Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

En Guide till produktion, kristallisering och strukturbestämning av mänskliga IKK1/α

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091

Summary

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) är en Ser/Thr proteinkinas som är inblandad i en myriad av cellulära aktiviteter främst genom aktivering av NF-κB transkriptionsfaktorer. Här beskriver vi de viktigaste stegen som krävs för produktion och crystal strukturbestämning av detta protein.

Abstract

En klass av extracellulära stimuli kräver aktivering av IKK1/α att inducera generation av en NF-κB subenhet, p52, genom bearbetning av dess föregångare p100. P52 fungerar som en homodimer eller en heterodimer med en annan NF-κB subenhet, RelB. Dessa dimerer reglerar i sin tur uttrycket av hundratals gener involverade i inflammation, cellöverlevnad och cellcykeln. IKK1/α återstår primärt associerade med IKK2/β och NEMO som en ternär komplex. Dock har en liten pool av det också observerats som en låg molekylvikt complex(es). Det är okänt om p100 bearbetning aktiviteten utlöses av aktivering av IKK1/α inom den större eller mindre komplexa poolen. Konstituerande aktiviteten av IKK1/α har upptäckts i flera cancer och inflammatoriska sjukdomar. För att förstå mekanismen för aktivering av IKK1/α och aktivera dess användning som drog mål, vi uttryckte rekombinant IKK1/α i olika värdsystem, exempelvis E. coli, insekt, och däggdjursceller. Vi lyckats uttrycka lösliga IKK1/α i baculoviridae infekterade insekt celler, att erhålla mg mängder mycket rent protein, utkristalliseras det i närvaro av hämmare och bestämma dess röntgen kristallstruktur. Här beskriver vi de detaljerade anvisningarna för att producera rekombinant protein, dess kristallisering och dess röntgen kristall struktur beslutsamhet.

Introduction

Transkriptionell aktiviteter i familjen NF-κB dimeriskt transkriptionsfaktorer som krävs för olika cellulära funktioner alltifrån inflammation och immunitet till överlevnad och död. Dessa aktiviteter är strikt kontrollerade i celler och en förlust av förordning leder till olika sjukdomstillstånd, inklusive autoimmuna sjukdomar och cancer1,2,3. I avsaknad av ett stimulus hålls NF-κB verksamhet hämmade av IκB (hämmare av - κB) proteiner4. Fosforyleringen av specifika Ser rester på IκB proteiner markerar dem för ubikvitinering och efterföljande proteasomen nedbrytning eller selektiv bearbetning5. Två mycket homologa Ser/Thr kinaser, IKK2/β och IKK1/α, fungera som central regulatorer av NF-κB aktiviteter genom att utföra dessa fosforylering händelser6,7.

Interaktioner mellan en ligand och en receptor transduces en signal genom en serie av mediatorer som leder till aktivering av NF-κB faktorer. NF-κB signalering processen kan i huvudsak delas in i två distinkta vägar – kanoniska och icke-kanoniska (alternativa)8. Aktiviteten av IKK2/β reglerar främst NF-κB signaleringen av canonical-vägen som är väsentlig för inflammatoriska och medfödda immunsvar9. Ett distinkt inslag i denna väg är en snabb och kortvarig aktivering av IKK2/β10 inom en hittills biokemiskt uncharacterized IKK komplexa — förmodas vara sammansatt av IKK1 och IKK2, samt en reglerande komponent, NEMO (NF-κB viktig Modulator )11,12,13. Mellan två katalytisk IKK subunitsna av komplexet IKK, IKK2 är primärt ansvarig14 för fosforyleringen av specifika rester av prototypiska IκBs (α, - β, & -γ) bundna till NF-κB och också en atypisk IκB protein, NF-κB1/p105, vilket är en föregångare av NF-κB p50 subenhet5. Fosforylering inducerad ubikvitinering och proteasomen nedbrytning av IκB (eller bearbetning av p105) leder till frigörande och aktivering av en specifik uppsättning av NF-κB dimerer15. Avvikande NF-κB aktivitet på grund av mis reglerad funktion av IKK2 har observerats i många cancerformer samt som autoimmuna sjukdomar2,3,16.

I motsats till IKK2/β reglerar aktiviteten av IKK1/α NF-κB signalering av icke-kanoniska väg, vilket är nödvändigt för utveckling och immunitet. IKK1 phosphorylates specifika rester av NF-κB2/p100 på sitt C-terminal IκBδ segment, vilket leder till dess bearbetning och generering av p52. Bildandet av transcriptionally aktiva p52:RelB heterodimer initierar en långsam och ihållande svar till utvecklingsmässiga signaler7,17,18,19,20. Intressant, är generering av den centrala NF-κB faktor p52 av denna väg kritiskt beroende av en annan faktor, NF-κB inducerande Kinase (NIK)21,22, men inte på IKK2 eller NEMO. I vilande celler, NIK är fortsatt låg på grund av dess konstant proteasom-beroende nedbrytning23,24,25. Vid stimulering av celler av 'icke-kanoniska' ligander och i vissa maligna celler, NIK blir stabiliserad för att rekrytera och aktivera IKK1 / α. Kinas verksamheter av både NIK och IKK1 är avgörande för effektiv bearbetning av p100 till p527. IKK1 och NIK fosforylera tre serines (Ser866, 870 och 872) av NF-κB2/p100 på sitt C-terminal IκBδ segment leder till dess bearbetning och generering av p52. Avvikande aktivering av den icke-kanoniska vägen har varit inblandad i många maligniteter inklusive multipelt myelom26,27,28.

Flera mycket effektiv och specifika hämmare för IKK2/β är kända, även om ingen har hittills visat sig vara ett effektivt läkemedel. Däremot är IKK1/α-specifika hämmare gles. Detta kan bero dels från vår brist på strukturella och biokemiska information på IKK1/α, som begränsar vår förståelse av den mekanistiska grunden för aktivering av NF-κB av IKK1 i celler och rationell läkemedelsdesign. Röntga strukturerar av IKK2/β gett oss insikter om aktiveringsmekanismen av IKK2/β29; dessa strukturer kan dock inte avslöja hur olika uppströms stimuli utlösa aktivering av IKK1/α eller IKK2/β för att reglera olika uppsättningar av NF-κB verksamhet 30,31. Att förstå den mekanistiska grunden underliggande funktionen distinct signalering av IKK1/α, och att inrätta en plattform för rationell läkemedelsdesign, fokuserade vi på att bestämma strukturen av IKK1/α.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av rekombinanta Virus lämplig för storskaliga uttryck för IKK1/α

  1. P1 virus förberedelse 32
    1. Dag 1: Plattan Sf9 celler (~ 6 X 105) (passage nummer mindre än 10) i 2 mL av Sf900 III insekt cell medium i varje brunn 6-well platta och inkubera vid 27 ° C. Passagen celler när de når en densitet på 2 till 3 X 106 celler per mL i suspension genom spädning i färska media på en densitet på ~ 6 X 105.
    2. Dag 2: Späd 8 µL Sf9-transfection reagens i 100 µL av Sf900 III eller Graces insekt Medium utan antibiotika och serum. Vortex kort.
    3. Späd 1 µg av kit-renat rekombinant bacmid (Detaljer finns i 'Representant resultat')32 till en annan 100 µL av samma medium, i ett separat rör.
    4. Kombinera utspädda DNA och transfection reagens (total volym ~ 210-220 μL) och odla i rumstemperatur 15-30 min.
    5. Ta bort mediet från brunnen. Tillsätt 1 mL färsk medium utan antibiotika och serum.
    6. Tillsätt den utspädda DNA-transfection reagens blandningen droppvis på cellerna. Justera droppe storlek så att det inte att rubba vidhäftande celler.
    7. Efter ~ 6 h, tillsätt 1,5 mL färsk medium på toppen eller ta bort mediet och tillsätt 2,5 mL färsk medium. Varma färska medium till 25-27 ° C innan tillägg.
    8. Inkubera cellerna på 27 ° C. Kontrollera brunnarna regelbundet varje ~ 12 h för tecken på virusinfektion. Utföra alla Sf9 underhåll och uttryck på 27 ° C.
    9. Dag 5: Ta ut mediet som innehåller celler 60-72 h efter infektion. Centrifugera under 5 minuter vid 500 x g- och 4 ° C. Spara supernatanten; Detta är P1-virus beståndet. Frysa små portioner vid-80 ° C.
  2. Välja den bästa uttrycker P1 virus klon.
    1. Platta celler på samma sätt som beskrivs i steg 1,1.
    2. Nästa dag eller ~ 6 h inlägg plätering, tillsätt 20 µL och 50 µL av olika P1 virus klon bestånd på cellerna i olika brunnar.
    3. Rubba de vidhäftande cellerna av mild pipettering och skörda infekterade celler 60-72 h efter infektionen genom centrifugering under 5 minuter vid 500 x g- och 4 ° C. Spara supernatanten. Det här är P2 virus beståndet. Lagra små delprover av beståndet vid-80 ° C.
    4. Tillsätt 100 µL av 2 x Laemmli SDS buffert till skördade cellpelleten. Värm på > 95 ° C i 10 min. Centrifugera (oftast > 10 000 x g) under 5 minuter.
    5. Kör 10-15 µL av varje prov på 8-10% SDS-PAGE på 120-160 V tills dye framdel når botten av gelen.
    6. Electro-överföring löst proteinerna av standard halvtorr överföra protokollet (20 V, 30-45 min) på nitrocellulosa/PVDF membran.
    7. Blot med anti-IKK1 antikropp (utspädning ~ 1:2, 000, måste optimeras) eller anti-PentaHis antikropp (utspädning ~ 1:3, 000, måste optimeras) för uttryck.
    8. Välja den bästa P1 virus klonen genom att jämföra uttrycket av rekombinant IKK1.
  3. Beredning av storskaliga P3 virus lager.
    1. Platta celler på samma sätt som beskrivs i steg 1.1 i en 15 cm tallrik innehållande 25-30 mL Sf900 III medium.
    2. ~ 6 h post plätering, tillsätt 150-300 µL bäst uttrycker P1 virus beståndet på cellerna.
    3. Efter 72 h efter infektion, aspirera på medellång noggrant från plattan i en lämplig slang (steril) och centrifugera röret vid 500-1000 X g under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera cellpelleten (om en bildats) och spara supernatanten. Det här är P3 virus lager.
  4. Att bestämma optimal virus titern för storskaliga proteinuttryck
    1. Platta celler i 2 mL av Sf900 III medium, som beskrivs i punkt 1.1, i en 6-bra platta.
    2. Lägg till 20, 30, 40 och 50 µL av P3 virus lager i separata brunnar ~ 6 h inlägget plätering. Inkludera en icke-infekterade kontroll.
    3. Skörda celler från varje väl 48-60 h post infektion.
    4. Tillsätt 100 µL av 2 X Laemmli SDS-buffert. Värm på > 95 ° C i 10 min. Centrifugera (vanligtvis på 14 000 x g) under 5 minuter.
    5. Lös 10-15 µL av varje prov i en 8-10% SDS-PAGE gel.
    6. Överföra löst protein till ett nitrocellulosa/PVDF membran som nämns i 1.2.6.
    7. Blot med anti-IKK1 antikropp (utspädning ~ 1: 2000, måste optimeras) eller anti-PentaHis antikropp (utspädning ~ 1:3000, måste optimeras).
    8. Använda viruset med det bästa som uttrycker titern för storskaliga uttryck.

2. stor skala uttryck för 6 x-hans etiketten mänskliga IKK129,33

  1. Utföra storskaliga uttryck i en suspension kultur. Dela celler i 1 L Sf900 III medium i en 2 L Erlenmeyerkolven med en ventilerad cap. Cell densiteten bör ~ 5 x 105 celler/mL.
  2. Odla dessa celler i suspension på ~ 100 rpm vid 27 ° C i en shaker ~ 2 dagar tills den når en densitet på 1-2 x 106/ml. Cell densiteten får inte överstiga6/2 x 10 ml.
  3. Tillsätt önskad mängd P3 virus, bedömt i 1.4.
  4. Växa de infekterade kulturen för 48-60 h på ~ 100 rpm vid 27 ° C i en shaker.
  5. Skörda celler genom centrifugering vid < 1 500 x g vid 4 ° C.
  6. Spara cellpelleten och kassera medium.
  7. Gå vidare till protein rening direkt. Blixt frysa cellpelleten i flytande kväve och förvaras vid-80 ° C för framtida bruk.

3. rening av hans-IKK133

  1. Dag 1, Återsuspendera cellpelleten i 40 mL lyseringsbuffert (25 mM Tris pH 8,0, 0,2% NP-40, 200 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 10% Glycerol, 5 mM β-merkaptoetanol och proteashämmare cocktail).
    Obs: Våt cellpelleten massan var inte beslutsamt. Vanligtvis användes ~ 2 L av kultur för det här steget.
  2. Lysera celler av ultraljudsbehandling på 60-70% tull cykler, 5-10 pulser av 30 s längd med ett intervall på > 1 min, att hålla cellsuspensionen kyld på is.
    Obs: Detta steg kräver optimering med varje modell av någon sonikator. Låt inte provet värma upp över 10 ° C.
  3. Klargöra den lysate genom centrifugering vid ≥ 28 000 x g i 45 min vid 4 ° C.
  4. Temperera 4 mL agaros som Ni-NTA harts med lyseringsbuffert och blanda den klargj橬一j lysate (supernatanten) efter tillverkarens protokollet.
  5. Låt proteinet att binda kådan genom inkubation för 2 h på en roterande mixer i en 4 ° C-rum.
  6. Tvätta kådan med den lyseringsbuffert innehållande 30 mM Imidazol. Kontrollera proteinkoncentration i tvätta fraktionen med jämna mellanrum med Bradford Assay. Tvätta tills denna proteinkoncentration i tvätta fraktionen når 0,1 mg/mL. Normalt krävs > 20 säng volymen av tvättbuffert för att nå denna punkt.
  7. Eluera hans-taggade IKK1/α protein under gravitation flöde, med 20 mL eluering buffert (den lyseringsbuffert innehållande 250 mM Imidazol). Samla 1-1,5 mL fraktioner.
  8. Kontrollera renhet eluerade protein på en 8 eller 10% SDS PAGE gel genom att läsa in 5-10 μL av prov från alla fraktioner blandas med Laemmli buffert.
  9. Pool peak fraktioner (koncentration ≥ 2mg/mL), och mäta proteinkoncentration med Bradford-analys.
  10. Smälta med TEV (1:30-50 (TEV proteashämmare: IKK1)) proteashämmare över natten (≥12 h) vid 4 ° C.
    Obs: Optimera mängden TEV proteas krävs för att slutföra (≥ 95%) rötning av de 6 X-hans tag en priori. TEV proteas renades i huset.
  11. På morgonen dag 2, inkubera proteinet med 1 mM ATP i närvaro av 20 mM MgCl2, 20 mM β-glycerofosfat, 10 mM NaF och 1 mM natrium orthovanadate för 1 h på 27 ° C.
  12. Filtrera protein lösningen genom ett 0,45 eller 0,22 μm filter.
  13. Ladda 6 mL av provet på en ~ 120 mL preparativ storlek-utslagning kolumnen kopplad till en automatiserad Vätskekromatografisystem. Jämvikta kolonnen med buffert A (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% Glycerol), före tillämpning av protein provet.
    Obs: En mindre kolumn kan användas beroende på avkastningen av protein efter den Ni-NTA affinitet reningssteg. Justera/beräkna Ladda volym för att vara 5% av kolumn volym).
  14. Kör storlek-utslagning kromatografi med en flödeshastighet av 1 mL/min och övervaka eluering vid 280 och 254 nm. Samla in fraktioner av 2 mL storlek.
  15. Kontrollera renheten av peak fraktioner (vanligtvis runt ~ 60-70 mL) på en 8-10% SDS-PAGE gel.
  16. Poolen ren fraktioner (renhet ≥ 95% med en koncentration av ≥0, 5 mg/mL) och koncentrat i en 10 kDa eller 30 kDa molekylvikt cut-off centrifugal protein koncentrator följa tillverkarens instruktioner.
  17. Regelbundet kontrollera proteinkoncentration av koncentratet av Bradford metoden och koncentrera provet upp till 8-12 mg/mL.
  18. Fördela 25 μl portioner och flash frysa i flytande kväve. Förvara dessa flash frysta prover i-80 ° C frysen.

4. skärmen för kristallisering villkorar av IKK1

  1. Beräkna den totala mängden (i volym) protein krävs till skärmen för kristaller efter de metoder som beskrivs nedan.
  2. Prova olika hämmare (generiska kinashämmare: AMPPNP och Staurosporine; IKK-specific hämmare: MLN120B, förening A och IKK-hämmare XII) att utföra screening för kristallisering. Gör stamlösningar av dessa föreningar som efter tillverkarens anvisningar. Se till att den maximala koncentrationen av föreningen i dess stamlösning inte överstiger 20 μM.
  3. Förbereda den komplexa IKK:inhibitor skärmen kristallisering av blandande 100 μM av IKK1 med 200 μM-hämmare och inkubera vid 18-20 ° C för 30-40 min. Centrifugera blandningen på > 15 000 x g under 2 minuter vid rumstemperatur. Spara supernatanten för kristallisering skärm.
  4. Använda kommersiellt tillgängliga kristallisering skärmarna (se Tabell för material).
  5. Tillsätt 80-100 μL av varje kristallisering reagens (reservoar solutions), med hjälp av en multikanalpipett eller en robot, in i reservoaren av en plattan med 96 brunnar. Plattan är nu redo att ställa in droppar. Se till att plattan rymmer 2 till 3 kristallisering droppar så att 2 till 3 hämmare kan undersökas i en enda skylt.
  6. Använder en kristallisering robot, fördela och blanda 0,2 – 0,25 μL av IKK1:inhibitor komplex med samma volym av reservoaren lösning.
    Obs: Screening kan utföras manuellt med större droppe volymer (0,5-1,0 μL av IKK1:inhibitor komplex med samma volym av reservoaren lösning). Användning av en robot skulle dock hjälpa Spara värdefulla reagenser.
  7. Förslut plattorna omedelbart efter att droppar med optiskt klart filmer för att undvika avdunstning. Täta ordentligt med lämpliga applikator. Göra replika plåtar för varje hämmare. Inkubera i en platta på 18 ° C, och den andra i kylrummet (temperatur intervall ~ 4 – 6 ° C). Kontrollera att inkubatorer inte påverkas av vibrationer.
  8. Använd ett stereomikroskop med en polarisator för att kontrollera för utseende av kristaller i varje droppe varje dag under de första sju dagarna, och sedan med längre intervall. Systematiskt notera och Poäng dessa observationer.
    Obs: Använd ett stereomikroskop med ett polarisationsfilter så att tillväxten defekter i kristaller kan bedömas visuellt. Här, kristaller dök upp i ett tillstånd där den reservoar lösningen innehöll 3% w/v Dextran sulfat natrium salt Mr 5,000, 0.1 M BICINE pH 8.5, 15% w/v polyetylenglykol 20.000. Kristaller av IKK1 ökade endast i närvaro av IKK-hämmare XII.

5. Crystal tillväxt optimering29,33

  1. Beredning av stamlösningar.
    1. Förbereda 30% w/v lösningar av Dextran sulfat med olika molekylvikt (Avg. MW 5 000, 8 000, 15 000, 40 000 Da) i avjoniserat H2O. filterlösning med 0,22 μm filter.
    2. Laga 1 M eller 0,5 M lager av olika buffertar i intervallet pH 6,5-9. Filtrera lösningar med 0,22 μm filter.
    3. Förbereda 25% eller 50% (w/v) PEG lösningar av olika molekylvikt (gen. MW:1000, 1,500 3,350, 4000, 6000, 8.000, 10.000, 12.000, 20 000 Da). Filtrera lösningar med 0,22 μm filter.
    4. Utföra en grid skärm genom att systematiskt varierande pH, bufferttyp, koncentration och typ av både PEG och Dextran sulfat.
  2. Optimera screening både på 18 ° C, och i kylrummet (temperatur intervall ~ 4-6 ° C).
  3. Blanda lika mycket av den komplexa IKK1:Inhibitor med väl lösning och inkubera över väl lösningen i en sluten miljö. Detta steg kan utföras manuellt eller använda en tubens robot.
    Obs: Här, de största och väldefinierade kristallerna (enligt bedömning av enhetlig färg under polarisationsfiltret som anges enhetliga tillväxt) erhölls under följande förhållanden: 100 mM BisTris pH 7,0, 2,8-3,5% av Dextran sulfat (genomsnittliga MW 15 kDa), 8,5-10% PEG 20 kDa i kylrummet.

6. växande kristaller i stort antal

  1. Förbered följande lager lösningar och filtrera dem genom 0,22 μm filter.
    1. Förbered 0,5 M BisTris pH 7,0 och BisTris propan pH 7,0 och 7.5.
    2. Förbereda 30% (w/v) Dextran sulfat (genomsnittliga MW ~ 15 kDa). Förvaras vid 4 ° C.
    3. Förbereda 50% PEG (genomsnittliga MW ~ 12 kDa).
  2. Användning 24 väl hängande droppe plattor.
  3. Tätningsmedel smörj på upphöjda ringar i varje brunn.
  4. Förbereda väl lösningen enligt följande (slutlig koncentration): 100 mM BisTris pH 7,0-7,5, 2,8-3,5% Dextran sulfat ~ 15 kDa, 8,5-10% PEG ~ 12 kDa. Bered 1 mL väl i 1,5 mL rör.
    Obs: En mindre ändring i kristallisering skick observerades beroende på partiet med protein och/eller Dextran sulfat, således en testversion av ett smalt intervall rekommenderas. Både BisTris och BisTris propan buffertar av samma pH range avkastning enkristaller.
  5. Hålla väl lösningar och smord plattor i kylrummet för minst 1 h.
  6. Förbered IKK1:Inhibitor komplex som beskrivs i 4.3. Överföra de väl lösningarna från 1,5 mL tuber till de enskilda brunnarna i 24 väl plattan.
  7. Ren silikoniserad (kommersiella eller in-house (siliconization/silanisering)) glas täckglas använder luddfria servetter och tillämpa identifierat luft Högtrycksstrålar använder kommersiellt tillgängliga aerosol duster.
  8. Placera 1 – 1,5 μL av väl lösning på en ren täckglas. Pipettera lika stor volym av IKK1:inhibitor komplex, blanda försiktigt genom pipettering upp och ner 3 - 4 gånger. Slå glas cover slip och placera på respektive väl med pincett och täta brunnen genom att trycka på fettet.
  9. När du har konfigurerat alla dropparna 24-well platta, inkubera plattan i kylrummet i mörkret. Ibland kontrollera dropparna under ett mikroskop för uppkomsten och tillväxten av kristaller.
    Obs: Det har inte testats om ruvning crystal plattor under ljuset skulle förändra resultatet. Dock är det viktigt, att plattorna inkuberas i en miljö med minimum/ingen vibration.

7. Cryo skydd av kristaller

  1. Beredning av cryo lösningar.
    1. Förbereda Cryo A (~ 2% Dextran sulfat, ~ 10% PEG 12000, 60 mM BisTris propan (av samma pH som den avsedda väl lösningen), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 2,5% Glycerol).
    2. Förbereda Cryo B (~0.3% Dextran sulfat, ~ 10% PEG 12000, 60 mM BisTris propan (av samma pH som den avsedda väl lösningen), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 20 eller 25% Glycerol eller 20 eller 25% etylenglykol).
      Obs: Testa olika cryo-protectants förutom Glycerol och etylenglykol (t.ex., PEG 200, PEG 400, PEG MME 550, PEG 1000).
  2. Försiktigt ta bort glas cover slip som innehåller kristallen och placera den på en fast yta med den kristall droppe uppåt. Varsamt tillsätt 10 μL av Cryo A lösning ovanpå drop och blanda försiktigt genom pipettering så att kristallen inte är berört.
    Obs: Detta rengör crystal ytan av skräp och hjälpa jämvikta kristallen med inledande cryo bufferten. Undvik mekanisk och termisk stress till kristallen. Utföra alla de efterföljande stegen under lupp att undvika skada till kristallen.
  3. Långsamt ta lite vätska från kristallen och håll om 5-8 μl av lösningen. Undvik uttorkning av kristallen. Ta extrem försiktighet för att förhindra mekanisk stress och uttorkning av kristallen i alla efterföljande steg.
  4. Varsamt Tillsätt 2,5 – 4 μL av Cryo B lösningen på drop, blanda mycket försiktigt genom pipettering. Täck med en liten petriskål att undvika direkta luftflödet över kristallen. Vänta i 5 min. försiktig alltid kristallen inte drabbas av snabba förändringar av osmotiskt tryck eller uttorkning.
  5. Upprepa steg 7,4 fyra gånger långsamt acklimatisera sig kristallen i cryo lösning.
  6. Hålla 10 – 20 μL av cryo lösningen i detta skede (dvs.tillåta kristallen att badas i ca 20 – 25% cryo-protectant innehållande lösning). Blötlägg i olika tidsperioder (5 min till 1 h) i den slutliga cryo-lösningen.
  7. Frysa flera kristaller vid olika tidpunkter.
  8. Försiktigt plocka en enda kristall från rullgardinsmenyn i en lämplig cryo-loop monterad på en ordentlig bas och plunge-frysa i vätska N2. Utföra detta steg snabbt och smidigt att undvika isbildning på kristallen.
    Obs: Plocka kristallen med en slinga diameter något större än den längsta axeln i kristallen så att den kan monteras i den robotic goniometer används i Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory.
  9. Lagra kristallen som innehåller cryo-loopar i puckar nedsänkt i vätska N2. Lagra dessa puckar i vätska N2 Dewar kolv tills de är redo för leverans för röntgendiffraktion på synchrotron. Gå vidare till röntgendiffraktion datainsamling och bearbetning (avsnitt 8 och 9).
    Obs: Diffraktion IKK1 kristaller från hem röntgenkällor var inte tillräckligt hög upplösning för struktur bestämning prövningar, även om det anges kvaliteten på kristaller som skall kontrolleras på synchrotron. Alla diffraktion data samlades på olika linjer (främst 19ID) i förväg Photon Source, Argonne National Laboratory, USA.

8. röntgen datainsamling

  1. Samla in röntgendiffraktion data på den ID19 beamline APS synkrotron källan, använder remote data insamling programvara34.
    Observera: Uppemot 100 kristaller testades för deras diffraktion egenskaper. Kristallerna rutinmässigt bombarderas en resolution av den 7-11 Å, endast sällan kristaller som brytas till bortom 5 Å var observerade, och endast en stor kristall bombarderas bortom 4.5 Å. Eftersom kristallerna skämda snabbt under datainsamlingen, samlades datamängder på olika delar av samma kristallen. Detta var möjligt eftersom kristallerna var stor (större än 400 µm), och beam diameter används var 100 µm.

9. röntgen databehandling

  1. Sammanfoga alla datamängder som samlas in på olika delar av den samma crystal34.
    Obs: sju datamängder slogs från bästa kristallen och den resulterande data var 93% komplett. Övergripande jag / σ var ~ 6,8) och Rmerge var 89% i högsta upplösning soporna (5.4-4.5 Å).
  2. Processen datamängder med HKL200034 att erhålla utrymmegruppen, enhet cell dimensioner, halten lösningsmedel och rimliga sammansättning av asymmetriska enheten.

10. struktur lösning

  1. Utarbetande av Sök modeller
    1. Baserat på tillgängliga strukturella modeller av hIKK2 (pdb-id 4E3C och 4KIK35), generera en serie av dimerer med olika inriktningar av den N-terminala KD (som gör en öppning på 30 och 62 Å, mellan P578 av två KD i dimeren). Ingen av dessa modeller hämtade en molekylär ersättningslösning Sök efter omfattande studier.
    2. Generera en karta över IKK1 från singel-particle kryo-EM data33.
    3. Generera en modell av mänsklig IKK1 från IKK2 högsta upplösning struktur (pdb-id 4KIK).
    4. Docka de enskilda domänerna av mänskliga IKK1 modell i cryo EM densitet karta över mänskliga IKK1 med SOTHÖNA36. Detta roteras KD orientering ca 24 grader och modifierade den N-terminala öppning till ~ 58 Å.
    5. Gälla alla dimerer genereras i 10.1.1 KD orientering av cryo-EM utrustade modellen (monomeren).
  2. Molekylär ersättning
    1. Använda dimerer från 10.1.1 och 10.1.5 som Sök modeller i program PHASER37, MOLREP38 och CNS39,40.
      Obs: Här, med en av dimerer från 10.1.5 (52 Å öppning) som a Sök modell, sex dimerer (två hexamers) fanns i asymmetrisk enheten med hjälp av MOLREP. På 52 Å öppna i Sök modellen liknar 49-50 Å öppnandet av dimerer (alla sex dimerer) i förfinad struktur.

11. struktur förfining

  1. Struktur förfining förfarande
    1. Fixa orientering och position av denna första modell av stel kropp förfining i CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Förfina strukturen ytterligare med minimization och simulerade glödgning med en högsta sannolikheten målfunktion och en platta bulk lösningsmedels korrigering med hjälp av CNS system39,40.
    3. Bygga en modell baserat på 2FO-FC och Fo-Fc kartor med Xtalview41.
      Obs: Gäller DEN-assisted förfining42 och NCS hindrar under förbättringarna för bättre noggrannhet av modellen. Faktiskt DEN förfining förbättrats dramatiskt geometrier och R-faktorer av struktur, och den R-faktorn var 22,2% och gratis R faktor var 27,8% för den slutgiltiga modellen. Den dramatiska förbättringen av R gratis måste bero på en hög noggrannhet modell av IKK1 domäner som genererades från IKK2 modell (4KIK).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kloning och uttryck för olika konstruktioner av IKK1/α
Full längd mänskliga IKK1/α var klonade in i baculoviridae uttryck vektor pFastBacHTa inom dess mina och NotI begränsning platser att erhålla en N-terminal hexa-histidin märkta IKK1. Etiketten kan avlägsnas genom TEV proteas matsmältningen. Eftersom full längd IKK1/α innehåller flexibla regioner i båda ändarna, och flexibla regioner brukar göra ett protein svårt att kristallisera, klonade vi olika trunkerade fragment av IKK1/α inom de ovan nämnda platserna i pFastBacHTa vektor. Olika trunkering mutanter av IKK1/α genererades med både vildtyp (wt) och S176E, 180E (EE) ryggrader. IKK1/α EE refererar till den mimetiska den fosforylerade kinase konstitutivt aktiv form. Rekombinant baculoviridae produktion och proteinuttryck utfördes med ett tidigare publicerade protokoll med mindre modifieringar43 (figur 1).

Svårigheter i IKK1/α kristallisering
Eftersom mänskliga IKK2/β och IKK1 är homologa, och vi kan kristallisera olika versioner av mänskliga IKK2/β under flera olika förhållanden, förväntade vi IKK1/α kristallisera under liknande förhållanden med liknande strategier. Men efter omfattande studier med flera varianter av IKK1, vi fick kristaller med endast en stympad konstruera (IKK1 10-667 EE) (figur 2), och som också endast i närvaro av de IKK hämmare XII44 som visas lämplig Röntgendiffraktion egenskaper.

Struktur lösning
IKK1/α kristaller drabbats av många problem med tillväxt och data visas ofta mycket hög mosaicity. Svag crystal packning förknippas med stora halten lösningsmedel och den dynamiska karaktären av IKK1 monomer/dimeren är sannolikt orsaken till detta. För att kringgå dessa problem, mödosamma ansträngningar har vidtagits för att få bästa möjliga kristallerna och cryo-bevarande förfarandet utfördes med största omsorg under olika förhållanden och olika cryo-konserveringsmedel buffertar. Data samlades också med yttersta precision att minimera beam skadorna. Eftersom kristallerna var stora (största dimensionen ofta överstiger 400 µm), exponerades olika områden av samma kristallerna för röntgen balken att samla flera datamängder. Detta aktiverat olika datamängder skalas och få en någorlunda komplett datamängd med högre redundans och minimerat fel. Blötläggning med tunga atomer, eller tung atom kluster (t.ex., TaBr och TAMM), orsakade kristallerna till gravering otillräckligt. Även om vi kunde lokalisera positionen av TaBr kluster i härledda data, upplysningar den dåliga kvaliteten på data utöver den icke-isomorphocity liten, om någon, fas.

Vi bearbetade datamängder med HKL2000 med hjälp av olika tillgängliga parametrar. Diffraktionsmönster avslöjade att kristallen tillhör den utrymme grupp P21 med enhet cell dimensioner, en = 174.51, b = 186.94, c = 275.83 Å och β = 98.84 grader. Vi använde främst jag / σ att uppskatta cut-off och testade olika cut-off för datamängder. Vi fick en sammanslagna data uppsättning 4.5 Å resolution från 4 av 7 uppsättningar av diffraktion data samlas in på en kristall. Vi beslutade att hålla data tills 4.5 Å från visuell inspektion av den slutliga densitet kartan. Det kan vara värt att använda CC1/2, eftersom vi kan analytiskt uppskatta CC av sammanslagna datamängden mot de sanna (oftast omätbara) stödnivåer som använder CC *45. På grund av den stora enhet cellen kombinerat med låga symmetrin i utrymmegruppen, förutsåg vi asymmetrisk enheten innehåller 12 till 24 molekyler utifrån ett lösningsmedel innehåll på 70% till 40%.

Den kombinerade effekten av låg upplösning röntgen data med svag intensitet (dvs, betydande fel i data) (figur 3), stor (12) antal IKK1 molekyler i asymmetrisk enhet och konfirmerande variant av IKK1 monomer/dimeriskt modell jämfört med kända IKK2 hindrade modeller, inledningsvis oss från att erhålla en molekylär ersättningslösning IKK1, och därmed fastställa dess struktur.

IKK1/α- och IKK2/β båda innehåller en tyrosinkinashämmare domän (KD), en ubiquitin-liknande domän (ULD) och en en-spiralformade byggnadsställning dimerization domän (SDD). Strukturera av IKK1 visade att den bildar dimerer på samma sätt som IKK2 utnyttjar en nästan identisk mellan subenhet gränssnitt SDD distala region. IKK1 dimer visas dock en signifikant relativ positionering av den N-terminala KD i förhållande till SDD + ULD jämfört med kända IKK2 dimerer. Olika IKK2 strukturer anges tidigare olika intermonomer orientering i dess dimerer (figur 4panel A), så att avståndet mellan de alfa kol av P578 i två KD i fyra olika dimer modeller varierade mellan 39 och 61 Å. Eftersom sekvenserna av dessa två kinaser är mycket lika och rester på gränssnittet dimer är identiska, förväntade vi IKK1/α skulle bilda en liknande dimer; men eftersom det finns betydande skillnader i rester av KD-SDD-gränssnittet (t.ex., W424 och F111 i IKK2 är V och P respektive), vi förväntade kanske en ännu annan KD orientering i IKK1. Faktiskt antydde IKK1/α struktur att de relaterade riktlinjerna för KD att SDD är unik och den avviker från alla kända modeller av IKK2/β. Över hundra dimer användes modeller som Sök modeller i program PHASER, MOLREP och CNS utan framgång, som visar behovet av en ganska exakt Sök modell för framgång för molekylär ersättning prövningar, särskilt med våra lågupplösta data. En monomer modell har för lite massa att plocka upp någon lösning i svag diffraktion data av stora asymmetriska enheten som innehåller 12 monomerer. Också, att inbegripa eller utelämnandet av vatten i Sök modellen gjorde ingen skillnad i molekylär ersättning sökningar, särskilt på grund av svag diffraktion data. De CC1/2 och CC * anger att data upp till 4.5 Å är ganska exakt. Vi använde en konservativ resolution cut-off 4.5 Å utifrån jag / σ 1.5. Datamängderna med olika upplösning cut-off visade inte någon skarp skillnad under molekylär ersättning sökåtgärder och slutliga kartor raffinerade mot dessa datamängder visade inte någon tydlig förbättring i kartfunktioner på att utvidga upplösning cut-off. Den final bygget av modellen är ganska exakt, mer än vad kunde byggas från densiteten ensam, sannolikt eftersom de inledande molekylära ersättning modellerna byggdes från modeller kommer med en högupplöst data, och utnyttjade vi att cryo-EM karta/densitet dubbelkontrollera funktioner i kartan, särskilt i regioner där kartor var oklart.

I efterhand var obtainmenten av en användbar sökning modell möjligt bara på grund av tillgången på låg upplösning cryo-EM karta, och en ganska hög noggrannhet modell av IKK1 domäner som genereras baserat på hög upplösning IKK2 struktur (figur 4panel B). Vi kunde docka IKK1 domäner i cryo-EM karta över IKK1 att få en någorlunda nära dimer modell. Den första modellen anges en orientering av KD roteras ca 24 grader i förhållande till det av en IKK2 monomer och N-terminala öppnandet av 58 Å (mellan P578 av två KDs i en dimer). Våra tidigare kunskap om olika IKK2/β dimer strukturer (och deras variation) gjorde det möjligt att finjustera Sök modellen genom att ändra öppningar mellan 30-62 Å. använda en av dimerer (52 Å öppna) som a Sök modell, vi ligger sex dimerer i asymmetrisk enheten med program MOLREP46. Dessa sex dimerer är organiserade i två hexamers i enheten asymmetriska och beräknade lösningsmedlet har en volym på 68%.

Figure 1
Figur 1: rening av IKK1. (A) uttryck av IKK1 (10-667) i insekt celler. (B) ett flödesschema för rening av IKK1; (C) en SDS-PAGE gel visar renhet av IKK1 efter steget Ni-NTA affinitet kromatografi. (D) storlek-utslagning profil som visar dimer av IKK1. (E) SDS-PAGE gel visar renhet av IKK1 från topp storlek-utslagning fraktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: morfologi och storlek av IKK1 kristaller. (A) en kristall av IKK1 bygga 10-667; kristallisering drop visar också kristaller av en annan morfologi (tunna plattor) som inte gravering väl. (B) zoomas med tanke på kristallen som brytas till bortom 5 Å. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3:. Kristallografiska data som erhållits från IKK1 kristaller. (A) en X-ray diffraction profil av en IKK1 kristall som indikerar dålig diffraktion boenden av typiska IKK1 kristaller. (B) HKL2000 skalning statistik för sammanslagna datamängden används för IKK1 strukturbestämning och redundans av data. R linjär = Summa (ABS (I - < i >)) / SUM (jag), R square = Summa ((I - < i >) ** 2) / SUM (jag ** 2), Chi ** 2 = Summa ((I - < i >) ** 2) / (fel ** 2 * N / (n-1))), CC1/2 = korrelationskoefficienten, CC * = korrelationskoefficient på sammanslagna datamängd mot sanna stödnivåer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: utarbetande av Sök modeller. (A) olika modeller av IKK2 dimer som anger olika inriktningar av KD i förhållande till SDD (ger upphov till olika separation mellan två KD); dessa modeller testades initialt för att hitta en molekylär ersättningslösning utan framgång. (B) Generation av IKK1 Sök modeller - Cryo-EM karta över IKK1 dimer vid 11 Å upplösning; EM-karta försedd inledande IKK1 Sök modell, enskilda domäner är baserade på IKK2 modell (4KIK); En IKK1 Sök modell ytterligare böter-tweaked (lämpliga KD läggning) baserat på olika möjligheter som bedöms från IKK2 modeller beskriver ovan i 4A. Överlagring av EM-karta utrustade modellen till Sök modellen som gett den molekylära ersättningslösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Produktion, kristallisering och struktur lösning av två relaterade IKK proteiner
Vi fastställde för att bestämma röntgen kristallstrukturen av IKK1/α med uppfattningen att det skulle vara en relativt enkel övning som gett vår erfarenhet med IKK2/β proteinproduktion, kristallisering och strukturbestämning. Vi var dock mycket förvånad över att dessa två relaterade proteiner betett sig mycket annorlunda när det gäller användarvänlighet kristallisering. Trots ansträngningar från flera högprofilerade laboratorier tog bestämning av IKK1 struktur nästan två decennier. Detta till stor del härrörde från några viktiga flaskhalsar.

Den första svårigheten var att få en mycket ren och lösligt protein form. Insekt cell uttryck systemet aktiverat oss att få mg mängder av rent protein som var någorlunda lösligt. När det gäller graden av uttryck uttryckte alla IKK1/α konstruktioner på mycket lägre nivåer än IKK2/β konstruerar i insekt cellsystem uttryck. Det bör noteras att varken protein är lösliga och funktionella uttryckt i E. coli. I en insekt cell uttryck systemet, IKK2/β fragment uttrycks på höga nivåer varierade från 10 till 30 mg/L av kultur beroende på konstruktioner. IKK1/α konstruktioner kunde däremot genereras endast på 0,5 till 2,0 mg/L av kultur. Anledningen till denna skillnad är fortfarande okänt för oss. Vi bör också försöka uttryck för IKK1 i native värdceller (dvs, däggdjur överuttryck systemet vid en IKK däggdjursprotein), särskilt sedan de post-translationella modifieringarna såsom auto - eller trans-fosforylering vanligt förekommande i IKK sker mest effektivt och lämpligt sätt i sin ursprungliga miljö. Rening av IKK komplex direkt från storskaliga kultur av däggdjursceller är också för närvarande mottaglig.

Medan du arbetar med IKK2/β, märkte vi att det kan vara homogent auto-fosforyleras genom att behandla med ATP, och detta gör proteinet mottagliga för kristallisering. Likaså gav inkubering av IKK1 protein med ATP och den resulterande auto-fosforyleringen, en aktiverad IKK1 som var lösligt, och passar både biokemisk karakterisering och crystal strukturbestämning.

Ett kritiskt steg att få väl diffracting kristaller var att finjustera kristallisering villkoren, särskilt tillägg av lämplig typ och koncentration av Dextran sulfat molekyler. Tätheten indikerar bundna Dextran sulfat molekyler, och dess resulterande effekt på IKK1 var sannolikt avgörande för kristallisering.

Den inneboende flexibiliteten av IKK1, som ofta observeras i kinaser, är den primära avskräckande för kristallisering och är ofta kopplad till engagemang av Kinas domänen med den aktiveringen öglan. IKK2 med både infödda (S177 och S181) och phosphomimetic (EE) former av aktiveringen ögla serines kunde kristalliseras, men vi endast erhållas kristaller med trunkerade IKK1/α av SSNA till EE mutant versionen och att alltför endast i närvaro av IKK hämmare XII. Dessa kristaller bombarderas tillräckligt bra för strukturbestämning endast när den odlas i kylrummet (~ 4-6 ° C). Om vi möter en likaså obstinata beteende med någon IKK1 homolog (eller en IKK ortholog), kan vi prova olika ryggraden modifikationer (särskilt av aktiva platsen loop serine restprodukter som är vanligen fosforyleras). Vi kan också prova samtidig kristallisation i närvaro av samverkande partner proteiner. Många kinaser, däribland familjen IKK, interagera med partner proteiner och uppehålla sig inom högsta komplex.

Flera hämmare hjälpte producera IKK2 kristaller i olika förhållanden (t.ex., med både hög salt, PEG som en fällningsmedel), både på 18 ° C, och i kylrummet. Dock gav under liknande förhållanden och med en mängd hämmare, IKK1/α inte någon crystal. Användning av en större repertoar av hämmare kommer således säkerligen öka chanserna att hitta en som gör att kristallisering.

Ett annat viktigt steg i strukturbestämning var försiktig cryo-bevarande och data insamling förfarande. Den svaga data och snabba förfall av kristaller i röntgen balken motiverat behovet av större kristaller och samling av flera datamängder från samma kristallerna. Utan en rimlig komplett datamängd för hög noggrannhet, kunde vi inte lyckats att få en molekylär ersättningslösning.

Slutligen kunde vi inte bestämma IKK1/α struktur av molekylär ersättning med hjälp av mer än 100 modeller skapats från kända IKK2/β strukturella modeller finns i den offentliga databasen. Således, att erhålla en lämplig modell för en molekylär ersättningsförfarandet var ett måste. Cryo-EM karta, hög noggrannhet strukturella modeller av enskilda domäner, tillsammans med jämförande studier av tidigare fastställts IKK2 strukturer lett oss att få en Sök modell som hämtade oss på molekylär ersättningslösning.

Kristallisation av ett protein är till sin natur slumpmässigt, så trots efter ovanstående strukturerad vägledning, kan vi möta problem i utkristalliseras en annan IKK1 homolog eller en annan fullängds eller trunkerade konstruktion av den mänskliga IKK1. Oavsett, kunskap om dessa kritiska steg gör det möjligt för forskare att utforska rationell villkor som kommer att öka chanserna att få en väl diffracting IKK-kristall.

IKK1/α och IKK2/β visar liknande domän organisation men olika interdomain organisation
Inte överraskande, anta både IKK1/α och IKK2/β en mycket liknande domänarkitektur som härrör från deras hög sekvens likheten33,43. Som nämnts tidigare, både IKK1/α och IKK2/β vika in tre distinkta domäner: N-terminala kinase domän, ubiquitin som domän (ULD) och byggnadsställning dimerization domän (SDD). Både IKK1/α och IKK2/β bildar stabila dimerer där C-terminalen hälften av SDD delta i dimerization. Rester som dimeren bidrar är identiska. Inter-Domain samspelet mellan SDD/ULD och KD är dock något annorlunda eftersom dessa involvera olika restprodukter. Detta orsakade sannolikt också Kinas domänen relativ orientering till SDD i IKK1/α skiljer sig från det i IKK2/β. Detta var inte helt oväntat eftersom vi också följa skillnader bland tillgängliga IKK2/β dimer modeller. Intressant, kan IKK2/β dimerer ordna i tetramers i crystal galler även om denna tetramerization benägenhet är svag i lösning. Dock bildade IKK1/α dimerer unika hexamers. Dessa hexamers kan också observeras i lösning, även om bara en liten pool av IKK1/α dimerer finns som hexamers. Dessa tyder på att hexamerization sannolikt har en specifik och viktig funktion.

Att skilja funktionella skillnader från strukturella skillnader
IKK1/α och IKK2/β utför olika funktioner i celler. Förhållandet mellan IKK1/α funktion och struktur har dock förblivit svårfångade. IKK1/α helt klart föreligger i olika former: som gratis dimer eller hexamer och inom ett hittills uncharacterized hetero-trimer komplex tillsammans med IKK2/β och NEMO. Eftersom IKK2/β aktivering av kanoniska signalering inte kräver IKK1/α, oklar den funktionella rollen för IKK1/α i heterotrimer (canonical IKK-komplex). Det är också oklart om aktivering av IKK1/α framkallas av icke-kanoniska signalering beroende gratis dimeriskt IKK1/α eller hexameric IKK1/α. Eftersom mutationsanalys experiment visar att störningar av gränssnittet hexamer starkt påverkar icke-kanoniska signalering, är hexamerization sannolikt att vara väsentliga i något skede under icke-kanoniska signalering.

Utforma småmolekylära hämmare med IKK1/α struktur
Att veta IKK1/α struktur tillåter oss att undersöka ytan fläckar på en monomer eller fickor på Inter-Domain eller mellan monomeren gränssnitt, som kan riktas av små molekyler. IKKs har länge ansetts vara viktigt målmolekyler. Dock gör essentialitet av dessa kinaser i en mängd olika funktioner inklusive cellulära homeostas, organismers livskraft och immunitet det extremt svårt att rikta dem. Hittills har har ingen IKK-riktade molekyl hittats som kan användas på ett säkert sätt till patienter.

IKK1/α och IKK2/β är ofta riktade samtidigt av sin hämmare eftersom deras kinase domäner är mycket liknande i sekvens och struktur. Betydande forskningsinsatser har spenderats till att hitta specifika hämmare inriktning endast en av dessa två kinaser. Följaktligen, flera IKK2/β-specifika hämmare har upptäckts, varav vissa inte påverkar IKK1/α funktion. Men enligt vår kännedom inga sådan förening finns som effektivt hämmar IKK1/α utan störande IKK2/β funktion. Denna frånvaro kunde hänföras till avsaknaden av strukturell information på IKK1/α. Våra strukturella och cellulära studier visar att, även om domänen arrangemang och globala subenhet strukturer är mycket liknande i dessa två proteiner, de visar unika hög ordningens arrangemang anställa specifika ytan patchar33. Dessa skillnader som gör att olika interaktioner med associerade proteiner måste översätta till deras funktionella skillnader. Vi är hoppfulla om att dessa distinktioner som avslöjade mellan IKK1/α och IKK2/β inter - och intra-subunit interaktioner kan utnyttjas för att subunit-specifika alloster hämmare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi vill tacka Personalen på de linjer 19ID, 24ID och 13ID på Advanced Photon Source, Lemont, IL, för stöd under datainsamlingen på olika kristaller. Vi är tacksamma mot Dmitry Lyumkis, Salk Institute för att hämta oss låg upplösning cryo-EM karta i tidiga skeden av EM karta/modellbygge, som användes till att bygga den första IKK1 molekylära ersättning Sök modellen. Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från NIH grants AI064326, CA141722 och GM071862 till GG. SP är för närvarande en Wellcome Trust DBT Indien mellanliggande Karl.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Tags

Biokemi fråga 141 serin-treonin protein Kinase IKK1/α NF-κB kristallstruktur molekylär ersättning hämmare
En Guide till produktion, kristallisering och strukturbestämning av mänskliga IKK1/α
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Polley, S., Huang, D. B., Biswas,More

Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter