 и3,подготовка «трубки»4. Видео-протокол для подготовки мышиных colorectum «плоским лист» был ранее опубликованных11. В этом протоколе, colorectum мыши, с PN) или поясничного чревного нервов (LSN) прилагается, собранный и superfused в камере ткани. Colorectum это продольно разрезать, и пучок нервных продлевается отсек запись, наполненный парафинового масла. Нерва действие записывается с помощью монополярный электрод платина иридий. Протокол позволяет для идентификации поля восприимчивы отдельных афферентных волокон с помощью беспристрастной электрической стимуляции. Он локализуется применение химических раздражителей, а также применение различных механических раздражений парадигмы (например, фокуса слизистой зондирующего и продольных стретч), чтобы афферентных нервных окончаний. Потому что нерв должна быть распространена на отдельной камере из ткани камеры, важно сохранить прилагаемый нерва относительно долго; успешное рассечение нервы представляет собой вызов для тех, кто новичок в этой методологии. Совсем недавно Nullens et al. опубликовал видео-протокол для записи в vitro брыжеечных афферентов в мышиных тощей кишки и толстой кишки сегментов12. В этом препарате «трубу» сегмента кишки с брыжейка придает хранится нетронутыми, таким образом позволяя градуированных растяжение и интра - и загородный просветный администрации различных химических веществ. Поскольку нерва брыжейка записывается с помощью всасывания электрод, который может быть расположен недалеко от ткани, афферентных деятельность может быть записан, хотя брыжейка нерва является относительно коротким. Однако, брыжейка нерв состоит из смешанных популяций позвоночника и блуждающего афферентных волокон, которые иннервируют тощей кишки или грудо подчревной. Пояснично-крестцовой области таза афферентов иннервируют colorectum, который не может быть подвергнут в настоящем Протоколе. Здесь мы представляем подробный протокол для электрофизиологических записи толстой афферентов крыс с помощью подготовки colorectum «трубки» с нетронутыми стр. Этот метод может позволить для описания функциональных свойств поясничный чревного (подчревной) и таза афферентов пояснично-крестцового отдела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
экспериментальный протокол, сообщили здесь был одобрен животное этического Комитета из Шанхая Jiaotong школы медицины университета (# SYXK2013-0050). рассечение colorectum с нетронутыми ганглия и нерва ствол занимает как минимум 15 минут для человека довольно опытные в этой технике. Поэтому необходимо сохранить животных жив но под глубокой анестезии во время проведения вскрытия, для обеспечения жизнеспособности тканей для последующего электрофизиологических записи.
1. Подготовка перфузии решения и испытаний соединений
- подготовить 5 Л раствора Кребс: 113 мм NaCl, 5,9 мм KCl, 1,2 мм NaH 2 PO 4, 1,2 мм MgSO 4, 1,2 мм CaCl мм NaHCO 3, 25 2 и глюкоза 11,5 мм. Пропитайте решение 95% O 2 + 5% CO 2 газовой смеси. Предварительно прохладно ~ 500 мл кислородом Кребс в холодильнике.
- Подготовка аликвоты акций испытания соединений (1 мм капсаицин в этаноле и 10 мм 5-гидрокситриптамин (5-HT) в солевых) при необходимости. Разбавляют фондовой Кребс (для приложения ванна) и в солевой раствор (для администрирования внутрипросветная) до конечной концентрации, как раз перед использованием.
2. Подготовка записи электрода
- тянуть записи электрода из стандартного стекла труб без внутренней нитей (внешний диаметр 1,5 мм) с помощью обычных электрода съемник. Настроить параметры съемник для тепла и тянуть так что хвостовик вытащил электродов находится между 20 и 25 mm.
3. Ткани коллекции
- обезболивают крыса, глубоко с помощью Пентобарбитал натрия (80 мг/кг, и.п.).
- При одновременном обеспечении стерильности, разоблачить брюшной полости, выполняя срединной разрез в брюшной стенке с помощью скальпеля. Потяните брыжейка и других тканях сторону подвергать colorectum.
- Место животного под микроскопом рассечения. Путем тщательного вскрытия найдите левый PG и определить PN и номер LSN, присоединиться к нему. Вырезать эти нервы на несколько миллиметров от стр
Примечание: PG находится недалеко от перекрестка толстого кишечника. Как правило, 3-4 PN от пояснично-крестцового отдела спинного мозга и номер LSN проекта к PG ( рис. 1). - Вырезать кости симфиза подвергать прямой кишки. Удаление ткани (то есть, мочевого пузыря и др.) выше colorectum; Будьте осторожны, чтобы оставить нетронутыми PG.
- Пожертвовать крыса, внутривенные инъекции передозировки Пентобарбитал. Разрез Колон около 3 см выше PG и удалить colorectum от животного, используя пинцет.
- Передачи colorectum чашку Петри, заполненные раствором предварительно охлажденным Кребс. Удалите фекалии, осторожно промывки кишечника. Удалите остатки мочевого пузыря и других тканей тщательно, без ущерба для стр
4. Рассечение кишечных афферентных нервов
- поместите двоеточие в записи камеру (20 мл) и perfuse ткани непрерывно с carbogenated Кребс решения. Установить скорость перфузии в 15 мл/мин
- Иглу colorectum на обоих концах орального и анального. Начните внутрипросветная настой толстой кишки с физиологического раствора со скоростью 10 мл/ч в Оральный анальный направлении.
- Найти основных ПГ под микроскопом рассечения. Использование насекомых булавки подвергать ганглия. С осторожным рассечение найти штраф ветви нерва, исходящие от ганглия и бежит к толстой кишки ( рис. 1). Вырезать нерва недалеко от ганглия.
Примечание: На рисунке 1 иллюстрирует запись от дистальной ветви нерва на стр. Нерв предположительно содержит смесь таза и поясничного чревного афферентных волокон. Кроме того, запись может производиться из PN и/или номер LSN проксимальнее стр - Включите Отопление ванна и теплый Кребс решение поддерживать температуру камеры на 34 ± 0,5 ° C.
5. Подготовка всасывания электрода
- взять предварительно вытащил стеклянные пипетки (шаг 2) и осмотрите его под микроскопом рассечения. Разорвать наконечник электрода с парой щипцов, так что это размер совместимы с диаметром нерв для того чтобы быть записаны.
- Рельеф кончик, разместив его рядом легче блика.
6. Электрофизиологические запись
- Connect среза электрода для держателя электрода. Подключение 10-мл шприц в сторону порт на держателе применять положительное или отрицательное давление к электроду.
- Подключите держателя к headstage bioamplifier и смонтировать headstage на манипулятор.
- Перемещение электрода в ванну ткани и заполняют раствором Кребс электрода, применяя нежный всасывания до тех пор, пока он связывается Серебряная проволока держателя. Место электрода недалеко от отрезока конце нерва и применить отрицательное давление сосать нерва в электрода. Применить более отрицательным давлением, так что ~ 1 мм нерва pulled в электрода и образует плотное прилегание.
- Поворот на bioamplifier и установите фильтр для 300-3000 Гц. контролировать сигнал на осциллограф и записывать нерва (20 кГц частота дискретизации) и сигнал давления внутрипросветная (частота 100 Гц), с помощью компьютера с обработкой данных Спайк программное обеспечение.
7. Тестирование Colonic афферентных чувствительность
- Применить рамп растяжение толстой кишки, закрыв трехходовой кран на выходе канюля при непрерывно вливая intraluminally. Контролировать внутрипросветная давление до тех пор, пока он достигает 60 мм рт.ст., в котором время открытой трехходовой кран на дренажный катетер.
- Повторите эту процедуру на регулярной основе 15 мин применить наркотиков дополнительных - или intraluminally для проверки химической чувствительности афферентных нервов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 представлена схематическая иллюстрация экспериментальной установки для подготовки colorectum ex vivo «трубу», с представителем записи от дистальной нерва на стр. Нерв предположительно содержится смесь чревного афферентов таза и поясницы. В подготовке от нормальных крыс кишечных афферентных нервов, как правило, имеют низкий уровень нерегулярных спонтанной активности. Рамп растяжение толстой кишки вызывает постепенное увеличение скорострельность (рис. 1B). Свойство mechanosensory каждый нерв представлена путем построения кривой отклика внутрипросветная давления афферентных нервов (рис. 1 c). Усредненное давление ответ кривых можно сравнить между группами (например, регулирование против лечение) выявить, является ли лечение изменяет свойство mechanosensory кишечных афферентных нервов, (см. Rong et al. 13 для подробной информации о кривой давления афферентные отклика).
Кроме того, записи могут быть изготовлены из PN или номер LSN проксимальнее стр. рис является представителем записи из комплекта PN, выставлены в ответ mechanosensory качественно похож на пачке дистальной PG, показано в Рисунок 1В. основной компонент анализа нейронных сигнала позволяет для идентификации единичного деятельности. Размеченные одной единицы классифицируются как низкого порога (LT) волокон, широкий динамический диапазон (WDR) волокон и волокон (HT) высокий порог, согласно профили ответы на растяжение. LT единиц активируются при давлении низкий растяжение, и скорострельность достигает максимума на около 20 мм рт.ст.. WDR единицы также активируются при давлении низкий растяжение, и скорострельность продолжает расти как внутрипросветная давление увеличивается (рис. 2A и C). HT единиц активируются при давлении растяжение > 20 мм рт.ст. (см. Донг и др.) 4.
Химической чувствительности толстой афферентов может быть проверена путем superfusion (ванна приложения) или инфузии внутрипросветная. Например применение баня 10 µM 5-HT вызвало незначительное увеличение, тогда как капсаицин на 0,3 мкм вызывали надежные увеличение таза афферентный разряд, которые последовали за снижение активности благодаря десенсибилизации (рис. 3).
Рисунок 1. Электрофизиологические запись крыса кишечных афферентных нервов в пробирке. A. схематическая иллюстрация ex vivo «трубки» Колон подготовки крысы. Colorectum с прилагаемой PG, superfused в зале звукозаписи и является канюлированной на обоих концах. Настой внутрипросветная достигается с помощью шприцевый насос и движется в устные анальный направлении. Растяжение толстой кишки осуществляется путем закрытия трехходовой кран (d) на выходе канюли. Ветвь штраф нерва от PG режется и записаны с помощью всасывания электрода. Также показаны филиал LSN и три ветви присоединения PG PN. . проксимальный конец разреза тонкой нерва, проектирование в толстой кишке. б. вырежьте Дистальная нерва всасывается в электрода. c. вырезать конец два штрафа нервов, проектирования до мочевого пузыря. Номер LSN: поясничного чревного нервов, PN: тазовых нервов. B. представитель следы кишечных афферентных нервных сигналов и внутрипросветная давления. C. участок кривой давления ответ этого нерва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель электрофизиологических запись от филиала тазовых нервов во время Ramp растяжение Colorectum Ex Vivo . A. ответ шаблон двух отдельных единиц (WDR и LT единиц), а также состоящих из нескольких единиц mechanosensory ответ во время рамп растяжение. Б. схематическая иллюстрация нерва расслоение записывается. Номер LSN: поясничного чревного нервов, PN: тазовых нервов. C. накладывается сигнала двух отдельных единиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представитель электрофизиологических запись от филиала тазовых нервов во время применения баня 5-HT и капсаицин. (Слева) Приложение 10 µM 5-HT. (право) применение капсаицина 0,3 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь является относительно простым экспериментальный метод для оценки электрофизиологических свойств толстой афферентов крыс. Протокол (от рассечение тканей для создания записи нерва) обычно занимает около 2 часов для завершения. Важнейшие шаги ткани коллекции (шаг 3) и подготовка всасывания электрода (шаг 5). Важно быть в состоянии найти PG, LSN и PN и заботиться, чтобы не повредить ганглия и нервы во время рассечение тканей. Наконечник пипетки стеклянные должны быть сломаны и скошенный размер совместим с нерва расслоение.
Подготовка обычно жизнеспособной на несколько часов, позволяя для изучения mechanosensitivity, химиочувствительность и фармакологические профили колоректального афферентных нервов. По сравнению с «плоским лист» подготовка11, в котором механическая стимуляция применяется через слизистой поглаживание или продольных растяжения, этот препарат «трубка» позволяет рампе или градуированные растяжение по аналогии с применением колоректального растяжение (CRD) на наркотизированных или просыпаются животных для оценки висцеральной боли. Используя аналогичный протокол, Винн и др. 3 изучал вклад purinergic рецепторов к трансдукции mechanosensory крыса толстой афферентов и обнаружил, что толстой афферентов были активированы приложением Ванна СПС (P2X и P2Y агонист) и α, β-meATP (P2X агонист) и что вздутие индуцированной таза афферентный разряд был аттенуированных антагонисты рецепторов P2. Совсем недавно, мы сравнили mechanosensory ответы толстой афферентов между нормальной и Стрептозотоцин (СТЗ)-индуцированной диабетической крысы. Мы обнаружили значительное снижение состоящих из нескольких единиц афферентных нервных ответов на рампе растяжение по ex vivo Колон в диабетической крысы (3-6 недель после инъекции СТЗ) по сравнению с крысы управления. Снижение mechanosensory ответ в толстой афферентов наблюдаемые в vitro согласуется с ослабленной visceromotor ответ (VMR) в естественных условиях CRD в группе диабетической. Единичного анализ показал, что нарушение mechanosensitivity LT и WDR волокна могут лежать в основе афферентных пониженная чувствительность в диабетической Колон4. Используя аналогичный протокол, мы также успешно записана из мышиных толстой афферентов и обнаружено значительно повышенной возбудимостью кишечных афферентных DSS-индуцированной IBD мышей (неопубликованные наблюдения).
Colorectum иннервируется грудо/подчревной и пояснично-крестцового/таза афферентных волокон1,2. Выясняется, что эти два набора первичных афферентов могут существенно отличаться в их функциональных свойств и может означать различные качества толстой раздражители14,,1516,17 . Важным преимуществом нынешнего протокола является ее потенциал сравнительно изучить подчревной и таза афферентов colorectum. Как показано на рисунке 1, седалищного нерва чревного (подчревной) и 3-4 ветвей PN проходят через основные ПГ и затем проект по убыванию толстой кишки и мочевого пузыря. Мы отметили, что качественно похож на что нерва дистальнее PG, которая предположительно содержит смешанные поясничного чревного и таза афферентов ответ mechanosensory комплекта PN. Технически это весьма возможно разместить два всасывания электроды вблизи PG одновременно записывать номера LSN и PN и оценить, если они по-разному реагируют на механическую и химическую стимуляцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Этот протокол был поддержан научно-исследовательских грантов от национального фонда Китая естественных наук (#31171066, #81270464) и китайско-немецкий научный центр (GZ919).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
