Summary
Assay microarray sialoglycan ניתן להשתמש כדי להעריך נוגדנים נוגדי Neu5Gc ב sera האדם, מה שהופך אותו assay אבחון תפוקה גבוהה פוטנציאל לסרטן ומחלות כרוניות אחרות מתווך דלקת כרונית.
Abstract
תאים מכוסים בגלימה של שרשרות פחמימות (גלייקנים) שמשתנות בדרך כלל בסרטן וכוללות וריאציות של ביטוי חומצי סיאלי (Sia). אלה הם סוכרים חומצי כי יש 9-פחמן עמוד השדרה וכי מכסה חוליות glycans על משטחי התא. שני של צורות סיה הגדולות היונקים הם N- Acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac) ואת טופס hydroxylated שלה, N- glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc). בני אדם לא יכולים לייצר אנדוגניים Neu5Gc עקב השבתה של הגן קידוד cytidine 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). זר Neu5Gc נרכש על ידי תאים אנושיים באמצעות הצריכה התזונתיים של בשר אדום ומוצרי חלב ולאחר מכן מופיע על glycans מגוונים על פני התא, צובר בעיקר על קרצינומה. כתוצאה מכך, בני אדם מפזרים נוגדנים נגד Neu5Gc שמשחקים תפקידים מגוונים בסרטן ומחלות דלקתיות כרוניות אחרות, אשר הופכים לתהליכים אבחנתיים וטיפוליים פוטנציאלייםתקציבים. כאן, אנו מתארים תפוקה גבוהה sialoglycan assay microarray להעריך נוגדנים אלה נגד Neu5Gc בסרה האדם. Neu5Gc המכילים glycans ואת זוגות מתאימים שלהם של פקדים (Neu5Ac המכילים glycans), כל אחד עם אמין העיקרי הליבה, הם מקושרים קוולנטית כדי אפוקסי מצופה זכוכית שקופיות. אנו מדגימים את הדפסת 56 שקופיות בפורמט 16-היטב באמצעות מדפסת nano ספציפית מסוגל לייצר עד 896 מערכים לכל הדפסה. כל שקופית ניתן להשתמש כדי המסך 16 שונים דגימות sera האדם להערכת אנטי Neu5Gc נוגדנים, ספציפיות וגיוון. הפרוטוקול מתאר את המורכבות של כלי זה חזק ומספק הנחיה בסיסית עבור אלה שמטרתם לחקור את התגובה Neu5Gc פחמימות תזונתיים אנטיגן בדגימות קליניות מגוונות בפורמט מערך.
Introduction
סיאס הם סוכרים חומציים המכסים שרשראות גליקניות על גליקופרוטאינים של תאי תאים וגליקוליפידים בחוליות. ביטוי Sia הוא שונה בתאי סרטן 1 וקושרת עם התקדמות ו / או גרורות 2 , 3 . שני של צורות סיה הגדולות היונקים הם Neu5Ac ואת טופס hydroxylated שלה, Neu5Gc 2 . בני אדם לא יכולים לסנתז Neu5Gc עקב אי פעילות מסוימת של הגן קידוד האנזים CMAH. זה סיא הלא אנושי מטבולית משלבת לתוך תאים אנושיים כמו "עצמי", שמקורה מזון תזונתיים Neu5Gc עשירים ( למשל, בשר אדום) 4 , 5 . Neu5Gc נמצא ברמות נמוכות על משטחי התא של אפיתל אנושי ואנדוטליה, אך הוא נצבר במיוחד בקרצינומה. Neu5Gc מזוהה זרים על ידי מערכת החיסון האנושית הומור 2 , 6 .המורכבות האנטיגנית של Neu5Gc-glycans עשויה להתעורר ברמות רבות, כולל שינוי Neu5Gc, הצמדה, גליקנים בסיסיים ו פיגומים, ואת הצפיפות שלהם, כל לידי ביטוי על ידי המורכבות של נוגדנים נוגדן Neu5Gc בבני אדם 6 . חלק מנוגדנים אלה משמשים ביומרקרים קרצינומה פוטנציאל immunotherapeutics 7 . הופעתו של chemoenzymatic סינתזה של sialoglycans שונים 8 סללה את הדרך לניתוח מעמיק יותר של נוגדנים כאלה, בהנחיית השימוש בטכנולוגיה microiray glycan 9 , 10 . לכן, עם ההכנה להקל על מניפולציה של ספריות גדולות של פחמימות טבעיות וסינתטיות, microlyrays glycan הפכו טכנולוגיה תפוקה גבוהה עוצמה לחקר האינטראקציות של פחמימות עם מספר עצום של biomolecules 10 , 11 , 12 , 13 . בתבנית מערך, כמות מינימלית של חומרים משמשים, ואת זה להציג multivalent של glycans רלוונטי מבחינה ביולוגית מאפשר חקירה של אלפי אינטראקציות מחייבות בניסוי אחד. חשוב לציין, טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת גם גילוי ביולוגי ו לניטור תגובות החיסון בדגימות שונות 7 , 12 .
מוצלח glycan ייצור microarray מחייב את השיקול של שלושה היבטים חשובים: סוג הרובוט מדפסת, כימיה glycan הצמידה, אופטיקה זיהוי. לגבי שיקול כלי ההדפסה, שתי טכניקות זמינות: מדפסות מגע ומגע. בדפוס מגע, 1-48 סיכות פלדה הם טבל לתוך צלחת מקור רב גם המכיל פתרון glycan והם הבחינו על שקופיות זכוכית פונקציונלי ידי מגע ישיר משטח שקופיות זכוכית. כמות הפתרון דה הכבד לשקופית הוא פונקציה של משך זמן מתמשכת על משטח השקופית. בדרך כלל, הדגימות הם הראשונים מראש מנומר על בלוק זכוכית (כדי להגיע כתמים הומוגנית) לפני שהם מודפסים על משטח השקופית. במדפסות ללא מגע ( לדוגמה, מדפסת piezo אלקטרוני), גליקים מודפסים מן נימי זכוכית באמצעות אותות חשמליים מבוקרת. האות החשמלי יכול להיות מכויל היטב כדי להשיג הדפסה מדויקת יותר ביחס להדפסה של איש קשר. גודל ומורפולוגיה של כתמים הם גם יחסית הומוגנית יותר. יתרון נוסף הוא מיחזור המדגם חזרה לצלחת המקור לאחר ההדפסה. עם זאת, החיסרון העיקרי של מדפסות piezo-Electronic הוא הגבלת קצה ההדפסה (4 או 8), וכתוצאה מכך משך הדפסה ארוך מאוד, המחייב תשומת לב מיוחדת ליציבות שקופיות, טמפרטורה, לחות והתאדות מדגם. מדפסת הזרקת הדיו שאינה מזדקקת דורשת כמות גדולה יותר של מדפסות 14 .
S = "jove_content"> בניגוד לאפשרויות הזמינות המוגבלות לשיטות הדפסה, כימיה גליקן הצמידה היא שיקול מורכב יותר, עם אפשרויות רבות לבחירה. כימיה immobilization נבחר חייב בחשבון הן את הקבוצות הפעילות על glycans ואת תגובת משטח שקופיות. את glycans להיות משותקת על משטח מסוים microarray, או synthtically synthesized או מבודד באופן טבעי, כל דורשים קבוצה תגובתי זהה. בנוסף, glycans צריך להיות טהור הומוגנית. מצד שני, משטח immobilization ואת הכימיה צריכה לספק reproducibility וצפיפות מצורף אמין. שיטות רבות immobilization פותחו עם קוולנטיים או לא קוולנטי (קליטה פיזית) 10 , 11 , 12 , 13 . לקבלת מידע מפורט על מודפס טכנולוגיית microarray glycan עבור uninitiateD, עיין אלה ביקורות מצוינות 13 , 15 . חשוב לציין, המידע המינימלי האחרון הנדרש עבור ניסוי Glycomics (MIRAGE) יוזמה מתאר הנחיות להכנת המדגם 16 ולדיווח נתונים מניתוח microarray glycan 17 כדי לשפר את הסטנדרטים בתחום זה גדל.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור ייצור של microarrays sialoglycan באמצעות קשר ספציפי nano מדפסת בפורמט 16-היטב. כל אחד glycans יש אמין הראשי כי לתווך קוולנטי שלהם קישור אפוקסי-מופעל שקופיות זכוכית. כמו כן, אנו מתארים את הפיתוח והניתוח של שקף אחד באמצעות דגימות שונות של סרה אנושית, נוגדנים, וסטטינים של צמחים מחברים. מבחני microarray Sialoglycan לערב כמה צעדים עיקריים הכוללים ייצור מערך, עיבוד, פיתוח וניתוח. מערך מערך דורש תכנון arRay פריסה, הכנת glycans ואת צלחת המקור, תכנות nano מדפסת, והדפסת שקופיות. לאחר מכן, השקפים מעובדים, מפותחים, ונותחו ( איור 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות סרה אנושיות התקבלו מבנק הדם הישראלי והשתמשו בהן בהתאם להצהרת הלסינקי ולמועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת תל אביב.
1. מערך ייצור תכנון פריסה
- קבע את פריסת השקופית.
הערה: כל שקופית מכילה 16 מערכי משנה מחולקים ל 16 בלוקים זהים ממוספרים B1 עד B16 ( איור 1 ב , איור משלים 1 א ). - קביעת פריסת PIN. השתמש בארבע סיכות, כל אחת מהן מדפיסה ארבע מערכי משנה (בלוקים) לשקופית:
פין 1 הדפסים בלוקים 1, 2, 9 ו -10;
פין 2 הדפסים בלוקים 3, 4, 11 ו -12;
פין 3 הדפסים בלוקים 5, 6, 13 ו -14; ו
פין 4 הדפסים בלוקים 7, 8, 15 ו -16 ( איור משלים 1 א ). - לקבוע את הבלוק ואת הפריסה צלחת 384 היטב.
הערה: הסדר שבו הגליקנים מופיעים בכל בלוק דורש תכנון זהיר. בדוגמה זואי, להדפיס כל דגימה בארבע משכפל, עיצוב נקודות סמן פלואורסצנטי להיות ממוקם בפינה הימנית התחתונה (כדי להקל על ניתוח נקודה), ולהדפיס עקומת תקן IgG (STD) כתמים על שש ריכוזים הולכים וגדלים ( איור משלים 1B ).- עבור כל נקודה מודפסת, תחילה לוותר על החומר לארבעה בארות (אחד לכל סיכה) בצלחת 384 היטב.
הערה: סדר החומרים בצלחת 384-היטב מסתמך על פריסת בלוק מעוצב ( איור משלים 1B-C ).
- עבור כל נקודה מודפסת, תחילה לוותר על החומר לארבעה בארות (אחד לכל סיכה) בצלחת 384 היטב.
2. הכנת גלייקנס ואת לוח המקור
- הכן חיץ הדפסה glycan (50 מ"ל של חיץ פוספט 300 מ"מ, pH 8.4). לשקול 58.5 מ"ג של מונוסודיום פוספט מונוסודיום (NaH 2 PO 4 .1H 2 O) ו 3.9 גרם של הפוספט זרחן heptahydrate (Na 2 HPO 4. 7H 2 O) ב 40 מ"ל של מים deionized (DIW). Titrate ל pH 8.4 באמצעות 4 M NaOH. כוונן את עוצמת הקול ל 50 מ"ל אD מסנן דרך קרום 0.2 מיקרומטר עבור עיקור.
- הכן חיץ סמן (50 מ"ל של חיץ פוספט 187 מ"מ, pH 5). לשקול 289 מ"ג של מונוסודיום פוספט מונוסודיום (NaH 2 PO 4 .1H 2 O) ו 1.94 גרם של פוספט זרחני heptahydrate (Na 2 HPO 4 .7H 2 O) ב 40 מ"ל של DIW. טיטרציה ל pH 5 באמצעות 1 M HCl. התאם את עוצמת הקול ל 50 מ"ל ומסנן דרך קרום 0.2 מיקרומטר עבור עיקור.
- הכן חיץ עקומת STD (50 מ"ל של PBS גליצרול: פוספט שנאגרו מלוחים, pH 7.4, בתוספת 10% גליצרול ממלאי גליצרול 100%) ולסנן אותו באמצעות קרום 0.2 מיקרומטר עבור עיקור.
- הכן כל פתרון מלאי glycan ב 10 מ"מ DIW. אימות ריכוז glycan sialylated על ידי זיהוי הקרינה על ניתוח בשלב הכבד בלחץ גבוה ניתוח כרומטוגרפיה 18 .
- לדלל כל גליקן 100 מיקרומטר בהיקף כולל של μL 100 למאגר הדפסה glycanצינורות microcentrifuge.
- הכן אמינים העיקרי המכיל צבע פלואורסצנטי. Solubilize אלקסה 555-hydrazide ל 1 מ"ג / מ"ל עם חיץ סמן ולאחר מכן לדלל ל 1 מיקרוגרם / מ"ל בנפח כולל 1 מ"ל.
הערה: כל צבע אחר המכיל אמין אמין יכול לשמש עם אורך גל מתאים בהתאם לסורק השקופיות.
הערה: נקודות סמן מסמנות את יישור הרשת בכל בלוק במהלך הניתוח. - הכן האדם IgG STD עקומות דילולים: להכין 0.5 מ"ל של פתרון המניות של IgG אדם ב 160 ng / μL במאגר עקומת STD. סדרתי לדלל את המניות 1: 1 שש פעמים כדי לקבל 80, 40, 20, 10, 5, ו 2.5 ng / μL, כל במאגר עקומת STD בהיקף כולל של 200 μL כל אחד.
הערה: ניתן להשתמש באיזוטופים אחרים של Ig אם הם מתאימים לניסוי ( לדוגמה, IgA, IgM, IgE, IgE או IgE של אורגניזם אחר). - מניחים את צלחת 384 היטב על הקרח. באמצעות אלקטרונית פיפטה, aliquot 7 μL של כל glycan, סמן, ועקומת STD IgG- ארבע לשכפלשל כל אחד על פי הפריסה צלחת ( איור משלים 1C ). לקבלת דיוק טוב יותר, לטעון 35 μL של כל מדגם aliquot 7 μL לתוך כל אחד בארבע בארות המדגם. מניחים את 7 μL הנותרים של כל glycan בחזרה לתוך הצינור המקורי שלהם.
- מכסים את הצלחת עם parafilm ספין למטה במשך 2 דקות ב 250 גרם ו 12 מעלות צלזיוס. מניחים את הצלחת בטמפרטורת החדר (RT), מוגן מפני האור. לא לחשוף את הצלחת לפני הלחות בחדר מגיע 60-70%.
3. תכנות המדפסת Nano
- פתח את התוכנה "מנהל Microarray". השתמש בחלון "מאפייני שיטה".
- הגדר את פריסת טבלת העבודה: בחר באפשרות "תצורת שקופיות 56".
הערה: זוהי תצורה מוגדרת מראש המאפשרת הדפסת 56 שקפים. כייל עבור כל סוג של צלחת, סיכה, ואת פורמט ההדפסה ( איור משלים 2 , שלב 1). - בחר "פין תצורה"| "פין כלי 1x4 9 מ"מ."
הערה: זוהי תצורה מוגדרת מראש לשימוש בארבע סיכות ( איור משלים 2 , שלב 2). - הגדר את "סוג פין". לחשב וליצור את סוג הסיכה המתאימה להדפסה.
הערה: שלב זה מגדיר כמה נקודות סיכה ידפיסו לפני טבילה מחדש במדגם 384 היטב ויש לייעל את סוגי סיכה שונים כימי משטח שקופיות.
הערה: בעת שימוש בסיכות של 946MP3, שקול שתי בעיות חשובות: 1) כל סיכה יכולה להדפיס עד 140 נקודות הומוגניות ו -2) טרום תצפית חיונית לניקוז עודפי נוזלים מקצה הסיכה לפני ההדפסה על השקופיות. לכן, תוכנית כל סיכה להדפיס 20 מראש כתמים על בלוק מראש דפוס (אופטימיזציה עבור 946MP3 סיכות על מצופים מצופים אפוקסי).- לחשב את המספר הכולל של כתמים מודפסים לכל מדגם.
הערה: כאן, כל סיכה מדפיסה 4 נקודות לכל תת-מערך (בלוק); סך של 4 תת מערכים לכל שקופיות = 16 כתמים / SLאידיאל. לאחר 7 שקפים, כל סיכה מדפיסה 16 x 7 = 112 נקודות. בנוסף, 20 מראש כתמים לפני ההדפסה נותן 132 נקודות / לטבול. לכן, סוג סיכה מוגדר "כתמים 946MP3-132" (4 כתמים לכל מדגם לכל בלוק x 4 בלוקים x 7 שקופיות + 20 נקודות מראש = 132). - צור את "סוג Pin" ( איור משלים 2 , שלב 3). לחץ על "Setup" (חלונית השמאלית של התוכנה) "מיקרו סיכות פינים" | "שם חדש" (כתמים 946MP3-132). הגדרת מספר כתמים לטבול (132), קוטר ספוט (100 מיקרומטר), ספיגה (0.25 μL), משלוח (0.7 nL), ואת המרווח נקודה מינימלי (100 מיקרומטר). לחץ על "אישור" "בסדר."
- בחלון "מאפייני שיטה", בחר את סוג הסיכה שנוצר: "946MP3-132 כתמים".
- לחשב את המספר הכולל של כתמים מודפסים לכל מדגם.
- הגדר את תנאי הכביסה. הגדר את "שטוף לפני תחילת" ו "לשטוף לאחר גימור" ל "לשטוף רגיל" ( איור משלים 2 , שלב 4).
- הגדר את "רשימת צלחת".
הערה: זהו דפוס הדגימה מהצלחת (סדר המטבלים מהצלחת 384 - באר) בהתאם לפריסת הצלחת. כדי להעלות את הצלחת לרשימת הצלחת, להגדיר דפוס הדגימה צלחת.- צור את הצלחת "תבנית דגימה". עבור אל "תבניות" ( איור 3 ) "דגימות דגימה". תן שם חדש ( למשל, מערך JoVE) ובחר "הוסף" "מילוי מלמטה למעלה" | "פין כלי 1 x4 9 מ"מ." בחר את סדר טנדרים היטב על פי הפריסה צלחת מוגדרת מראש ( איור משלים 1 א ). לחץ על "אישור" "בסדר."
- טען את תבנית הדגימה צלחת. לחץ על הצד הימני של התא "רשימת פלייט" ( איור משלים 3 ) "הוסף צלחת" ובחר את תבנית הדגימה נכונה צלחת ("מערך JoVE" המתואר בשלב 3.6.1.). בחר "רגיל לשטוף". ללחוץ"אישור" | "בסדר."
- עבור אל "מדגם דוגמאות" ולשנות את המיקום לקזז ל 1 (אשר קובע היכן את הצלחת ממוקמת על הסיפון arrayer).
הערה: מיקום היסט של 0 הוא קרוב יותר את אמבטיה sonicator. - הגדר את "עיצוב הדפסה Microarray." לחשב את המרחקים לחסום לחסום ואת המרווח.
- קחו את הממדים של הכלי המתפתח המחלק את השקופית ל 16 בארות של 7 x 7 מ"מ, עם רווחים 2 מ"מ בין מערכי משנה (סך של 9 מ"מ בין בלוקים, איור משלים 4 ).
- שקול את המאפיינים של מערך המשנה.
הערה: המרווח בין הכתמים הוא 0.275 מ"מ ויש 12 עמודים ו -18 שורות בעיצוב זה; המידות כוללות: רוחב (11 x 0.275 מ"מ = 3.025 מ"מ) וגובה (17 x 0.275 מ"מ = 4.675 מ"מ). חישוב המרווח האופקי: 9 מ"מ - (11 0.275) = 5.97 מ"מ. חישוב המרווח האנכי: 9 מ"מ - (17 x 0.275) = 4.325 מ"מ. חישוב דIstance מצד שמאל של שקופית: 4.43 מ"מ + 1.07 מ"מ = 5.5 מ"מ. חישוב המרחק מהצד העליון של השקופית: 2.95 מ"מ + 0.55 מ"מ = 3.5 מ"מ ( איור משלים 4 ). - הגדר את "דפוסים דפוס" ( איור משלים 5 ). בחר "תבניות" | "הדפס עיצובים" "חָדָשׁ."
- בחר "הגדרת פין" | "כלי פין 1 x 4 9 מ"מ" | "פין - 946MP3-132 כתמים." בכרטיסייה "כללי", לשנות את "שם Microarray הדפסה" ( כלומר, "מערך JoVE"). בחר "מהירות ספוט" "מספר לשכפל" (4) | "נקודת מגע גובה" (0 מ"מ) | "גובה מגע רך" (3 מ"מ) | "הדפס לכל הפוזיציות הזמינות" ( איור משלים 5 א ).
- בכרטיסייה "Microarray", בחר את המרווח האופקי והאנכי (5.9 מ"מ ו -4.325 מ"מ משלב 3.8.2) ואת מספר המיקרו-ראיים האופקיים והאנכיים (2). בחר "הדפסMicroarray אופקית "|" שכפל Microarray שכפול "( איור משלים 5 ב ).
- בכרטיסייה תת מערך, בחר את המספר המרבי של עמודות (12), המספר המרבי של שורות (18), ואת המרחק בין העמודות והשורות (275 מיקרומטר) ( איור משלים 5C ).
- בכרטיסייה מדידות, בחר את המרחק מהצד השמאלי של השקופית (5.5 מ"מ), את המרחק מהחלק העליון של השקופית (3.5 מ"מ, מחושב בשלב 3.8.2), רוחב השקופית להדפיס (25 מ"מ) , ואת הגובה של השקופית להדפיס (75 מ"מ) ( משלים איור 5D ). לחץ על "אישור" "בסדר."
- לחץ על הצד הימני של "Microarray הדפס עיצובים" תא ובחר את העיצוב מוגדר ("מערך JoVE" משלב 3.8.3, איור משלים 6 ).
- הגדר את "ספירת שקופיות" (56), ולשנות את "מיקום אופסט" (0). זה קובע את פושל שקופית הראשונה להיות מודפס על סיפון מערבל ( איור משלים 6 ).
- הגדר את "Microarray טרום הדפסה עיצוב" ( איור משלים 6 ). בחר "בלוק זכוכית" "טרום הדפסה 1 x 4 מ"מ הכלי פין."
הערה: אפשרות זו של ריווח נקודה מאפשרת 46,464 נקודות מוקדמות (עבור כל 4 הסיכות) על גוש הזכוכית, לכן 46,464 / 4 = 11,616 נקודות מוקדמות לכל סיכה. כאשר נעשה שימוש בחלל שבדפוס לפני ההדפסה, המדפסת תפסיק ויהיה צורך להזיז את הבלוק.
הערה: כדי לחשב לאחר כמה דגימות טרום להדפיס בלוק מלא, שקול את הדברים הבאים: כל מדגם יילקח על ידי 8 פינים מטבלים בצלחת 384 היטב כדי להשלים 56 שקופיות (7 שקופיות לכל לטבול), וכל לטבול יש עוד 20 נקודות מראש, נותן סך של 160 נקודות מראש לכל מדגם. לכן 11,616 / 160 = 72.6 דגימות. לכן, לפני ההדפסה זכוכית בלוק היה צריך להיות התהפך לאחר 72 דגימות (כדי להעריך את הזמן עבור מרפרף, למדוד hכמה זמן זה לוקח עבור מדגם אחד כדי להשלים ריצה מלאה על 56 שקופיות ולאחר מכן להכפיל ב 72). - בחר "השתמש בעיצוב PrePrint" "כן" | "סרוק ברקודים" (לא) | "הדפס שכפול יחיד" (לא) ( איור משלים 6 ).
- לחץ על "Validate" ( איור משלים 6 ).
- לחץ על "שמור" ולשמור את השיטה כקובץ arr ( למשל, "JoVE array.arr," איור משלים 6 ).
4. הדפסת מערכים מעוצבים
הערה: יש לבצע את כל השלבים בחדר נקי עם לחות של 60-70% ובכפפות ובגדים מתאימים להגנה
- הפעל את המדפסת ננו מכונת אדים.
- עבור חיץ לשטוף לחות, למלא במים DI. רוקן את בקבוק לשטוף (ניקוז) ואת מלכודת לחות carboy ( איור משלים 7A ).
- הגדר את אדים70% לחות ולהתחיל לחות.
- נקה את כל הפינים לפני ההדפסה. הכן 50 מ"ל של חם (65 מעלות צלזיוס) סיכת קצה פתרון ניקוי (15 גרם של סיכה קצה ניקוי מגיב 50 מ"ל של 65 מעלות צלזיוס מים, מעורבב היטב עד מגיב מוצק נמסה לחלוטין).
- החל את פתרון ניקוי לכל קצה סיכה על ידי טבילה מברשת קצה סיכה (בסדר) לתוך פתרון סיכה קצה ניקוי צחצוח פני השטח של כל קצה סיכה.
הערה: פתרון ניקוי קצה קצה הוא קורוזיבי ורעיל. הקפד ללבוש כפפות וכוסות בטיחות בכל עת בעת שימוש בפתרון זה. סיכות השריה בפתרון קצה ניקוי פתרון במשך יותר מכמה דקות עלול לגרום נזק קבוע סיכה. - ממלאים את אמבטיה קולי עם 1 L של מים מזוקקים ומכניסים את הסיכות בתוך סיכה ניידת ניקוי המדף באמבטיה. Sonicate במשך 5 דקות ולהסיר את הפינים. בואו לייבש בעדינות לנגב עם חדר נקי מגבונים מיוחדים.
- החל את פתרון ניקוי לכל קצה סיכה על ידי טבילה מברשת קצה סיכה (בסדר) לתוך פתרון סיכה קצה ניקוי צחצוח פני השטח של כל קצה סיכה.
- פתח את "מנהל Microarray" הדפסהתוכנות; עם הגדרת החיבור, נורית המדפסת נדלקת (אדום / ירוק). לחץ על "עצור" "נקה" "ראשוני" ( איור משלים 7B , שלבים 1-3); הזרוע של ראש ההדפסה תאפס את X, Y, Z יישור.
- כדי לטעון את הסיכות לתוך ראש ההדפסה, לחץ על "טען" ( איור משלים 7B , שלב 4) והנח את הסיכות בראש ההדפסה בהתאם לתצורה המוגדרת של פריסת כלי ההדפסה / הדפים ( איור משלים 7 ג ); פריסה זו משתמשת 4 סיכות, כל הדפסה 4 תת מערכים על כל שקופית כדי לקבל סך של 16 מערכי משנה לכל שקופית ( משלים איור 1 א ). לאחר הנחת הפינים, לחץ על "Init" שוב.
- להרכיב את השקופיות על הסיפון מערבל. פתח את שקופית תיבת לנקות כל שקופית על ידי נושבת גז חנקן במיוחד טוהר. הצב את מספר השקופיות הרצוי בפלטפורמת המערך. החזק את השקופיות עם שתי אצבעות בפינות התחתונה ולאחר מכן הניח את השקופית לתוך שלהעמדה. החזק את שתי הפינות הישרות ודחוף את הפינות השמאליות בעדינות עד שהשקופית תתאים היטב למקומו. דחוף בעדינות לכיוון הפינה השמאלית התחתונה כדי להבטיח התאמה הדוקה ( איור משלים 7D ).
- נקה את הזכוכית טרום בלוק עם מים מזוקקים, אתנול 70%, ואתנול 100% ולתת לו להתייבש אוויר (להשתמש רק ייעודי לנקות את החדר מגבונים). מניחים את הזכוכית מראש לחסום את מיקומו על הסיפון.
- ממלאים אמבטיה sonicator ( איור משלים 7B ). לחץ על "מילוי" עבור 55 שניות ולאחר מכן לחץ על "אישור". מסננים את sonicator על ידי לחיצה על "Drain" במשך 20 שניות ולאחר מכן לחיצה על "אישור". חזור על המילוי וייבוש פעם נוספת ואז למלא שוב 55 s.
- ממלאים את אמבט הכביסה ( איור משלים 7B ): לחצו על "ראש" למשך 40 שניות ולאחר מכן לחצו על "אישור".
- מניחים את הצלחת 384 היטב עם דגימות aliquoted למיקומו על הסיפון arrayer ולהסיר את כיסוי parafilm.
- כאשר ההדפסה הושלמה, נקז את אמבט ה - sonicator ( איור משלים 7 ב ) ותכבה את מכשיר האדים.
- אפשר את השקופיות להתייבש על הסיפון המערך עבור 16-24 שעות ללא לחות.
- מספר שקופיות עם עט סימון / אלכוהול עמיד ממס לאחסן אותם בתיבה ואקום אטום בחושך.
5. עיבוד ופיתוח מערכים
- מוציאים שקופית מתוך תיבת ואקום אטום ומניחים אותו ברדס כימי במשך 5 דקות, מערך כלפי מעלה, כדי להתאדות את הנוזל עודף.
- סרוק את השקופית ברווח הגבוה ביותר (950 PMT) כדי לוודא שכל הכתמים הודפסו.
- המשך חסימה כימית של קבוצות אפוקסי בשקופית
- הכן 50 מ"ל של פתרון אתנולמין חסימת (0.1 M Tris-HCl, pH 8 ו 0.05 M אתנולמין). מערבבים 140 מ"ל של DIW עם 8.8 מ"ל של Tris-HCl (1.7 M, pH 8) ו 0.45 מ"ל של ethanolamine (16.6 M). העברה ל 50-מ"ל מכתים צינור ( איור משלים 8A ) וחם עד 50 מעלות צלזיוס.
- הידר את השקופית. מניחים את השקופית בצינור מכתים מלא דיו, לכסות אותו עם לסכל, ו דגירה במשך 5 דקות עם רועד איטי ועדין ב RT.
- לחסום את קבוצות אפוקסי תגובתי בשקופית. טובלים את השקופית לתוך צינור 50 מ"ל מכתים מלאים מראש אתנולאמין לחסום פתרון חסימה, לכסות עם לסכל, ו דגירה של 30 דקות עם רעד איטי ועדין ב RT.
- מחק את פתרון חסימת אתנולמין לתוך כלי קיבול האשפה המתאים biohazard ומניחים את השקופית בצינור חדש, נקי מכתים מלא 50 מעלות C DIW. מכסים עם לסכל ו דגירה במשך 10 דקות עם רועד איטי ועדין ב RT.
- מחק את המים ולהעביר את השקופיות למחזיק זכוכית מכתים ( איור משלים 8B ). מניחים את הזכוכית מכתים בעל לתוך מחזיק צלחת נדנוד צנטריפוגה לייבש את השקופית במשך 5 דקות ב 200 xg ו RT.
- מניחים את השקופית על מחלף 16-היטב ( איור משלים 8C ).
- הכן פתרון כביסה PBST: 50 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), pH 7.4 + 0.1% Tween-20.
- הכן פתרון חסימה ביולוגית (PBS-OVA): 5 מ"ל של PBS, pH 7.4 + 1% עוף ovalbumin (10 מ"ג / מ"ל).
הערה: הבחירה של מגיב חסימת הוא קריטי להצלחת איתור נוגדן אנטי Neu5Gc. Ovalbumin הוא עשה תרנגולות אשר, כמו בני אדם, לא יכול לסנתז Neu5Gc, גרימת חוסר ביטוי של זה סיא. עבור איתור של Neu5Gc, אפילו זיהומים קלים יכול להפחית באופן דרמטי את הרגישות של assay, לפעמים אפילו לא מצליח לזהות כל anti-Neu5Gc תגובתיות. לדוגמה, מגיב החסימה הנפוץ ביותר, אלבומין בסרום שור (BSA), אם כי לא glycosylated בפני עצמו, מכיל IgG מזהמים קרום שנושאים Neu5Gc-moieties ולכן מתחרותIth מודפס glycans כאשר מחייב לדגום עם נוגדנים נגד Neu5Gc 19 , 20 . - Prewet הבארות. שימוש רב פיפטה, aliquot 200 μL של PBST לתוך שקופיות בארות, למקם אותם בחדר לח מכוסה, ולנער במשך 5 דקות.
הערה: תא לחות הוא מגש זכוכית עם נייר מגבת רטובה, מכוסה בניילון ניילון לסכל כדי להגן על דגימות מן האור. - הסר את PBST ידי מהבהב הקשה בעדינות על נייר נקי מגבת aliquot 200 μL של חיץ PBS-OVA חסימת לתוך כל טוב. מקום בחדר לח ו דגירה במשך שעה 1 ב RT עם רעד עדין.
- הכנת איתור ראשוני מדולל במאגר חסימת PBS-OVA, כמפורט בטבלה 2 .
הערה: עבור בקרת איכות (QC) הערכה של microarray sialoglycan זה, להשתמש בכמה חלבונים מחייב סיה: Sambucus nigra lectin (SNA), מבודדים קליפת סמבוק, צפוי לזהות Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis לקטין II (MALII) צפוי לזהות Siaα23; ו עוף נגד Neu5Gc IgY צפוי להכיר את כל Neu5Gc המכיל sialoglycans. בנוסף, השתמש שונים דגימות sera האדם פרופיל אנטי Neu5Gc תגובה IgG. ריכוז של lectins / נוגדנים / sera צריך להיות מכויל ניסיוני. - קפיצי יבש PBS-OVA חסימת חיץ ולהוסיף 200 μL של נוגדנים ראשוניים לכל טוב (נפח מינימלי לכל טוב: 70 μL), דגירה בחדר לח במשך 2 שעות.
- קפיצי יבש איתור הראשי לשטוף 4 פעמים עם PBST (בין 3 r ו לשטוף 4 ה , דגירה את השקופית PBST במשך 5 דקות בחדר לח). לשטוף פעם עם PBS.
- הכן את הנוגדנים המשניים PBS, כמפורט בטבלה 2 .
- קפיצי יבש PBS ולהוסיף 200 μL של נוגדן משני. דגירה עבור 1 שעה ב RT עם רעד.
- קפיצי יבש את הנוגדן משני לשטוף ארבע פעמים עם PBST (בין 3rd ו 4 לשטוף ה, דגירה שקופית PBST עבור 5 דקות בתא לח).
- בזהירות להסיר את המסגרת במקום שקופיות לתוך צינור 50 מ"ל שקופיות מכתים מלא PBS ולנער במשך 5 דקות.
- מלאו שתי אמבטיות מכתים שקופיות ( איור משלימה 8D ) עם DIW, את השקופית לתוך השקופית מחזיק, ולטבול אותו בתוך האמבטיה. טוב לטבול 10 פעמים ולאחר מכן להעביר את האמבטיה השנייה לטבול 10 פעמים נוספות. דגירה של 10 דקות ב RT עם רעד.
- מחק את המים ולהעביר את השקופית למחזיק זכוכית מכתים ( איור משלים 8B , לאפשר את השקופית לאוויר יבש). מניחים את הזכוכית מכתים בעל מחזיק צלחת נדנוד צנטריפוגה לייבש את השקופית במשך 5 דקות ב 200 גרם ו RT.
- סרוק את השקופית ולאחר מכן לאחסן אותו בתיבה ואקום אטום בחושך.
6. מערך סריקה ניתוח נתונים
- פתח את הסורק שקופיות ניאון ולתת לו חם במשך 5 דקות. פתח את הסריקה וניתוח תוכנה.
- הגדרת הפרמטרים סריקה ( איור משלים 9A ): סריקה ב 532 ננומטר ו 100% כוח עם רווח של 350 PMT, עם שורה אחת למיקום ממוצע המיקוד 0 מיקרון. השתמש ברזולוציה 10.0 פיקסלים פיקסל גודל.
הערה: ניתן לשנות את הפרמטרים של הסריקה לסוגי שקפים שונים, לקרינה ולרזולוציה. - סרוק את השקף המפותח. פתח את דלת הסורק והנח את השקופית פנימה, המערך פונה כלפי מטה. התחל סריקה (כפתור "הפעל" ירוק בתפריט לוח ניווט התוכנה, איור משלים 9B ).
- שמור את השקופיות שנסרקו כקובץ טיף.
- הכן שקופית לניתוח. בחר "טען רשימת מערך" והעלה את קובץ ה- GAL המתאים הממפה את המערכים בכל בלוק בשקופית ( איור משלים 9C ).
הערה: קובץ GAL מכיל מידע לגבי הזהות והמיקום (X, Y) של כל נקודה בשקופית. ניתן ליצור קובץ זהעל ידי תוכנת המדפסת לייצא קובץ טקסט מופרד באמצעות טאב מבוסס על זהויות דגימות בצלחת המקור 384 היטב ואת עיצוב ההדפסה מוגדר. - הגדר את הפרמטרים יישור ופרמטרים. לחץ על הלחצן "אפשרות" בתפריט לוח הניווט של התוכנה ( איור משלים 10 ).
- הגדר את הפרמטרים יישור. מצא תכונות מעגליות, תכונות שינוי גודל במהלך יישור על ידי 50 - 350%, להגביל תכונה תכונה לתרגום מקסימלי של 40 מיקרומטר, תכונות unflag כי להיכשל סף הרקע (סף CPI 0), להעריך את העטיפה ואת הסיבוב בעת מציאת בלוקים, וכן להפוך תמונה אחת (10 פיקסלים) ( איור משלים 10 ).
- הגדרת הפרמטרים ניתוח: יחס W1 / 532, סטיית תקן נורמלי, לנתח תכונות נעדרים, חיסור רקע. לחץ על "בחר" ולאחר מכן "מקומי רקע תכונה מקומית" ולהגדיר 2 פיקסלים כדי לכלול רוחב של 3 פיקסלים של הרקע. לחץ על "אישור". SeT רמת רוויה הסורק לברירת המחדל ( איור משלים 10 ).
הערה: שיטת חיסור הרקע תלויה בעיצוב הניסוי וניתן לשנותה בהתאם לצרכים ספציפיים. - יישר את מפות התכונות. הגדר את התוכנית למצב בלוק (לחץ על "B"), בחר את כל הבלוקים (Ctrl + A), הצב את רשתות מפת המערך ויישר את כל החסימות (Alt + Shift + F7) ( איור משלים 11 ).
- צמצם את יישור התכונה בכל בלוק. זום (לחץ על "Z" כדי להיכנס למצב זום) לתוך הבלוק השמאלי העליון, לחץ על "B" שוב (מצב בלוק), ולחץ על הרשת של גוש זה. רק להזיז את הרשת של גוש זה עד שהוא יישור מושלם עם כתמים לחסום ולחץ על F5 כדי ליישר את התכונות בבלוק זה נבחר. חזור על תנועת הרשת ו F5 יישור עד כתמים מעוגלים באופן מושלם. לעשות את אותו הדבר עבור כל אחד 16 בלוקים עד כל רשתות נמצאים במקום.
- לנתח ולשמור את הנתונים. בחר את כל הבלוקים (Crtl +)A) ולאחר מכן לנתח את הנתונים (Alt + A). שמור את תוצאות הניתוח (Ctrl + U) כקובץ gpr.
- פתח את הקובץ שנשמר. Gpr בתוכנית גיליון אלקטרוני ולנתח את העוצמה של כל נקודה על בסיס הקרינה לאחר חיסור רקע מקומי (F532-B532).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערך הדפסה, פיתוח וניתוח:
הדפסת microarray sialoglycan עם דגימות glycan מרובים האדם IgG STD עקומות ב 16 בלוקים שונים דורש כיול יסודי על מנת להבטיח כי כל הדגימות מודפסים כמו אחיד ככל האפשר בכל 16 בלוקים לכל שקופית לכל שקופיות באותה הדפסה לרוץ. לכן, ניסויים כיול מרובים נדרשים לפני הפרמטרים הדפסה ספציפיים נקבעים, כולל הרכב חיץ עבור כל סוג של מדגם, סוג שקופית וייצור, סוג צלחת 384 גם, רמות לחות, נפח המדגם בצלחת 384 היטב, כמות pre , הדפסה עבור כל סוג של מדגם, האדם IgG STD ריכוזי עקומת, סוג הסמן. העמידות של שקפים מסוג sialoglycan מודפסים כאלה אומתה עד 10 חודשים בתיבה אטומה ואקום בחושך בטמפרטורת החדר. בכל ניסוי הדפסה, האחידות היאפיקוח נוסף ואמת באמצעות ניסויים בקרת איכות באמצעות lectia מחייב סיה נוגדנים. פיתוח וסריקה של פרוטוקולים היה מותאם כדי להשיג אחידות ודיוק על ידי השוואת דגימות בתוך ובין שקפים מאותו ריצה הדפסה. השקופיות מפותחות עם המחיצה 16-היטב, אשר מבטיח הפרדה נכונה בין בלוקים, באמצעות תנאי חסימה אופטימליים (כימי וביולוגי), שוטף, ואת הדגירה פעמים. זיהוי ראשוני ומשני היה מכויל באופן נרחב כדי להבטיח זיהוי מקסימלי עם רקע מינימלי ולא מחייב ספציפי. עם סריקה סריקה וניתוח, תוצאות הפלט הועברו לקובץ גיליון אלקטרוני ונותחו כדי לקבוע את זיהוי בכל נקודה. כל נקודה היתה כפופה לבדיקות חריגות ושמטה אם היא לא עמדה ב- QC (אם ה- CV% 20 והמקום נמצא מחוץ לטווח של סטיית תקן אחת הרחק מהממוצע של ארבעת המשכפלות). ואז, עוצמת האות הממוצע afteR החיסור של הרקע המקומי היה ממוצעים עבור כתמים לשכפל לכל מדגם כדי ליצור את יחידת הקרינה היחסית (RFU) נקודת נתונים למדגם מודפס. לאחר אחידות של עקומות IgG STD היה מאומת בכל בלוקים נבדק, ערכי RFU מנורמל לתוך ng / μL IgG, המאפשר הזדמנות להשוות טוב יותר דגימות בתוך ובין ניסויים.
SIA מחייב Assay תפוקה גבוהה:
מערכים Sialoglycan ניתן להשתמש כדי לזהות דטרמיננטים ( למשל, חלבונים, lectins, נוגדנים, וירוסים, וכו ' ) כי לאגד סיאקים המכילים גליקנים. עבור QC לאחר ההדפסה, סיה מחייב lectins המפעל נגד Neu5Gc IgY משמשים 19 . SNA נקשר α2-6 מקושר SIA, MALII נקשר α2-3 מקושר Sia, ו Neu5Gc IgY IgY נקשר Neu5Gc המכיל sialoglycans אבל לא לאגד Neu5AC המכילים sialoglycans 19 , כפי שמוצג באיור 2 א . ניסוי QC שואפת לאמת את הדפוס ואת הזהות הספציפית ואת חוסר ההשתנות בין הבלוקים המודפסים באמצעות ארבעת הפינים השונים. בלוק אל הבלוק השתנות הוא פיקוח על ידי פיתוח ארבעה בלוקים עבור כל גילוי ראשוני לכל שקופית ועל ידי השוואת בלוקים מודפסים עם כל אחד מארבעת סיכות עם אותו גילוי ראשוני זהה. לאחר מכן נעשה השוואה כדי להבטיח כי לא קיימים הבדלים משמעותיים.
הסרום האנושי מכיל נוגדנים אנטי-Neu5Gc מגוונים 6 עם משמעות למחלות אנושיות שונות 2 , 21 , 22 , 23 . כדי להעריך את ההכרה sialoglycan ב IgG sera האדם, 12 sera מתורמים אנושיים בריאים נותחו על micr sialoglycan מודפסOarray ופיתח באמצעות fluorescently שכותרתו אנטי אנושי IgG ( איור 2 ב ). כל בלוק מודפס מכיל אדם IgG STD עקומת כי הוא דומה הומוגני בכל בלוקים ( איור 2 ג ). רק לאחר אימות האיכות של עקומות STD בכל בלוק ( איור 2 ג ) הם תוצאות כתמים glycan מנורמל על פי המדרון בבלוק ולאחר מכן מוכפל על ידי גורם דילול. כפי שמוצג באיור 2B , כל סרא האדם נבדק מכילים רמות שונות של אנטי Neu5Gc IgG, עם כמעט שום הכרה של זוגות תואמים של Neu5Ac המכיל sialoglycans. יתר על כן, אנטי Neu5Gc דפוסי הכרה IgG הם מגוונים מאוד בין אלה 12 sera שונים, הן ברמת האינטנסיביות של מגוון.
איור 1: סקירה כלליתשל מערך מערך, פיתוח, ניתוח תמונה. ( A ) Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2 מוצג כנציג נציג Neu5Gc-sia glycan, עם אמין ראשוני המודפס על שקופיות זכוכית מצופות אפוקסי. ( ב ) מערכים מודפסים מפותחים עם חלבונים שונים מחייב SIA, ואחריו זיהוי עם נוגדן משני המתאים fluorescently שכותרתו. כל תת מערך ניתן לפתח בנפרד. ( C ) סריקת שקופית בדיקה סורק פלואורסצנטי מייצר תמונה כי הוא עוד לנתח באמצעות תוכנת התמונה סורק. מערכי המשנה הם עלים עם מיפוי רשת כל נקודה על מערכים ואת הקרינה זוהה עבור כל נקודה. התוצאות מועברות לאחר מכן לתוך קובץ גיליון אלקטרוני. מערך אחד בבאר אחת מיוצג באופן סכמטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: פרופילים של Siroglycan Microarrays באמצעות שונים SIA מחייב חלבונים.
Slides פותחו עם 16 moessions זיהוי שונים, אחד בכל בלוק. ( א ) נציג 3 בלוקים של שקופית QC מראה את הדפוסים מחייב של סיא ספציפי צמח lectins SNA ו MALII ו polyclonal מונו ספציפיים עוף נגד Neu5Gc IgY. התוצאות מוצגות בתור RFU בפורמט מפת החום עבור כל בלוק בודדים (אדום, לבן, כחול, המייצג את 100 ה, 50 ה, ו 0 העשירונים ה, בהתאמה). ( B ) 12 שונים בריאים סרה אנושית נבדקו בדילול 1: 100 ו זוהה עם אנטי huamn אנטי נגד פרופיל אנטי Neu5Gc תגובת IgG. נתוני ה- RFU מנורמל ל- ng / μL על-ידי חלוקת כל ערך עם שיפוע עקומת IgG STD בכל בל"ד ספציפיOck ולאחר מכן מוכפל על ידי גורם דילול. הנתונים מיוצג בפורמט מפת החום לכל בלוקים משולב (אדום, לבן, כחול, המייצג te 100 th, 50 ה, ו 0 העשירונים ה, בהתאמה). ( ג ) האדם IgG STD עקומות של 12 בלוקים שפותחה עם sera האדם ששימש לנרמל את הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| תעודת גליקן | מִבְנֶה | |||
| 1 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcNAcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 2 | (CH 2 ) 2 CH 2 </ Sub> NH 2 | |||
| 3 | Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcNAcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 4 | Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 5 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 6 | Neu5Gcα6GalNAcαO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 7 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GlcNAcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 8 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 9 | Neu5, 9Ac 2 α3Galβ3גאלאנאקאו (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 10 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 11 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 12 | Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 13 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 14 | Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 15 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 16 | 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 17 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 18 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 19 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 20 | Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 21 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 22 | Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 23 | Neu5, 9Ac 2 α6GalNAcαO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 24 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 25 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 26 | Neu5Gcα3GalβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 27 | Neu5Acα6GalβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 28 | Neu5Gcα6GalβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 29 | Neu5, 9Ac 2 α3GalβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 30 | 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 31 | Neu5, 9Ac 2 α6GalβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 32 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 33 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 34 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 35 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 36 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | ||||
| 38 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 39 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcβO (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 40 | (CH 2 ) 2 CH 2 NH 2 | |||
טבלה 1: רשימת גליקנים מודפסים.
| ראשי / משני | נוגדן / לקטין | ריכוז במלאי | ספֵּצִיפִיוּת | עבודה דילול / ריכוז |
| איתור ראשוני | ביאליאטי | 1 מ"ג / מ"ל | Sialic חומצה ב α2-3 הצמדה | 1:50, 20 מיקרוגרם / מ"ל |
| Biotinilated-SNA | 2 מ"ג / מ"ל | Sialic חומצה ב α2-6 הצמדה | 1: 100, 20 מיקרוגרם / מ"ל | |
| עוף נגד Neu5Gc IgY | ND | Neu5Gc חומצה סיאלית | 1: 7,000 | |
| סרום אנושי | 100% | אפיטופים רבים | 1: 100 | |
| זיהוי משני | Cy3-Streptavidin | 0.75 מ"ג / מ"ל | ביוטין | 1: 500, 1.5 מיקרוגרם / מ"ל |
| Cy3 נגד עוף IgY | 0.75 מ"ג / מ"ל | עוף IgY | 1: 2,000, 0.375 מיקרוגרם / מ"ל | |
| Cy3-anti אדם IgG H + L | 0.6 מ"ג / מ"ל | חומהN IgG | 1: 1,500, 0.4 מיקרוגרם / מ"ל |
טבלה 2: רשימת חלבונים לזיהוי ראשוניים ומשניים.
נתונים משלימים: אנא לחץ כאן להורדת הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מוצלח glycan ייצור microarray דורש תכנון זהיר כולל מספר שלבים חשובים בפרוטוקול. אלה כוללים: (1) תכנון פריסות הבלוק והצלחות המגדירים את כל הפרמטרים הבאים ( לדוגמה, מרחקים, ריווח, כמות הדגימות והדפסה); (2) לנקות את הסיכות ולהבטיח שלמות הדק, שהיא קריטית לשליטה בהומוגניות ספוטית; (3) שמירה על לחות גבוהה במהלך ההדפסה, קריטי כדי למנוע אידוי מדגם במהלך הדפסה ארוכה, אשר עלול לפגוע בהומוגניות ספוט; (4) בחירת יישור נכון פרמטרים ניתוח, אשר יכול להשפיע על התוצאות ( למשל, שיטת חיסור רקע, סף, וגודל גודל גמישות).
השיטה יכולה להיות שונה עוד יותר כדי לפגוש עיצובים ניסויים ספציפיים ויעדים. לדוגמה, ניתן לשנות את מספר הטרום-מראש כדי שיתאים בצורה טובה יותר לכל סוג של חומר שיודפס על המערך. שלב סיכת הכביסה במהלךניתן להדפיס בצורה אופטימלית בהתאם לחומרים מודפסים שונים, עם מחזורי כביסה קצרים או ממושכים יותר. יתר על כן, כמות כתמים הדפסים סיכה לטבול יכול להיות שונה כדי לכלול יותר או פחות נקודות אבל דורש כיול נפרד עבור כל סוג של חומר המשמש במערך. סוג של סמן הקרינה ואת הריכוז שלה יכול להיות שונה, כל עוד הוא מכיל את הקבוצה הכימית הנכון עבור הצמידה ( כלומר, אמין הראשי עבור מצופים אפוקסי מצופה). ריכוזים וסוגים של עקומות STD ניתן להרחיב ( למשל, אדם / עכבר / אורגניזם אחרים IgG, IgM, IgA, וכו ' ). תנאי Buffer יכול להיות מותאם כדי להתאים חומרים שונים, רצוי חסר חומרים עם אמין העיקרי, כדי למנוע מחייב ספציפי למערך, אשר יגרום רקע מוגבר. חשוב לציין, עבור זיהוי אופטימלי של Neu5Gc, מגיב החסימה הביולוגית חייב להיות חופשי Neu5Gc ( למשל, להימנע BSA אמד חלב), כמו זה עשוי להפחית Neu5Gc- sialoglycan איתור אנירקע 19 , 20 . ריכוזי זיהוי ראשוני ומשני צריך להיות מותאם כדי למנוע רקע גבוה שאינם מחייב ספציפי. בנוסף, הפרמטרים סריקה ( למשל, כוח, רווח, רזולוציה) ניתן לשנות כדי להפחית את הרקע או לשפר אותות נמוכים. לבסוף, יישור ופרמטרים ניתוח ניתן לשנות כדי להתאים רקע גבוה או תכונות בצורת שונה. מידע נוסף והנחיות בנוגע לסטנדרטים המומלצים לדיווח על נתוני המיקרו-רייאן של Glycan תוארו לאחרונה על-ידי יוזמת MIRAGE 17 , אשר יכולה בסופו של דבר להקל על שיתוף נתונים ופרשנות.
לסיכום, microlyrays glycan לספק כלי חזק לחקר אינטראקציות glycan biomolecule והוא יכול להיות מותאם לדגימות ביולוגיות שונות. נוגדנים נגד Neu5Gc ממלאים תפקידים שונים במחלות אנושיות 23 . לדוגמה, בסרטן, נוגדנים נוגדי Neu5Gc משחקים תפקידים כפולים: מצד אחד, הם משמשים סמנים ביולוגיים פוטנציאליים, אך מצד שני, הם משמשים כטיפול פוטנציאלי 7 , 21 , 24 . נוגדנים אלה גם תורמים להחמרת טרשת עורקים 25 , היעילות של xenotransplantation 20 , 26 , ואת ההשפעה של biotherapeutics glycosylated 27 . לפיכך, אפיון נוגדנים נוגדי Neu5Gc בדגימות אנושיות שונות הוא בעל עניין הולך וגדל, ובדיקות תפוקה גבוהה, כמו זו המתוארת כאן, יכולות לתרום לקידום ההבנה שלנו לגבי תפקודן בבריאות האדם ובמחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקם על ידי קרן מחקר מחקר ופיתוח של הקרן למחקר הסרטן בישראל, מענק מהקרן הלאומית לננוטכנולוגיה וקרן הצדקה של הלמסלי עבור תחום מוקד על ננו-רפואה לתרנוסטים מותאמים אישית (VP-K) מכוני בריאות מענק R01GM076360 (ל- XC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
