Summary
可以使用sialoglycan微阵列测定来评估人血清中的抗Neu5Gc抗体，使其成为癌症和其他慢性炎症介导的人类疾病的潜在的高通量诊断测定。
Abstract
细胞覆盖着通常在癌症中被改变并包括唾液酸（Sia）表达变化的碳水化合物链（聚糖）的斗篷。这些是具有9碳骨架并且在细胞表面上覆盖脊椎动物聚糖的酸性糖。哺乳动物中主要的Sia形式中的两种是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）及其羟基化形式， N-乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。由于编码胞苷5'-单磷酸-Neu5Ac（CMP-Neu5Ac）羟化酶（CMAH）的基因失活，人类不能产生内源性Neu5Gc。外源Neu5Gc由人类细胞通过红肉和乳制品的饮食消耗而获得，随后出现在细胞表面的多种聚糖上，主要集中在癌上。因此，人类具有循环的抗Neu5Gc抗体，其在癌症和其他慢性炎症介导的疾病中起着不同的作用，并且正在成为潜在的诊断和治疗rgets。在这里，我们描述了一种高通量sialoglycan微阵列测定法来评估人血清中的这种抗Neu5Gc抗体。含有Neu5Gc的聚糖及其配对的对照（含Neu5Ac的聚糖），每个具有核心伯胺，共价连接到环氧树脂涂布的玻璃片上。我们举例说明了使用特定的纳米打印机，可以以16孔格式打印56张幻灯片，每台打印机最多可生成896个阵列。每张幻灯片可用于筛选16种不同的人血清样品，以评估抗Neu5Gc抗体的特异性，强度和多样性。该协议描述了这种强大的工具的复杂性，并提供了一个基本准则，旨在探讨在阵列格式的不同临床样品中对Neu5Gc膳食碳水化合物抗原的反应。
Introduction
Sias是覆盖细胞表面糖蛋白上的聚糖链和脊椎动物中糖脂的酸性糖。 SIA表达在癌细胞1改性，并与进展和/或转移2,3相关。哺乳动物中主要的Sia形式的两种是Neu5Ac及其羟基化形式Neu5Gc 2 。由于编码CMAH酶的基因的特异性失活，人类不能合成Neu5Gc。这种非人的新航代谢合并到人体细胞的“自我”，从富含膳食中Neu5Gc的食物（ 如红肉）始发4,5。 Neu5Gc在人上皮细胞和内皮细胞表面的低水平存在，但特别积累在癌中。 Neu5Gc被人体液免疫系统2认为是外来的， 6 。Neu5Gc-聚糖的抗原性复杂性可能出现在多个水平，包括Neu5Gc修饰，连锁，底层聚糖和支架及其密度，都反映在人类6抗体Neu5Gc抗体的复杂性6 。一些抗体作为癌生物标志物和潜在的免疫治疗7。不同sialoglycans 8的酶法合成的到来铺平了道路这样的抗体的更深入的分析，通过使用聚糖微阵列技术9,10容易。因此，具有天然和合成碳水化合物的大文库的制备容易和操纵，聚糖微阵列已经成为一个强大的高通量技术用于研究与生物分子10，11的无数的碳水化合物的相互作用， 12，13。以阵列形式，使用最少量的材料，并且生物相关聚糖的这种多重显示允许在单个实验中调查数千个结合相互作用。重要的是，这种技术也可以应用于生物标志物发现以及各种样品7中，12监测免疫应答。
成功的聚糖微阵列制造需要考虑三个重要方面：打印机器人类型，聚糖共轭化学和检测光学。关于印刷仪器的考虑，有两种技术可供选择：联系和非接触式打印机。在接触印刷中，将1-48个钢针浸入含有聚糖溶液的多孔源板中，并通过直接接触玻璃载片表面而在功能化玻璃载片上点样。溶液量活动到幻灯片是滑动表面上持续时间的函数。通常，样品首先在玻璃块上预先点样（达到同质点），然后再将其印刷在载玻片上。在非接触式打印机（ 例如，压电式打印机）中，使用受控电信号从玻璃毛细管印刷聚糖。可以对电信号进行精细校准，以实现相对于接触印刷的更精确的印刷。斑点的大小和形态也相对更均匀。另外的优点是在打印后将样品回收到源极板。然而，压电式打印机的主要缺点是打印头限制（4或8），导致打印时间非常长，需要特别注意滑动稳定性，温度，湿度和样品蒸发。非接触喷墨打印机需要更大的样品体积14 。
10，11，12，13。关于印刷聚糖微阵列技术的非常详细的信息ð调查，把这些优秀回顾13，15。重要的是，最近提供的一个糖尿病实验最低限度信息（MIRAGE）计划描述了样品制备的准则16，并报告了聚糖微阵列分析17的数据，以提高这一增长领域的标准。
在这里，我们描述了使用16孔格式的特定接触式纳米打印机制造sialoglycan微阵列的详细协议。每个聚糖具有介导它们与环氧基活化玻璃载片的共价键的伯胺。我们还描述了使用各种人血清样品，抗体和Sia结合植物凝集素的一个载玻片的开发和分析。 Sialoglycan微阵列测定涉及几个主要步骤，包括阵列制造，加工，开发和分析。阵列制造需要规划射线布局，制备聚糖和源极板，编程纳米打印机和打印幻灯片。随后，对载玻片进行处理，显影和分析（ 图1 ）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
人血清样本是从以色列血库获得的，并按照赫尔辛基宣言和特拉维夫大学机构审查委员会使用。
阵列制作规划与布局
- 确定幻灯片布局。
注意：每个幻灯片包含16个子阵列，分成16个相同的块，编号为B1到B16（ 图1B ， 补充图1A ）。 - 确定引脚布局。使用四个引脚，每个幻灯片打印四个子阵列（块）：
第1针打印块1,2,9和10;
第2针打印块3，4，11和12;
第3针打印块5,6,13和14;和
第4针打印块7,8,15和16（ 补充图1A ）。 - 确定块和384孔板的布局。
注意：聚糖在每个区块中出现的顺序需要仔细规划。在这个例子中ay，以四个重复的方式打印每个样品，设计位于右下角的荧光标记点（以方便斑点分析），并以六个增加浓度打印标准曲线IgG（STD）斑点（ 补充图1B ）。- 对于每个印刷点，首先在384孔板中将材料分配到四个孔中（每个针一个）。
注意：384孔板中的材料顺序依赖于设计的块布局（ 补充图1B-C ）。
- 对于每个印刷点，首先在384孔板中将材料分配到四个孔中（每个针一个）。
2.制备甘蔗和源板
- 制备聚糖印迹缓冲液（50mL 300mM磷酸盐缓冲液，pH8.4）。称取58.5mg磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 .1H 2 O）和3.9g磷酸二钠七水合物（Na 2 HPO 4· 7H 2 O）在40mL去离子水（DIW）中。使用4M NaOH滴定至pH8.4。将体积调整至50 mLd过滤通过0.2μm膜进行灭菌。
- 准备标记缓冲液（50mL的187mM磷酸盐缓冲液，pH5）。称取289mg磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 .1H 2 O）和1.94g磷酸二钠七水合物（Na 2 HPO 4 .7H 2 O）在40mL DIW中。使用1M HCl滴定至pH5。将体积调节至50 mL，过滤0.2μm膜进行灭菌。
- 制备STD曲线缓冲液（50 mL PBS-甘油：磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，补充有100％甘油储备液的10％甘油），并通过0.2μm膜过滤灭菌。
- 在DIW中制备10mM的每种聚糖储备溶液。通过荧光检测在反相高压液相色谱分析上验证唾液酸化聚糖浓度18 。
- 将每个聚糖稀释至100μM，总体积为100μL的聚糖印刷缓冲液在微量离心管中。
- 制备含伯胺的荧光染料。用标记缓冲液将Alexa 555酰肼溶解至1 mg / mL，然后在1 mL总体积中稀释至1μg/ mL。
注意：根据幻灯片扫描仪，任何其他含伯胺的染料都可以使用合适的波长。
注意：标记点在分析期间便于每个块中的网格对齐。 - 制备人IgG STD曲线稀释液：在STD曲线缓冲液中，以160ng /μL制备0.5mL人IgG原液。连续稀释1：1 6次，得到80,40,20,10,5和2.5 ng /μL，均在STD曲线缓冲液中，总体积为200μL。
注意：如果适用于实验（ 例如人IgA，IgM，IgE或不同生物的Ig），可以使用其他Ig同种型。 - 将384孔板放在冰上。使用电子多移液管，将7μL的每个聚糖，标记和STD曲线IgG-4等份重复每个 - 根据板布局（ 补充图1C ）。为了更好的准确性，将35μL每个样品加载到样品的四个孔中的每个样品中，分别加入7μL。将剩余的7μL每个聚糖放回原来的管中。
- 用石蜡膜覆盖板，并在250g和12℃下旋转2分钟。将板放在室温（RT）下，避光保存。房间湿度达到60-70％之前，不要露出板子。
3.编制纳米打印机
- 打开“Microarray Manager”软件。使用“方法属性”窗口。
- 设置工作台布局：选择“56幻灯片配置”。
注意：这是一个预定义的配置，允许打印56张幻灯片。校准每种类型的板，引脚和打印格式（ 补充图2 ，步骤1）。 - 选择“引脚配置”| “Pin Tool 1x4 9 mm”。
注意：这是使用四个引脚的预定义配置（ 补充图2 ，步骤2）。 - 定义“引脚类型”。计算并创建适合打印的针脚类型。
注意：此步骤定义了在再次浸入样品384孔之前打印引脚的斑点数，应针对不同的引脚类型和滑动表面化学特性进行优化。
注意：使用946MP3引脚时，请考虑以下两个重要问题：1）每个引脚可打印多达140个同质点，2）在打印幻灯片之前，预先识别是必须从引脚顶部排出多余的液体。因此，编程每个引脚在预打印块上打印20个预点（针对环氧树脂涂层幻灯片上的946MP3引脚进行了优化）。- 计算每个样品的印刷点总数。
注意：这里，每个引脚每个子阵列打印4个点（块）;每个幻灯片共有4个子阵列= 16个点/ slIDE。 7个幻灯片后，每个针头打印16 x 7 = 112个点。此外，打印之前的20个前景点提供了132个点/下降。因此，引脚类型被定义为“946MP3-132个点”（每块每个样本4个点×4个块×7个幻灯片+20个预斑点= 132）。 - 创建“引脚类型”（ 补充图2 ，步骤3）。按“设置”（软件的左侧面板）| “Micro Spotting Pins”| “新名”（946MP3-132点）。定义每个浸渍点（132），斑点直径（100μm），摄取（0.25μL），输送（0.7nL）和最小斑点间隔（100μm）的斑点数。按“确定”| “好。”
- 在“方法属性”窗口中，选择创建的引脚类型：“946MP3-132点”。
- 计算每个样品的印刷点总数。
- 定义洗涤条件。将“开始前洗涤”和“完成后洗涤”设置为“正常洗涤”（ 补充图2 ，步骤4）。
- 定义“盘单”。
注意：这是从板的采样模式（从384孔板的下降顺序）根据板布局。要将板材上传到板材列表中，请设置板材采样图案。- 创建板“采样模式”。转到“模板”（ 补充图3 ）| “抽样模式”。给一个新名称（ 例如， JoVE数组）并选择“插入”| “填充顶部”| “Pin Tool 1 x4 9 mm”。根据预定义的板布局（ 补充图1A ）选择油井拾取的顺序。按“确定”| “好。”
- 加载板采样模式。单击“板列表”单元格的右侧（ 补充图3 ）| “添加板”，并选择正确的板采样模式（步骤3.6.1中描述的“JoVE阵列”）。选择“正常洗涤”。按“OK”| “好。”
- 转到“样品板”，将位置偏移更改为1（确定板在位于平台上的位置）。
注意：0的偏移位置更接近超声波槽。 - 定义“微阵列打印设计”。计算块到块的距离和间距。
- 考虑开发工具的尺寸，其将滑块分成16个7×7mm的孔，在子阵列之间具有2mm间隔（块之间总共9mm; 补充图4 ）。
- 考虑子数组维度。
注意：在此打印设计中，斑点之间的间距为0.275 mm，有12列和18列;总尺寸为：宽度（11×0.275mm = 3.025mm）和高度（17×0.275mm = 4.675mm）。计算水平间距：9 mm - （11 0.275）= 5.97 mm。计算垂直间距：9 mm - （17 x 0.275）= 4.325 mm。计算d从滑块的左侧方向：4.43mm + 1.07mm = 5.5mm。计算从滑块顶部的距离：2.95 mm + 0.55 mm = 3.5 mm（ 补充图4 ）。 - 定义“打印设计”（ 补充图5 ）。选择“模板”| “打印设计”| “新。”
- 选择“引脚设置”| “针工具1 x 4 9 mm”| “Pin - 946MP3-132点”。在“常规”选项卡中，更改“微阵列打印名称”（ 即 “JoVE数组”）。选择“现货速度”| “复制号码”（4）| “触点高度”（0 mm）| “Soft Touch Height”（3 mm）| “打印到所有可用位置”（ 补充图5A ）。
- 在“微阵列”选项卡中，选择水平和垂直间距（步骤3.8.2中为5.9 mm和4.325 mm）以及水平和垂直微阵列（2）的数量。选择“打印”微阵列水平“|”打印重复微阵列“（ 补充图5B ）。
- 在子数组选项卡中，选择最大列数（12），最大行数（18）以及列和行之间的距离（275μm）（ 补充图5C ）。
- 在测量选项卡中，选择滑块左侧距离（5.5 mm），滑块顶部的距离（3.5 mm，步骤3.8.2中计算），打印滑块的宽度（25 mm） ，以及打印滑块的高度（75mm）（ 补充图5D ）。按“确定”| “好。”
- 单击“微阵列打印设计”单元格的右侧，并选择定义的设计（步骤3.8.3中的“JoVE阵列”; 补充图6 ）。
- 定义“幻灯片计数”（56），并更改“位置偏移”（0）。这决定了po第一张幻灯片打印在阵列甲板上的位置（ 补充图6 ）。
- 定义“微阵列预印设计”（ 补充图6 ）。选择“玻璃块”| “预打印1 x 4 mm针工具”。
注意：这个光斑间距设置允许玻璃块上的46,464个预光斑（对于所有4个引脚），因此每个引脚的46,464 / 4 = 11,616个预光点。当预打印块上的空间已用完时，打印机将停止，并且块将需要翻转。
注意：要计算预打印块满满多少个样品后，请考虑以下事项：每个样品将通过384孔板中的8针汲取，以完成56个幻灯片（每个浸液7个幻灯片），每个浸液还有20个前景点，每个样本共有160个预先点。因此11,616 / 160 = 72.6样本。因此，在72个样品之后需要翻转预印刷玻璃块（以评估翻转的时间，测量h一个样本需要一个样本完成一个完整的运行在56个幻灯片，然后乘以72）。 - 选择“使用PrePrint设计”| “是”| “扫描条形码”（No）| “打印单个复制”（否）（ 补充图6 ）。
- 点击“验证”（ 补充图6 ）。
- 点击“保存”并将方法保存为arr文件（ 例如， “JoVE array.arr”， 补充图6 ）。
打印设计数组
注意：所有步骤应在湿度为60-70％的洁净室内进行，并配有适当的手套和衣物进行保护
- 打开纳米打印机和加湿器。
- 对于洗涤缓冲液和加湿，请填充去离子水。清空洗瓶（排水）和加湿陷阱（ 补充图7A ）。
- 将加湿器设为70％湿度，开始加湿。
- 在打印前清洁所有针脚。准备50ml热（65℃）针尖清洁溶液（15克针尖清洗剂和50毫升65℃水，彻底混合直至固体试剂完全溶解）。
- 通过将针尖刷（细）浸入针尖清洁溶液中并刷涂每个针尖的表面，将清洁溶液涂抹到每个针尖。
注意：针尖清洗液具有腐蚀性和毒性。使用此溶液时，请始终佩戴手套和安全眼镜。将引脚清洁溶液中的引脚浸泡超过几分钟可能会导致永久的引脚损坏。 - 向超声波浴中加入1升蒸馏水，并将引脚放入可漂浮的针清洁架中。超声处理5分钟并取出针脚。干燥，用洁净室特殊擦拭物轻轻擦拭。
- 通过将针尖刷（细）浸入针尖清洁溶液中并刷涂每个针尖的表面，将清洁溶液涂抹到每个针尖。
- 打开“微阵列管理器”打印呃软件;连接设置后，打印机指示灯将亮起（红色/绿色）。按“停止”| “清除”| “Init”（ 补充图7B ，步骤1-3）;然后，打印头臂将重置X，Y，Z对准。
- 要将引脚装入打印头，请按“加载”（ 补充图7B ，步骤4），并根据打印/引脚工具布局（ 补充图7C ）的定义配置将引脚放入打印头。该布局使用4个引脚，每个幻灯片上打印4个子阵列，每个幻灯片总共获得16个子阵列（ 补充图1A ）。放置引脚后，再次按“Init”。
- 组装幻灯片在阵列甲板上。打开滑块，吹入超高纯度氮气清洗每个载玻片。将所需数量的幻灯片放在阵列平台上。用两根手指握住幻灯片在底角，然后将幻灯片放入其中位置。握住两个右角，轻轻推动左角，直到滑块紧紧地插入其位置。轻轻推向左下角，以确保紧身（ 附图7D ）。
- 用蒸馏水，70％乙醇和100％乙醇清洗前阻挡玻璃，让其风干（仅使用专用的洁净室擦拭巾）。将前挡板玻璃放在甲板上的位置。
- 填充超音波浴（ 补充图7B ）。按“填充”55秒，然后按“确定”。点击“排水”20秒，然后按“确定”，排空超声波发生器。再次重复填充和排水，然后再次填充55秒。
- 填充洗涤槽（ 补充图7B ）：按“Prime”40秒，然后按“确定”。
- 将等分样品的384孔板置于其阵列甲板上的位置，并取下石蜡膜盖。
- 打印完成后，排空超声波浴（ 补充图7B ）并关闭加湿器。
- 允许幻灯片在阵列甲板上干燥16-24小时，无需加湿。
- 用酒精/耐溶剂的标记笔编号幻灯片，并将其存放在阴暗的真空密封盒中。
5.处理和开发数组
- 从真空密封的箱子中取出一个滑块，将其放在化学品罩中5分钟，阵列朝上，以蒸发多余的液体。
- 以最高增益（950 PMT）扫描幻灯片，以确保已打印所有斑点。
- 继续在幻灯片上的环氧基团的化学阻挡
- 准备50mL乙醇胺封闭溶液（0.1M Tris-HCl，pH8和0.05M乙醇胺）。将140mL DIW与8.8mL Tris-HCl（1.7M，pH8）和0.45mL乙醇胺（16.6M）混合。转移到50-mL染色管（ 补充图8A ）并温至50℃。
- 水合幻灯片。将载玻片置于装有DIW的染色管中，用箔覆盖，并在室温下慢慢温和振荡孵育5分钟。
- 阻挡载玻片上的反应性环氧基团。将载玻片浸入装有预热的乙醇胺封闭溶液的50-mL染色管中，用箔覆盖，并在室温下慢慢温和振荡孵育30分钟。
- 将乙醇胺封闭溶液丢弃到适当的生物危害垃圾容器中，并将载玻片置于装有50°C DIW的新的干净染色管中。用箔盖住并在室温下慢慢温和振荡孵育10分钟。
- 弃去水并将载玻片转移到玻璃染色架上（ 补充图8B ）。将玻璃染色保持器放入摇摆板支架中，并以200 x g和RT离心干燥载玻片5 min。
- 将幻灯片放在16孔隔板上（ 补充图8C ）。
- 制备PBST洗涤溶液：50mL磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4 + 0.1％Tween-20。
- 制备生物封闭溶液（PBS-OVA）：5mL PBS，pH 7.4 + 1％鸡卵清蛋白（10mg / mL）。
注意：阻断试剂的选择对于抗Neu5Gc抗体检测的成功至关重要。卵白蛋白是在像人类一样不能合成Neu5Gc的鸡中制成，造成Sia缺乏表达。为了检测Neu5Gc，即使是较小的污染物也能显着降低检测的敏感性，有时甚至无法检测到任何抗Neu5Gc反应性。例如，最常用的阻断试剂牛血清白蛋白（BSA）虽然没有被本身糖基化，但含有携带Neu5Gc部分的牛IgG污染物，因此与结合到样品与抗Neu5Gc抗体19,20当第i个印刷聚糖。 - 预润井。使用多移液管，将200μLPBST等分入载玻片，将其置于一个覆盖的潮湿室中，摇动5分钟。
注意：湿度箱是带有湿毛巾纸的玻璃托盘，用尼龙包装和箔片覆盖，以保护样品免受光照。 - 轻轻取出PBST，轻轻敲打干净的纸巾，并将200μLPBS-OVA封闭缓冲液分装入各孔。置于潮湿的室中，轻轻摇动在室温下孵育1小时。
- 准备在PBS-OVA封闭缓冲液中稀释的初级检测，如表2所列。
注意：对于该sialoglycan微阵列的质量控制（QC）评估，使用几种Sia结合蛋白：从接骨木树皮分离的接骨木黑素凝集素（SNA），预期识别Sia＆＃945; 26; Maackia Amurensis 凝集素II （MALII）有望识别Siaα23;并且预计鸡抗Neu5Gc IgY可以识别所有含Neu5Gc的sialoglycans。此外，使用各种人血清样品来描绘抗Neu5Gc IgG的反应。凝集素/抗体/血清的浓度应经实验校准。 - 轻轻洗涤PBS-OVA封闭缓冲液，每孔加入200μL一抗（最小体积/孔：70μL），在潮湿室中孵育2小时。
- 轻拂干燥主检测，并用PBST洗涤4次（第3 次和第 4 次洗涤之间，在孵育PBST滑动5分钟在潮湿的腔室）。用PBS洗一次。
- 在PBS中制备二抗，如表2所列。
- 将PBS干燥，加入200μL二级抗体。在室温下振荡孵育1小时。
- 轻轻擦干二抗，用PBST洗4次（3次第 4和第 4 次洗涤，在PBST中将载玻片在潮湿室中孵育5分钟）。
- 仔细取出框架，将载玻片放入装有PBS的50 mL载玻片染色管中，摇匀5分钟。
- 用DIW填充两个载玻片染色浴（ 补充图8D ），将载玻片放入滑块中，并将其浸入浴中。快速浸10次，然后转移到第二浴，再浸10次。在室温下振荡孵育10分钟。
- 丢弃水并将载玻片转移到玻璃染色架上（ 补充图8B ;允许滑块风干）。将玻璃染色保持器放置在摆动板支架中，并离心干燥载玻片5分钟，时间为200 g。
- 扫描幻灯片，然后将其存放在阴暗的真空密封盒中。
阵列扫描和数据分析
- 打开荧光幻灯片扫描仪，让其温热5分钟。打开扫描和分析软件。
- 设置扫描参数（ 补充图9A ）：以532 nm扫描和100％功率，增益为350 PMT，一行平均和一个0μm聚焦位置。使用10.0μm像素大小的分辨率。
注意：扫描参数可以调整为不同的幻灯片类型，荧光和分辨率。 - 扫描开发的幻灯片。打开扫描仪门并将幻灯片放在里面，阵列朝下。开始扫描（软件导航面板菜单上的绿色“播放”按钮， 补充图9B ）。
- 将扫描的幻灯片保存为tiff文件。
- 准备幻灯片进行分析。选择“加载数组列表”并上传相应的GAL文件，该文件将幻灯片上每个块中的数组映射（ 补充图9C ）。
注意：GAL文件包含有关幻灯片上每个斑点的身份和位置（X，Y）的信息。可以创建此文件由打印机软件根据384孔源板中的样本标识和定义的打印设计导出制表符分隔的文本文件。 - 设置对齐和分析参数。按软件导航面板菜单上的“选项”按钮（ 补充图10 ）。
- 定义对齐参数。查找圆形特征，在对齐期间将特征的大小调整50 - 350％，将特征移动限制为最大平移40μm，失败背景阈值（CPI阈值0）的未标记特征，估计找到块时的包装和旋转，并自动进行图像注册（10像素）（ 补充图10 ）。
- 定义分析参数：W1 / 532比例，正常标准差，分析缺失特征和背景减除。单击“选择”，然后单击“本地功能背景中值”，并设置2个像素排除和3像素宽度的背景。按“确定”。硒将扫描仪饱和度设置为默认值（ 补充图10 ）。
注意：背景减法方法取决于实验设计，可根据具体需要进行修改。 - 对齐功能图。将程序设置为程序模式（按“B”），选择所有程序段（Ctrl + A），定位阵列地图格栅，并对齐所有程序段（Alt + Shift + F7）（ 补充图11 ）。
- 优化每个块中的特征对齐。放大（按“Z”进入变焦模式）进入左上方块，再次按“B”（块模式），然后按下此块的网格。只能移动该块的网格，直到与块点完全对齐，然后按F5对齐所选块中的要素。重复网格移动和F5对齐，直到斑点完美圈出。对16个块中的每一个执行相同操作，直到所有网格都到位。
- 分析并保存数据。选择所有块（Crtl +A）然后分析数据（Alt + A）。将分析结果（Ctrl + U）保存为.gpr文件。
- 在电子表格程序中打开保存的.gpr文件，并根据局部背景减法后的荧光（F532-B532）分析每个斑点的强度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
阵列打印，开发和分析：
打印具有多个聚糖样品的sialoglycan微阵列和16个不同块中的人IgG STD曲线需要彻底校准，以确保所有样品在每个幻灯片所有16个块中以及在相同打印运行中的所有幻灯片尽可能均匀地打印。因此，在确定特定印刷参数之前需要进行多次校准实验，包括每种样品的缓冲液组合物，载玻片类型和制造，384孔板型，湿度水平，384孔板中的样品体积，预量的量每种类型样品的印刷，人IgG STD曲线浓度和标记类型。这种印刷的sialoglycan阵列载玻片的耐久性在室温下在黑暗中的真空密封箱中经过验证可持续长达10个月。在每个印刷实验中，均匀度是通过使用Sia结合凝集素和抗体的质量控制实验进一步监测和验证。通过比较来自相同打印运行的幻灯片之间和之间的样本，已经优化了开发和扫描协议以实现均匀性和准确性。使用16孔隔板开发载玻片，通过使用优化的封闭条件（化学和生物），洗涤和孵育时间，确保块之间的适当分离。主要和次要检测被广泛地校准，以确保最小的背景和非特异性结合的检测。在幻灯片扫描和分析时，将输出结果转移到电子表格文件并进行分析，以确定每个点的检测。如果不符合QC（如果％CV> 20，斑点在四个重复的平均值之外的一个标准偏差的范围之外），则每个点都经过异常值检查并被忽略。然后，平均信号强度对于每个样品的重复斑点平均减去局部背景，以产生每个印刷样品的相对荧光单位（RFU）数据点。一旦IgG STD曲线的均匀性在所有测试的块中得到验证，RFU值被归一化为ng /μLIgG，允许在实验之内和之间更好地比较样品。
Sia结合高通量测定：
Sialoglycan阵列可用于检测结合含Sia聚糖的决定簇（ 如蛋白质，凝集素，抗体，病毒等 ）。对于QC印刷后，SIA-结合植物凝集素和抗Neu5Gc的IgY被用于19。 SNA结合α2-6连接的Sia，MALII结合α2-3连接的Sia，抗Neu5Gc IgY结合含Neu5Gc的唾液酸，但不结合Neu5Ac含有sialoglycans 19 ， 如图2A所示。 QC实验的目的是通过使用四个不同的引脚来验证打印和识别的印刷块之间的差异。通过开发每个幻灯片的每个主要检测的四个块来监测块对块的变异性，并且通过将与四个引脚中的每一个打印的块与相同的主要检测部分进行比较来监控。然后进行比较以确保不存在重大差异。
人血清含有抗多样Neu5Gc抗体6含义多种人类疾病的2，21，22，23。为了评估人血清IgG中的sialoglycan识别，在印刷的唾液酸多糖微粒上分析来自健康人供体的12个血清使用荧光标记的抗人IgG（ 图2B ）发展并发展。每个印刷块含有人IgG STD曲线，其在所有方块中都是相当的和均匀的（ 图2C ）。只有在验证每个块中的STD曲线的质量（ 图2C ）之后，聚糖斑点结果根据块中的斜率进行归一化，然后乘以稀释因子。 如图2B所示，所有测试的人血清含有各种水平的抗Neu5Gc IgG，几乎没有识别出配对的含Neu5Ac的唾液酸对。此外，抗Neu5Gc IgG识别模式在这12种不同血清之间是高度多样的，无论是在强度和多样性水平上。
图1：概述阵列打印，开发和图像分析。 （ A ）Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2显示为代表性的Neu5Gc含量的Sia聚糖，其中将伯胺印在环氧树脂涂覆的载玻片上。 （ B ）印刷阵列与各种Sia结合蛋白一起开发，随后用合适的荧光标记的二抗检测。每个子阵列可以单独开发。 （ C ）在荧光扫描仪中扫描探测幻灯片，生成使用扫描仪图像软件进一步分析的图像。子阵列覆盖着阵列上的每个斑点的网格，并为每个斑点检测到荧光。然后将结果转移到电子表格文件中。示意性地表示单个孔中的单个阵列。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：使用各种Sia结合蛋白的唾液酸多糖微阵列的谱图。
幻灯片与16个不同的主要检测部分开发，每个块中有一个。 （ A ）代表性的3块QC载片，显示Sia特异性植物凝集素SNA和MALII以及多克隆单特异性鸡抗Neu5Gc IgY的结合模式。结果以每个单独块（红色，白色和蓝色，分别表示第100 个 ， 第 50 个和第 0百分位数）的热图格式的RFU表示。 （ B ）以1:100稀释度测试12种不同的健康人血清，并用抗huamn IgG检测以描绘抗Neu5Gc IgG反应性。通过将每个值与每个特定bl中的IgG STD曲线斜率相除，将RFU数据归一化为ng /μL然后乘以稀释因子。对于所有组合的块（红色，白色和蓝色，分别代表第 100 个 ， 第 50 个和第 0 个百分位数），数据以热图格式表示。 （ C ）已经用于标准化数据的人血清开发的12个区块的人IgG STD曲线。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 糖冠ID | 结构体 | |||
| 1 | Neu5,9Ac 2α3Galβ4GlcNAcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 | |||
| 2 | Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2/ sub> NH 2 | |||
| 3 | Neu5,9Ac 2α6Galβ4GlcNAcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 | |||
| 4 | Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 五 | Neu5Acα6GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 6 | Neu5Gcα6GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 7 | Neu5,9Ac 2α3Galβ3GlcNAcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 | |||
| 8 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 9 | Neu5,9Ac 2α3Galβ3GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 10 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 11 | Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 12 | Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 13 | Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 14 | Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 15 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 16 | 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 17 | Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 18 | Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 19 | Neu5Acα6Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 20 | Neu5Gcα6Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 21 | Neu5Acα3Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 22 | Neu5Gcα3Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 23 | Neu5,9Ac 2α6GalNAcαO（CH 2）2 CH 2 NH 2 | |||
| 24 | Neu5Gc9Acα6GalNAcαO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 25 | Neu5Acα3GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 26 | Neu5Gcα3GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 27 | Neu5Acα6GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 28 | Neu5Gcα6GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 29 | Neu5,9Ac 2α3GalβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 | |||
| 三十 | 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 31 | Neu5,9Ac 2α6GalβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 | |||
| 32 | Neu5Gc9Acα6GalβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 33 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 34 | Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 35 | Neu5,9Ac 2α3Galβ3GalNAcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 | |||
| 36 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| Neu5,9Ac 2α6Galβ4GlcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 | ||||
| 38 | Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
| 39 | Neu5,9Ac 2α3Galβ4GlcβO（CH 2）2 CH 2 NH 2 | |||
| 40 | Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO（CH 2 ） 2 CH 2 NH 2 | |||
表1：印刷糖列表。
| 小学/中学 | 抗体/凝集素 | 库存集中 | 特异性 | 工作稀释/浓缩 |
| 主要检测 | 生物素化MALII | 1 mg / mL | 唾液酸α2-3键 | 1:50，20μg/ mL |
| 生物素化SNA | 2 mg / mL | 唾液酸α2-6键 | 1：100,20μg/ mL | |
| 鸡抗Neu5Gc IgY | ND | Neu5Gc唾液酸 | 1：7.000 | |
| 人血清 | 100％ | 许多表位 | 1：100 | |
| 二次检测 | 的Cy3-链霉 | 0.75 mg / mL | 生物素 | 1：500,1.5μg/ mL |
| Cy3抗鸡IgY | 0.75 mg / mL | 鸡IgY | 1：2,000,0.375μg/ mL | |
| Cy3抗人IgG H + L | 0.6 mg / mL | 呼玛n IgG | 1：1,500，0.4μg/ mL |
表2：初级和次级检测蛋白的列表。
补充数据： 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
成功的聚糖微阵列制造需要仔细的规划，并包括协议中的几个重要步骤。这些包括：（1）规划定义所有后续参数（ 例如距离，间距，样品量和打印）的块和板布局; （2）清洁引脚并确保引脚的完整性，这对于控制点均匀性至关重要; （3）在印刷过程中保持高湿度，在长时间打印运行期间避免样品蒸发至关重要，这可能损害光斑均匀性; （4）选择正确的对齐和分析参数，这可以影响结果（ 例如，背景扣除方法，阈值和斑点尺寸灵活性）。
该方法可以进一步修改以满足特定的实验设计和目标。例如，可以修改预先识别号码以更好地适合要在阵列上打印的每种类型的材料。针清洗步骤期间可以优化打印以适应不同的印刷材料，具有较短或延长的洗涤周期。此外，可以修改针头每次浸渍的斑点数量，以包括更多或更少的斑点，但是需要对阵列上使用的每种类型的材料进行单独的校准。荧光标记物的类型及其浓度可以进行修饰，只要它含有合适的缀合化学基团（ 即用于环氧涂布载片的伯胺）即可。 STD曲线的浓度和类型可以延长（ 例如，人/小鼠/其他生物体IgG，IgM，IgA 等 ）。可优化缓冲条件以适应不同的材料，优选不含伯胺的材料以避免非特异性结合阵列，这将导致增加的背景。重要的是，为了最佳的检测Neu5Gc，生物阻断试剂必须不含Neu5Gc（ 例如避免BSA牛奶），因为这可能会减少Neu5Gc-唾液酸多糖检测，现象越来越背景19,20。应优化初级和次级检测浓度，以避免高背景和非特异性结合。此外，可以修改扫描参数（ 例如功率，增益和分辨率）以减少背景或增强低信号。最后，对齐和分析参数可以修改以适应高背景或不同形状的特征。关于报告聚糖微阵列数据的推荐标准的更多信息和指南最近由MIRAGE倡议17描述，最终可以促进数据共享和解释。
总之，聚糖微阵列提供了一种用于研究聚糖 - 生物分子相互作用的强大工具，可适用于各种生物样品。抗Neu5Gc抗体在人类疾病中起着不同的作用23 。例如，在癌症，抗Neu5Gc抗体扮演双重角色：一方面，他们作为潜在生物标志物，但在另一方面，他们作为潜在的治疗7，21，24。这些抗体也有助于动脉粥样硬化25的恶化，异种移植20,26的功效，和糖基化的生物治疗药物27的效果。因此，在各种人体样品中分析抗Neu5Gc抗体的兴趣越来越高，而高通量测定（如本文所述）可有助于进一步了解其在人类健康和疾病中的作用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到以色列癌症研究基金研究职业发展奖的支持，以色列国家纳米技术计划和赫尔姆斯利慈善信托基金会为个人化支持纳米医学（VP-K）和国家卫生署授予R01GM076360（至XC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
