Summary
Et sialoglycan-mikroarray-assay kan anvendes til at evaluere anti-Neu5Gc-antistoffer i humane sera, hvilket gør det til et potentielt diagnostisk test med høj gennemløb for kræft og andre kroniske inflammationsmedierede humane sygdomme.
Abstract
Celler er dækket af en kappe af kulhydratkæder (glycaner), der almindeligvis ændres i kræft, og som omfatter variationer i sialinsyre (Sia) -ekspression. Disse er sure sukkerarter, der har en 9-carbon backbone, og at hatte hvirveldyr glycaner på celleoverflader. To af de vigtigste Sia-former i pattedyr er N- acetylneuraminsyre (Neu5Ac) og dens hydroxylerede form, N- glycolylneuraminsyre (Neu5Gc). Mennesker kan ikke producere endogent Neu5Gc på grund af inaktiveringen af genet kodende for cytidin 5'monophosphat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Udenlandske Neu5Gc er erhvervet af humane celler gennem kostforbruget af rødt kød og mejeri og ses efterfølgende på forskellige glykaner på celleoverfladen, der hovedsagelig ophobes på carcinomer. Følgelig har mennesker cirkulerende anti-Neu5Gc-antistoffer, der spiller forskellige roller i kræft og andre kroniske inflammationsmidlede sygdomme, og som bliver potentielle diagnostiske og terapeutiske lægemidlerrgets. Her beskriver vi et high-throughput sialoglycan microarray assay for at vurdere sådanne anti-Neu5Gc antistoffer i humane sera. Neu5Gc-holdige glycaner og deres matchede kontrolpar (Neu5Ac-holdige glycaner), hver med en primær amin, er kovalent bundet til epoxy-coatede glasskinner. Vi eksemplificerer udskrivning af 56 dias i 16-brøndsformat ved hjælp af en specifik nanoprinter, der kan generere op til 896 arrayer pr. Print. Hvert dias kan bruges til at screene 16 forskellige humane sera prøver til evaluering af anti-Neu5Gc antistof specificitet, intensitet og mangfoldighed. Protokollen beskriver kompleksiteten af dette robuste værktøj og giver en grundlæggende retningslinje for dem, der sigter mod at undersøge svaret på Neu5Gc diætcarbohydratantigen i forskellige kliniske prøver i et arrayformat.
Introduction
Sias er sure sukkerarter, der dækker glycan kæder på celleoverflade glycoproteiner og glycolipider hos hvirveldyr. Sia-ekspression er modificeret i cancerceller 1 og korrelerer med progression og / eller metastase 2 , 3 . To af de store Sia former i pattedyr er Neu5Ac og dens hydroxyleret form Neu5Gc 2. Mennesker kan ikke syntetisere Neu5Gc på grund af en specifik inaktivering af genet kodende for CMAH-enzymet. Denne ikke-humane Sia inkorporerer metabolisk i menneskelige celler som "selv", der stammer fra kostholdige Neu5Gc-rige fødevarer ( fx rødt kød) 4 , 5 . Neu5Gc er til stede i lave niveauer på celleoverfladerne af human epithelia og endothelia, men det akkumuleres især i carcinomer. Neu5Gc er anerkendt som fremmed af det humane humoral immune system 2 , 6 .Den antigeniske kompleksitet af Neu5Gc-glycaner kan opstå på flere niveauer, herunder Neu5Gc modifikation, binding, underliggende glycaner og stilladser, og deres tæthed, som alle afspejles af kompleksiteten af anti-Neu5Gc-antistofrespons hos mennesker 6 . Nogle af disse antistoffer tjener som carcinombiomarkører og potentielle immunoterapeutika 7 . Fremkomsten af den kemoenzymatiske syntese af forskellige sialoglycaner 8 banede vejen for den mere dybtgående analyse af sådanne antistoffer, lette ved anvendelse af glycan mikroarray teknologi 9 , 10 . Med den lettere forberedelse og manipulation af store biblioteker af naturlige og syntetiske kulhydrater er glycanmikarrayser blevet en stærk høj-gennemstrømningsteknologi til undersøgelse af vekselvirkningerne af kulhydrater med et utal af biomolekyler 10 , 11 , 12 , 13 . I et arrayformat anvendes der små mængder materialer, og denne multivalente visning af biologisk relevante glycaner muliggør undersøgelse af tusindvis af bindende interaktioner i et enkelt forsøg. Det er vigtigt, at denne teknologi også kan anvendes til biomarkøropdagelse og til overvågning af immunresponser i forskellige prøver 7 , 12 .
Succesfuld fremstilling af glykan mikroarray kræver overvejelse af tre vigtige aspekter: printerrobotypen, glykan-konjugationskemi og detektionsoptik. Med hensyn til udskrivningsinstrumentet er der to teknikker til rådighed: kontakt- og ikke-kontaktprintere. Ved kontaktudskrivning dyppes 1-48 stålstifter i en multi-well-kildeplade indeholdende glycanopløsning og ses på funktionaliserede glasskinner ved direkte at kontakte glasskærmens overflade. Opløsningen er deLeveret til diaset er en funktion af den langvarige varighed på diasoverfladen. Normalt er prøverne først forspottet på en glasblok (for at nå homogene punkter), før de trykkes på glidens overflade. I ikke-kontaktprintere ( fx den piezo-elektroniske printer), udskrives glycanerne fra en glaskapillær ved hjælp af kontrollerede elektriske signaler. Det elektriske signal kan finskalibreres for at opnå mere præcis udskrivning i forhold til kontaktudskrivning. Pletternes størrelse og morfologi er også relativt mere homogene. En yderligere fordel er genbrug af prøven tilbage til kildeskiltet efter udskrivning. Ikke desto mindre er den største ulempe ved piezo-elektroniske printere trykbegrænsningen (4 eller 8), hvilket resulterer i en meget lang udskrivningstid, hvilket kræver særlig opmærksomhed på glidestabilitet, temperatur, fugtighed og prøvefordampning. Inkjet-printeren uden kontakt kræver større prøvevolumener 14 .
10 , 11 , 12 , 13 . For meget detaljerede oplysninger om trykt glycan microarray teknologi til uindviedeD undersøger, henvis til disse gode anmeldelser 13 , 15 . Det er vigtigt, at den seneste minimale information, der er påkrævet for et glykamikforsøg (MIRAGE), beskriver retningslinjer for prøvepræparation 16 og til rapportering af data fra glykanmikarrayanalyser 17 for at forbedre standarderne i dette voksende felt.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til fremstilling af sialoglycan-mikroarrays ved hjælp af en bestemt kontakt nano-printer i et 16-brøndsformat. Hver af glycans har en primær amin, der formidler deres kovalente forbindelse til epoxyaktiverede glasskinner. Vi beskriver også udviklingen og analysen af et dias ved hjælp af forskellige humane sera prøver, antistoffer og Sia-bindende plante lectins. Sialoglycan microarray analyser involverer flere store trin, der omfatter array fabrikation, behandling, udvikling og analyse. Array fabrikation kræver planlægning af arRay-layout, forberedelse af glycans og kildeplade, programmering af nano-printeren og udskrivning af diasene. Derefter behandles, udvikles og analyseres diasene ( figur 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human sera prøver blev opnået fra den israelske blodbank og blev brugt i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og Tel Aviv Universitets Institutional Review Board.
1. Array Fabrication Planlægning og Layout
- Bestem dias layout.
BEMÆRK: Hvert dias indeholder 16 sub-arrays opdelt i 16 identiske blokke nummereret B1 til B16 ( Figur 1B , Supplerende Figur 1A ). - Bestem pin layout. Brug fire stifter, hver udskriver fire sub-arrayer (blokke) pr. Dias:
Pin 1 udskriver blokke 1, 2, 9 og 10;
Pin 2 udskriver blokke 3, 4, 11 og 12;
Pin 3 udskriver blokke 5, 6, 13 og 14; og
Pin 4 udskriver blokke 7, 8, 15 og 16 ( supplerende figur 1A ). - Bestem blokken og 384 brøndspladens layout.
BEMÆRK: Ordren, hvor glycansne forekommer i hver blok, kræver omhyggelig planlægning. I dette eksempel arrAy, udskrive hver prøve ved fire replikater, designe fluorescerende markørpletter, der skal placeres i nederste højre hjørne (for at lette pletanalyse) og udskrive standardkurve IgG (STD) pletter ved seks stigende koncentrationer ( Supplerende Figur 1B ).- For hver trykt plet skal du først disponere materialet i fire brønde (en for hver stift) i en 384 brønds plade.
BEMÆRK: Materialernes rækkefølge i 384-brøndspladen afhænger af det konstruerede bloklayout ( Supplerende Figur 1B-C ).
- For hver trykt plet skal du først disponere materialet i fire brønde (en for hver stift) i en 384 brønds plade.
2. Fremstilling af glycaner og kildepladen
- Forbered glycan-trykbuffer (50 ml 300 mM phosphatpuffer, pH 8,4). Afvej 58,5 mg mononatriumphosphat monohydrat (NaH 2 PO4 1H 2 O) og 3,9 g dinatriumphosphat heptahydrat (Na2HPO 4 .7H 2 O) i 40 ml deioniseret vand (DIW). Titrer til pH 8,4 ved anvendelse af 4 M NaOH. Juster lydstyrken til 50 ml anD filtrer gennem en 0,2 μm membran til sterilisering.
- Forbered markørbuffer (50 ml 187 mM phosphatpuffer, pH 5). Afvej 289 mg mononatriumphosphat monohydrat (NaH 2 PO4 1H 2 O) og 1,94 g dinatriumphosphat heptahydrat (Na2HPO 4 .7H 2 O) i 40 ml DIW. Titrer til pH 5 ved anvendelse af 1 M HCI. Juster lydstyrken til 50 ml og filtrer gennem en 0,2 μm membran til sterilisering.
- Forbered STD-kurvebuffer (50 ml PBS-glycerol: phosphatpufret saltopløsning, pH 7,4, suppleret med 10% glycerol fra en 100% glycerolmasse) og filtrer den gennem en 0,2 μm membran til sterilisering.
- Forbered hver glycan stamopløsning ved 10 mM i DIW. Verificere de sialylerede glycankoncentrationer ved hjælp af fluorescensdetektion på revers-fase højtryksvæskekromatografi analyse 18 .
- Fortynd hver glycan til 100 μM i et totalt volumen på 100 μl glycanprintpufferI mikrocentrifugerør.
- Forbered primær amin indeholdende fluorescerende farvestof. Solubiliser Alexa 555-hydrazid til 1 mg / ml med markørpuffer og fortynd derefter til 1 μg / mL i et 1 mL totalvolumen.
BEMÆRK: Ethvert andet primært aminholdigt farvestof kan anvendes med en passende bølgelængde i henhold til diasscanneren.
BEMÆRK: Markeringspunkter gør det lettere at justere nettet i hver blok under analysen. - Forbered human IgG STD-kurvefortyndinger: Fremstil 0,5 ml af en stamopløsning af humant IgG ved 160 ng / μl i STD-kurvebuffer. Sædvanligvis fortynd bestanddelen 1: 1 seks gange for at opnå 80, 40, 20, 10, 5 og 2,5 ng / μl, alt sammen i STD-kurvebuffer med et samlet volumen på 200 μl hver.
BEMÆRK: Andre Ig-isotyper kan anvendes, hvis det er egnet til eksperimentet ( fx humant IgA, IgM, IgE eller et Ig af en anden organisme). - Placer 384-brøndspladen på is. Ved anvendelse af en elektronisk multi-pipette replikeres alikvot 7 μl af hver glykan-, markør- og STD-kurve IgG-4-replikatS af hver-ifølge plade layoutet ( supplerende figur 1C ). For bedre nøjagtighed skal 35 μl af hver prøve og alikvot 7 μl indlæses i hver af de fire brønde i prøven. Anbring de resterende 7 μl af hver glycan tilbage i deres oprindelige rør.
- Dæk pladen med parafilm og drej ned i 2 minutter ved 250g og 12 ° C. Placér pladen ved stuetemperatur (RT), beskyttet mod lys. Tag ikke pladen op, før fugtigheden i rummet når 60-70%.
3. Programmering af nano-printeren
- Åbn "Microarray Manager" software. Brug vinduet "Metodeegenskaber".
- Indstil arbejdsbordlayoutet: vælg "56 dias konfiguration."
BEMÆRK: Dette er en foruddefineret konfiguration, der gør det muligt at udskrive 56 dias. Kalibrere for hver type plade, stift og udskriftsformat ( Supplerende figur 2 , trin 1). - Vælg "Pin-konfiguration"| "Pin Tool 1x4 9 mm."
BEMÆRK: Dette er en foruddefineret konfiguration til brug af fire ben ( Supplerende Figur 2 , Trin 2). - Definer "Pin type." Beregn og opret den pin type, der er egnet til udskrivningen.
BEMÆRK: Dette trin definerer, hvor mange pletter en knap ville udskrive, før geninddypning i prøven 384 brønd og bør optimeres for de forskellige stifttyper og glideklædekemi.
BEMÆRK: Ved brug af 946MP3-stifter skal du overveje to vigtige problemer: 1) hver stift kan udskrive op til 140 homogene pletter og 2) forspotting er afgørende for at dræne overskydende væske fra spidsen af stiften, inden du trykker på diasene. Programmér derfor hver stiften til at udskrive 20 præ-pletter på en fortryksblok (optimeret til 946MP3 stifter på epoxy-coatede dias).- Beregn det samlede antal trykte pletter pr. Prøve.
BEMÆRK: Her udskriver hver knap 4 pletter pr. Undergruppe (blok); I alt 4 sub-arrays pr dias = 16 pletter / slide. Efter 7 dias udskriver hver stifter 16 x 7 = 112 punkter. Derudover giver 20 præ-pletter før udskrivning 132 pletter / dip. Derfor er pin-typen defineret som "946MP3-132 pletter" (4 pletter pr. Prøve pr. Blok x 4 blokke x 7 dias + 20 præ-pletter = 132). - Opret "Pin type" ( Supplerende Figur 2 , Trin 3). Tryk på "Setup" (venstre panel af softwaren) | "Micro Spotting Pins" | "Nyt navn" (946MP3-132 pletter). Definer antallet af pletter pr. Dip (132), spotdiameteren (100 μm), optagelsen (0,25 μL), afgivelsen (0,7 nL) og den minimale punktafstand (100 μm). Tryk på "OK" | "OKAY."
- I vinduet "Metodeegenskaber" skal du vælge den oprettede pin type: "946MP3-132 pletter."
- Beregn det samlede antal trykte pletter pr. Prøve.
- Definer vaskeforholdene. Indstil "Vask før start" og "Vask efter efterbehandling" til "Normal vask" ( Supplerende Figur 2 , Trin 4).
- Definer "Plate liste."
BEMÆRK: Dette er prøveudtagningsmønsteret fra pladen (rækkefølgen af dips fra 384-brøndspladen) ifølge pladelayoutet. For at uploade pladen i pladelisten skal du oprette et plademønster.- Opret pladen "Sampling Pattern." Gå til "Skabeloner" ( Supplerende Figur 3 ) | "Prøveudtagningsmønstre." Giv et nyt navn ( fx JoVE array) og vælg "Insert" | "Fyld top-bottom" | "Pin Tool 1 x4 9 mm." Vælg rækkefølgen af brøndoptagelser i overensstemmelse med det foruddefinerede pladelayout ( Tillægs figur 1A ). Tryk på "OK" | "OKAY."
- Indsæt plademønsteret. Klik på højre side af "Plate liste" celle ( Supplerende Figur 3 ) | "Tilføj plade" og vælg det korrekte pladesamplingsmønster ("JoVE array" beskrevet i trin 3.6.1.). Vælg "Normal vask". Trykke"OK" | "OKAY."
- Gå til "Prøveplader" og skift positionsforskydningen til 1 (som bestemmer, hvor pladen er placeret på arraydækket).
BEMÆRK: Offsetpositionen 0 er tættere på sonikatorbadet. - Definer "Microarray Print Design." Beregn blok-til-blok afstanden og afstanden.
- Overvej dimensionerne af udviklingsværktøjet, der opdeler diaset i 16 brønde på 7 x 7 mm, med 2 mm mellemrum mellem delrader (i alt 9 mm mellem blokke; Supplerende Figur 4 ).
- Overvej sub-array dimensioner.
BEMÆRK: Afstanden mellem pletter er 0,275 mm, og der er 12 kolonner og 18 rækker i dette printdesign; De samlede dimensioner er: bredde (11 x 0.275 mm = 3.025 mm) og højde (17 x 0.275 mm = 4.675 mm). Beregn vandret afstand: 9 mm - (11 0,275) = 5,97 mm. Beregn den lodrette afstand: 9 mm - (17 x 0.275) = 4.325 mm. Beregn dIstance fra venstre side af dias: 4,43 mm + 1,07 mm = 5,5 mm. Beregn afstanden fra glidens overside: 2.95 mm + 0.55 mm = 3.5 mm ( Supplerende Figur 4 ). - Definer "Print Designs" ( Supplerende Figur 5 ). Vælg "Skabeloner" | "Print Designs" | "Ny."
- Vælg "Pin Setup" | "Pin Tool 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 spots." På fanen "Generelt" skal du ændre "Navn på Microarray Print" ( dvs. "JoVE array"). Vælg "Spot Speed" | "Repliceringsnummer" (4) | "Touch point height" (0 mm) | "Soft Touch Height" (3 mm) | "Udskriv til alle ledige stillinger" ( Supplerende figur 5A ).
- Vælg "Horisontal og lodret afstand" (5,9 mm og 4,325 mm fra trin 3.8.2) og antallet af vandrette og lodrette mikroarrays (2) i fanen "Microarray". Vælg "UdskrivMicroarray Horisontalt "|" Print Duplicate Microarray "( Supplerende Figur 5B ).
- Vælg det maksimale antal kolonner (12), det maksimale antal rækker (18) og afstanden mellem kolonnerne og rækkerne (275 μm) ( Supplerende figur 5C ) i fanen under-array.
- Vælg afstanden fra glidens venstre side (5.5 mm), afstanden fra toppen af objektglaset (3,5 mm, beregnet i trin 3.8.2), bredden af udskrivningslyset (25 mm) , Og højden på udskriftsbilledet (75 mm) ( Tillægs figur 5D ). Tryk på "OK" | "OKAY."
- Klik på højre side af cellen "Microarray Print Designs" og vælg det definerede design ("JoVE array" fra trin 3.8.3; Supplerende Figur 6 ).
- Definer "Slide Count" (56), og skift "Position Offset" (0). Dette bestemmer poSition af det første dias, der skal udskrives på arraydækket ( supplerende figur 6 ).
- Definer "Microarray Pre-Print Design" ( Supplerende Figur 6 ). Vælg "Glass Block" | "Pre-Print 1 x 4 mm pin værktøj."
BEMÆRK: Denne indstilling for spot-afstand tillader 46.464 præ-pletter (for alle 4 stifter) på glasblokken, således 46.464 / 4 = 11.616 præ-pletter pr. Pin. Når pladsen på pre-print-blokken var blevet brugt, stopper printeren, og blokken skal vendes om.
BEMÆRK: For at beregne efter, hvor mange prøver præ-print-blokken er fuld, skal du overveje følgende: Hver prøve bliver taget med 8 pin-dips i 384-brøndspladen for at gennemføre 56 dias (7 dias pr. Dip) og hver dip Har yderligere 20 præ-pletter, hvilket giver i alt 160 præ-pletter pr. Prøve. Derfor er 11.616 / 160 = 72.6 prøver. Således skal fortryksglasblokken være vendt om efter 72 prøver (for at evaluere tiden for at vende, måle hOw lang tid tager det for en prøve at fuldføre en fuld kørsel på 56 dias og derefter multiplicere med 72). - Vælg "Brug PrePrint Design" | "Ja" | "Scan stregkoder" (Nej) | "Print Single Replicate" (Nej) ( Supplerende Figur 6 ).
- Klik på "Validér" ( Supplerende Figur 6 ).
- Klik på "Gem" og gem fremgangsmåden som en arr-fil ( fx "JoVE array.arr," Supplementary Figure 6 ).
4. Udskrivning af designede arrays
BEMÆRK: Alle trin skal udføres i et rent rum med en luftfugtighed på 60-70% og med passende handsker og beklædning til beskyttelse
- Tænd nano-printeren og luftfugtigheden.
- Til vaskebufferen og befugtningen skal du fylde med DI vand. Tøm vaskeflasken (afløb) og befugtningsfælde carboy ( Supplerende Figur 7A ).
- Indstil befugteren til70% fugtighed og startbefugtning.
- Rens alle stifter inden udskrivning. Forbered 50 ml varm (65 ° C) rensepinde rensningsopløsning (15 g rensespids rengøringsreagens og 50 ml 65 ° C vand, blandes grundigt, indtil det faste reagens opløses helt).
- Påfør rengøringsopløsningen på hvert spidsspids ved at dyppe pinpipebørsten (fint) ind i spidsrengøringsopløsningen og børste overfladen af hvert spidsspids.
BEMÆRK: Pin-tip rengøringsopløsning er ætsende og giftig. Sørg for, at du altid bruger handsker og sikkerhedsbriller, når du bruger denne løsning. Soaking pins i pin-tip rengøring opløsning i mere end et par minutter kan resultere i permanent pin skade. - Fyld ultralydsbadet med 1 liter destilleret vand, og sæt tappene i et flytbart stifterestativ i badet. Sonikere i 5 minutter og fjern stifterne. Lad tørre og forsigtigt tørre med specielle klud til rengøring.
- Påfør rengøringsopløsningen på hvert spidsspids ved at dyppe pinpipebørsten (fint) ind i spidsrengøringsopløsningen og børste overfladen af hvert spidsspids.
- Åbn "Microarray Manager" printEr software; Ved tilslutningen indstilles printerens lys (rød / grøn). Tryk på "Stop" | "Clear" | "Init" ( supplerende figur 7B , trin 1-3); Printhovedarmen vil derefter nulstille X, Y, Z-indstillingerne.
- For at indlæse tappene i skrivehovedet skal du trykke på "Load" ( Supplerende figur 7B , trin 4) og læg tappene i skrivehovedet i overensstemmelse med den definerede konfiguration af print / pin værktøjslayout ( Supplerende Figur 7C ). Dette layout bruger 4 stifter, hver udskrivning 4 sub-arrays på hvert dias for at få i alt 16 sub-arrays pr dias ( supplerende figur 1A ). Når du har anbragt stifterne, skal du trykke på "Init" igen.
- Saml diaserne på arraydækket. Åbn glidekassen og rengør hvert objektglas ved at blæse nitrogen med høj renhed. Anbring det ønskede antal dias på array-platformen. Hold gliderne med to fingre i nederste hjørner, og sæt glidestykket ind i detposition. Hold de to højre hjørner og skub de venstre hjørner forsigtigt, indtil glidestykket passer godt ind i sin position. Skub forsigtigt mod venstre nederste hjørne for at sikre en tæt pasform ( Supplerende Figur 7D ).
- Rengør præ-blokglaset med destilleret vand, 70% ethanol og 100% ethanol, og lad det lufttørre (brug kun dedikerede rengøringsservietter). Placer præ-blokglaset i sin position på dækket.
- Fyld et sonicatorbad ( Supplerende Figur 7B ). Tryk på "Fyld" i 55 s, og tryk derefter på "OK". Afløb sonicatoren ved at klikke på "Afløb" i 20 s og tryk derefter på "OK". Gentag påfyldningen og drænet igen og derefter fylde igen i 55 s.
- Fyld vaskebadet ( Supplerende Figur 7B ): Tryk på "Prime" i 40 s og tryk derefter på "OK".
- Placer 384-brøndspladen med alikvoterede prøver i dens placering på arraydækket, og fjern parafilmdækslet.
- Når udskrivningen er færdig, skal du tømme sonicatorbadet ( Tillæg Figur 7B ) og slukke for befugteren.
- Lad gliderne tørre på arraydækket i 16-24 timer uden befugtning.
- Nummer diasene med en alkohol / opløsningsmiddelresistent mærkepenne og opbevar dem i en vakuumforseglet boks i mørket.
5. Behandling og udvikling af arrays
- Tag et dias ud af den vakuumforseglede boks, og læg den i en kemisk hætte i 5 minutter, array opad for at fordampe den overskydende væske.
- Scan glideren med den højeste forstærkning (950 PMT) for at sikre, at alle pletterne er blevet udskrevet.
- Fortsæt med den kemiske blokering af epoxygrupper på objektglasset
- Tilbered 50 ml ethanolaminblokerende opløsning (0,1 M Tris-HCI, pH 8 og 0,05 M ethanolamin). Bland 140 ml DIW med 8,8 ml Tris-HCI (1,7 M, pH 8) og 0,45 ml ethanolamin (16,6 M). Overfør til en 50-mL farvningsrør ( supplerende figur 8A ) og varm til 50 ° C.
- Hydrater glideren. Placer diaset i et farvningsrør fyldt med DIW, dækk det med folie, og inkuber i 5 minutter med langsom og forsigtig rystning ved stuetemperatur.
- Bloker de reaktive epoxygrupper på diaset. Dyp diaset i 50 ml farvningsrøret fyldt med forvarmet ethanolaminblokerende opløsning, dække med folie og inkuber i 30 minutter med langsom og forsigtig rystning ved stuetemperatur.
- Kassér ethanolaminblokeringsopløsningen i den passende beholder til binære affaldsbeholdere og læg glideren i et nyt, rent farvningsrør fyldt med 50 ° C DIW. Dæk med folie og inkuber i 10 minutter med langsom og forsigtig rystning ved stuetemperatur.
- Kassér vandet og overfør diasene til en glasfarveholder ( Supplerende figur 8B ). Placer glasfarveholderen i en svingpladeholder, og centrifuger tørringen i 5 minutter ved 200 xg og RT.
- Placer diaset på en 16-brønds deler ( Supplerende Figur 8C ).
- Forbered PBST vaskeopløsning: 50 ml phosphatpufret saltopløsning (PBS), pH 7,4 + 0,1% Tween-20.
- Forbered biologisk blokeringsopløsning (PBS-OVA): 5 ml PBS, pH 7,4 + 1% kyllingalvalbumin (10 mg / ml).
BEMÆRK: Valget af blokeringsreagens er kritisk for succesen med påvisning af anti-Neu5Gc-antistoffer. Ovalbumin er lavet hos kyllinger, som som mennesker ikke kan syntetisere Neu5Gc, hvilket forårsager mangel på udtryk for denne Sia. Til påvisning af Neu5Gc kan selv mindre forureninger dramatisk reducere analysens følsomhed, nogle gange endog ikke at detektere nogen anti-Neu5Gc-reaktivitet. For eksempel indeholder det mest almindeligt anvendte blokeringsreagens, bovint serumalbumin (BSA), selvom det ikke er glycosyleret i sig selv, kvæg-IgG-forureninger, der bærer Neu5Gc-enheder og konkurrerer derfor wI trykte glycaner, når de bindes til prøve med anti-Neu5Gc antistoffer 19 , 20 . - Forbor brøndene. Brug en multi-pipette, alikvot 200 μl PBST i glidebroerne, placer dem i et dækket fugtigt kammer og ryster i 5 minutter.
BEMÆRK: Fugtkammeret er en glasskuffe med et vådt håndklædepapir, dækket af nylonfolie og folie for at beskytte prøverne mod lys. - Fjern PBST ved at flette og trykke forsigtigt på et rent papirhåndklæde og alikvot 200 μl PBS-OVA blokeringsbuffer i hver brønd. Placer i et fugtigt kammer og inkuber i 1 time ved stuetemperatur ved forsigtig omrystning.
- Forbered primærdetektion fortyndet i PBS-OVA-blokeringsbuffer som angivet i tabel 2 .
BEMÆRK: Ved kvalitetskontrol (QC) af denne sialoglycan-mikroarray anvendes flere Sia-bindingsproteiner: Sambucus nigra lectin (SNA), isoleret fra elderbærbark, forventes at genkende Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis Lectin II (MALII) forventes at genkende Siaa23; Og kylling anti-Neu5Gc IgY forventes at genkende alle Neu5Gc-holdige sialoglycaner. Derudover brug forskellige humane sera prøver til profil anti-Neu5Gc IgG respons. Koncentrationen af lectiner / antistoffer / sera bør kalibreres eksperimentelt. - Flip tør PBS-OVA blokeringsbuffer og tilsæt 200 μL primært antistof pr. Brønd (mindste volumen pr. Brønd: 70 μl), inkuber i et fugtigt kammer i 2 timer.
- Flick tørre den primære påvisning og vask 4 gange med PBST (mellem 3. og 4. th vask inkuberes objektglasset i PBST i 5 minutter i den fugtige kammer). Vask en gang med PBS.
- Forbered det sekundære antistof i PBS som angivet i tabel 2 .
- Flick tørre PBS og tilsæt 200 μL sekundært antistof. Inkubér i 1 time ved stuetemperatur med rystning.
- Flick tør det sekundære antistof og vask fire gange med PBST (mellem 3rd og 4. vask, inkuber glideren i PBST i 5 minutter i den fugtige kammer).
- Fjern forsigtigt rammen og læg gliderne i et 50 ml lysrør fyldt med PBS og ryst i 5 min.
- Fyld to diasfarvningsbadekar ( supplerende figur 8D ) med DIW, sæt glideret ind i glideholderen, og dypp det inde i badet. Dyk hurtigt 10 gange og overfør derefter til det andet bad og dip 10 gange mere. Inkubér i 10 minutter ved stuetemperatur ved omrystning.
- Kassér vandet og overfør objektglaset til en glasfarveholder ( Supplerende figur 8B , lad glideren lufttørre). Placer glasfarveholderen i en svingpladeholder, og centrifuger tørr glideren i 5 minutter ved 200 g og RT.
- Scan lysbilledet og opbevar det derefter i en vakuumforseglet boks i mørket.
6. Array scanning og data analyse
- Åbn fluorescerende dias scanner og lad den varme i 5 min. ÅbnScanning og analyse af software.
- Indstil scanningsparametrene ( Supplerende Figur 9A ): Scan ved 532 nm og 100% strøm med en forstærkning på 350 PMT, med en linje til gennemsnittet og en 0 μm fokusposition. Brug en opløsning på 10,0 μm pixelstørrelse.
BEMÆRK: Scanningsparametre kan justeres til forskellige diasetyper, fluorescens og opløsning. - Scan den udviklede dias. Åbn scannerdøren og læg glideren inde, array vendt nedad. Start scanning (grøn "Play" -knap på menuen til software navigationspanel, Supplerende figur 9B ).
- Gem de scannede dias som en tiff-fil.
- Klargør dias til analyse. Vælg "Load array list" og upload den relevante GAL-fil, der kortlægger arrayerne i hver blok på objektglasset ( Supplerende figur 9C ).
BEMÆRK: GAL-filen indeholder oplysninger om både identiteten og placeringen (X, Y) for hvert punkt på diaset. Denne fil kan oprettesVed hjælp af printersoftwaren, der eksporterer en faneafgrænset tekstfil baseret på eksempler identiteter i 384 brønds kildeplade og det definerede udskriftsdesign. - Indstil justerings- og analyseparametrene. Tryk på "Option" -knappen på menuen Software Navigeringspanel ( Supplerende Figur 10 ).
- Definer justeringsparametrene. Find cirkulære funktioner, resize funktioner under justering med 50 - 350%, begrænse funktionsbevægelse til en maksimal oversættelse på 40 μm, unflag funktioner, der mislykkes baggrundstærskel (CPI tærskel 0), estimere indpakning og rotation når du finder blokke og automatiser billedregistrering (10 pixels) ( Supplerende Figur 10 ).
- Definer analyseparametrene: W1 / 532 forhold, normal standardafvigelse, analyser fraværende funktioner og baggrundsintertraktion. Klik på "Vælg" og derefter "Local feature background median" og indstil 2 pixels for at udelukke og en 3 pixel bredde af baggrunden. Tryk på "OK". seT scannermætningsniveauet til standard ( Supplerende Figur 10 ).
BEMÆRK: Baggrundsubtraktionsmetoden afhænger af det eksperimentelle design og kan ændres efter specifikke behov. - Juster funktionerne kortene. Indstil programmet i blokmodus (tryk på "B"), vælg alle blokke (Ctrl + A), positioner matrixkortnettet, og juster alle blokke (Alt + Skift + F7) ( Supplerende Figur 11 ).
- Definer funktionstilpasningen i hver blok. Zoom (tryk på "Z" for at komme ind i zoom-modus) i den øverste venstre blok, tryk "B" igen (blokmodus), og tryk på rutenettet for denne blok. Flyt kun gitteret til denne blok, indtil det justeres perfekt med blokspots og tryk F5 for at justere funktionerne i denne valgte blok. Gentag gitterbevægelsen og F5 justeringen, indtil pletterne er helt cirkulerede. Gør det samme for hver af de 16 blokke, indtil alle net er på plads.
- Analyser og gem dataene. Vælg alle blokke (Crtl +A) og derefter analysere dataene (Alt + A). Gem analyseresultaterne (Ctrl + U) som en .gpr-fil.
- Åbn den gemte .gpr-fil i et regnearksprogram og analyser intensiteten af hvert punkt baseret på fluorescens efter lokal baggrundsundertrækning (F532-B532).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Array Udskrivning, udvikling og analyse:
Udskrivning af en sialoglycan-mikroarray med flere glycanprøver og humane IgG STD-kurver i 16 forskellige blokke kræver grundig kalibrering for at sikre, at alle prøver udskrives så ensartet som muligt i alle 16 blokke pr. Dias og til alle dias i samme print runde. Derfor kræves der flere kalibreringsforsøg, inden de specifikke trykparametre bestemmes, herunder buffersammensætning for hver type prøve, glidetype og fremstilling, 384 brøndspladetype, fugtighedsniveauer, prøvevolumen i 384 brøndspladen, præmængde -printing for hver type prøve, humane IgG STD-kurvekoncentrationer og markørtype. Holdbarheden af sådanne trykte sialoglycan array slides blev valideret til at vare i op til 10 måneder i en vakuumforseglet kasse i mørke ved stuetemperatur. I hvert udskrivningseksperiment er ensartethedYderligere overvåges og valideres gennem kvalitetskontrolforsøg under anvendelse af Sia-bindende lectiner og antistoffer. Udviklings- og scanningsprotokollerne blev optimeret for at opnå ensartethed og nøjagtighed ved at sammenligne prøver inden for og mellem dias fra samme print runde. Slidesne er udviklet med 16-brøndsdeleren, som sikrer den korrekte adskillelse mellem blokke ved hjælp af optimerede blokeringsforhold (kemiske og biologiske), vaske og inkubationstider. Den primære og sekundære detektion var i vid udstrækning blevet kalibreret for at sikre maksimal detektion med minimal baggrund og ikke-specifik binding. Ved dias scanning og analyse blev outputresultater overført til en regnearkfil og analyseret for at bestemme detektionen i hvert sted. Hvert punkt blev udsat for en outlier-kontrol og udeladt, hvis den ikke opfyldte QC (hvis% CV er> 20, og stedet er uden for en standardafvigelse væk fra gennemsnittet af de fire replikater). Så den gennemsnitlige signalintensitet afteR blev subtraktionen af lokal baggrund målt i gennemsnit for replikationspunkter pr. Prøve for at generere det relative fluorescensenhed (RFU) datapunkt pr. Trykt prøve. Når ensartetheden af IgG STD-kurverne blev valideret i alle testede blokke, blev RFU-værdierne normaliseret i ng / μL IgG, hvilket muliggør en bedre sammenligning af prøver inden for og mellem eksperimenter.
Sia-bindende High-throughput Assay:
Sialoglycan arrays kan bruges til at detektere determinanter ( fx proteiner, lectiner, antistoffer, vira, etc. ), der binder Sia-holdige glycaner. For QC efter udskrivning anvendes Sia-bindende plantelektiner og anti-Neu5Gc IgY 19 . SNA binder α2-6-bundet Sia, MALII binder α2-3-bundet Sia, og anti-Neu5Gc IgY binder Neu5Gc-holdige sialoglycaner, men binder ikke Neu5AC-indeholdende sialoglycaner 19 , som vist i figur 2A . QC-eksperimentet sigter mod at validere spotprint og identitet og manglen på variabilitet mellem de trykte blokke ved hjælp af de fire forskellige stifter. Blok-til-blok-variabilitet overvåges ved at udvikle fire blokke for hver primær detektion pr. Dias og ved at sammenligne blokke, der blev trykt med hver af de fire ben med den samme primære detektionsdel. Der foretages en sammenligning for at sikre, at der ikke er nogen store forskelle.
Humane sera indeholder forskellige anti-Neu5Gc antistoffer 6 med implikation for forskellige humane sygdomme 2 , 21 , 22 , 23 . For at evaluere sialoglycan-genkendelse i humant sera IgG blev 12 sera fra raske humane donorer analyseret på den trykte sialoglycan-micrOarray og udviklet ved anvendelse af fluorescensmærkede anti-humane IgG ( figur 2B ). Hver trykt blok indeholder en human IgG STD-kurve, som er sammenlignelig og homogen i alle blokke ( figur 2C ). Først efter valideringen af kvaliteten af STD-kurverne i hver blok ( figur 2C ) resulterer glycan-punkter normaliseret i henhold til hældningen i blokken og multipliceres derefter med fortyndingsfaktoren. Som vist i figur 2B indeholder alle testede humane sera forskellige niveauer af anti-Neu5Gc IgG, med næsten ingen genkendelse af de matchede par af Neu5Ac-holdige sialoglycaner. Desuden er anti-Neu5Gc IgG-genkendelsesmønstre meget forskellige mellem disse 12 forskellige sera, både i intensitetsniveauet og i mangfoldigheden.
Figur 1: OversigtAf Array Udskrivning, Udvikling og Billedanalyse. ( A ) Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2 er vist som en repræsentativ Neu5Gc-containg Sia-glycan, med en primær amin, der er trykt på epoxy-coatede glasskinner. ( B ) Trykte arrays udvikles med forskellige Sia-bindende proteiner efterfulgt af påvisning med et passende fluorescensmærket sekundært antistof. Hver undergruppe kan udvikles individuelt. ( C ) Scanning af det probede dias i en fluorescensscanner genererer et billede, der analyseres yderligere ved hjælp af scannerbilledsoftwaren. Underarrayerne er overlejret med et gitter kortlægning hvert sted på arraysne og fluorescens detekteret for hvert sted. Resultaterne overføres derefter til en regnearkfil. Et enkelt array i en enkelt brønd er skematisk repræsenteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Profiler af Sialoglycan Microarrays Brug af forskellige Sia-bindende Proteiner.
Slides blev udviklet med 16 forskellige primære detektionsdele, en i hver blok. ( A ) Repræsentativ 3 blokke af en QC-dias, der viser bindingsmønstrene af de Sia-specifikke plante-lectiner SNA og MALII og polyklonale monospecifikke kylling anti-Neu5Gc IgY. Resultaterne er præsenteret som RFU i Heatmap format for hver enkelt blok (rød, hvid og blå, der repræsenterer 100 th, 50 th, og 0 percentil, henholdsvis). ( B ) 12 forskellige sunde humane sera blev testet ved en 1: 100 fortynding og påvist med anti-huamn IgG til profil anti-Neu5Gc IgG-reaktivitet. RFU-data blev normaliseret til ng / μL ved at dividere hver værdi med IgG STD-kurvehældningen i hver specifik blOck og derefter multipliceret med fortyndingsfaktoren. Dataene er repræsenteret i Heatmap format for alle blokke tilsammen (rød, hvid og blå, der repræsenterer te 100 th, 50 th, og 0 percentil henholdsvis). ( C ) Human IgG STD-kurver af de 12 blokke udviklet med humane sera, der var blevet brugt til normalisering af dataene. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Glycan ID | Struktur | |||
| 1 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 2 | Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 </ sub> NH2 | |||
| 3 | Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 4 | Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 5 | Neu5Acα6GalNAcαO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 6 | Neu5Gcα6GalNAcαO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 7 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 8 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 9 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 10 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 11 | Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 12 | Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 13 | Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 14 | Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 15 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 16 | (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 17 | Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 18 | Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 19 | Neu5Acα6Galβ4GlcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 20 | Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 21 | Neu5Acα3Galβ4GlcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 22 | Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 23 | Neu5,9Ac 2 α6GalNAcαO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 24 | Neu5Gc9Acα6GalNAcαO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 25 | Neu5Acα3GalβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 26 | Neu5Gcα3GalβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 27 | Neu5Acα6GalβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 28 | Neu5Gcα6GalβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 29 | Neu5,9Ac 2 α3GalβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 30 | (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 31 | Neu5,9Ac 2 α6GalβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 32 | Neu5Gc9Acα6GalβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 33 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 34 | Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 35 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 36 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | ||||
| 38 | Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 39 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
| 40 | Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO (CH2) 2CH 2 NH2 | |||
Tabel 1: Liste over trykte glycaner.
| Primær / Sekundær | Antistof / Lectin | Lager koncentration | Specificitet | Arbejdsfortynding / koncentration |
| Primær detektion | Biotinyleret-MALII | 1 mg / ml | Sialinsyre i a2-3-binding | 1:50, 20 μg / ml |
| Biotinyleret-SNA | 2 mg / ml | Sialinsyre i a2-6-binding | 1: 100, 20 μg / ml | |
| Kylling anti-Neu5Gc IgY | ND | Neu5Gc sialinsyre | 1: 7.000 | |
| Humant serum | 100% | Talrige epitoper | 1: 100 | |
| Sekundær detektion | Cy3-Streptavidin | 0,75 mg / ml | Biotin | 1: 500, 1,5 μg / ml |
| Cy3-anti kylling IgY | 0,75 mg / ml | Kylling IgY | 1: 2000, 0,375 μg / ml | |
| Cy3-anti humant IgG H + L | 0,6 mg / ml | HumaN IgG | 1: 1500, 0,4 μg / ml |
Tabel 2: Liste over primære og sekundære detektionsproteiner.
Supplerende figurer: Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En vellykket glycan microarray-fremstilling kræver omhyggelig planlægning og indeholder flere vigtige trin i protokollen. Disse omfatter: (1) planlægning af blok- og pladelayouterne, der definerer alle efterfølgende parametre ( f.eks. Afstande, afstand, antal prøver og udskrivning); (2) rensning af stifterne og sikring af pin integritet, hvilket er kritisk for styring af spot homogenitet; (3) opretholdelse af høj luftfugtighed under tryk, hvilket er kritisk for at undgå prøveinddampning under lange printkørsler, hvilket kan kompromittere spothomogenitet; (4) Valg af korrekte justerings- og analyseparametre, som kan påvirke resultaterne ( fx baggrundsintertraktionsmetode, tærskel og spotstørrelse fleksibilitet).
Metoden kan ændres yderligere for at opfylde specifikke eksperimentelle design og mål. For eksempel kan forspottingsnummeret modificeres for bedre at passe til hver type materiale, der skal udskrives på arrayet. Stiftvasketrin underPrint kan optimeres til at passe forskellige trykte materialer, med enten kortere eller forlængede vaskecykler. Desuden kan antallet af pletter, der udskrives pr. Dip, ændres til at omfatte flere eller færre pletter, men kræver separat kalibrering for hver type materiale, der anvendes på arrayet. Typen af fluorescensmarkøren og dens koncentration kan modificeres, så længe den indeholder den rette kemiske gruppe til konjugering ( dvs. primær amin til epoxy-coatede dias). Koncentrationerne og typerne af STD-kurver kan udvides ( fx human / mus / anden organisme IgG, IgM, IgA, etc. ). Bufferbetingelser kan optimeres for at passe forskellige materialer, der fortrinsvis mangler materialer med primær amin for at undgå ikke-specifik binding til arrayet, hvilket ville medføre øget baggrund. Det er vigtigt, at det biologiske blokeringsreagens skal være fri for Neu5Gc ( f.eks. Undgå BSA amd-mælk), da det kan reducere Neu5Gc-sialoglycan-detektion og jegNcrease baggrund 19 , 20 . Primær og sekundær detektionskoncentrationer bør optimeres for at undgå høj baggrund og ikke-specifik binding. Desuden kan scanningsparametre ( fx strøm, forstærkning og opløsning) ændres for at reducere baggrunden eller forbedre lave signaler. Endelig kan justerings- og analyseparametre ændres for at passe til høj baggrund eller forskelligt formede egenskaber. Yderligere informationer og retningslinjer vedrørende de anbefalede standarder for rapportering af glycan microarray data er for nylig blevet beskrevet af MIRAGE-initiativet 17 , som i sidste ende kan lette dataudveksling og fortolkning.
Sammenfattende tilvejebringer glycan-mikroarrays et robust værktøj til undersøgelse af glykan-biomolekyl-interaktioner og kan tilpasses forskellige biologiske prøver. Anti-Neu5Gc antistoffer spiller forskellige roller i human sygdom 23 . For eksempel i kræftAnti-Neu5Gc antistoffer spiller dobbelt roller: på den ene side tjener de som potentielle biomarkører, men på den anden side tjener de som potentielle terapeutiske midler 7 , 21 , 24 . Disse antistoffer bidrager også til forværringen af aterosklerose 25 , effektiviteten af xenotransplantation 20 , 26 og virkningen af glycosylerede bioterapeutika 27 . Således er profilering af anti-Neu5Gc-antistoffer i forskellige humane prøver af voksende interesse, og analyser med høj gennemstrømning, som den her beskrevne, kan bidrage til at fremme vores forståelse af deres roller i menneskers sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af en Research Career Development Award fra Israels Kræftforskningsfond, et tilskud fra det israelske nationale nanoteknologiske initiativ og Helmsley Charitable Trust for et fokalt teknologisk område for nanomedicin til personlig terapeutisk medicin (VP-K) og nationalt Institutter for sundhedsbidrag R01GM076360 (til XC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
