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Behavior

साइलोग्लाइकेन माइक्रोएरे परख के साथ मानव सेरा में एंटी-नेऊ 5 जीसी आईजीजी को प्रोफाइलिंग करना

Published: July 13, 2017 doi: 10.3791/56094
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University, 2Department of Chemistry, University of California-Davis

Summary

एक सियालोग्लिकैन माइक्रोएरे परख मानव-तंत्र में एंटी-नेयू 5 जीसी एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिससे कैंसर और अन्य पुरानी सूजन-मध्यस्थता वाले मानव रोगों के लिए यह एक संभावित उच्च-थ्रूपुट डायग्नोस्टिक परख बना सकता है।

Abstract

कोशिकाओं में कार्बोहाइड्रेट चेन (ग्लाइकन्स) का एक ढेर लगा हुआ है जो आमतौर पर कैंसर में बदल जाता है और इसमें सैयलिक एसिड (सीआ) अभिव्यक्ति में भिन्नताएं शामिल हैं ये अम्लीय शर्करा है जो 9-कार्बन रीढ़ की हड्डी हैं और कोशिका सतहों पर कैप वर्टेब्रेट ग्लाइकेंस हैं। स्तनधारियों में प्रमुख सेआ रूपों में से दो हैं एन -केटेलेनेरमिनिक एसिड (नेयु 5 एसी) और इसका हाइड्रोक्सिलाटेड फॉर्म, एन- ग्लाइकोलेनेमैनिक एसिड (नेऊ 5 जीसी)। जीन एन्कोडिंग cytidine 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) हाइड्रॉक्सीलेज़ (सीएमएएच) के निष्क्रिय होने के कारण मानव अंतर्जात Neu5Gc का उत्पादन नहीं कर सकते। लाल मांस और डेयरी के आहार उपभोग के माध्यम से मानव कोशिकाओं द्वारा विदेशी Neu5Gc का अधिग्रहण किया जाता है और बाद में कोशिका की सतह पर विविध ग्लाइकन्स पर दिखाई देता है, जो ज्यादातर कार्सिनोमा पर जमा होता है। नतीजतन, इंसान ने एंटी Neu5Gc एंटीबॉडी को परिचालित किया है जो कैंसर और अन्य पुरानी सूजन-मध्यस्थता वाली बीमारियों में विविध भूमिका निभाते हैं और जो संभावित नैदानिक ​​और चिकित्सीय रोग बन रहे हैंrgets। यहां, हम मानवीय सेरा में इस तरह के एंटी-नेऊ 5 जीसी एंटीबॉडी का आकलन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट सिआलाोग्लिक्कैन माइक्रोएरे परख का वर्णन करते हैं। Neu5Gc युक्त ग्लाइकैंस और उनके मिलान किए गए जोड़े नियंत्रण (Neu5Ac युक्त ग्लाइकान), प्रत्येक मुख्य प्राथमिक अमाइन के साथ, ईवॉक्सी-लेपित गिलास स्लाइड से संयोजक रूप से जुड़े हुए हैं। हम एक विशिष्ट नैनो प्रिंटर का उपयोग करके 56 स्लाइड्स के मुद्रण को एक 16-अच्छी तरह प्रारूप में दिखाते हैं, जो प्रिंट प्रति 896 एरे तक पैदा करने में सक्षम है। एंटी Neu5Gc एंटीबॉडी विशिष्टता, तीव्रता और विविधता के मूल्यांकन के लिए प्रत्येक स्लाइड 16 अलग-अलग मानव सीरा नमूनों को स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल इस मजबूत उपकरण की जटिलता का वर्णन करता है और एक सरणी प्रारूप में विभिन्न नैदानिक ​​नमूनों में Neu5Gc आहार कार्बोहाइड्रेट एंटीजन के प्रति प्रतिक्रिया की जांच करने के उद्देश्य के लिए एक बुनियादी दिशानिर्देश प्रदान करता है।

Introduction

सियास अम्लीय शर्करा हैं जो सेल-स्पेस ग्लाइकोप्रोटीन और वर्मीशैबल्स में ग्लाइकोलीपिड्स पर ग्लाइकन चेन को कवर करते हैं। सीआ अभिव्यक्ति कैंसर कोशिकाओं 1 में संशोधित की गई है और प्रगति और / या मेटास्टेसिस 2 , 3 के साथ संबंध है। स्तनधारियों में प्रमुख सेआ रूपों में से दो हैं Neu5Ac और इसकी हाइड्रोक्सीलाइटेड फॉर्म, Neu5Gc 2 सीएनएएच एंजाइम जीन एन्कोडिंग के विशिष्ट निष्क्रियता के कारण मानव Neu5Gc को संश्लेषित नहीं कर सकते। यह गैर-मानव Sia metabolically मानव कोशिकाओं के रूप में "स्व", आहार Neu5Gc युक्त खाद्य पदार्थ ( जैसे, लाल मांस) 4 , 5 से उत्पन्न होने वाली है। Neu5Gc मानव एपिथेलिया और एंडोथेलिया की कोशिका सतहों पर निम्न स्तर पर मौजूद है, लेकिन यह विशेष रूप से कार्सिनोमा में जम जाता है। Neu5Gc मानव humoral प्रतिरक्षा प्रणाली 2 , 6 द्वारा विदेशी के रूप में मान्यता प्राप्त है।Neu5Gc-ग्लाइकान की प्रतिजनी जटिलता Neu5Gc संशोधन, लिंकेज, अंतर्निहित ग्लाइकान और मचान, और उनके घनत्व सहित कई स्तरों पर उत्पन्न हो सकती है, सभी मनुष्यों 6 में विरोधी Neu5Gc एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की जटिलता से परिलक्षित। इनमें से कुछ एंटीबॉडी कार्सिनोमा बायोमार्कर और संभावित इम्युनोथेराप्पटिक्स 7 के रूप में कार्य करते हैं। विभिन्न सियालोग्लाइकेन्स 8 के chemoenzymatic संश्लेषण के आगमन ने ऐसे एंटीबॉडी के अधिक गहराई से विश्लेषण के लिए मार्ग प्रशस्त किया, जो ग्लाइकैन माइक्रोएरे तकनीक 9 , 10 के प्रयोग से सहायता प्रदान की गई थी। इस प्रकार, प्राकृतिक और सिंथेटिक कार्बोहाइड्रेट के बड़े पुस्तकालयों की आसान तैयारी और हेरफेर के साथ, कार्बन डाइऑक्साइड 10 , 11 के असंख्य कार्बोहाइड्रेट्स के इंटरैक्शन की जांच के लिए ग्लाइकन माइक्रोएरे एक शक्तिशाली उच्च-थ्रुपुटन प्रौद्योगिकी बन गए हैं , 12 , 13 सरणी प्रारूप में, कम मात्रा में सामग्री का उपयोग किया जाता है, और जैविक रूप से संबंधित ग्लाइकेंस के इस बहुविकल्प प्रदर्शन से एक प्रयोग में हजारों बाध्यकारी बातचीत की जांच की अनुमति मिलती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि बायोमार्कर की खोज के लिए और विभिन्न नमूने 7 , 12 में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए भी यह तकनीक लागू की जा सकती है।

सफल glycan माइक्रोएरे निर्माण के लिए तीन महत्वपूर्ण पहलुओं पर विचार करना आवश्यक है: प्रिंटर रोबोट प्रकार, ग्लाइकन संयुग्मन रसायन विज्ञान, और पहचान प्रकाशिकी। मुद्रण उपकरण के विचार के अनुसार, दो तकनीकों उपलब्ध हैं: संपर्क और गैर संपर्क प्रिंटर संपर्क प्रिंटिंग में, 1-48 इस्पात पिन एक मल्टी-प्लस सॉकेट प्लेट में गिलीकन समाधान युक्त डूबा हो जाते हैं और ग्लास स्लाइड सतह से सीधे संपर्क करके फ़ंक्शनल ग्लास स्लाइड पर देखा जाता है। समाधान राशि डीस्लाइड के लिए लाइव स्लाइड की सतह पर सुस्त अवधि का एक फ़ंक्शन होता है। आम तौर पर, नमूने पहले स्लाइड सतह पर मुद्रित होने से पहले एक ग्लास ब्लॉक (एकरूप स्पॉट तक पहुंचने के लिए) पर पूर्व-देखा जाता है। गैर-संपर्क प्रिंटर ( जैसे, पाइज़ो-इलेक्ट्रॉनिक प्रिंटर) में, ग्लाइकेंस नियंत्रित इलेक्ट्रिक सिग्नल का उपयोग कर गिलास केशिका से मुद्रित होते हैं। प्रिंटिंग से संपर्क करने के लिए अधिक सटीक मुद्रण प्राप्त करने के लिए बिजली के संकेत को पतला कैलिब्रेट किया जा सकता है। धब्बे के आकार और आकारिकी अपेक्षाकृत अधिक सजातीय हैं। एक अतिरिक्त लाभ प्रिंटिंग के बाद स्रोत प्लेट में वापस नमूनाकरण के रीसाइक्लिंग है। फिर भी, पाइज़ो-इलेक्ट्रॉनिक प्रिंटर का मुख्य नुकसान प्रिंटिंग टिप सीमा (4 या 8) है, जिसके परिणामस्वरूप बहुत लंबे मुद्रण अवधि होती है, जिससे स्लाइड स्थिरता, तापमान, आर्द्रता और नमूना वाष्पीकरण पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। गैर-संपर्क इंकजेट प्रिंटर को बड़ा नमूना संस्करण 14 की आवश्यकता है।

10 , 11 , 12 , 13 के साथ विकसित किया गया है। मुद्रित ग्लाइकैन माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी पर अत्यधिक विस्तृत जानकारी के लिए अनिश्चितडी जांचकर्ता, इन उत्कृष्ट समीक्षाओं को देखें 13 , 15 महत्वपूर्ण रूप से, एक Glycomics प्रयोग (मिराज) पहल के लिए हाल ही में न्यूनतम जानकारी आवश्यक नमूना तैयार करने के लिए 16 और 17 का विश्लेषण करती है इस बढ़ते क्षेत्र में मानकों में सुधार करने के लिए glycan माइक्रोएरे से डेटा रिपोर्ट करने के लिए दिशा-निर्देशों का वर्णन है।

यहां, हम एक 16-अच्छी तरह से प्रारूप में एक विशिष्ट संपर्क नैनो प्रिंटर का उपयोग करने वाले सियालोग्लाइकन माइक्रोएरे के निर्माण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रत्येक ग्लाइकेंस में एक प्राथमिक अमाइन होता है जो कि ईपीओक्सी-सक्रिय ग्लास स्लाइड्स को उनके सहसंयोजक लिंक में मध्यस्थता करता है। हम विभिन्न मानव सीरा नमूनों, एंटीबॉडी, और सिया-बाध्यकारी संयंत्र लैक्टिन का उपयोग करके एक स्लाइड के विकास और विश्लेषण का भी वर्णन करते हैं। सियालोग्लिक्कैन माइक्रोएरे एशेज में कई प्रमुख कदम शामिल हैं जिनमें सरणी निर्माण, प्रसंस्करण, विकास और विश्लेषण शामिल हैं। एरे का निर्माण AR की योजना बना रहा हैरे लेआउट, ग्लाइकेंस और स्रोत प्लेट तैयार करना, नैनो प्रिंटर को प्रोग्रामिंग करना, और स्लाइड्स प्रिंट करना। इसके बाद, स्लाइड संसाधित, विकसित और विश्लेषण ( चित्रा 1 ) हैं।

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Protocol

ह्यूमन सीरा नमूने इज़राइली ब्लड बैंक से प्राप्त किए गए थे और हेलसिंकी घोषणापत्र और तेल अवीव विश्वविद्यालय संस्थानिक समीक्षा बोर्ड के अनुसार इसका उपयोग किया गया था।

1. अर्रे निर्माण योजना और लेआउट

  1. स्लाइड लेआउट निर्धारित करें
    नोट: प्रत्येक स्लाइड में 16 उप-ऑरेज़ हैं, जो 16 समान ब्लॉकों में गिने गए बी 1 से बी -1 ( चित्रा 1 बी , पूरक चित्रा 1 ए ) में विभाजित हैं।
  2. पिन लेआउट निर्धारित करें प्रति स्लाइड चार उप-एरे (ब्लॉक) प्रत्येक मुद्रण प्रत्येक चार पिन का प्रयोग करें:
    पिन 1 प्रिंट्स ब्लॉक 1, 2, 9 और 10;
    पिन 2 प्रिंट्स ब्लॉक 3, 4, 11, और 12;
    पिन 3 प्रिंट्स ब्लॉक 5, 6, 13, और 14; तथा
    पिन 4 प्रिंट्स ब्लॉक 7, 8, 15 और 16 ( पूरक चित्रा 1 ए )।
  3. ब्लॉक और 384-अच्छी तरह से प्लेट लेआउट निर्धारित करें।
    नोट: जिस क्रम में प्रत्येक ब्लॉक में ग्लाइकन्स दिखाई देते हैं, वह सावधानीपूर्वक योजना बना रहा है। इस उदाहरण में arrएआई, प्रत्येक नमूना पर चार प्रतिकृतियां मुद्रित करें, नीचे-दाएं कोने पर स्थित होने के लिए फ्लोरोसेंट डिज़ाइन वाले स्पॉट्स को प्रिंट करें, और स्पॉट स्टैंडर्ड-वक्र आईजीजी (एसटीडी) स्पॉट छह बढ़ती सांद्रता ( पूरक चित्रा 1 बी ) पर मुद्रित करें।
    1. प्रत्येक मुद्रित स्थान के लिए, पहले 384-अच्छी तरह से प्लेट में सामग्री को चार कुओं में विभाजित करें (प्रत्येक पिन के लिए एक)
      नोट: 384-अच्छी तरह से प्लेट में सामग्री का क्रम तैयार ब्लॉक लेआउट ( पूरक चित्रा 1 बी-सी ) पर निर्भर करता है।

2. ग्लाइकेंस और स्रोत प्लेट की तैयारी

  1. ग्लाइकन मुद्रण बफर (300 एमएम फॉस्फेट बफर के 50 एमएल, पीएच 8.4) तैयार करें। 40 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी (डीआईडब्ल्यू) में 58.5 मिलीग्राम मोनोसडियम फॉस्फेट मोनोहाइड्रेट (एनएएच 2 पीओ 4 .1 एच 2 ओ) और 3. 9 जी डिएडियम फॉस्फेट हेप्टाइहाइड्रेट (ना 2 एचपीओ 4 .7 एच 2 ओ) वजन करें। पीएच 8.4 को 4 एम। मात्रा को 50 एमएल को समायोजित करेंनसबंदी के लिए 0.2-माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से डी फिल्टर।
  2. मार्कर बफर (187 मिमी फॉस्फेट बफर का 50 एमएल, पीएच 5) तैयार करें। 40 एमएल डायल में 28 9 मिलीग्राम मोनोसडियम फॉस्फेट मोनोहाइड्रेट (एनएएच 2 पीओ 4 .1 एच 2 ओ) और डिएडियम फॉस्फेट हेप्टाइहाइड्रेट (ना 2 एचपीओ 4 .7 एच 2 ओ) के 1.94 ग्राम का वजन। 1 एम एचसीएल का उपयोग करके पीएच 5 को टेटेट करें मात्रा को 50 एमएल में समायोजित करें और नसबंदी के लिए 0.2 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से फिल्टर करें।
  3. एसटीडी वक्र बफर (50 मिलीलीटर पीबीएस-ग्लिसरॉल: फॉस्फेट-बफरर खारा, पीएच 7.4, 100% ग्लिसरॉल स्टॉक से 10% ग्लिसरॉल के साथ पूरक) तैयार करें और नसबंदी के लिए 0.2-माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से फिल्टर करें।
  4. DIW में 10 मिमी में प्रत्येक ग्लाइकन स्टॉक समाधान तैयार करें। रिवर्स चरण उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण 18 पर प्रतिदीप्ति का पता लगाने से sialylated glycan सांद्रता का सत्यापन करें।
  5. ग्लाइकेन छपाई बफर के 100 μL की कुल मात्रा में प्रत्येक ग्लिकेन 100 माइक्रोन तक पतलासूक्ष्मदर्शी ट्यूबों में
  6. फ्लोरोसेंट डाई युक्त प्राथमिक अमाइन तैयार करें मार्कर बफर के साथ एलेक्सा 555-हाइडराइजैड को 1 मिलीग्राम / एमएल का सोल्यूबल करें और फिर 1 एमएल / एमएल की मात्रा 1 एमएल कुल मात्रा में कम करें।
    नोट: स्लाइड स्कैनर के अनुसार किसी भी अन्य प्राथमिक अमाइन युक्त डाई का प्रयोग उचित तरंग दैर्ध्य के साथ किया जा सकता है।
    नोट: मार्कर स्पॉट विश्लेषण के दौरान प्रत्येक ब्लॉक में ग्रिड संरेखण की सुविधा प्रदान करते हैं।
  7. मानव आईजीजी एसटीडी वक्र dilutions तैयार: एसटीडी वक्र बफर में 160 एनजी / μL पर मानव आईजीजी के स्टॉक समाधान के 0.5 एमएल तैयार करें। 80, 40, 20, 10, 5, और 2.5 एनजी / μ एल प्राप्त करने के लिए स्टॉक 1: 1 छः गुना कम कर देते हैं, सभी एसटीडी वक्र बफर में 200 μL की कुल मात्रा में होते हैं।
    नोट: प्रयोग के लिए उपयुक्त अगर अन्य आईजी के सटेटाइप इस्तेमाल किया जा सकता है ( जैसे, मानव आईजीए, आईजीएम, आईजीई, या एक अलग जीव के एक आईजी)।
  8. बर्फ पर 384 अच्छी तरह से प्लेट रखें इलेक्ट्रॉनिक मल्टी-पिपेट का उपयोग करना, प्रत्येक गिलीकैन, मार्कर के 7 μL की अनुपस्थिति, और एसटीडी वक्र आईजीजी-चार प्रतिलिपिप्लेट लेआउट ( अनुपूरक चित्रा -1 सी ) के अनुसार प्रत्येक-के अनुसार बेहतर सटीकता के लिए, प्रत्येक नमूने के 35 μL लोड करें और नमूना के चार कुओं में से प्रत्येक में 7 μL लोड करें। प्रत्येक ग्लाइकिन के शेष 7 μL को अपनी मूल ट्यूब में वापस रखें।
  9. प्लेट को पैराफिल्म के साथ कवर करें और 2 मिनट के लिए 250 ग्राम और 12 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर प्लेट रखें, जो प्रकाश से सुरक्षित है। कमरे में आर्द्रता 60-70% तक पहुंचने से पहले प्लेट को उजागर न करें

3. नैनो प्रिंटर प्रोग्रामिंग

  1. "माइक्रोएरे प्रबंधक" सॉफ्टवेयर खोलें "विधि गुण" विंडो का उपयोग करें
  2. कार्य तालिका लेआउट सेट करें: "56 स्लाइड कॉन्फ़िगरेशन" चुनें।
    नोट: यह एक पूर्वनिर्धारित कॉन्फ़िगरेशन है जो 56 स्लाइडों के मुद्रण की अनुमति देता है। प्रत्येक प्रकार की प्लेट, पिन और प्रिंट प्रारूप ( पूरक चित्रा 2 , चरण 1) के लिए कैलिब्रेट करें।
  3. "पिन कॉन्फ़िगरेशन" चुनें| "पिन उपकरण 1x4 9 मिमी।"
    नोट: यह चार पिन ( अनुपूरक चित्रा 2 , चरण 2) का उपयोग करने के लिए एक पूर्वनिर्धारित कॉन्फ़िगरेशन है।
  4. "पिन प्रकार" को परिभाषित करें। प्रिंटिंग के लिए उपयुक्त पिन प्रकार की गणना और बनाएं
    नोट: यह चरण इस बात को परिभाषित करता है कि 384-अच्छी तरह से नमूना में एक पिन को कितना धब्बा प्रिंट होगा और विभिन्न पिन प्रकारों और स्लाइड की सतह के रसायन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    नोट: 946 एमपी 3 पिनों का उपयोग करते समय, दो महत्वपूर्ण मुद्दों पर विचार करें: 1) प्रत्येक पिन 140 समरूप स्पॉट तक प्रिंट कर सकता है और 2) स्लाइड्स पर मुद्रण करने से पहले पिन की नोक से अतिरिक्त तरल निकालना आवश्यक है। इसलिए, एक प्री-प्रिंटिंग ब्लॉक (epoxy-coated slides पर 946MP3 पिन के लिए अनुकूलित) पर 20 प्री-स्पॉट मुद्रित करने के लिए प्रत्येक पिन प्रोग्राम करें।
    1. प्रति नमूना मुद्रित स्पॉट की कुल संख्या की गणना करें।
      नोट: यहां प्रत्येक पिन प्रत्येक उप-सरणी (ब्लॉक) के अनुसार 4 स्पॉट प्रिंट करता है; स्लाइड्स के कुल 4 उप-एरेज़ = 16 स्पॉट / एसएलआईडीई। 7 स्लाइड्स के बाद, प्रत्येक पिन 16 x 7 = 112 स्पॉट प्रिंट करता है। इसके अलावा, मुद्रण से पहले 20 पूर्व-स्पॉट 132 स्पॉट / डुबकी देता है। इसलिए, पिन प्रकार "946MP3-132 स्पॉट" (4 अंक प्रति प्रति नमूना प्रति x 4 ब्लॉक x 7 स्लाइड + 20 पूर्व-स्पॉट = 132) के रूप में परिभाषित किया गया है।
    2. "पिन प्रकार" ( पूरक चित्रा 2 , चरण 3) बनाएँ। प्रेस "सेटअप" (सॉफ्टवेयर का बाएं पैनल) | "माइक्रो स्पॉटिंग पिंस" | | "नया नाम" (946MP3-132 स्पॉट) स्पॉट व्यास (100 माइक्रोन), तेज (0.25 μL), डिलीवरी (0.7 एनएल), और न्यूनतम स्पॉट रिक्त स्थान (100 माइक्रोन) के लिए स्पॉट्स की संख्या निर्धारित करें। "ओके" दबाएं | "ठीक।"
    3. "विधि गुणों" विंडो में, बनाया पिन प्रकार का चयन करें: "946MP3-132 स्पॉट।"
  5. धोने की स्थिति को परिभाषित करें "शुरू करने से पहले धोएं" और "सामान्य धोने" ( अनुपूरक चित्रा 2 , चरण 4) को "फिनिशिंग के बाद धो लें" सेट करें।
  6. "प्लेट की सूची" को परिभाषित करें।
    नोट: थाली लेआउट के अनुसार थाली से नमूना पैटर्न (384-अच्छी तरह से थाली से डुबकी का आदेश) है। प्लेट सूची में प्लेट को अपलोड करने के लिए, एक प्लेट नमूना पैटर्न सेट करें
    1. प्लेट "नमूनाकरण पैटर्न" बनाएं। "टेम्प्लेट" ( अनुपूरक चित्रा 3 ) पर जाएं "सैंपलिंग पैटर्न।" एक नया नाम दें ( जैसे, जॉव सरणी) और "सम्मिलित करें" का चयन करें | "ऊपर से नीचे भरें" | "पिन उपकरण 1 x 4 9 मिमी।" पूर्व-निर्धारित प्लेट लेआउट ( अनुपूरक चित्रा 1 ए ) के अनुसार अच्छी पिकअप का क्रम चुनें। "ओके" दबाएं | "ठीक।"
    2. प्लेट नमूनाकरण पैटर्न लोड करें। "प्लेट सूची" सेल ( अनुपूरक चित्रा 3 ) के दाईं ओर क्लिक करें | "प्लेट जोड़ें" और सही प्लेट नमूना पैटर्न का चयन करें (चरण 3.6.1 में वर्णित "JoVE सरणी"।)। चुनें "सामान्य धो।" दबाएँ"ओके" | "ठीक।"
  7. "नमूना प्लेट्स" पर जाएं और 1 के ऑफसेट स्थिति को बदल दें (जो निर्धारित करता है कि प्लेट सरणी डेक पर स्थित है)।
    नोट: 0 की ऑफ़सेट की स्थिति सोनिकेटर स्नान के करीब है।
  8. "माइक्रोएरे प्रिंट डिजाइन" को परिभाषित करें। ब्लॉक-टू-ब्लॉक दूरी और रिक्ति की गणना करें
    1. विकासशील उपकरण के आयामों पर विचार करें जो स्लाइड को 7 x 7 मिमी के 16 कुओं में विभाजित करता है, जिसमें उप-एरे के बीच 2 मिमी के रिक्त स्थान हैं (ब्लॉक के बीच 9 मिमी की कुल, अनुपूरक चित्रा 4 )।
    2. उप-सरणी आयामों पर विचार करें
      नोट: स्पॉट के बीच की दूरी 0.275 मिमी है और इस प्रिंट डिजाइन में 12 कॉलम और 18 पंक्तियाँ हैं; कुल आयाम हैं: चौड़ाई (11 x 0.275 मिमी = 3.025 मिमी) और ऊंचाई (17 x 0.275 मिमी = 4.675 मिमी)। क्षैतिज अंतर की गणना करें: 9 मिमी - (11 0.275) = 5.97 मिमी ऊर्ध्वाधर रिक्ति की गणना करें: 9 मिमी - (17 x 0.275) = 4.325 मिमी। डी की गणना करेंस्लाइड के बाईं तरफ से आवरण: 4.43 मिमी + 1.07 मिमी = 5.5 मिमी। स्लाइड के ऊपर की ओर से दूरी की गणना करें: 2.95 मिमी + 0.55 मिमी = 3.5 मिमी ( पूरक चित्रा 4 )।
    3. "प्रिंट डिज़ाइन" ( पूरक चित्रा 5 ) को परिभाषित करें। "टेम्पलेट" चुनें | "प्रिंट डिज़ाइन" | "नया।"
      1. "पिन सेटअप" चुनें | "पिन उपकरण 1 x 4 9 मिमी" | "पिन - 946MP3-132 स्थान।" "सामान्य" टैब में, "नाम का माइक्रोएरे प्रिंट" ( यानी, "जोव सरणी") बदलें। "स्पॉट स्पीड" का चयन करें | "प्रतिलिपि संख्या" (4) | "टच प्वाइंट ऊँचाई" (0 मिमी) | "सॉफ्ट टच ऊँचाई" (3 मिमी) | "सभी उपलब्ध पदों पर प्रिंट करें" ( अनुपूरक चित्रा 5 ए )।
      2. "माइक्रोएरे" टैब में, क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर अंतरण (चरण 3.8.2 से 5.9 मिमी और 4.325 मिमी) और क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर माइक्रोएरे (2) की संख्या चुनें। "प्रिंट करें चुनेंमाइक्रोएरे क्षैतिज रूप से "|" प्रिंट डुप्लिकेट माइक्रोएरे "( अनुपूरक चित्रा 5 बी )।
      3. उप-सरणी टैब में, स्तंभों की अधिकतम संख्या (12), पंक्तियों की अधिकतम संख्या (18) और कॉलम और पंक्तियों (275 माइक्रोन) ( पूरक चित्रा 5C ) के बीच की दूरी चुनें।
      4. माप टैब में, स्लाइड (5.5 मिमी) की बाईं ओर से दूरी चुनें, स्लाइड के ऊपर से दूरी (3.5 मिमी, चरण 3.8.2 में गणना की जाती है), प्रिंट स्लाइड की चौड़ाई (25 मिमी) , और प्रिंट स्लाइड की ऊंचाई (75 मिमी) ( पूरक चित्रा 5 डी )। "ओके" दबाएं | "ठीक।"
  9. "माइक्रोएरे प्रिंट डिजाइन" सेल की दाईं ओर क्लिक करें और परिभाषित डिज़ाइन (चरण 3.8.3; पूरक चित्रा 6 से "जॉव एरे" चुनें)।
  10. "स्लाइड गणना" (56) को परिभाषित करें, और "स्थिति ऑफसेट" (0) बदलें। यह पो को निर्धारित करता हैसरणी डेक ( अनुपूरक चित्रा 6 ) पर मुद्रित होने वाली पहली स्लाइड का समापन।
  11. "माइक्रोएरे प्री-प्रिंट डिज़ाइन" ( पूरक चित्रा 6 ) को परिभाषित करें "ग्लास ब्लॉक" का चयन करें | "प्री-प्रिंट 1 x 4 मिमी पिन टूल।"
    नोट: यह स्पॉट-स्पेसिंग सेटिंग ग्लास ब्लॉक पर 46,464 प्री-स्पॉट (सभी 4 पिंस के लिए) की अनुमति देता है, इस प्रकार 46,464 / 4 = 11,616 प्री स्पॉट प्रति पिन। जब प्री-प्रिंट ब्लॉक का स्थान इस्तेमाल किया गया था, तो प्रिंटर बंद हो जाएगा और ब्लॉक को फ्लिप करने की आवश्यकता होगी।
    नोट: पूर्व-प्रिंट ब्लॉक के कितने नमूनों को पूरा किया गया है इसकी गणना करने के लिए, निम्नलिखित पर विचार करें: हर नमूना को 56 स्लाइडों (7 स्लाइड्स प्रति डुबकी) को पूरा करने के लिए 384 अच्छी तरह से प्लेट में 8 पिन-डुप्स द्वारा लिया जाएगा, और प्रत्येक डुबकी एक अतिरिक्त 20 पूर्व-स्पॉट हैं, जिससे प्रति नमूना 160 पूर्व-स्पॉट दिए गए हैं। इसलिए 11,616 / 160 = 72.6 नमूने। इस प्रकार, पूर्व-प्रिंट ग्लास ब्लॉक को 72 नमूनों के बाद फ्लिप करने की आवश्यकता होगी (फ्लिपिंग के लिए समय का मूल्यांकन करने के लिए, माप hओवे लम्बी एक नमूने के लिए 56 स्लाइड्स पर एक पूर्ण रन पूरा करने के लिए लेता है और फिर 72 द्वारा गुणा)।
  12. "प्रीप्रिंट डिजाइन का उपयोग करें" का चयन करें | "हां" | "स्कैन बारकोड्स" (नहीं) | "प्रिंट एकल रीप्लिकेट" (नहीं) ( अनुपूरक चित्रा 6 )।
  13. "मान्य" ( अनुपूरक चित्रा 6 ) पर क्लिक करें
  14. "सहेजें" पर क्लिक करें और विधि को एक arr फ़ाइल के रूप में सहेजें ( जैसे, "JoVE array.arr," पूरक चित्रा 6 )।

4. मुद्रण डिज़ाइन एरेज़

नोट: सभी चरणों को साफ कमरे में 60-70% की नमी के साथ और उचित दस्ताने और सुरक्षा के लिए कपड़ों के साथ किया जाना चाहिए

  1. नैनो प्रिंटर मशीन और ह्यूमिडीफायर चालू करें
  2. धो बफर और आर्द्रीकरण के लिए, डि पानी से भरें। वॉश बॉटल (नाली) और आर्द्रीकरण जाल कारबॉय खाली करें ( पूरक चित्रा 7 ए )।
  3. सेट करने के लिए humidifier70% आर्द्रता और आर्द्रीकरण प्रारंभ करें।
  4. मुद्रण से पहले सभी पिन साफ़ करें 50 मिलीलीटर गर्म (65 डिग्री सेल्सियस) पिन-टिप सफाई समाधान तैयार करें (15 ग्राम पिन-टिप सफाई अभिकर्मक और 50 एमएल 65 डिग्री सेल्सियस पानी, ठोस अभिकर्मक पूरी तरह से घुलन तक पूरी तरह से मिश्रित)।
    1. पिन-टिप सफाई समाधान में पिन-टिप ब्रश (ठीक) को डुबोकर प्रत्येक पिन टिप पर सफाई समाधान लागू करें और प्रत्येक पिन टिप की सतह को साफ़ करें।
      नोट: पिन-टिप सफाई समाधान संक्षारक और विषाक्त है इस समाधान का उपयोग करते समय हर समय दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहनना सुनिश्चित करें। पिन-टिप सफाई समाधान में कुछ मिनटों तक पैनिंग करने से स्थायी पिन क्षति हो सकती है।
    2. आसुत जल के 1 एल के साथ अल्ट्रासोनिक स्नान भरें और बाथ में एक फ्लोटबल पिन सफाई रैक में पिन रखें। 5 मिनट के लिए सोनाट करें और पिन को हटा दें। सूखा और धीरे से साफ कमरे विशेष पोंछे के साथ पोंछे।
  5. "माइक्रोएरे प्रबंधक" प्रिंट खोलेंएर सॉफ़्टवेयर; कनेक्शन सेट पर, प्रिंटर प्रकाश चालू होगा (लाल / हरा) "स्टॉप" दबाएं | "साफ़ करें" | "इनिट" ( अनुपूरक चित्रा 7 बी , चरण 1-3); प्रिंट-सिर बांह फिर एक्स, वाई, जेड संरेखण रीसेट करेगा।
  6. प्रिंट सिर में पिंस को लोड करने के लिए, "लोड" ( पूरक चित्रा 7B , चरण 4) दबाएं और प्रिंट / पिन टूल लेआउट ( अनुपूरक चित्रा 7C ) के परिभाषित कॉन्फ़िगरेशन के अनुसार प्रिंट सिर में पिंस रखें; इस स्लाइड में प्रत्येक स्लाइड पर 4 पिन, प्रत्येक प्रिंटिंग 4 उप-एरे का उपयोग होता है, जिससे स्लाइड प्रति स्लाइड ( अनुपूरक चित्रा 1 ए ) के कुल 16 उप-एरेज़ मिल सकते हैं। पिंस रखने के बाद, फिर से "Init" दबाएं
  7. सरणी डेक पर स्लाइड्स को इकट्ठा करें। अल्ट्रा-उच्च-शुद्धता नाइट्रोजन गैस को उड़ाने से स्लाइड बॉक्स खोलें और प्रत्येक स्लाइड को साफ करें। सरणी मंच पर वांछित संख्या स्लाइड करें। स्लाइड को दो कोने के नीचे के किनारों पर रखें और फिर स्लाइड को उसके ऊपर रखेंपद। दो सही कोनों को पकड़ो और बाएं कोनों को धीरे से धक्का दें जब तक कि स्लाइड अपनी स्थिति में फिट न हो। एक तंग फिट ( पूरक चित्रा 7 डी ) सुनिश्चित करने के लिए बाएं नीचे के कोने में धीरे से पुश करें।
  8. डिस्टिल्ड वॉटर, 70% इथेनॉल, और 100% इथेनॉल के साथ प्री ब्लॉक ग्लास को साफ करें और इसे हवा में सूखा (केवल समर्पित क्लीन-रूम पोंछे का उपयोग करें)। डेक पर प्री-ब्लॉक ग्लास को अपनी स्थिति में रखें।
  9. एक सॉनिकेटर स्नान ( पूरक चित्रा 7 बी ) भरें। 55 के लिए "भरें" पर प्रेस करें और फिर "ठीक" दबाएं। 20 सेकंड के लिए "नाली" पर क्लिक करके और फिर "ओके" दबाकर सोनिकेटर को निकाल दें। एक बार फिर से भरना और निकालना और फिर 55 एस के लिए फिर से भरें
  10. वॉशिंग बाथ ( पूरक चित्रा 7 बी ) भरें: 40 सेकंड के लिए "प्राइम" दबाएं और फिर "ओके" दबाएं।
  11. सरणी के डेक पर अपने स्थान में अनावृत नमूनों के साथ 384 अच्छी तरह से थाली की स्थिति और पैराफिल कवर को हटा दें।
  12. जब छपाई पूरी हो जाती है, तो सोनिकेटर स्नान ( पूरक चित्रा 7 बी ) को हटा दें और humidifier बंद करें।
  13. आर्द्रर डेक पर आर्द्रता के बिना 16-24 घंटे के लिए स्लाइड्स सूखने दें।
  14. शराब / विलायक-प्रतिरोधी अंकन पेन के साथ स्लाइड्स की संख्या और उन्हें अंधेरे में एक वैक्यूम-सीलबंद बॉक्स में रखें।

5. एआरएएस प्रसंस्करण और विकसित करना

  1. वैक्यूम-सीलबंद बॉक्स से एक स्लाइड निकालें और इसे 5 मिनट के लिए एक रासायनिक हुड में रखें, अतिरिक्त तरल को लुप्त हो जाना, ऊपर की ओर सरणी।
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी स्पॉट मुद्रित किए गए हैं, उच्चतम लाभ (950 पीएमटी) पर स्लाइड को स्कैन करें।
  3. स्लाइड पर इपॉक्सी समूहों के रासायनिक अवरुद्ध के साथ आगे बढ़ें
    1. 50 एमएल एथेनॉलमाइन अवरुद्ध समाधान (0.1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8 और 0.05 एम एथनोलैमाइन) तैयार करें। त्रिज-एचसीएल के 8.8 एमएल (1.7 एम, पीएच 8) और 0.45 एमएल एथानोलमाइन (16.6 एम) के साथ DIW के 140 एमएल मिलाएं। 5 को स्थानांतरित करें0-एमएल धुंधला ट्यूब ( पूरक चित्रा 8 ए ) और गर्म 50 डिग्री सेल्सियस
    2. स्लाइड हाइड्रेट करें स्लाइड को एक धुंधला ट्यूब में डाइव से भर कर रखें, इसे पन्नी के साथ कवर करें, और आरटी पर धीमे और कोमल झटकों के साथ 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. स्लाइड पर प्रतिक्रियाशील ईपीओ ग्रुप को अवरुद्ध करें। पूर्व गर्म एथेनोलमाइन अवरुद्ध समाधान से भरे हुए 50 एमएल धुंधला ट्यूब में स्लाइड को डुबो दें, पन्नी के साथ कवर करें, और आरटी पर धीमा और कोमल झटकों के साथ 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. उचित बायोहाजर्ड कचरा वाले गोदाम में इथेनॉलैमिने अवरुद्ध समाधान को त्यागें और स्लाइड को एक नया, साफ धुंधला ट्यूब में 50 डिग्री सेल्सियस डीआईवी से भरा रखें। पन्नी के साथ कवर और 10 मिनट के लिए आरटी पर धीमे और कोमल झटकों के साथ सेते हैं।
    5. पानी को त्यागें और स्लाइड्स को ग्लास स्टेनेस होल्डर ( पूरक चित्रा 8 बी ) में स्थानांतरित करें। ग्लास स्टेनिंग होल्डर को झूलते हुए प्लेट धारक में रखें और सेंटीफ्यूज को 200 मिनट और आरटी पर 5 मिनट के लिए स्लाइड करें।
    4. एक विभक्त सेट अप करें और जैविक अवरोधन के साथ आगे बढ़ें।
    1. एक 16-अच्छी तरह से विभक्त ( अनुपूरक चित्रा 8C ) पर स्लाइड रखें।
    2. पीबीएसटी धोने का समाधान तैयार करें: 50 एमएल ऑफ फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस), पीएच 7.4 + 0.1% ट्विल -20
    3. जैविक अवरोधन समाधान (पीबीएस-ओवीए) तैयार करें: पीबीएस का 5 एमएल, पीएच 7.4 + 1% चिकन ओवलबिमिन (10 मिलीग्राम / एमएल)।
      नोट: अवरुद्ध अभिकर्मक का विकल्प विरोधी Neu5Gc एंटीबॉडी का पता लगाने की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। ओवलबिमिन को मुर्गियों में बनाया जाता है, जो इंसानों की तरह, Neu5Gc को संश्लेषित नहीं कर सकते हैं, जिससे इस सेआ की अभिव्यक्ति की कमी हो सकती है। Neu5Gc का पता लगाने के लिए, यहां तक ​​कि मामूली contaminants नाटकीय ढंग से परख की संवेदनशीलता को कम कर सकते हैं, कभी-कभी भी किसी भी विरोधी Neu5Gc रिएक्टिव का पता लगाने में विफल। उदाहरण के लिए, सबसे अधिक इस्तेमाल किया अवरुद्ध अभिकर्मक, गोजातीय सीरम एल्बूमिन (बीएसए), हालांकि स्वयं के द्वारा ग्लाइकोसिलेटेड नहीं है, इसमें गोजातीय आईजीजी प्रदूषकों शामिल हैं जो नेयू 5 जीसी-मोइटीज़ लेते हैं और इसलिए वे प्रतिस्पर्धा करते हैंIth छिद्रित ग्लाइकैंस जब एंटी-नेऊ 5 जीसी एंटीबॉडी 19 , 20 के साथ नमूना करने के लिए बाइंडिंग।
    4. कुओं को प्रीवेट करें स्लाइड-कुओं में बहु-विंदुक, पीबीएसटी के 200 μL को विभाजित करने के लिए, उन्हें ढक्कन वाले छत में रखें, और 5 मिनट के लिए हिलाएं।
      नोट: आर्द्रता कक्ष एक गीला तौलिया कागज के साथ एक गिलास ट्रे है, जो नायलॉन की चादर के साथ आच्छादित है और प्रकाश से नमूनों की रक्षा के लिए पन्नी है।
    5. पीबीएसटी को एक साफ कागज तौलिये और पीबीएस-ओवीए अवरोधक बफर के 200 μL को हर अच्छी तरह से अवरुद्ध बफर पर धीरे से टैप करके और दोहन करके निकालें। एक आर्द्र कक्ष में रखें और 1 घंटे के लिए आरटी पर कोमल झटकों के साथ सेते रहें।
  4. पीबीएस-ओवीए ब्लॉकिंग बफर में पतला प्राथमिक पहचान तैयार करें, जैसा कि तालिका 2 में सूचीबद्ध है।
    नोट: इस सियालोग्लिक्कैन माइक्रोएरे के गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) के मूल्यांकन के लिए, कई सिया बाइंडिंग प्रोटीन का उपयोग करें: सैब्यूबुस नीग्ररा लेक्टिन (एसएनए), बड़े बकरी की छाल से अलग,# 945; 26; माकेआ अमरेन्सिस लेक्टिन II (एमएएलएलआई) सेआइया 23 को पहचानने की उम्मीद है; और चिकन विरोधी Neu5Gc IgY सभी Neu5Gc युक्त sialoglycans पहचानने की उम्मीद है इसके अलावा, एंटी-नेऊ 5 जीसी आईजीजी प्रतिक्रिया के प्रोफाइल के लिए विभिन्न मानव सीरा नमूनों का उपयोग करें। लैक्टिन / एंटीबॉडी / सेरा की एकाग्रता को प्रयोगात्मक रूप से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए।
  5. झाड़ू सूखा पीबीएस-ओवीए अवरुद्ध बफर और प्रति प्रति प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μL (अच्छी तरह से न्यूनतम मात्रा: 70 μL), 2 घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष में सेते हैं।
  6. झटका प्राथमिक पहचान को सूखता है और पीबीएसटी के साथ 4 बार धोता है (3 डी और 4 वें धोने के बीच, आर्द्र कक्ष में 5 मिनट के लिए पीबीएसटी में स्लाइड सेते हैं)। एक बार पीबीएस के साथ धोएं
  7. तालिका 2 में सूचीबद्ध के रूप में पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार करें
  8. झटका पीबीएस को सूखा और 200 μL का माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें मिलाते हुए आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  9. झटका माध्यमिक एंटीबॉडी को सूखा और पीबीएसटी के साथ चार बार धोएं (3 के बीच)आरडी और 4 वें धोने, पीबीएसटी में आर्मी चैंबर में 5 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं)।
  10. सावधानी से फ्रेम को हटा दें और स्लाइड्स को पीबीएस से भरे 50 एमएल स्लाइड स्टेनिंग ट्यूब में रखें और 5 मिनट के लिए हिलाएं।
  11. डीआईडब्ल्यू के साथ दो स्लाइड-स्टेनाइंग स्नान ( पूरक चित्रा 8 डी ) भरें, स्लाइड को स्लाइड-धारक में रखें, और स्नान के अंदर इसे डुबकी। जल्दी 10 बार डुबकी और फिर दूसरे स्नान के लिए स्थानांतरण और 10 बार अधिक डुबकी। मिलाते हुए आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  12. पानी को त्याग दें और स्लाइड को ग्लास स्टेनेस होल्डर ( पूरक चित्रा 8 बी ; स्लाइड को हवा में सूखने दें) में स्थानांतरित करें। झूलते हुए प्लेट धारक में कांच के धुंधले धारक को रखें और सेंटीफ्यूज को 200 ग्राम और आरटी पर 5 मिनट के लिए स्लाइड पर सूखा।
  13. स्लाइड को स्कैन करें और फिर उसे अंधेरे में एक वैक्यूम-सीलबंद बॉक्स में संग्रहीत करें।

6. अरे स्कैनिंग और डेटा विश्लेषण

  1. फ्लोरोसेंट स्लाइड स्कैनर खोलें और इसे 5 मिनट के लिए गर्म करें को खोलोस्कैनिंग और सॉफ्टवेयर का विश्लेषण
  2. स्कैनिंग मापदंडों ( पूरक चित्रा 9 ए ) निर्धारित करें: 532 एनएम और 350 पीएमटी के लाभ के साथ 100% बिजली स्कैन करें, एक लाइन से औसत और एक 0 माइक्रोन फोकस स्थिति। 10.0 माइक्रोन पिक्सेल आकार का संकल्प का प्रयोग करें।
    नोट: स्कैनिंग मापदंडों को अलग-अलग स्लाइड प्रकार, प्रतिदीप्ति और रिज़ॉल्यूशन पर समायोजित किया जा सकता है।
  3. विकसित स्लाइड को स्कैन करें स्कैनर के दरवाज़े को खोलें और अंदर की ओर स्लाइड करें, सरणी का सामना करना पड़ रहा है। स्कैनिंग प्रारंभ करें (सॉफ्टवेयर नेविगेशन पैनल मेनू पर हरी "प्ले" बटन, पूरक चित्रा 9 बी )।
  4. स्किड स्लाइड्स को टिफ़ फ़ाइल के रूप में सहेजें
  5. विश्लेषण के लिए स्लाइड तैयार करें "लोड सरणी सूची" का चयन करें और उचित GAL फ़ाइल अपलोड करें जो स्लाइड पर प्रत्येक ब्लॉक में एआरएड्स को मैप करता है ( पूरक चित्रा 9 सी )।
    नोट: GAL फाइल में स्लाइड पर प्रत्येक स्थान की पहचान और स्थान (एक्स, वाई) दोनों के बारे में जानकारी है। यह फाइल बनाई जा सकती हैप्रिंटर सॉफ्टवेयर द्वारा 384-अच्छी तरह से स्रोत प्लेट और परिभाषित प्रिंट डिजाइन में नमूने पहचान के आधार पर एक टैब-सीमांकित पाठ फ़ाइल निर्यात कर रहा है।
  6. संरेखण और विश्लेषण पैरामीटर सेट करें सॉफ्टवेयर नेविगेशन पैनल मेनू ( अनुपूरक चित्रा 10 ) पर "विकल्प" बटन दबाएं।
  7. संरेखण पैरामीटर को परिभाषित करें सर्कुलर फीचर्स ढूंढें, 50 से 350% तक संरेखण के दौरान सुविधाओं का आकार बदलें, 40 माइक्रोन के अधिकतम अनुवाद के लिए फीचर आंदोलन को सीमित करें, पृष्ठभूमि थ्रेशोल्ड (सीपीआई थ्रेसहोल्ड 0) को विफल करने वाली फीचर्स फीचर्स, ब्लॉकों की खोज करते समय रैपिंग और रोटेशन का अनुमान लगाते हैं, और इमेज पंजीकरण को स्वचालित बनाएं (10 पिक्सल) ( अनुपूरक चित्रा 10 )।
  8. विश्लेषण मापदंडों को परिभाषित करें: W1 / 532 अनुपात, सामान्य मानक विचलन, अनुपस्थित सुविधाओं का विश्लेषण, और पृष्ठभूमि घटाव। "चयन करें" और फिर "स्थानीय सुविधा पृष्ठभूमि औसत" पर क्लिक करें और 2 पिक्सेल को बाहर करने के लिए और पृष्ठभूमि की एक 3-पिक्सेल चौड़ाई सेट करें। दबाबो ठीक।" Seस्कैनर संतृप्ति स्तर को डिफ़ॉल्ट ( अनुपूरक चित्रा 10 ) में।
    नोट: पृष्ठभूमि घटाव विधि प्रायोगिक डिजाइन पर निर्भर करता है और विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।
  9. सुविधाओं के नक्शे को संरेखित करें ब्लॉक मोड में प्रोग्राम सेट करें ("बी" पर दबाएं), सभी ब्लॉक (Ctrl + A) का चयन करें, सरणी मैप ग्रिड की स्थिति बनाएं, और सभी ब्लॉक (Alt + Shift + F7) ( अनुपूरक चित्रा 11 ) संरेखित करें।
  10. प्रत्येक ब्लॉक में फीचर संरेखण परिशोधित करें। ज़ूम (ज़ूम मोड में आने के लिए "Z" दबाएं) ऊपरी-बायां ब्लॉक में, "B" को फिर से (ब्लॉक मोड) दबाएं, और इस ब्लॉक के ग्रिड को दबाएं। केवल इस ब्लॉक के ग्रिड को तब तक ले जाएं जब तक ब्लॉक ब्लॉक से पूरी तरह से संरेखित न हो जाए और इस चयनित ब्लॉक में सुविधाओं को संरेखित करने के लिए F5 दबाएं। ग्रिड आंदोलन और F5 संरेखण दोहराएं जब तक कि स्पॉट पूरी तरह से चक्कर न हों। 16 गलतियों में से हर एक के लिए ऐसा ही करें जब तक कि सभी ग्रिड जगह में न हों।
  11. डेटा का विश्लेषण और सहेजना सभी ब्लॉकों का चयन करें (सीआरटी + +ए) और फिर डेटा का विश्लेषण (Alt + A) विश्लेषण परिणाम (Ctrl + U) को .gpr फ़ाइल के रूप में सहेजें
  12. स्प्रैडशीट प्रोग्राम में सहेजी गई। जीपीआर फ़ाइल खोलें और स्थानीय पृष्ठभूमि घटाव (एफ 532-बी 532) के बाद प्रतिदीप्ति पर आधारित प्रत्येक स्थान की तीव्रता का विश्लेषण करें।

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Representative Results

सरणी मुद्रण, विकास और विश्लेषण:

कई ग्लिकेन नमूनों के साथ एक सैलोग्लाइकैन माइक्रोएरे को प्रिंट करना और 16 अलग-अलग ब्लॉकों में मानव आईजीजी एसटीडी घटता मुद्रण सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से अंशांकन की आवश्यकता है ताकि सभी नमूने सभी प्रिंटों में 16 ब्लॉकों के लिए समान रूप से समान रूप से सभी प्रिंटों में समान रूप से प्रिंट की जा सकें। इसलिए, विशिष्ट मुद्रण पैरामीटर निर्धारित किए जाने से पहले कई कैलिब्रेशन प्रयोगों की आवश्यकता होती है, प्रत्येक प्रकार के नमूने, स्लाइड प्रकार और निर्माण, 384-अच्छी तरह से प्लेट प्रकार, आर्द्रता के स्तर, 384-अच्छी तरह से प्लेट में नमूना मात्रा, पूर्व की मात्रा -प्रत्येक प्रकार के नमूने, मानव आईजीजी एसटीडी वक्र सांद्रता, और मार्कर प्रकार के लिए मुद्रण। ऐसे मुद्रित सियालोग्लिसैन सरणी स्लाइड्स के स्थायित्व को कमरे के तापमान पर अंधेरे में निर्वात-मुहरबंद बक्से में 10 महीनों तक टिकने के लिए मान्य किया गया था। प्रत्येक मुद्रण प्रयोग में, एकरूपता हैसिया बाध्यकारी लेक्टिन और एंटीबॉडी का उपयोग करके गुणवत्ता नियंत्रण प्रयोगों के माध्यम से आगे की निगरानी और मान्य। विकासशील और स्कैनिंग प्रोटोकॉल समान प्रिंट रन से स्लाइड्स के भीतर और बीच नमूनों की तुलना करके एकरूपता और सटीकता हासिल करने के लिए अनुकूलित किया गया था। स्लाइड्स 16-अच्छी तरह से विभाजक के साथ विकसित की जाती हैं, जो ब्लॉकिंग के बीच उचित अवरोधन सुनिश्चित करता है, अनुकूलित अवरुद्ध शर्तों (रासायनिक और जैविक), वाश, और ऊष्मायन समय का उपयोग कर। न्यूनतम पृष्ठभूमि और गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के साथ अधिकतम पहचान सुनिश्चित करने के लिए प्राथमिक और माध्यमिक पहचान को व्यापक रूप से कैलिब्रेट किया गया था। स्लाइड स्कैनिंग और विश्लेषण पर, आउटपुट परिणाम एक स्प्रैडशीट फ़ाइल में स्थानांतरित किए गए और प्रत्येक स्थान में पहचान का निर्धारण करने के लिए विश्लेषण किया गया। प्रत्येक स्थान को एक बाहरी चेक के अधीन किया जाता है और अगर वह क्यूसी (यदि सीवी है 20 और स्पॉट चार रेप्लिकेट के मतलब से एक मानक विचलन की सीमा के बाहर है) से मिलना नहीं छोड़ा जाता है तो उसे छोड़ दिया गया है। फिर, मतलब संकेत संकेत तीव्रता afteस्थानीय प्रतिरूप के घटाव को प्रति नमूना प्रतिलिपि स्थान के लिए औसतन औसत प्रतिदीप्ति इकाई (आरएफयू) डेटा बिंदु प्रति मुद्रित नमूना उत्पन्न करने के लिए औसत था। आईजीजी एसटीडी घटकों की एकरूपता सभी परीक्षण वाले ब्लॉकों में एक बार वैध हो जाने के बाद, आरएफयू वैल्यू एनजी / μL आईजीजी में सामान्यीकृत थी, जिससे प्रयोगों के भीतर और प्रयोग के बीच बेहतर नमूने की तुलना करने का मौका मिला।

Sia- बाध्यकारी उच्चतर throughput परख:

Sialoglycan सरणियों के लिए निर्धारकों ( जैसे, प्रोटीन, लेक्टिन, एंटीबॉडी, वायरस, आदि ) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो कि Sia युक्त ग्लाइकन्स को बांधता है। मुद्रण के बाद क्यूसी के लिए, सिया-बाइंडिंग प्लांट लेक्टिन और एंटी-नेऊ 5 जीसी आईजीआई का प्रयोग 1 9 में किया जाता है। एसएनए α2-6 से जुड़ा हुआ सिया को बांधता है, मालिआई α2-3 से जुड़ी जुड़ाव से जुड़ा हुआ है, और एंटी-नेऊ 5 जीसी आईजीवी नेयू 5 जीसी युक्त सैयालोग्लिकेन बांधता है लेकिन नयू 5 एसी-युक्त सियालोगलीकंस 1 9 , जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है। क्यूसी प्रयोग का उद्देश्य हाजिर मुद्रण और पहचान और चार अलग-अलग पिनों के उपयोग से मुद्रित ब्लॉकों के बीच परिवर्तनशीलता की कमी को मान्य करना है। ब्लॉक-टू-ब्लॉक परिवर्तनशीलता को प्रति स्लाइड प्रत्येक प्राथमिक पहचान के लिए चार ब्लॉकों को विकसित करके और उन ब्लॉकों की तुलना करके दिखाया जाता है जो चार पिनों में से प्रत्येक को एक ही प्राथमिक पता लगाने वाले भाग के साथ मुद्रित किया गया था। एक तुलना तो यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि कोई बड़ा अंतर मौजूद नहीं है।

मानव सीरा में विभिन्न एंटी-नेऊ 5 जीसी एंटीबॉडी होते हैं, जिसमें विभिन्न मानव रोग 2 , 21 , 22 , 23 के लिए प्रभाव होता है । मानवीय सेरा आईजीजी में सियालोग्लिकेन की मान्यता का मूल्यांकन करने के लिए, स्वस्थ मानव दाताओं से 12 सीरा का मुद्रित साइलोग्लिकैन माइक्रो पर विश्लेषण किया गयाओरेरे और फ्लोरोसेंटली लेबल एंटी-मानव आईजीजी ( चित्रा 2 बी ) का उपयोग करके विकसित किया गया। प्रत्येक मुद्रित ब्लॉक में एक मानव आईजीजी एसटीडी वक्र होता है जो सभी ब्लॉकों ( चित्रा 2 सी ) में तुलनीय और समरूप होता है। प्रत्येक ब्लॉक में एसटीडी घटता की गुणवत्ता ( चित्रा 2 सी ) की पुष्टि करने के बाद ही ब्लॉक में ढलान के अनुसार ग्लाइकन स्पॉट परिणाम सामान्य हो जाते हैं और फिर कमजोर पड़ने वाले कारक द्वारा गुणा किया जाता है। जैसा कि चित्रा 2 बी में दिखाया गया है, सभी परीक्षण किए गए मानव सीरा में एंटी Neu5Gc आईजीजी के विभिन्न स्तर होते हैं, जिसमें Neu5Ac युक्त सियालोग्लिकेन्स के मिलान वाले जोड़े की लगभग कोई मान्यता नहीं है। इसके अलावा, एंटी-नेऊ 5 जीसी आईजीजी पहचान पैटर्न तीव्रता और विविधता के स्तर में दोनों, इन 12 अलग-अलग सेरा के बीच बहुत भिन्न हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: अवलोकनऐरे मुद्रण, विकास और छवि विश्लेषण का ( ए ) Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2 एक प्रतिनिधि Neu5Gc- containg Sia glycan के रूप में दिखाया गया है, एक प्राथमिक अमाइन के साथ कि epoxy- लेपित गिलास स्लाइड पर मुद्रित है। ( बी ) मुद्रित सरणियों को विभिन्न सािया बाध्यकारी प्रोटीनों के साथ विकसित किया जाता है, इसके बाद उपयुक्त फ्लोरोसेंटली लेबल वाला माध्यमिक एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है। प्रत्येक उप-अलार्म को व्यक्तिगत रूप से विकसित किया जा सकता है। ( सी ) प्रतिदीप्ति स्कैनर में जांच की गई स्लाइड को स्कैन करने से एक छवि उत्पन्न होती है जिसे स्कैनर छवि सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके और विश्लेषण किया जाता है। उप-सरणियों को प्रत्येक स्थान के लिए ग्रिड मैपिंग के साथ मढ़ा हुआ है और प्रत्येक स्थान पर प्रतिदीप्ति पता लगाया गया है। इसके परिणामस्वरूप इनए स्प्रैडशीट फ़ाइल को स्थानांतरित कर दिया जाता है। एक एकल अच्छी तरह से एक एकल सरणी schematically प्रतिनिधित्व किया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: सियालोग्लाइकेन माइक्रोएरे की प्रोफाइल विभिन्न सिया बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग कर रहे हैं।
स्लाइड्स को 16 भिन्न प्राथमिक पहचान मोएटियों के साथ विकसित किया गया, प्रत्येक ब्लॉक में एक। ( ए ) प्रतिनिधि एक क्यूसी स्लाइड के सिया-विशिष्ट पौधे lectins SNA और MALII और पॉलीक्लोनल मोनो-विशिष्ट चिकन विरोधी Neu5Gc IgY के बाध्यकारी पैटर्न दिखा प्रतिनिधि के 3 ब्लॉकों। परिणाम (0 वें शतमक क्रमश: लाल, सफेद और नीले रंग, 100 वें, 50 वें का प्रतिनिधित्व करने, और) प्रत्येक व्यक्ति के ब्लॉक के लिए हीटमैप प्रारूप में RFU के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। ( बी ) 12 अलग-अलग स्वस्थ मानव सीरा 1: 100 कमजोर पड़ने पर परीक्षण किया गया था और एंटी-ह्यूमन आईजीजी से पता चला था कि एंटी-नेऊ 5 जीसी आईजीजी रिएक्टिविटी का पता चला है। प्रत्येक विशिष्ट बीएल में आईजीजी एसटीडी वक्र ढलान के साथ प्रत्येक मूल्य को विभाजित करके आरएफयू डेटा एनजी / μL में सामान्यीकृत होता थाओक और फिर कमजोर पड़ने वाले कारक द्वारा गुणा किया जाता है। सभी गर्मी (लाल, सफेद और नीले, क्रमशः ते 100 वें , 50 वें और 0 वें प्रतिशतियल्स का प्रतिनिधित्व करते हुए) के लिए हीटमैप प्रारूप में डेटा का प्रतिनिधित्व किया जाता है। ( सी ) मानव आईजीजी एसटीडी मानव धाराओं के साथ विकसित 12 ब्लॉकों के घटता है जो डेटा को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Glycan ID संरचना
1 Neu5 9Ac 2 α3Galβ4GlcNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
2 Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 </ उप> एनएच 2
3 Neu5 9Ac 2 α6Galβ4GlcNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
4 Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAc बीओ (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
5 Neu5Acα6GalNAcαO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
6 Neu5Gcα6GalNAcαO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
7 Neu5 9Ac 2 α3Galβ3GlcNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
8 Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAc बीओ (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
9 Neu5 9Ac 2 α3Galβ3गैलाकैको (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
10 Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
1 1 Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
12 Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
13 Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
14 Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
15 Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
16 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
17 Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
18 Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
19 Neu5Acα6Galβ4GlcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
20 Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
21 Neu5Acα3Galβ4GlcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
22 Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
23 Neu5 9Ac 2 α6GalNAcαO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
24 Neu5Gc9Acα6GalNAcαO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
25 Neu5Acα3GalβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
26 Neu5Gcα3GalβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
27 Neu5Acα6GalβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
28 Neu5Gcα6GalβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
29 Neu5 9Ac 2 α3GalβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
30 5 जीसी 9 एक्सा 3 जीलाओओ (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
31 Neu5,9Ac 2 α6GalβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
32 Neu5Gc9Acα6GalβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
33 Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
34 Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
35 Neu5 9Ac 2 α3Galβ3GalNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
36 Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
Neu5 9Ac 2 α6Galβ4GlcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
38 Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
39 Neu5 9Ac 2 α3Galβ4GlcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2
40 Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO (सीएच 2 ) 2 सीएच 2 एनएच 2

तालिका 1: मुद्रित ग्लाइकन्स की सूची

प्राथमिक माध्यमिक एंटीबॉडी / लेक्टिन स्टॉक एकाग्रता विशेषता काम कर रहे तनाव / एकाग्रता
प्राथमिक पहचान Biotinilated-MALII 1 मिलीग्राम / एमएल Α2-3 संबंध में सियालिक एसिड 1:50, 20 μg / एमएल
Biotinilated-SNA 2 मिलीग्राम / एमएल Α2-6 संबंध में सियालिक एसिड 1: 100, 20 माइक्रोग्राम / एमएल
चिकन विरोधी Neu5Gc IgY एन डी Neu5Gc सियालिक एसिड 1: 7000
मानव सीरम 100% कई एपिटॉप 1: 100
माध्यमिक जांच Cy3-Streptavidin 0.75 मिलीग्राम / एमएल बायोटिन 1: 500, 1.5 माइक्रोग्राम / एमएल
Cy3- विरोधी चिकन IgY 0.75 मिलीग्राम / एमएल चिकन IgY 1: 2,000, 0.375 μg / एमएल
साइ 3-एंटी मानव आईजीजी एच + एल 0.6 मिलीग्राम / एमएल हुमाएन आईजीजी 1: 1,500, 0.4 माइक्रोग्राम / एमएल

तालिका 2: प्राथमिक और माध्यमिक जांच प्रोटीन की सूची।

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Discussion

एक सफल ग्लाइकैन माइक्रोएरे के निर्माण के लिए सावधानीपूर्वक योजना की आवश्यकता है और प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। इनमें निम्न शामिल हैं: (1) ब्लॉक और प्लेट लेआउट की योजना बना जो कि बाद के सभी पैरामीटर ( जैसे, दूरी, अंतर, नमूनों की मात्रा, और छपाई) को परिभाषित करता है; (2) पिंस सफाई करना और पिन अखंडता सुनिश्चित करना, जो स्थान एकरूपता को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है; (3) मुद्रण के दौरान उच्च नमी बनाए रखने, लंबे प्रिंट रन के दौरान नमूना वाष्पीकरण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जो स्थान एकरूपता को समझौता कर सकता है; (4) उचित संरेखण और विश्लेषण मानकों का चयन, जो परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं ( जैसे, पृष्ठभूमि घटाव विधि, थ्रेसहोल्ड और स्थान आकार लचीलापन)।

विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइनों और लक्ष्यों को पूरा करने के लिए विधि को और संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सरणी पर मुद्रित किए जाने वाले प्रत्येक प्रकार की सामग्री को बेहतर तरीके से बेहतर करने के लिए पूर्व-खोलने की संख्या को संशोधित किया जा सकता है। इस दौरान पिन वॉशिंग चरणप्रिंट अलग मुद्रित सामग्री फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, या तो छोटे या विस्तारित धोने के चक्र के साथ इसके अलावा, प्रत्येक डुबकी प्रति पिन प्रिंट्स की मात्रा अधिक या कम स्थानों को शामिल करने के लिए संशोधित की जा सकती है, लेकिन सरणी पर उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक प्रकार की सामग्री के लिए अलग-अलग अंशांकन की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति मार्कर का प्रकार और इसकी एकाग्रता को संशोधित किया जा सकता है, जब तक कि इसमें संयुग्मन के लिए उचित रासायनिक समूह शामिल होता है ( यानी, एपोनी-लेपित स्लाइडों के लिए प्राथमिक अमाइन)। एसटीडी घटता की सांद्रता और प्रकार ( जैसे, मानव / माउस / अन्य जीव IgG, आईजीएम, आईजीए, आदि ) बढ़ाया जा सकता है। बफर की स्थिति को अलग-अलग सामग्री में फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, अधिमानतः प्राथमिक अमाइन के साथ सामग्री की कमी के कारण गैर-विशिष्ट बाध्यकारी सरणी से बचने के लिए, जिससे पृष्ठभूमि में बढ़ोतरी हो सकती है। महत्वपूर्ण रूप से, Neu5Gc के इष्टतम पता लगाने के लिए, जैविक अवरुद्ध अभिकर्मक Neu5Gc ( जैसे, बीएसए अम्ल दूध से बचने) से मुक्त होना चाहिए, क्योंकि यह Neu5Gc-sialoglycan पता लगाने और Iपृष्ठभूमि की वृद्धि 19 , 20 उच्च पृष्ठभूमि और गैर-विशिष्ट बंधन से बचने के लिए प्राथमिक और माध्यमिक पहचान सांद्रता को अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, पृष्ठभूमि को कम करने या कम संकेतों को बढ़ाने के लिए स्कैनिंग मापदंडों ( जैसे, शक्ति, लाभ और रिज़ॉल्यूशन) को संशोधित किया जा सकता है। अंत में, संरेखण और विश्लेषण मापदंडों को उच्च पृष्ठभूमि या अलग आकार की विशेषताओं के अनुरूप बनाने के लिए संशोधित किया जा सकता है। ग्रेकेन माइक्रोएरे डेटा की रिपोर्ट करने के लिए सिफारिश की गई मानकों के बारे में अधिक जानकारी और दिशानिर्देश हाल ही में मीराज पहल 17 द्वारा वर्णित किए गए हैं, जो अंततः डेटा साझा करने और व्याख्या की सुविधा प्रदान कर सकते हैं।

संक्षेप में, ग्लाइकन माइक्रोएरे ग्लिकेन-बायोमोलेकेय इंटरैक्शन की जांच के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करते हैं और विभिन्न जैविक नमूनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एंटी Neu5Gc एंटीबॉडी मानव रोग 23 में विभिन्न भूमिका निभाते हैं। उदाहरण के लिए, कैंसर में, एंटी Neu5Gc एंटीबॉडी दोहरी भूमिकाएं निभाते हैं: एक तरफ, वे संभावित बायोमार्कर के रूप में काम करते हैं, लेकिन दूसरी ओर, वे संभावित चिकित्सीय 7 , 21 , 24 के रूप में काम करते हैं। ये एंटीबॉडीज एथेरोस्क्लेरोसिस 25 की तीव्रता, एक्सैनोट्रान्सप्लटेंशन 20 , 26 की प्रभावकारिता और ग्लाइकोसिलेटेड बायोथेरेप्यूटिक्स 27 के प्रभाव में योगदान करते हैं। इस प्रकार, विभिन्न मानव नमूनों में एंटी-नेऊ 5 जीसी एंटीबॉडी की प्रगति बढ़ती ब्याज की है, और उच्च-थ्रूट्यूप एसेल्स, जैसे कि यहाँ वर्णित व्यक्ति मानव स्वास्थ्य और रोग में अपनी भूमिकाओं को समझने में योगदान दे सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम इज़राइल कैंसर रिसर्च फंड से एक रिसर्च कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड, इजरायल नेशनल नैनोटेक्नोलॉजी इनिशिएटिव से अनुदान और निजीकृत थेरोनोस्टिक्स (वीपी-के) के लिए नैनोमेडिसिन पर एक फोकल टेक्नोलॉजी एरिया के लिए हैम्सले चैरिटेबल ट्रस्ट और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R01GM076360 (XC करने के लिए) संस्थानों

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primary-amine containing sialoglycans Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) Contact info@glycohubusa.com for compound requests Printed glycans
Monosodium phosphate monohydrate Sigma S9638 Printing buffer component
Disodium phosphate heptahydrate Sigma S9390 Printing buffer component
Phosphate buffered saline Hy-Labs BP-507/500D Printing buffer/ incubation/washing buffer
Tris-base Sigma T1503 Slide blocking reagent
Glycerol Sigma G-7893 Printing buffer component
Ethanolamine Thermo-Fisher Scientific 0700/08 Slide blocking reagent
Ovalbumin (Grade V) Sigma A5503 Slide Blocking protein
Tween-20 Sigma P7949 Slide washing detergent
Alexa 555-Hydrazide Thermo-Fisher Scientific A20501MP Marker on array
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson Immunoresearch 009-000-003 Printing component
Biotinylated- SNA Vector Laboratories B-1305 Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked
Biotinylated-MALII Vector Laboratories B-1265 Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked
Chicken-anti Neu5Gc IgY BioLegend 146903 Primary detection
Cy3-Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-0848 Biotin binding
Cy3-anti Human IgG Jackson Immunoresearch 109-165-088 Secondary detection against human IgG
Cy3-anti Chicken IgY Jackson Immunoresearch 703-165-155 Secondary detection against chicken IgY
Human sera samples Israeli Blood Bank Primary detection
Compressed Nitrogen (Grade 5) General dusting/drying tool
Epoxy-coated slides Corning 40044 Slides
Epoxy-coated slides PolyAn 2D 104-00-221 Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots.
384-well microtiter plate Genetix 2070 Printing plate
VWR lab marker VWR 52877-310 Slide labeling
Staining Tube ArrayIt MST Slide developing tool
Staining bath VWR 25608-904 Slide developing tool
Slides glass holders VWR 631-9321 Slide developing tool
GenePix Scanner Molecular devices 4000B Slide scanner
LM-60 NanoPrinter ArrayIt LM-60 Array printer
Pins ArrayIt 946MP3 Printing pins
ProPlate Module Grace Bio-Labs P37004 Slide developing module
Distilled water Bio-Lab 2321020500 Required for arrayer and humidifier
Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL Thermo-Fisher Scientific (Matrix) MA-2131 Impact2 Equalizer 384 Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate

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References

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व्यवहार अंक 125 सियालिक एसिड, Neu5Ac, नेयू 5 जीसी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडीज लेक्टिन ग्लाइकैन माइक्रोएरे कैंसर डायग्नोस्टिक्स हाई-थ्रूटुट परख
साइलोग्लाइकेन माइक्रोएरे परख के साथ मानव सेरा में एंटी-नेऊ 5 जीसी आईजीजी को प्रोफाइलिंग करना
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Leviatan Ben-Arye, S., Yu, H., Chen, … More

Leviatan Ben-Arye, S., Yu, H., Chen, X., Padler-Karavani, V. Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay . J. Vis. Exp. (125), e56094, doi:10.3791/56094 (2017).

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