Summary
İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir.
Abstract
Hücreler, kanserde yaygın şekilde değişen ve sialik asit (Sia) ifadesinde değişiklikler içeren karbonhidrat zincirleri (glikanlar) paketi ile kaplıdır. Bunlar, 9-karbon omurgasına sahip olan ve hücre yüzeylerinde omurgalı glıkanları kaplayan asidik şekerlerdir. Memelilerin başlıca Sia formlarından ikisi N- asetilnöraminik asit (Neu5Ac) ve onun hidroksillenmiş formu, N- glikolilneuraminik asit (Neu5Gc) 'dir. İnsanlar, sitidin 5'monofosfat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hidroksilaz (CMAH) kodlayan genin inaktivasyonu nedeniyle endojen Neu5Gc üretemez. Yabancı Neu5Gc, kırmızı et ve sütten besin tüketimi yoluyla insan hücreleri tarafından edinilir ve ardından çoğunlukla karsinomalar üzerine biriken hücre yüzeyindeki çeşitli glıkanlarda görülür. Sonuç olarak, insanlar kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı hastalıklarda çeşitli rol oynayan ve potansiyel tanı ve terapötik ta olan dolaşımdaki anti-Neu5Gc antikorlarına sahiptirler.rgets. Burada, bu tür anti-Neu5Gc antikorlarını insan serumunda değerlendirmek için yüksek verimli bir sialoglikan mikroarray deneyi tarif ederiz. Neu5Gc içeren glikanlar ve bunların her biri bir çekirdek primer amin içeren eşleştirilmiş kontrol çiftleri (Neu5Ac içeren glikanlar), epoksi kaplı cam slaytlara kovalent olarak bağlanır. Baskı başına 896 diziye kadar çıkabilen özel bir nano-yazıcı kullanarak 16 slayt formatında 56 slaytın baskısını örnekledik. Her slayt, anti-Neu5Gc antikor özgüllüğünün, yoğunluğunun ve çeşitliliğinin değerlendirilmesi için 16 farklı insan serum örneğini taramak için kullanılabilir. Protokol, bu sağlam aracın karmaşıklığını tanımlar ve bir dizi formatında farklı klinik örneklerde Neu5Gc diyet karbonhidrat antijenine cevabı araştırmayı amaçlayanların temel bir kılavuz sağlar.
Introduction
Sias, hücre yüzeyi glikoproteinleri üzerindeki glıkan zincirlerini ve omurgalılardaki glikolipitleri kapsayan asidik şekerlerdir. Sia kanser hücrelerinde 1 değiştirilebilir ve ilerlemesi ve / veya metastaz 2, 3 ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Memelilerdeki başlıca Sia formlarından ikisi Neu5Ac ve onun hidroksillenmiş formu Neu5Gc 2'dir . İnsanlar CMAH enzimini kodlayan genin belirli bir inaktivasyonu nedeniyle Neu5Gc'yi sentezleyemez. Bu insan dışı Sia metabolik diyet Neu5Gc zengin besinler (örneğin kırmızı et) den "kendini," menşeli 4, 5 gibi insan hücrelerine sahiptir. Neu5Gc, insan epitelinin ve endotelin hücre yüzeylerinde düşük seviyelerde bulunur, ancak özellikle karsinomalarda birikir. Neu5Gc, insan humoral bağışıklık sistemi 2 , 6 tarafından yabancı olarak tanınır.Neu5Gc-glıkanların antijenik karmaşıklığı, insanlardaki anti-Neu5Gc antikor cevabının karmaşıklığı tarafından yansıtılan, Neu5Gc modifikasyonu, bağlanma, altta yatan glıkanlar ve iskeleler ve bunların yoğunluğu da dahil olmak üzere çoklu seviyelerde ortaya çıkabilir 6 . Bu antikorlardan bazıları karsinom biyolojik belirteçleri ve potansiyel immünoterapötikler 7 olarak kullanılır . Farklı sialoglikanlar 8'in kemoenzimatik sentezinin ortaya çıkışı, bu tür antikorların daha derinlemesine analizine yol açtı, bu da glıkan mikroarray teknolojisi 9 , 10 kullanılarak kolaylaştırıldı. Bu nedenle, doğal ve sentetik karbonhidratların büyük kütüphanelerinin kolaylaştırılmış hazırlanması ve manipülasyonu ile, glıkan mikrodizileri karbonhidratların sayısız biyomoleküllerle olan etkileşimlerini araştırmak için güçlü, yüksek verimli bir teknoloji haline geldi 10 , 11 , 12 , 13 . Bir dizi formatında, az miktarda malzeme kullanılır ve biyolojik olarak ilgili glıkanların bu çok-değerli gösterimi, tek bir deneyde binlerce bağlanma etkileşiminin araştırılmasını sağlar. Önemli olan, bu teknoloji aynı zamanda biyomarkır bulguları ve çeşitli numunelerde 7 , 12 bağışıklık yanıtlarını izlemek için de uygulanabilir.
Başarılı glıkan mikrodizi imalatı, üç önemli hususu göz önüne alır: yazıcı robot tipi, glikan konjugasyon kimyası ve tespit optiği. Baskı aleti konusuna gelince, iki teknik mevcuttur: temaslı ve temassız yazıcılar. Temas baskıda, 1-48 çelik pim, glikan solüsyonu içeren çok iyi kaynak plakasına daldırılır ve cam sürgü yüzeyine doğrudan temas ederek işlevselleştirilmiş cam slaytlar üzerinde lekelenir. Çözelti miktarı deSlayta gömülmüş olan, slayt yüzeyinde kalıcı sürenin bir fonksiyonudur. Genellikle, numuneler önce kaygan yüzey üzerine basılmadan önce bir cam blok üzerine (homojen noktalere ulaşmak için) önceden lekelenir. Temassız yazıcılarda ( örn., Piezo elektronik yazıcı), glikanlar, kontrollü elektrik sinyalleri kullanılarak bir cam kılcalından basılır. Kontak baskıya kıyasla daha hassas baskı elde etmek için elektrik sinyali hassas bir şekilde kalibre edilebilir. Noktaların boyutu ve morfolojisi de nispeten daha homojen. Ek bir avantaj, numunenin baskıdan sonra kaynak plakasına geri döndürülmesidir. Bununla birlikte, piezo elektronik yazıcıların en büyük dezavantajı baskı ucu sınırlaması (4 veya 8) olup, kayma kararlılığı, sıcaklık, nem ve numunenin buharlaşmasına özel dikkat gerektiren çok uzun bir yazdırma süresi sağlar. Temassız inkjet yazıcı 14 daha büyük numune hacimleri gerektirir.
10 , 11 , 12 , 13 ile geliştirilmiştir . Baskın glikan mikroarray teknolojisi ile ilgili son derece detaylı bilgi almak içinD araştırmacı, bu mükemmel değerlendirmeleri 13 , 15 bakın . Önemlisi, bir Glikomik Deney (MIRAGE) inisiyatifi için gereken son Minimum Bilgi, numune hazırlama 16 için ve bu büyüyen alanda standartları iyileştirmek için glıkan mikrodizi analizleri 17'den veri raporlama talimatlarını açıklar.
Burada, 16 yuvalı bir formatta belirli bir kontaklı nano-yazıcı kullanarak sialoglikan mikrodizilerinin imalatı için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Glikanlardan her biri, epoksi ile aktive edilen cam slaytlarına kovalent bağlantısına aracılık eden bir birincil amin içerirler. Ayrıca çeşitli insan sera örneklerini, antikorları ve Sia bağlayıcı bitki lektinlerini kullanarak bir slaytın gelişimini ve analizini açıklıyoruz. Siyaloglikan mikroarray tahlilleri, dizi imalatı, işlenmesi, geliştirilmesi ve analizi içeren birkaç ana aşamayı içerir. Dizi üretiminde armanın planlanması gerekirRay düzeni, glikanlar ve kaynak plakası hazırlanması, nano yazıcının programlanması ve slaytların basılması. Daha sonra, slaytlar işlenir, geliştirilir ve analiz edilir ( Şekil 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan serum örnekleri İsrail Kan Bankası'ndan alındı ve Helsinki bildirgesi ve Tel Aviv Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu'na uygun olarak kullanıldı.
1. Dizi Üretim Planlama ve Düzen
- Slayt düzenini belirleyin.
NOT: Her slayt B1'den B16'ya numaralandırılmış 16 özdeş bloğa bölünmüş 16 alt diziyi içerir ( Şekil 1B , Ek Şekil 1A ). - Pin düzenini belirleyin. Slayt başına dört alt diziliş (blok) yazdıran dört iğne kullanın:
Pin 1, Bloklar 1, 2, 9 ve 10'u yazdırır;
Pin 2, Blok 3, 4, 11 ve 12'yi yazdırır;
Pin 3, Blok 5, 6, 13 ve 14 yazdırır; ve
Pim 4, Blok 7, 8, 15 ve 16'yı basar ( Ek Şekil 1A ). - Blok ve 384 plaka düzeni belirleyin.
NOT: Glikaların her bir blokta görünme sırası dikkatli bir planlama gerektirir. Bu örnekte, arrHer örneği dört kopyaya yazdırın, sağ alt köşede bulunacak (spot analizini kolaylaştırmak için) floresan işaretçi lekelerini tasarlayın ve standart eğri IgG (STD) lekelerini altı artan konsantrasyonda basın ( Ek Şekil 1B ).- Her basılı nokta için önce materyali 384 gözlü bir plakada dört kuyuya (her pim için bir tane) boşaltın.
NOT: 384 delikli plakadaki malzemelerin sırası tasarlanmış blok düzenine dayanır ( Ek Şekil 1B-C ).
- Her basılı nokta için önce materyali 384 gözlü bir plakada dört kuyuya (her pim için bir tane) boşaltın.
2. Glccan ve Kaynak Tabakasının Hazırlanması
- Glikan baskı tamponu (50 mL 300 mM fosfat tamponu, pH 8.4) hazırlayın. Monosodyum fosfat monohidrat 58.5 mg (NaH2 4 .1H 2 O) ve deiyonize su, 40 mL (DIW) içinde disodyum fosfat heptahidrat (Na2 HPO 4 .7H 2 O) 3.9 g tartılır. 4 M NaOH kullanarak pH 8.4'e titre edin. Sesi 50 mL'ye veD filtreden geçirildi ve sterilizasyon için 0.2 μm membrandan geçirildi.
- İşaret tamponu (50 mL, 187 mM fosfat tamponu, pH 5) hazırlayın. Monosodyum fosfat monohidrat 289 mg (NaH2 4 .1H 2 O) ve DIW 40 mL disodyum fosfat heptahidrat (Na2 HPO 4 .7H 2 O), 1.94 g tartılır. 1 M HCI kullanarak pH 5'e kadar titre edin. Sterilizasyon için hacmi 50 mL'ye ayarlayın ve 0.2 μm'lik bir zar boyunca filtre edin.
- STD eğrisi tamponu (% 100 gliserol stoktan% 10 gliserol ile takviye edilmiş 50 ml PBS-gliserol: fosfat tamponlu salin, pH 7.4) hazırlayın ve sterilizasyon için 0.2 um membran boyunca filtreleyin.
- DIW'de her glikan stok solüsyonunu 10 mM'de hazırlayın. Ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografi analizi 18 üzerinde floresans algılama ile sialilatlanmış glikan konsantrasyonlarını doğrulayın.
- Her bir glikanın, 100 mcL glikan baskı tamponu hacminde 100 uM'ye seyreltilmesiMikrosantrifüj tüplerinde.
- Birincil amin içeren floresan boyayı hazırlayın. Alexa 555-hidrazidi belirteç tamponu ile 1 mg / mL'ye çözünür ve daha sonra 1 mL'lik toplam hacimde 1 μg / mL'ye seyreltin.
NOT: Diğer birincil amin içeren boya, slayt tarayıcıya göre uygun bir dalga boyuyla kullanılabilir.
NOT: İşaretleme noktaları, analiz sırasında her bloğun ızgaranın hizalamasını kolaylaştırır. - İnsan IgG STD eğrisi seyreltmelerini hazırlayın: STD eğrisi tamponunda 160 ng / μL'de 0.5 mL insan IgG stok solüsyonu hazırlayın. Her biri toplam 200 μL hacimde STD eğrisi tamponunda 80, 40, 20, 10, 5 ve 2.5 ng / μL toplamak için altı kez stoktan 1: 1 seyreltin.
NOT: Deney için uygunsa diğer Ig izotipleri kullanılabilir ( örn., Insan IgA, IgM, IgE veya farklı bir organizmanın Ig'si). - 384 plaka buz üzerine yerleştirin. Bir çoklu elektronik pipet kullanarak, her bir glikan, markör ve STD eğrisi için 7 μL'lik bir alikot IgG-dördü çoğaltılırPlakanın düzenine ( Ek Şekil 1C ) göre her biri için. Daha iyi doğruluk sağlamak için, her örneğin 35 μL'ini yükleyin ve numunenin dört kuyusunun her birine 7 mcL alikot yükleyin. Kalan 7 μL'lik her bir glikanın orijinal tüpüne geri koyun.
- Plakayı parafilm ile örtün ve 250g ve 12 ° C'de 2 dakika döndürün. Plakayı oda sıcaklığında (RT), ışığa karşı koruyun. Odadaki nem% 60-70'e ulaşmadan plakayı açmayın.
3. Nano yazıcıyı programlama
- "Microarray Manager" yazılımını açın. "Yöntem özellikleri" penceresini kullanın.
- Çalışma masası düzenini ayarlayın: "56 slayt yapılandırması" nı seçin.
NOT: Bu, 56 slaytın yazdırılmasına izin veren önceden tanımlanmış bir yapılandırmadır. Her tip plaka, pim ve baskı biçimi için kalibre edin ( Ek Şekil 2 , adım 1). - "Pin Yapılandırması" nı seçin| "Pin Arac 1x4 9 mm."
NOT: Bu, dört iğnenin kullanılması için önceden tanımlanmış bir yapılandırmadır ( Ek Şekil 2 , adım 2). - "Pin tipi" ni tanımlayın. Yazdırma için uygun olan pin türünü hesaplayın ve oluşturun.
NOT: Bu adım, numunenin 384 numaralı numuneye tekrar daldırılmadan önce bir iğnenin kaç tane noktasının yazdırılacağını tanımlar ve farklı pin tipleri ve kayan yüzey kimyası için optimize edilmelidir.
NOT: 946MP3 iğneler kullanılırken iki önemli hususu göz önünde bulundurun: 1) her bir iğne 140 homojen noktaya kadar yazdırabilir ve 2) kaymalar üzerine baskı yapmadan önce iğnenin ucundan fazla sıvı boşaltmak için ön lekeleme şarttır. Bu nedenle, her bir iğneyi bir ön baskı bloğunda 20 ön noktayı yazdıracak şekilde programlayın (epoksi kaplı slaytlarda 946MP3 iğneler için optimize edilmiştir).- Her örnek için yazdırılan noktaların toplam sayısını hesaplayın.
NOT: Burada, her pim alt dizi başına 4 nokta yazdırır (blok); Her slayt için toplam 4 alt dizin = 16 leke / slide. 7 sürgüden sonra her pim 16 x 7 = 112 nokta yazdırır. Buna ek olarak, baskı öncesi 20 ön nokta 32 nokta / dip verir. Bu nedenle, pim tipi "946MP3-132 lekeler" olarak tanımlanır (blok başına örnek başına 4 nokta, x 4 blok x 7 slayt + 20 ön nokta = 132). - "Pin tipi" ni oluşturun ( Ek Şekil 2 , adım 3). "Setup" a (yazılımın sol paneli) basın. "Mikro Spot Pins" | "Yeni Adı" (946MP3-132 nokta). Dip (132), nokta çapı (100 μm), alım miktarı (0.25 μL), dağıtım (0.7 nL) ve minimum nokta aralığı (100 μm) için nokta sayısını belirleyin. "Tamam" a basın | "TAMAM."
- "Yöntem özellikleri" penceresinde oluşturulan pin türünü seçin: "946MP3-132 noktalar".
- Her örnek için yazdırılan noktaların toplam sayısını hesaplayın.
- Yıkama koşullarını tanımlayın. "Başlamadan önce yıka" ve "Sonlandıktan Sonra Yıkama" yı "Normal yıkama" ya ayarlayın ( Ek Şekil 2 , adım 4).
- "Plaka listesi" ni tanımlayın.
NOT: Bu, levha düzenine göre plakadan örnekleme desenidir (384 oyuklu plakadan dipslerin sırası). Plakayı plaka listesine yüklemek için bir plaka örnekleme deseni oluşturun.- Plakayı "Örnekleme Modeli" oluşturun. "Şablonlara" Git ( Ek Şekil 3 ) | "Örnekleme Kalıpları." Yeni bir ad verin ( örneğin, JoVE dizisi) ve "Ekle" yi seçin | "Üstü doldur" | "Pin Aracı 1 x4 9 mm." Önceden tanımlanmış plaka yerleşimine göre iyi alıcıların sırasını seçin ( Ek Şekil 1A ). "Tamam" a basın | "TAMAM."
- Plaka örnekleme desenini yükleyin. "Plaka listesi" hücresinin sağ tarafını tıklayın ( Ek Şekil 3 ) | "Plaka ekleyin" ve doğru plaka örnekleme desenini seçin (adım 3.6.1'de açıklanan "JoVE dizisi".). "Normal Yıkama" yı seçin. Basın"Tamam" | "TAMAM."
- "Örnek Plakalara" gidin ve konum ofsetini 1 olarak değiştirin (plakanın dizi bölmesindeki yerini belirler).
NOT: 0 ofset konumu sonikatör banyosuna daha yakındır. - "Microarray Baskı Tasarımı" nı tanımlayın. Blok-blok arası uzaklıkları ve boşluğu hesaplayın.
- Kaydırıcıyı, alt diziler arasında 2 mm'lik boşluklarla (bloklar arasında toplam 9 mm'lik, Ek Şekil 4'te ), slaydı 7x7 mm'lik 16 kuyucuğa bölen gelişen aletin boyutlarını göz önünde bulundurun.
- Alt dizi boyutlarını düşünün.
NOT: Noktalar arasındaki boşluk 0.275 mm'dir ve bu baskı tasarımında 12 sütun ve 18 sıra vardır; Toplam boyutlar şunlardır: genişlik (11 x 0.275 mm = 3.025 mm) ve yükseklik (17 x 0.275 mm = 4.675 mm). Yatay aralığı hesaplayın: 9 mm - (11 0,275) = 5,97 mm. Dikey aralığı hesaplayın: 9 mm - (17 x 0.275) = 4.325 mm. D hesaplaKaymanın sol tarafındaki durum: 4.43 mm + 1.07 mm = 5.5 mm. Slaytın üst tarafından olan mesafeyi hesaplayın: 2.95 mm + 0.55 mm = 3.5 mm ( Ek Şekil 4 ). - "Baskı Tasarımlarını" tanımlayın ( Ek Şekil 5 ). "Şablonlar" ı seçin | "Baskı Tasarımları" | "Yeni."
- "Pin Ayarı" nı seçin | "Pin Aracı 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 noktalar." "Genel" sekmesinde, "Microarray Baskısının Adı" ( yani, "JoVE dizisi") değiştirin. "Nokta Hızı" nı seçin | "Numarayı Çoğalt" (4) | "Temas noktası yüksekliği" (0 mm) | "Yumuşak Dokunma Yüksekliği" (3 mm) | "Mevcut tüm pozisyonlara yazdır" ( Ek Şekil 5A ).
- "Mikroarray" sekmesinde, yatay ve dikey aralığı seçin (adım 3.8.2'den 5.9 mm ve 4.325 mm) ve yatay ve dikey mikroarray sayısını (2) seçin. "Yazdır" ı seçinMicroarray Horizontally "" Yinelenen Mikroarray Yazdır "( Ek Şekil 5B ).
- Alt dizi sekmesinde maksimum sütun sayısını (12), maksimum satır sayısını (18) ve sütunlar ve satırlar arasındaki mesafeyi (275 μm) seçin ( Ek Şekil 5C ).
- Ölçümler sekmesinde, slaytın sol tarafından (5.5 mm), slaytın üstünden (3.8.2 adımda hesaplanan 3,5 mm) arasındaki mesafe, baskı slaydın genişliği (25 mm) Ve baskı slaydın yüksekliği (75 mm) ( Ek Şekil 5D ). "Tamam" a basın | "TAMAM."
- "Microarray Print Designs" hücresinin sağ tarafını tıklayın ve tanımlanan tasarımı seçin (3.8.3. Adımdan "JoVE array"; Ek Şekil 6 ).
- "Slayt Sayımını" (56) tanımlayın ve "Konum Ofseti" (0) değerini değiştirin. Bu,Arayüz güverte üzerine basılacak olan ilk slaydın ekli ( Ek Şekil 6 ).
- "Mikroarray Baskı öncesi Tasarımı" nı tanımlayın ( Ek Şekil 6 ). "Cam Blok" seçiniz | "Ön Baskı 1 x 4 mm İğne aleti."
NOT: Bu nokta aralığı ayarı, cam bloğunda 46.464 önceden noktaya (4 pim için), dolayısıyla pim başına 46.464 / 4 = 11.616 ön noktaya izin verir. Ön baskı bloğundaki alan tükendiğinde yazıcı duracak ve bloğun üzerine ters çevrilmesi gerekecektir.
NOT: Ön baskı bloğunun kaç numunesinin dolduğunu hesaplamak için aşağıdakileri göz önünde bulundurun: her numune, 56 slayt tamamlamak için 384 oyuklu plakada 8 pip dips ile alınır (daldırma başına 7 slayt) ve her bir daldırma Ek olarak 20 ön-lekeye sahiptir ve her örnekte toplam 160 ön leke verir. Bu nedenle 11.616 / 160 = 72.6 örnek. Böylece, baskı öncesi cam blok 72 numuneden sonra ters çevirilmelidir (ters çevirme süresini değerlendirmek için hUzun süreler bir sınıftan 56 slaytta tam bir çalışma tamamlayıp 72 çarpı alır). - "PrePrint Tasarım Kullan" ı seçin | "Evet" | "Tarama Barkodları" (Hayır) | "Tek Kopyalama Yazdır" (Hayır) ( Ek Şekil 6 ).
- "Doğrula" yı tıklayın ( Ek Şekil 6 ).
- "Kaydet" i tıklayın ve metodu bir arr dosyası olarak kaydedin ( örn., "JoVE array.arr," Ek Şekil 6 ).
4. Dizayn Edilen Dizileri Yazdırma
NOT: Tüm basamaklar% 60-70 nem ile temiz bir odada ve korunması için uygun eldiven ve kıyafetlerle yapılmalıdır
- Nano yazıcı makinesini ve nemlendiriciyi açın.
- Yıkama tamponu ve nemlendirme için, DI su ile doldurun. Yıkama şişesini (boşaltma) ve nemlendirme tuzağı carboy'u boşaltın ( Ek Şekil 7A ).
- Nemlendiriciyi% 70 nem ve nemlendirme başlar.
- Yazdırmadan önce tüm pimleri temizleyin. 50 mL sıcak (65 ° C) uç ucu temizleme solüsyonu hazırlayın (15 g iğne ucu temizleme reaktifı ve 50 mL 65 ° C su, katı reaktif tamamen çözülene kadar iyice karıştırın).
- Temizleme solüsyonunu pim uçlu fırçayı (ince) pim ucu temizleme solüsyonuna daldırıp her pim ucunun yüzeyini fırçalayarak her bir pim ucuna uygulayın.
NOT: İğne ucu temizleme çözeltisi aşındırıcı ve toksiktir. Bu çözümü kullanırken eldiven ve koruyucu gözlük kullandığınızdan emin olun. İğne uçlu temizleme solüsyonundaki birkaç dakika boyunca sürünen pimler kalıcı iğne hasarına neden olabilir. - Ultrasonik banyoyu 1 L damıtılmış su ile doldurun ve pimleri banyoda yüzebilen pim temizleme rafına yerleştirin. Sonik 5 dakika boyunca ve pimleri çıkarın. Temiz oda özel mendillerle kurutun ve hafifçe silin.
- Temizleme solüsyonunu pim uçlu fırçayı (ince) pim ucu temizleme solüsyonuna daldırıp her pim ucunun yüzeyini fırçalayarak her bir pim ucuna uygulayın.
- "Microarray Manager" yazdırmasını açınYazılım; Bağlantı seti üzerine yazıcı ışığı açılır (kırmızı / yeşil). "Durdur" a basın | "Berrak" | "Başlangıç" ( Tamamlayıcı Şekil 7B , 1-3. Adımlar); Baskı kafası kolu X, Y ve Z hizalamalarını sıfırlar.
- Pimleri baskı kafasına yüklemek için "Yükle" düğmesine basın ( Ek Şekil 7B , adım 4) ve iğneleri, baskı / pin aleti düzeninin tanımlanmış yapılandırmasına uygun olarak baskı kafasına yerleştirin ( Ek Şekil 7C ); Bu düzen, her slaytta toplam 16 alt-dizi elde etmek için her slaytta 4 alt dizgi yazdıran 4 iğne kullanır ( Ek Şekil 1A ). Pimleri yerleştirdikten sonra tekrar "Init" düğmesine basın.
- Slaytları, dizi bölmesinde bir araya getirin. Slayt kutusunu açın ve ultra-yüksek saflıkta azot gazı üfleyerek her slaytyı temizleyin. Arzu edilen sayıda slaytları dizi platformuna yerleştirin. Slaytları, iki parmağınızla alt köşelerde tutun ve ardından sürgüyü yerine oturtunkonumu. Sağa iki köşeyi tutun ve kaydırıcıyı sıkıca yerine oturana dek sol köşeleri hafifçe itin. Sıkı oturması için hafifçe sol alt köşeye doğru itin ( Ek Şekil 7D ).
- Ön camı damıtılmış su,% 70 etanol ve% 100 etanol ile temizleyin ve hava kurumasını bekleyin (sadece temiz oda mendilleri kullanın). Blok öncesi camı güvertesindeki yerine yerleştirin.
- Bir sonikatör banyosu doldurun ( Ek Şekil 7B ). "Dolgu" yı 55 sn için basıp "Tamam" a basın. Sonicatöre 20 saniyeliğine "Boşalt" ı tıklayıp ardından "Tamam" a basarak boşaltın. Dolum ve boşaltmayı bir kez daha tekrarlayın ve sonra tekrar 55 saniye doldurun.
- Yıkama banyosunu doldurun ( Ek Şekil 7B ): "Başbakan" düğmesine 40 sn basın ve ardından "Tamam" a basın.
- 384 gözlü plakayı örnek örneklerle dizici güverte üzerindeki yerine yerleştirin ve parafilm kapağını çıkarın.
- Yazdırma işlemi tamamlandığında sonikatör banyosunu boşaltın ( Ek Şekil 7B ) ve nemlendiriciyi kapatın.
- Slaytların, nemlendirme olmadan 16-24 saat süreyle dizi vericisi üzerinde kurumasına izin verin.
- Slaytları alkol / solvent dayanıklı markalama kalemi ile numaralayın ve karanlıkta vakumla sızdırmaz bir kutu içerisinde saklayın.
5. Dizileri İşleme ve Geliştirme
- Vakumla kapatılmış kutudan bir slayt çıkarın ve fazla sıvıyı buharlaştırmak için kimyasal bir kapağa 5 dakika, dizi yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
- Tüm noktaların yazdırıldığından emin olmak için slaydı en yüksek kazançta (950 PMT) tarayın.
- Slayt üzerindeki epoksi gruplarının kimyasal olarak bloke edilmesine devam edin
- 50 mL etanolamin bloke edici çözeltiyi (0.1 M Tris-HC1, pH 8 ve 0.05 M etanolamin) hazırlayın. 140 mL DIW'yi 8.8 mL Tris-HC1 (1.7 M, pH 8) ve 0.45 mL etanolamin (16.6 M) ile karıştırın. 5'e aktarma0 mL boyama tüpü ( Ek Şekil 8A ) ve 50 ° C'ye kadar ılıtıldı .
- Sürüyü su ile sıkın. Slayt, DIW ile dolu bir boyama tüpüne yerleştirin, folyoyla örtün ve oda sıcaklığında yavaş ve nazikçe çalkalarken 5 dakika inkübe edin.
- Slayt üzerindeki reaktif epoksi gruplarını bloke edin. Slayt, önceden ısıtılmış etanolamin engelleyici çözelti ile dolu 50 mL'lik boyama tüpüne batırın, folyo ile kaplayın ve oda sıcaklığında yavaş ve nazikçe çalkalanarak 30 dakika inkübe edin.
- Etanolamin engelleme solüsyonunu uygun biyolojik tehlike çöp kutusuna atın ve slaydınızı 50 ° C DIW ile doldurulmuş yeni, temiz bir boyama tüpüne yerleştirin. Folyo ile kaplayın ve oda sıcaklığında yavaşça ve yavaşça çalkalanarak 10 dakika inkübe edin.
- Suyu atın ve slaytları bir cam boyama tutacağına aktarın ( Ek Şekil 8B ). Cam boyama tutucusunu sallanan bir plaka tutucuya yerleştirin ve slaydınızı 200 xg ve RT'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Slaytları 16 bölmeli ayırıcıya yerleştirin ( Ek Şekil 8C ).
- PBST yıkama solüsyonu hazırlayın: 50 mL fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 +% 0.1 Tween-20.
- Biyolojik engelleme çözeltisi (PBS-OVA) hazırlayın: 5 mL PBS, pH 7.4 +% 1 tavuk ovalbümin (10 mg / mL).
NOT: Engelleyici ayıraç seçimi, anti-Neu5Gc antikorlarının saptanmasında başarılıdır. Ovalbümin, insanlar gibi, Neu5Gc'yi sentezleyemediği, bu Sia'nın eksikliğine neden olan tavuklarda üretilir. Neu5Gc'nin saptanması için, küçük kirleticiler bile, bazen herhangi bir anti-Neu5Gc reaktivitesini tespit etmede başarısız olduğundan, tahlilin duyarlılığını önemli ölçüde azaltabilir. Örneğin, en sık kullanılan bloke etme reaktif olan sığır serum albümin (BSA), kendiliğinden glıkosile edilmezse de, Neu5Gc parçalarını taşıyan sığır IgG kirleticilerini içerir ve bu nedenle wIkincisi, anti-Neu5Gc antikorları 19 , 20 ile numuneye bağlandığında basılı glıkanlar. - Kuyuları önceden ıslatın. Slayt-kuyulara bir çok pipetle, 200 μL PBST alikotu kullanarak, nemli bir odaya koyun ve 5 dakika boyunca çalkalayın.
NOT: Nem bölmesi, ıslak havlu kağıdına sahip bir cam tepsi olup, örnekleri ışıktan korumak için naylon sarıyla ve folyo ile kaplıdır. - Flicking ve yavaşça temiz bir kağıt havlu ve 200 uL PBS-OVA her bir kuyu içine tampon engelleme alikotu vurarak PBST çıkarın. Nemli bir odaya yerleştirin ve nazikçe çalkalarken oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Tablo 2'de listelendiği gibi PBS-OVA engelleyici tamponda seyreltilmiş birincil saptama hazırlayın.
NOT: Bu siyaloglikan mikroarrayinin kalite kontrol (QC) degerlendirmesi için, birkaç Sia baglanti proteini kullanin: Sariçuk kabuğundan izole edilen Sambucus nigra lectin'in (SNA) Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis Lectin II'nin (MALII) Siaα23'ü tanıması beklenmektedir; Tavuk anti-Neu5Gc IgY'nin tüm Neu5Gc içeren sialoglikanları tanıması beklenmektedir. Buna ek olarak, anti-Neu5Gc IgG cevabını profillemek için çeşitli insan serum örneklerini kullanın. Lektinler / antikorlar / serum konsantrasyonu deneysel olarak kalibre edilmelidir. - Kuru PBS-OVA engelleme tamponu sürükleyin ve göz başına birincil antikor 200 mcL (göz başına minimum hacim: 70 mcL) ekleyin, nemli bir odada 2 saat inkübe edin.
- Fiske birincil algılama kurutun ve PBST ile 4 kez yıkayın (3 ve 4. yıkama arasında, nemli bir oda içinde 5 dakika süre ile PBST içinde slayt inkübe). PBS ile bir kez yıkayın.
- İkincil antikoru, Tablo 2'de listelendiği gibi PBS'de hazırlayın.
- Flick PBS kuru ve ikincil antikor 200 mcL ekleyin. Odağı sallayarak 1 saat inkübe edin.
- İkincil antikoru fırçalayın ve PBST ile dört kez yıkayın (3ve 4. yıkama, nemli bir oda içinde, 5 dakika) PBST slayt inkübe edin.
- Çerçeveyi dikkatlice kaldırın ve plakları 50 mL'lik bir slayt boyama tüpüne PBS ile doldurarak yerleştirin ve 5 dakika boyunca çalkalayın.
- İki slayt boyalı banyo ( Ek Şekil 8D ) DIW ile doldurun, slaydı tutucuya yerleştirin ve banyoda daldırın. Çabuk 10 kez daldırın ve sonra ikinci banyosuna aktarın ve 10 kez daha damlayın. Çalkalayarak oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- Suyu atın ve sürgüyü bir cam lekelenme tutucusuna aktarın ( Ek Şekil 8B ; slaydın kuruması için bekletin). Cam boyama tutucusunu sallanan bir plakalı tutucuya yerleştirin ve slaydayı 200 gr ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Sürgüyü tarayıp karanlıkta vakumla sızdırmaz bir kutuda saklayın.
6. Dizi Tarama ve Veri Analizi
- Floresan slayt tarayıcıyı açın ve 5 dakika boyunca sıcak bırakın. AçTarama ve analiz yazılımı.
- Tarama parametrelerini ayarlayın ( Ek Şekil 9A ): 532 nm'de tarama yapın ve 350 PMT'lik bir kazanç ile% 100 güçle tarayın, bir satır ortalama ve bir 0-μm odağı pozisyonu. 10.0 μm piksel çözünürlük kullanın.
NOT: Tarama parametreleri farklı slayt tiplerine, floresansa ve çözünürlüğe ayarlanabilir. - Gelişmiş slaydı tarayın. Tarayıcı kapısını açın ve slaydı içeri bakacak şekilde yerleştirin. Taramaya başlayın (yazılım gezinme paneli menüsünde Ek "Şekil 9B " ye yeşil "Oynat" düğmesi).
- Taranan slaytları bir tiff dosyası olarak kaydedin.
- Analiz için slayt hazırlayın. "Diziyi yükle" yi seçin ve dizileri slayttaki her bloğa eşleyen uygun GAL dosyasını yükleyin ( Ek Şekil 9C ).
Not: GAL dosyası, slayttaki her bir yerin kimliği ve konumu (X, Y) ile ilgili bilgi içerir. Bu dosya oluşturulabilirYazıcı yazılımı tarafından, 384 kuyulu kaynak plakasındaki örnek kimliklerine ve tanımlanmış baskı tasarımına dayanan sekmeyle ayrılmış bir metin dosyası verilir. - Hizalama ve analiz parametrelerini ayarlayın. Yazılım gezinme paneli menüsündeki "Option" düğmesine basın ( Ek Şekil 10 ).
- Hizalama parametrelerini tanımlayın. Dairesel özellikler bulun, hizalamada özellikleri yeniden boyutlandırma% 50 -% 350, özellik hareketini en çok 40 μm çevirmeye sınırla, arka plan eşiğini aşan özellikleri (CPI eşiği 0), blok bulurken sargıyı ve rotasyonu hesapla ve görüntü kaydını otomatikleştir (10 piksel) ( Ek Şekil 10 ).
- Analiz parametrelerini tanımlayın: W1 / 532 oranı, normal standart sapma, bulunmayan özellikleri ve arka çıkarma analiz edin. "Seç" i ve ardından "Yerel özellik arka plan ortası" nı tıklayın ve hariç tutmak için 2 piksel ve arka planın 3 piksel genişliğini ayarlayın. "Tamam" a basın. SeTarayıcı doygunluk düzeyini varsayılana getirin ( Ek Şekil 10 ).
NOT: Arka arkaya çıkarma yöntemi, deneysel tasarıma bağlıdır ve spesifik ihtiyaçlara göre değiştirilebilir. - Özellik haritalarını hizalayın. Programı blok moduna getirin ("B" ye basın), tüm blokları seçin (Ctrl + A), dizi haritası ızgaralarını konumlandırın ve tüm blokları hizalayın (Alt + ÜstKrkt + F7) ( Ek Şekil 11 ).
- Her bloğun özellik hizalamasını düzeltin. Zoom (sola kaydırma moduna girmek için "Z" ye basınız), sol üstteki bloğa girin, tekrar "B" ye basın (blok modu) ve bu bloğun ızgarasına basın. Blok noktalarıyla mükemmel şekilde hizalanana kadar bu bloğun ızgarasını hareket ettirin ve bu seçili bloğun özelliklerini hizalamak için F5 tuşuna basın. Noktalar mükemmel daire içine alıncaya kadar ızgara hareketi ve F5 hizalamasını tekrarlayın. Tüm ızgaralar yerinde oluncaya kadar 16 bloktan her biri için aynı şeyi yapın.
- Verileri analiz edin ve kaydedin. Tüm blokları seçin (Crtl +A) ve verileri analiz edin (Alt + A). Analiz sonuçlarını (Ctrl + U) bir .gpr dosyası olarak kaydedin.
- Kaydedilen .gpr dosyasını bir elektronik tablo programında açın ve yerel arka plan çıkarımı sonrasında (F532-B532) flüoresans temelinde her bir noktanın yoğunluğunu analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dizi Baskı, Geliştirme ve Analiz:
Birden fazla glikan numunesi ve insan IgG STD eğrileri ile 16 farklı bloktaki bir sialoglikan mikroarrayi basmak, tüm numunelerin, slayt başına ve tüm slaytlara aynı baskıda 16 blokta mümkün olduğunca eşit şekilde basılmasını sağlamak için kapsamlı kalibrasyona ihtiyaç duyar. Bu nedenle, spesifik baskı parametreleri belirlenmeden önce, her bir numune türü için tampon kompozisyonu, slayt tipi ve imalat, 384 gözlü plaka tipi, nem seviyeleri, 384 oyuklu plakadaki numune hacmi, ön Her numune tipi, insan IgG STD eğrisi konsantrasyonları ve markör tipi için baskı. Bu baskılı sialoglikan serisi plakaların dayanıklılığı, oda sıcaklığında karanlıkta vakumla sızdırmaz hale getirilmiş bir kutuda 10 ay kadar sürecek şekilde doğrulanmıştır. Her baskı deneyinde, tekdüzelikSia bağlayıcı lektinler ve antikorlar kullanarak kalite kontrol deneyleri ile daha da izlenir ve onaylanır. Gelişmekte olan ve tarama protokolleri aynı baskılardaki slaytlar içindeki ve arasındaki örnekleri karşılaştırarak tekdüzelik ve doğruluk elde etmek üzere optimize edildi. Slaytlar, optimum tıkanma koşulları (kimyasal ve biyolojik), yıkamalar ve kuluçka süreleri kullanılarak bloklar arasında uygun bir şekilde ayrılmayı sağlayan 16 bölmeli bölücü ile geliştirildi. Birincil ve ikincil tespit, minimal arka plan ve spesifik olmayan bağlanma ile maksimum algılama sağlamak için geniş çapta kalibre edildi. Slayt tarama ve analizi üzerine, çıktı sonuçları bir elektronik tablo dosyasına aktarıldı ve her bir noktadaki algılamayı belirlemek için analiz edildi. Her nokta, bir aykırı değer kontrolüne tabi tutuldu ve eğer QC'yi karşılamadıysa atlandı (% CV> 20 ise ve nokta dört replikattan ortalama bir standart sapmanın aralığının dışındaydı). Daha sonra, ortalama sinyal yoğunluğu afteR yerel örneklemin çıkartılması, basılı numuneye göre göreceli flüoresan birimi (RFU) veri noktası üretmek üzere numune başına tekrarlanan noktalar için ortalaması alınmıştır. IgG STD eğrilerinin tekdüzeliği, test edilen tüm bloklarda doğrulandıktan sonra, RFU değerleri ng / μL IgG'ye normalize edildi ve deneyler arasındaki ve deneyler arasındaki numuneleri daha iyi karşılaştırma şansı verdi.
Sia-bağlama Yüksek verimli tepki:
Sialoglikan dizileri, Sia içeren glikanları bağlayan belirteçleri ( örn., Proteinleri, lektinleri, antikorları, virüsleri, vb. ) Tespit etmek için kullanılabilir. Baskı sonrası QC için, Sia bağlayıcı bitki lektinleri ve anti-Neu5Gc IgY kullanılır 19 . SNA, α2-6 bağlantılı Sia'yı, MALII, α2-3 bağlantılı Sia'yı bağlar ve anti-Neu5Gc IgY, Neu5Gc içeren siyaloglikanları bağlar, ancak Neu5A'ya bağlamazC-içeren siyaloglikanlar 19 , Şekil 2A'da gösterildiği gibi. QC deneyi, dört farklı iğneyi kullanarak basılı bloklar arasında spot baskı ve kimliğin ve değişkenliğin eksikliğini doğrulamayı amaçlıyor. Bloktan bloğa değişkenlik, slayt başına her bir birincil algılama için dört blok geliştirerek ve dört birimin her biriyle aynı ana algılama parçasıyla basılan blokları karşılaştırarak izlenir. Bundan sonra, önemli bir farklılığın bulunmadığından emin olmak için bir karşılaştırma yapılır.
İnsan serumu, çeşitli insan hastalıkları 2 , 21 , 22 , 23 için ima edilen çeşitli anti-Neu5Gc antikorları 6 içerir. İnsan sera IgG'sinde sialoglikanın tanımasını değerlendirmek için, sağlıklı insan vericilerinden alınan 12 serum, basılı sialoglikan mikrKürek ve flüoresan etiketli anti-insan IgG ( Şekil 2B ) kullanılarak geliştirildi. Her baskılı blok, tüm bloklarda karşılaştırılabilir ve homojen olan bir insan IgG STD eğrisi içerir ( Şekil 2C ). Her bloğun ( Şekil 2C ) STD eğrilerinin kalitesini doğruladıktan sonra bloktaki eğime göre normalize edilen glikan lekeleri sonuçları ve daha sonra seyreltme faktörü ile çarpılır. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, test edilen tüm insan serumları, Eşleştirilmiş Neu5Ac içeren sialoglikan çiftlerinin neredeyse hiç tanınmadığı çeşitli anti-Neu5Gc IgG seviyelerini ihtiva etmektedir. Ayrıca, anti-Neu5Gc IgG tanıma paternleri, hem yoğunluk hem de çeşitlilik seviyesinde bu 12 farklı serum arasında oldukça çeşitlidir.
Şekil 1: Genel BakışDizi Baskı, Geliştirme ve Görüntü Analizi. ( A ) Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2, epoksi kaplı cam slaytlara basılan birincil amin ile temsili bir Neu5Gc-ihtiva eden Sia glikanı olarak gösterilir. ( B ) Baskılı diziler, çeşitli Sia bağlayıcı proteinler ile geliştirilir ve ardından uygun bir flüoresan etiketli sekonder antikor ile saptama yapılır. Her alt dizi ayrı ayrı geliştirilebilir. ( C ) Problanan slaydı bir floresan tarayıcıda taramak, tarayıcı görüntü yazılımı kullanılarak daha da analiz edilen bir görüntü üretir. Alt diziler, dizilerdeki her bir noktayı haritalandıran bir ızgarayla örtülür ve her spot için floresan tespit edilir. Sonuçlar daha sonra bir elektronik tablo dosyasına aktarılır. Tek bir kuyudaki tek bir dizi şematik olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Çeşitli Sia-Bağlayıcı Proteinleri Kullanan Sialoglikan Mikroarray'lerin Profilleri.
Slaytlar, her blokta bir tane olmak üzere 16 farklı primer tespit kısmı ile geliştirildi. ( A ) Temsilci, Sia'ya spesifik bitki lektinleri SNA ve MALII'nin ve poliklonal mono-spesifik tavuk anti-Neu5Gc IgY'nin bağlanma modellerini gösteren bir QC slayttan 3 blok. Sonuçlar, her bir blok için ısı haritası formatında RFU olarak sunulan (kırmızı, beyaz ve mavi, 100, 50. temsil ediyordu ve 0. yüzdelik, sırasıyla). ( B ) 12 farklı sağlıklı insan serumu, 1: 100 seyreltmeyle test edildi ve anti-Neu5Gc IgG reaktivitesini profillemek üzere anti-huamn IgG ile saptandı. RFU verileri, her bir değeri, her spesifik bl'de IgG STD eğrisi eğimine bölünerek ng / μL olarak normalize edildiVe daha sonra seyreltme faktörü ile çarpılır. Veri (sırasıyla, te 100, 50. ve 0. yüzdelik temsil beyaz, kırmızı ve mavi) tüm kombine bloklar için ısı haritası formatında temsil edilir. ( C ) Verilerin normalleştirilmesi için kullanılan insan serumu ile geliştirilmiş 12 bloğun insan IgG STD eğrileri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Glycan kimliği | yapı | |||
| 1 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2 NH2 | |||
| 2 | Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2 </ alt> NH2 | |||
| 3 | Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2 NH2 | |||
| 4 | Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 5 | Neu5Acα6GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 6 | Neu5Gcα6GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 7 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2 CH2 NH2 | |||
| 8 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 9 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 10 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 11 | Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 12 | Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 13 | Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 14 | Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 15 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 16 | (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 17 | Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 18 | Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 19 | Neu5Acα6Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 20 | Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 21 | Neu5Acα3Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 22 | Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 23 | Neu5,9Ac 2 α6GalNAcαO (CH2) 2 CH2 NH2 | |||
| 24 | Neu5Gc9Acα6GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 25 | Neu5Acα3GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 26 | Neu5Gcα3GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 27 | Neu5Acα6GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 28 | Neu5Gcα6GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 29 | Neu5,9Ac 2 α3GalβO (CH2) 2 CH2 NH2 | |||
| 30 | (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 31 | Neu5,9Ac 2 α6GalβO (CH2) 2 CH2 NH2 | |||
| 32 | Neu5Gc9Acα6GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 33 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 34 | Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 35 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2 CH2 NH2 | |||
| 36 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2 NH2 | ||||
| 38 | Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 39 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2 NH2 | |||
| 40 | Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
Tablo 1: Baskılı Glccan Listesi.
| Birincil ikincil | Antikor / Lektin | Stok konsantrasyonu | Özgünlük | Çalışma Seyreltme / Konsantrasyon |
| Birincil tespit | Biotinilated-malii | 1 mg / mL | Α2-3 bağlantılı sialik asit | 1:50, 20 ug / mL |
| Biotinilated-SNA | 2 mg / mL | Α2-6 bağında sialik asit | 1: 100, 20 ug / mL | |
| Tavuk anti-Neu5Gc IgY | ND | Neu5Gc Sialik asit | 1: 7.000 | |
| Insan serumu | 100% | Çok sayıda epitop | 1: 100 | |
| İkincil Algılama | Cy3 Streptavidin | 0.75 mg / mL | biyotin | 1: 500, 1.5 ug / mL |
| Cy3-anti tavuk IgY | 0.75 mg / mL | Tavuk IgY | 1: 2000, 0.375 ug / mL | |
| Cy3-anti İnsan IgG H + L | 0.6 mg / mL | HumaN IgG | 1: 1.500, 0.4 ug / mL |
Tablo 2: Birincil ve İkincil Algılama Proteinlerinin Listesi.
Ek Göstergeler: Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başarılı bir glikan mikroarray üretimi dikkatli planlama gerektirir ve protokolde birkaç önemli adımı içerir. Bunlar arasında şunlar bulunur: (1) sonraki tüm parametreleri tanımlayan blok ve plaka düzenlerini planlama ( ör. Mesafeler, aralık, numune miktarı ve baskı); (2) piksellerin temizlenmesi ve nokta homojenliğini kontrol etmek için kritik olan pin bütünlüğünün sağlanması; (3) baskı esnasında yüksek nem oranının korunması, spot homojenliğinden ödün verebilecek uzun basılmalar sırasında numunenin buharlaşmasını önlemek için kritik önem taşır; (4) sonuçları etkileyebilecek uygun hizalama ve analiz parametrelerini seçme ( örneğin, arka plan çıkarma yöntemi, eşik ve nokta boyutu esnekliği).
Yöntem, belirli deneysel tasarım ve hedefleri karşılamak üzere daha da modifiye edilebilir. Örneğin, ön lekelenme sayısı dizide basılacak her malzeme türüne daha iyi uyacak şekilde değiştirilebilir. Sırasında iğne yıkama adımıBaskı, farklı basılı materyallere uyacak şekilde, kısa veya uzun yıkama döngüleri ile optimize edilebilir. Ayrıca, bir dübel başına bir pimin yazdırdığı lekelerin miktarı, daha fazla veya daha az nokta içermek üzere değiştirilebilir, ancak dizi üzerinde kullanılan her malzeme türü için ayrı kalibrasyon gerektirir. Floresan işaretleyicinin türü ve konsantrasyonu, konjügasyon için uygun kimyasal grubu ( yani, epoksi kaplı slaytlar için birincil amin) içerdiği sürece modifiye edilebilir. STD eğrilerinin konsantrasyonları ve türleri genişletilebilir ( örn., Insan / fare / diğer organizma IgG, IgM, IgA, vb. ). Tampon koşulları, artmış arka plana neden olacak, diziye spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için, tercihen, primer amin içeren materyalden yoksun olan farklı materyallere uyacak şekilde optimize edilebilir. Önemli bir husus, Neu5Gc'yi optimal olarak saptamak için, biyolojik bloke edici reaktif Neu5Gc içermemelidir ( örn., BSA amd sütünden kaçının), bu, Neu5Gc-sialoglikan algılanmasını azaltabilir ve iArt arda 19 , 20 . Birincil ve ikincil saptama konsantrasyonları, yüksek arka plan ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için optimize edilmelidir. Buna ek olarak, tarama parametreleri ( örneğin güç, kazanç ve çözünürlük) arka planı azaltmak veya alçak sinyalleri geliştirmek için değiştirilebilir. Son olarak, hizalama ve analiz parametreleri, yüksek arka plana veya farklı şekillendirilmiş özelliklere uyacak şekilde değiştirilebilir. Glikan mikroarray verilerini raporlamak için önerilen standartlarla ilgili daha fazla bilgi ve yönergeler son zamanlarda en sonunda veri paylaşımı ve yorumlanmasını kolaylaştırabilir MİRAGE girişimi 17 tarafından tarif edilmiştir.
Özet olarak, glikan mikrodizileri, glikan-biyomolekül etkileşimlerini araştırmak için sağlam bir araç sağlar ve çeşitli biyolojik örneklere adapte edilebilir. Anti-Neu5Gc antikorları, insan hastalığında farklı roller oynamaktadır 23 . Örneğin, kanserde, Anti-Neu5Gc antikorları ikili rol oynamaktadır: bir yandan potansiyel biyolojik belirteç olarak hizmet ederken diğer yandan potansiyel terapötikler 7 , 21 ve 24 olarak görev yapmaktadırlar. Bu antikorlar aynı zamanda ateroskleroza 25'in şiddetlenmesine, ksenon- transplantasyonun etkinliğine 20 , 26 ve glikozillenmiş biyoterapötiklerin etkisine katkıda bulunur 27 . Bu nedenle, çeşitli insan örneklerinde anti-Neu5Gc antikorlarının profillendirilmesi giderek artan bir ilgi göstericidir ve burada açıklanan gibi yüksek verimli testler, insan sağlığı ve hastalıklarındaki rollerini anlamamıza katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen İsrail Kanser Araştırma Fonu'ndan Ar-Ge Kariyer Geliştirme Ödülü, İsrail Ulusal Nanoteknoloji Girişimi ve Helmsley Bağışlı Güven'den Kişiselleştirilmiş Teröristler için Nano Dedektifler (VP-K) için bir Odaklı Teknoloji Alanından hibe tarafından desteklendi ve Ulusal Sağlık yardımı enstitüleri R01GM076360 (XC'ye).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
