Summary
시알로 글리 칸 마이크로 어레이 분석은 인체 혈청에서 항 -Neu5Gc 항체를 평가하는 데 사용될 수있어 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에 대한 잠재적 인 고효율 진단 분석법이됩니다.
Abstract
세포는 일반적으로 암에서 변형되고 시알 산 (Sia) 발현의 변화를 포함하는 탄수화물 사슬 (glycans)의 외투로 덮여 있습니다. 이들은 9 탄소 백본을 가지고 있으며 세포 표면에 척추 동물의 glycan을 캡핑하는 산성 당입니다. 포유 동물의 주요 Sia 형태 중 두 가지는 N- 아세틸 뉴 라민 산 (Neu5Ac)과 N- 히드 록 실화 형태 인 N- 글리콜 노 뉴라민 산 (Neu5Gc)입니다. 인간은 cytidine 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH)를 암호화하는 유전자의 불 활성화 때문에 내인성 Neu5Gc를 생성 할 수 없다. 외래 Neu5Gc는 붉은 육류 및 유제품의식이 섭취를 통해 인간 세포에 의해 획득되고 이후 세포 표면의 다양한 글리 칸에 주로 나타나 암종에 축적됩니다. 결과적으로 인간은 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에서 다양한 역할을하는 순환 Neu5Gc 항체를 가지고 있으며 잠재적 인 진단 및 치료제가되고있다rgets. 여기, 우리는 인간 항체에서 이러한 안티 Neu5Gc 항체를 평가하는 높은 처리량 sialoglycan microarray 분석을 설명합니다. Neu5Gc 함유 글리 칸과 각각 일치하는 대조군 쌍 (Neu5Ac 함유 글리 칸)은 각각 핵심 1 차 아민과 함께 에폭시 코팅 유리 슬라이드에 공유 결합되어 있습니다. 우리는 인쇄 당 최대 896 개의 어레이를 생성 할 수있는 특정 나노 프린터를 사용하여 16- 웰 포맷으로 56 개의 슬라이드를 인쇄하는 것을 예시합니다. 각 슬라이드는 안티 Neu5Gc 항체 특이성, 강도 및 다양성의 평가를 위해 16 개의 다른 인간 혈청 샘플을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜은이 견고한 도구의 복잡성을 설명하고 배열 형식으로 다양한 임상 샘플에서 Neu5Gc식이 탄수화물 항원에 대한 반응을 조사하고자하는 사람들을위한 기본 지침을 제공합니다.
Introduction
Sias는 척추 동물의 세포 표면 당 단백질과 당지질의 글리 칸 쇄를 덮는 산성 당입니다. Sia 발현은 암세포 1 에서 변형되고 진행 및 / 또는 전이와 관련이있다 2 , 3 . 포유 동물의 주요 시아 형태의 두 Neu5Ac 및 수산화 형태, Neu5Gc 2이다. 인간은 CMAH 효소를 암호화하는 유전자의 특정 불활 화 때문에 Neu5Gc를 합성 할 수 없다. 이 비인간적 인 Sia는 Neu5Gc가 풍부한식이 요법 ( 예 : 붉은 고기)에서 유래하여 "자기"로 인간 세포에 대사 적으로 결합합니다 4 , 5 . Neu5Gc는 인간 상피와 내피의 세포 표면에 낮은 수준으로 존재하지만 특히 암종에 축적됩니다. Neu5Gc는 인체 체액 성 면역계에 의해 외국으로 인정됩니다 2 , 6 .Neu5Gc 글리 칸의 항원 복잡성은 모든 인간 6 항 Neu5Gc 항체 반응의 복잡성에 의해 반사, Neu5Gc 수정, 연결, 기본 글리 칸과 비계, 그 밀도 등의 여러 수준에서 발생할 수 있습니다. 이러한 항체의 일부는 암 바이오 마커 및 잠재적 immunotherapeutics (7)의 역할을한다. 다른 sialoglycans (8)의 화학 효소 적 합성의 출현 당쇄 마이크로 어레이 기술 (9) (10)의 사용에 의해 용이 항체의 더 심도 깊은 분석을위한 방법을 닦았다. 따라서, 천연 및 합성 탄수화물의 큰 도서관의 촉진 준비와 조작으로, 글리 칸 마이크로 어레이는 생체 분자 (10), (11)의 무수히 많은 탄수화물의 상호 작용을 조사하기위한 강력한 높은 처리량 기술이있다, 12 , 13 . 배열 형태로, 최소량의 물질이 사용되며, 생물학적으로 관련이있는 글리 칸의 다가의 디스플레이는 단일 실험에서 수천 개의 결합 상호 작용을 조사 할 수 있습니다. 중요한 것은,이 기술은 바이오 마커 발견 및 12, 다양한 시료 7에 대한 면역 반응을 모니터링에 적용될 수있다.
성공적인 glycan microarray 제작에는 3 가지 중요한 측면, 즉 프린터 로봇 유형, glycan 접합 화학 및 검출 광학을 고려해야합니다. 인쇄 기기 고려 사항에 관해서는 접촉 및 비접촉식 프린터의 두 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 접촉 프린팅에서 1-48 강철 핀을 글리 칸 용액이 들어있는 멀티 웰 원판에 담궈 유리 슬라이드 표면에 직접 접촉시켜 관능 화 된 유리 슬라이드에 얼룩을지게합니다. 솔루션 금액 de슬라이드에 생존하는 것은 슬라이드 표면의 느린 지속 시간의 함수입니다. 일반적으로 샘플은 슬라이드 표면에 인쇄되기 전에 먼저 유리 블록 (균질 한 지점에 도달하기 위해)에서 미리 얼룩을지게됩니다. 비접촉식 프린터 ( 예 : 압전기 프린터)에서 글리 칸은 제어 된 전기 신호를 사용하여 유리 모세관에서 인쇄됩니다. 접촉 식 인쇄에 비해 더 정밀한 인쇄를 달성하기 위해 전기 신호를 미세하게 조정할 수 있습니다. 스폿의 크기와 형태 또한 비교적 균질합니다. 추가적인 이점은 인쇄 후 시료를 원판에 재활용하는 것입니다. 그럼에도 불구하고 피에조 전자 프린터의 가장 큰 단점은 인쇄 팁 제한 (4 또는 8)으로 매우 긴 인쇄 시간을 초래하며 슬라이드 안정성, 온도, 습도 및 샘플 증발에 특별한주의가 요구됩니다. 비접촉식 잉크젯 프린터에는 더 큰 샘플 용적이 필요합니다 14 .
10 , 11 , 12 , 13 으로 다중 고정화 방법이 개발되었다. Uninitiate를위한 인쇄 된 glycan microarray 기술에 관한 매우 자세한 정보는연구원은 훌륭한 리뷰 13 , 15를 참조하십시오. 중요한 것은 글리코 믹스 실험 (MIRAGE) 이니셔티브에 대한 최근의 최소 필요한 정보는 샘플 준비 (16)과이 성장하는 분야의 표준을 개선하기 위해 (17)을 분석 글리 칸 마이크로 어레이 데이터를보고하기위한 지침을 설명합니다.
여기, 우리는 16 웰 형식의 특정 연락처 나노 프린터를 사용하여 sialoglycan microarrays의 제조에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 각 글리 칸은 에폭시 활성화 유리 슬라이드에 대한 공유 결합을 매개하는 1 차 아민을 가지고 있습니다. 우리는 또한 다양한 인간 혈청 시료, 항체 및 Sia 결합 식물 렉틴을 사용하여 한 슬라이드의 개발과 분석을 설명합니다. Sialoglycan 마이크로 어레이 분석은 어레이 제조, 프로세싱, 개발 및 분석을 포함한 몇 가지 주요 단계를 포함합니다. 어레이 제작에는 ar 계획이 필요합니다.나노 그리드 및 소스 플레이트 준비, 나노 프린터 프로그래밍, 슬라이드 인쇄 등의 작업을 수행 할 수 있습니다. 이어서 슬라이드를 처리, 개발 및 분석합니다 ( 그림 1 ).
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Protocol
인체 혈청 샘플은 이스라엘 혈액 은행 (Israeli Blood Bank)에서 얻은 것이며 헬싱키 선언 및 Tel Aviv University Institutional Review Board에 따라 사용되었습니다.
1. 어레이 제조 계획 및 레이아웃
- 슬라이드 레이아웃을 결정하십시오.
참고 : 각 슬라이드에는 B1 ~ B16으로 번호가 매겨진 16 개의 동일한 블록으로 분할 된 16 개의 하위 어레이가 포함됩니다 ( 그림 1B , 보충 그림 1A ). - 핀 배치를 결정하십시오. 슬라이드마다 4 개의 하위 배열 (블록)을 인쇄하는 4 개의 핀을 사용하십시오.
핀 1은 블록 1, 2, 9 및 10을 인쇄하고,
핀 2는 블록 3, 4, 11 및 12를 인쇄합니다.
핀 3은 블록 5, 6, 13 및 14를 인쇄합니다. 과
핀 4는 블록 7, 8, 15 및 16을 인쇄합니다 ( 보충 그림 1A ). - 블록 및 384 웰 플레이트 레이아웃을 결정하십시오.
참고 : 글리 칸이 각 블록에 나타나는 순서는주의 깊은 계획이 필요합니다. 이 예제에서 arr4 개의 복제본으로 각 샘플을 인쇄하고, 오른쪽 하단 모서리 (형광 분석을 용이하게하기 위해)에 형광 마커 스폿을 디자인하고, 증가하는 농도로 표준 곡선 IgG (STD) 스폿을 인쇄합니다 ( 보충 그림 1B ).- 인쇄 된 각 스폿에 대해 먼저 384 웰 플레이트에 4 개의 웰 (각 핀 당 하나)에 재료를 분배합니다.
참고 : 384 웰 플레이트의 재료 순서는 설계된 블록 레이아웃 ( 그림 1B-C )에 달려 있습니다.
- 인쇄 된 각 스폿에 대해 먼저 384 웰 플레이트에 4 개의 웰 (각 핀 당 하나)에 재료를 분배합니다.
2. 글리 칸 및 소스 플레이트의 제조
- 글리 칸 인쇄 버퍼 (300 MM 인산 완충액, 산도 8.4 50 ML)를 준비합니다. 모노 소듐 포스페이트 모노 하이드레이트 58.5 mg의 (에 NaH 2 PO 4 .1H 2 O)과 40㎖의 탈 이온수 (DIW)의 인산 나트륨 수화물 (NA 2 HPO 4 · 7H 2 O) 3.9 g을 계량. 4 M NaOH를 사용하여 pH 8.4로 적정한다. 볼륨을 50 mL로 조절하십시오.0.2 μm 멤브레인을 통해 여과하여 살균합니다.
- 표지 버퍼 (187 MM 인산 버퍼 50 ML, 산도 5)를 준비합니다. 모노 소듐 포스페이트 모노 하이드레이트 289 mg의 (에 NaH 2 PO 4 .1H 2 O)과 DIW 40 ㎖의 인산 나트륨 수화물 (NA 2 HPO 4 · 7H 2 O)을 1.94 g을 단다. 1 M HCl을 사용하여 pH 5로 적정한다. 50 ML에 볼륨을 조정하고 멸균 0.2 μm의 멤브레인을 통해 필터.
- STD 곡선 버퍼 (50 % PBS - 글리세롤 : 100 % 글리세롤 주식에서 10 % 글리세롤을 보충 한 인산염 완충 식염수, 인산염 완충 식염수)를 준비하고 멸균을 위해 0.2 μm 멤브레인을 통해 걸러냅니다.
- DIW 10 MM에서 각 glycan 주식 솔루션을 준비합니다. 역상 고압 액체 크로마 토 그래피 분석 18 에서 형광 검출에 의해 시알 릴화 glycan 농도를 확인하십시오.
- glycan 인쇄 버퍼의 100 μL 총 볼륨 100 μM 각 glycan을 희석microcentrifuge 관에서.
- 형광 염료가 포함 된 1 급 아민을 준비하십시오. Alexa 555- 히드라 지드를 마커 버퍼로 1 mg / mL로 용해시킨 다음 1 mL 총 부피에서 1 μg / mL로 희석하십시오.
참고 : 다른 모든 1 급 아민 함유 염료는 슬라이드 스캐너에 따라 적절한 파장으로 사용할 수 있습니다.
참고 : 마커 스폿은 분석하는 동안 각 블록에서 격자 정렬을 용이하게합니다. - 인간 IgG STD 곡선 희석을 준비하십시오 : STD 곡선 버퍼에서 160 ng / μL에서 인간 IgG의 원액 0.5 mL를 준비하십시오. 연속적으로 주식을 1 : 1로 6 번 희석하여 80, 40, 20, 10, 5 및 2.5 ng / μL를 얻으십시오. 모두 STD 곡선 버퍼에 200 μL를 넣으십시오.
참고 : 실험에 적합하다면 다른 Ig 이소 타입을 사용할 수 있습니다 ( 예 : 인간 IgA, IgM, IgE 또는 다른 유기체의 Ig). - 얼음에 384 잘 접시를 놓습니다. 전자 멀티 피펫을 사용하여 각 글리 칸, 마커 및 STD 곡선의 7 μL 분량 IgG - 4 복제( 그림 1C ). 정확성을 높이기 위해 각 시료 35 μL를 적재하고 시료의 4 개 웰 각각에 7 μL를 분주하십시오. 원래의 튜브에 각 glycan의 나머지 7 μL를 다시 놓습니다.
- 플레이트를 파라 필름으로 덮고 250g 및 12 ° C에서 2 분 동안 스핀 다운합니다. 빛으로부터 보호 된 실온 (RT)에 판을 놓습니다. 실내 습도가 60-70 %에 도달하기 전에 판을 꺼내지 마십시오.
3. 나노 프린터 프로그래밍
- "Microarray Manager"소프트웨어를 엽니 다. "메서드 속성"창을 사용하십시오.
- 작업 테이블 레이아웃 설정 : "56 슬라이드 구성"을 선택하십시오.
참고 :이 슬라이드는 56 개의 슬라이드를 인쇄 할 수 있도록 미리 정의 된 구성입니다. 각 유형의 판, 핀 및 인쇄 형식을 보정하십시오 ( 추가 그림 2 , 1 단계). - "핀 구성"을 선택하십시오.| "핀 공구 1x4 9mm."
참고 : 이것은 4 개의 핀을 사용하기위한 사전 정의 된 구성입니다 ( 보충 그림 2 , 2 단계). - "핀 유형"을 정의하십시오. 인쇄에 적합한 핀 유형을 계산하고 작성하십시오.
참고 :이 단계는 핀이 샘플 384-well에 재 채취되기 전에 인쇄 할 지점 수를 정의하며 다른 핀 유형과 슬라이드 표면 화학에 맞게 최적화되어야합니다.
참고 : 946MP3 핀을 사용하는 경우 두 가지 중요한 문제를 고려하십시오. 1) 각 핀은 최대 140 개의 균일 한 스폿을 인쇄 할 수 있으며 2) 사전 스폿 팅은 슬라이드에 인쇄하기 전에 핀 끝에서 과도한 액체를 배출하는 데 필수적입니다. 따라서 각 핀을 사전 인쇄 블록 (에폭시 코팅 슬라이드의 946MP3 핀에 맞게 최적화 됨)에 20 개의 사전 스폿을 인쇄하도록 프로그램하십시오.- 샘플 당 인쇄 된 총 스팟 수를 계산하십시오.
참고 : 각 핀은 하위 어레이 (블록) 당 4 개의 스폿을 인쇄합니다. 슬라이드 당 총 4 개의 서브 어레이 = 16 개 / sl이상. 슬라이드 7 장 후, 각 핀은 16 x 7 = 112 스폿을 인쇄합니다. 또한, 인쇄 전 20 사전 스폿은 132 스폿 / 딥을 제공합니다. 따라서 핀 유형은 "946MP3-132 스폿"(블록 당 샘플 4 개 x 4 블록 x 7 슬라이드 + 20 개 예비 스폿 = 132)으로 정의됩니다. - "핀 유형"을 만듭니다 ( 보충 그림 2 , 3 단계). "설정"을 누르십시오 (소프트웨어의 왼쪽 패널) | "마이크로 검출 핀"| "새 이름"(946MP3-132 점). 딥 (132), 스폿 직경 (100 μm), 흡수 (0.25 μL), 전달 (0.7 nL) 및 최소 스폿 간격 (100 μm) 당 스팟 수를 정의하십시오. "확인"을 누르십시오 | "승인."
- "Method properties"창에서 "946MP3-132 spots"핀 유형을 선택하십시오.
- 샘플 당 인쇄 된 총 스팟 수를 계산하십시오.
- 세척 조건을 정의하십시오. "시작하기 전에 닦으십시오"및 "마무리 후 씻으십시오"를 "표준 세척"( 보충 그림 2 , 4 단계)으로 설정하십시오.
- "플레이트 목록"을 정의하십시오.
참고 : 이것은 플레이트 레이아웃에 따라 플레이트에서 샘플링 패턴 (384 웰 플레이트의 딥 순서)입니다. 플레이트를 플레이트 목록에 업로드하려면 플레이트 샘플링 패턴을 설정하십시오.- 플레이트 "샘플링 패턴"을 만듭니다. "템플릿"( 부록 3 )으로 이동하십시오. "샘플링 패턴." 새 이름을 지정하십시오 ( 예 : JoVE 배열). "Insert"를 선택하십시오. "상단 하단 채우기"| "핀 공구 1 x4 9 mm." 사전 정의 된 플레이트 레이아웃 ( 추가 그림 1A )에 따라 웰 픽업의 순서를 선택하십시오. "확인"을 누르십시오 | "승인."
- 플레이트 샘플링 패턴을로드하십시오. "Plate list"셀의 오른쪽을 클릭하십시오 ( 보충 그림 3 ). "Add plate"를 선택하고 정확한 플레이트 샘플링 패턴을 선택하십시오 (3.6.1 절에서 설명 된 "JoVE array"). "일반 워시"를 선택하십시오. 프레스"OK"| "승인."
- "Sample Plates (샘플 플레이트)"로 이동하여 위치 오프셋을 1 (플레이트가 배열 기 데크에있는 위치를 결정하는)로 변경하십시오.
참고 : 오프셋 위치 0은 초음파 분쇄기에 가깝습니다. - "Microarray Print Design"을 정의하십시오. 블록 간 거리와 간격을 계산하십시오.
- 슬라이드를 7 x 7 mm 크기의 16 개의 웰로 분할하는 현상 툴의 크기를 고려해보십시오. 서브 어레이 사이의 간격은 2 mm입니다 (블록 사이의 합계 9 mm, 보충 그림 4 ).
- 서브 어레이 크기를 고려하십시오.
참고 : 스폿 간 간격은 0.275mm이며이 인쇄 디자인에는 12 열과 18 행이 있습니다. 전체 크기는 너비 (11 x 0.275 mm = 3.025 mm) 및 높이 (17 x 0.275 mm = 4.675 mm)입니다. 수평 간격을 계산하십시오 : 9 mm - (11 0.275) = 5.97 mm. 수직 간격을 계산하십시오 : 9 mm - (17 x 0.275) = 4.325 mm. d를 계산하십시오.슬라이드 왼쪽에서 4.43 mm + 1.07 mm = 5.5 mm. 슬라이드의 위쪽에서부터의 거리를 계산하십시오 : 2.95 mm + 0.55 mm = 3.5 mm ( 보충 그림 4 ). - "인쇄물 디자인"을 정의하십시오 ( 보충 그림 5 ). "템플릿"| "디자인 인쇄"| "새로운."
- "Pin Setup"을 선택하십시오 | "핀 공구 1 x 4 9 mm"| "핀 - 946MP3-132 개 반점." "General"탭에서 "Microarray Print"의 이름을 변경하십시오 ( 예 : "JoVE array"). "Spot Speed"를 선택하십시오 | "복제 번호"(4) | "터치 포인트 높이"(0 mm) | "소프트 터치 높이"(3 mm) | "사용 가능한 모든 위치에 인쇄하십시오"( 보충 그림 5A ).
- "Microarray"탭에서 수평 및 수직 간격 (3.8.2 단계에서 5.9mm 및 4.325mm)과 수평 및 수직 마이크로 어레이 수 (2)를 선택하십시오. '인쇄'를 선택하십시오.Microarray Horizontally "|"Print Duplicate Microarray "( 보충 그림 5B ).
- 하위 배열 탭에서 최대 열 수 (12), 최대 행 수 (18) 및 열과 행 사이의 거리 (275 μm)를 선택하십시오 ( 보충 그림 5C ).
- 측정 탭에서 슬라이드 왼쪽에서부터의 거리 (5.5 mm), 슬라이드 상단에서의 거리 (3.8.2에서 계산 된 3.5 mm), 인쇄 슬라이드 너비 (25 mm) , 인쇄 슬라이드 높이 (75 mm) ( 보 조 그림 5D ). "확인"을 누르십시오 | "승인."
- "Microarray Print Designs"셀의 오른쪽을 클릭하고 정의 된 디자인 (3.8.3 단계의 "JoVE array", 보충 그림 6 )을 선택하십시오.
- "슬라이드 카운트"(56)를 정의하고 "위치 오프셋"(0)을 변경하십시오. 이것은 po를 결정합니다.arrayer 데크에 인쇄 할 첫 번째 슬라이드의 위치 ( 그림 6 ).
- "Microarray Pre-Print Design"을 정의하십시오 ( 보충 그림 6 ). "유리 블록"선택 | "1mm x 4mm 핀 공구 사전 인쇄"
참고 :이 스폿 간격 설정은 유리 블록에 46,464 개의 사전 스폿 (4 개 핀 모두)을 허용하므로 핀 당 46,464 / 4 = 11,616 개의 사전 스폿이 가능합니다. 사전 인쇄 블록의 공간이 모두 소모되면 프린터가 중지되고 블록을 뒤집어 야합니다.
참고 : 인쇄 전 블록이 채워진 샘플 수를 계산하려면 다음을 고려하십시오. 모든 샘플은 384 웰 플레이트에서 8 핀 디핑으로 56 슬라이드 (딥 당 7 슬라이드)를 완료하고 각 딥 추가로 20 개의 사전 스폿이있어 샘플 당 총 160 개의 사전 스팟을 제공합니다. 그러므로 11,616 / 160 = 72.6 샘플. 따라서 사전 인쇄 유리 블록은 72 샘플 후에 뒤집을 필요가 있습니다 (뒤집기 시간을 측정하려면 h한 샘플이 56 개의 슬라이드에서 전체 실행을 완료 한 다음 72로 곱하면됩니다. - "Use PrePrint Design"을 선택하십시오. "예"| "바코드 스캔"(아니오) | "단일 복제본 인쇄"(No) ( 보충 그림 6 ).
- "Validate"를 클릭하십시오 ( 보충 그림 6 ).
- "저장"을 클릭하고 메소드를 arr 파일로 저장하십시오 ( 예 : "JoVE array.arr", 보충 그림 6 ).
4. 설계된 배열 인쇄하기
참고 : 모든 단계는 습기가 60-70 % 인 깨끗한 방에서 보호를 위해 적절한 장갑과 의복으로 수행되어야합니다
- 나노 프린터 기계와 가습기를 켜십시오.
- 세척 완충액과 가습을 위해 DI 수를 채 웁니다. 세척 병 (배수구)과 가습 트랩 카보이 ( 추가 그림 7A )를 비우십시오.
- 가습기를로 설정하십시오.70 % 습도 및 가습 시작.
- 인쇄하기 전에 모든 핀을 청소하십시오. 고온 (65 ° C) 핀 - 팁 세척 용액 (핀 - 팁 세척 시약 15 g 및 65 mL 물 50 mL)을 50 mL 씩 준비하고 고체 시약이 완전히 녹을 때까지 완전히 혼합합니다.
- 핀 팁 브러시 (미세)를 핀 팁 세척 용액에 담그고 각 핀 팁의 표면을 닦아서 각 핀 팁에 세척 용액을 바릅니다.
참고 : 핀 팁 세척 용액은 부식성이며 독성이 있습니다. 이 솔루션을 사용할 때는 항상 장갑과 보안경을 착용하십시오. 핀 팁 세척 용액에 핀을 몇 분 이상 담가두면 영구 핀이 손상 될 수 있습니다. - 1L의 증류수로 초음파 욕조를 채우고 욕조의 부유 식 핀 세척 랙에 핀을 놓습니다. 5 분 동안 초음파 처리하고 핀을 제거하십시오. 클린 룸의 특수 헝겊으로 건조하고 부드럽게 닦아냅니다.
- 핀 팁 브러시 (미세)를 핀 팁 세척 용액에 담그고 각 핀 팁의 표면을 닦아서 각 핀 팁에 세척 용액을 바릅니다.
- "Microarray Manager"프린트 열기어 소프트웨어; 연결이 설정되면 프린터 표시등이 켜집니다 (빨간색 / 녹색). "중지"를 누르십시오 | "지우기"| "Init"( 보충 그림 7B , 단계 1-3); 프린트 헤드 암은 X, Y, Z 정렬을 재설정합니다.
- 핀을 인쇄 헤드에로드하려면 "Load"( 보충 그림 7B , 4 단계)를 누르고 인쇄 / 핀 도구 레이아웃의 정의 된 구성 ( 보충 그림 7C )에 따라 핀을 인쇄 헤드에 놓습니다 . 이 레이아웃은 각 슬라이드에 4 개의 하위 어레이를 인쇄하는 4 개의 핀을 사용하여 슬라이드 당 총 16 개의 하위 어레이를 얻습니다 ( 보충 그림 1A ). 핀을 놓은 후 "Init"를 다시 누르십시오.
- Arrayer 덱에서 슬라이드를 조립하십시오. 슬라이드 상자를 열고 초 고순도 질소 가스를 불어 넣어 각 슬라이드를 청소하십시오. 어레이 플랫폼에 원하는 수의 슬라이드를 놓습니다. 두 개의 손가락으로 슬라이드를 잡고 아래 모서리에 놓은 다음 슬라이드를위치. 오른쪽 모서리 두 개를 잡고 슬라이드가 제 위치에 완전히 끼울 때까지 왼쪽 모서리를 조심스럽게 누릅니다. 단단히 고정되도록 왼쪽 아래 구석을 향해 살짝 미십시오 ( 보충 그림 7D ).
- 증류수, 70 % 에탄올 및 100 % 에탄올로 사전 블록 유리를 닦아 낸 다음 공기 건조시켜야합니다 (전용 클린 룸 와이프 만 사용하십시오). 프리 블록 유리를 데크의 위치에 놓습니다.
- sonicator bath를 채 웁니다 ( 보충 그림 7B ). "Fill"을 55 초 동안 누른 다음 "OK"를 누르십시오. "Drain"을 20 초 동안 누른 다음 "OK"를 눌러 초음파 분쇄기를 배출하십시오. 채우기 및 배수를 한 번 더 반복 한 다음 55 초 동안 다시 채 웁니다.
- 세척 욕조를 채우십시오 ( 보충 그림 7B ) : "Prime"을 40 초 동안 누른 다음 "OK"를 누르십시오.
- aliquoted 샘플과 384 잘 판을 arrayer 갑판에 그 위치에 놓고 parafilm 덮개를 제거하십시오.
- 인쇄가 완료되면 초음파 분쇄기 배수구 ( 그림 7B 참조 )를 배출하고 가습기를 끕니다.
- 가습없이 슬라이드를 16 ~ 24 시간 동안 건조시켜야합니다.
- 알코올 / 내용 매성 마킹 펜으로 번호를 매기고 어두운 곳에서 진공 봉인 된 상자에 보관하십시오.
5. 배열 처리 및 개발
- 진공 봉인 된 상자에서 슬라이드를 꺼내어 배열이 위를 향하게 5 분간 화학 후드에 놓아 과도한 액체를 증발시킵니다.
- 가장 높은 게인 (950 PMT)으로 슬라이드를 스캔하여 모든 스폿이 인쇄되었는지 확인하십시오.
- 슬라이드의 에폭시 그룹을 화학적으로 차단하십시오.
- 에탄올 아민 차단 용액 (0.1 M Tris-HCl, pH 8 및 0.05 M 에탄올 아민) 50 mL를 준비한다. 140 mL의 DIW와 8.8 mL의 트리스 -HCl (1.7 M, pH 8) 및 0.45 mL의 에탄올 아민 (16.6 M)을 혼합한다. 5로 이동0-mL 염색 튜브 ( 보충 그림 8A )로 옮기고 50 ° C로 따뜻하게합니다.
- 슬라이드를 수화합니다. DIW로 가득 찬 염색 튜브에 슬라이드를 넣고 호일로 덮은 다음 RT에서 천천히 부드럽게 흔들어 5 분 동안 배양합니다.
- 슬라이드의 반응성 에폭시 그룹을 차단하십시오. 미리 데워진 ethanolamine 블록 솔루션으로 가득 50 ML 얼룩 튜브에 슬라이드를 담가 호일로 덮고, RT에서 천천히 부드러운 흔들어와 30 분 동안 품어.
- 적절한 biohazard 쓰레기통에 ethanolamine 블록킹 용액을 버리고 50 ° C DIW로 채워진 새롭고 깨끗한 염색 튜브에 슬라이드를 놓습니다. 호일로 덮고 RT에서 천천히 부드럽게 흔들어 10 분간 품어 라.
- 물을 버리고 슬라이드를 유리 염색 홀더에 옮깁니다 ( 보충 그림 8B ). 스윙 플레이트 홀더에 유리 얼룩 홀더를 놓고 200 xg 및 RT에서 5 분 동안 슬라이드를 원심 분리 건조시킵니다.
- 슬라이드를 16 - 웰 구분선에 놓으십시오 ( 보충 그림 8C ).
- PBST 세척 용액 준비 : 인산 완충 식염수 (PBS), pH 7.4 + 0.1 % Tween-20 50 mL.
- 생물학적 차단 용액 (PBS-OVA)을 준비하십시오 : 5 mL의 PBS, pH 7.4 + 1 % 닭 오발 부민 (10 mg / mL).
참고 : 차단 시약의 선택은 항 -Neu5Gc 항체의 검출 성공에 중요합니다. 오발 부민은 인간과 마찬가지로 Neu5Gc를 합성 할 수없는 닭에서 만들어지며이 Sia의 발현이 부족합니다. Neu5Gc의 검출을 위해, 심지어 사소한 오염 물질은 분석의 민감도를 극적으로 감소시킬 수 있으며 때로는 어떠한 Anti-Neu5Gc 반응도 검출하지 못합니다. 예를 들어, 가장 일반적으로 사용되는 블로킹 시약인 소 혈청 알부민 (BSA)은 그 자체로는 글 라이코 실화되지 않지만 Neu5Gc- 잔기를 보유하는 소 IgG IgG 오염 물질을 포함하므로 w항 -Neu5Gc 항체로 시료에 결합 할 때 인쇄 된 글리 칸 19 , 20 . - 우물을 미리 준비하십시오. 멀티 피펫을 사용하여 PBST 200 μL를 슬라이드 웰에 넣고 습도가 높은 챔버에 넣고 5 분간 흔들어줍니다.
참고 : 습도 챔버는 샘플을 빛으로부터 보호하기 위해 나일론 랩과 호일로 덮인 젖은 수건 종이가있는 유리 트레이입니다. - 깨끗한 종이 타월에 부드럽게 톡톡 두드려서 PBST를 제거하고 각 웰에 PBS-OVA blocking buffer 200 μL를 분취하십시오. 습도가 높은 챔버에 넣고 부드럽게 흔들어 RT에서 1 시간 동안 배양합니다.
- 표 2에 나열된 바와 같이 PBS-OVA 차단 완충액으로 희석 한 1 차 검출을 준비합니다.
참고 :이 시알로 글리 칸 마이크로 어레이의 품질 관리 (QC) 평가를 위해 여러 Sia 결합 단백질을 사용하십시오 : 엘더베리 나무 껍질에서 분리 된 Sambucus nigra lectin (SNA)은 Sia &# 945; Maackia Amurensis Lectin II (MALII)는 Siaα23을 인식 할 것으로 기대된다. 및 닭 anti-Neu5Gc IgY는 모든 Neu5Gc 함유 시알로 글리 칸을 인식 할 것으로 기대된다. 또한, 다양한 Neu5Gc IgG 반응을 프로파일 링하기 위해 다양한 인간 혈청 샘플을 사용하십시오. 렉틴 / 항체 / 혈청의 농도는 실험적으로 보정해야합니다. - 건조 PBS - OVA 차단 버퍼를 가볍게 치고 우물 당 1 차 항체 200 μL를 추가합니다 (웰당 최소 부피 : 70 μL). 습도가 높은 챔버에서 2 시간 동안 품어 둡니다.
- 1 차 검출을 톡톡히 말려서 PBST로 4 회 세척하십시오 (3 회 및 4 회 세척 사이, 습도가 높은 챔버에서 5 분 동안 PBST에서 슬라이드를 품을 것). PBS로 한번 씻으십시오.
- 표 2에 나열된대로 PBS에 보조 항체를 준비합니다.
- PBS를 톡톡히 말리고 2 차 항체 200 μL를 첨가하십시오. 흔들어서 RT에서 1 시간 동안 품어 낸다.
- 이차 항체를 톡톡히 말려서 PBST로 4 번 씻으십시오 (3Rd 및 제 4 회 씻어, 습한 챔버 내에서, 5 분)에 대한 PBST에서 슬라이드를 배양한다.
- 조심스럽게 프레임을 제거하고 PBS로 채워진 50 ML 슬라이드 얼룩 튜브에 슬라이드를 놓고 5 분 동안 흔들어.
- 2 개의 슬라이드 얼룩이는 욕조 ( 그림 8D 참조 )를 DIW로 채우고 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 욕조에 담그십시오. 빠르게 10 번 담그고 두 번째 욕조로 옮기고 10 번 더 담그십시오. 흔들어 섞으면 서 RT에서 10 분 동안 품어 낸다.
- 물을 버리고 슬라이드를 유리 염색 홀더에 옮기십시오 ( 보충 그림 8B , 슬라이드가 공기 건조하게하십시오). 스윙 플레이트 홀더에 유리 얼룩 홀더를 놓고 원심 분리기를 200g 및 RT에서 5 분 동안 건조시킵니다.
- 슬라이드를 스캔 한 다음 어둠 속의 진공 봉인 된 상자에 보관하십시오.
6. 어레이 스캐닝 및 데이터 분석
- 형광 슬라이드 스캐너를 열고 5 분 동안 따뜻하게하십시오. 그스캐닝 및 분석 소프트웨어.
- 스캐닝 매개 변수를 설정하십시오 ( 보충 그림 9A ) : 532 nm 및 100 % 출력에서 350 PMT의 이득으로 스캔하십시오. 평균은 한 줄, 초점 위치는 0 μm입니다. 10.0 μm 픽셀 크기 해상도를 사용하십시오.
참고 : 스캔 매개 변수는 다양한 슬라이드 유형, 형광 및 해상도로 조정할 수 있습니다. - 개발 된 슬라이드를 스캔하십시오. 스캐너 도어를 열고 어레이 안쪽을 아래로 향하게 슬라이드를 놓으십시오. 스캔을 시작합니다 (소프트웨어 탐색 패널 메뉴의 녹색 "재생"버튼, 추가 그림 9B ).
- 스캔 한 슬라이드를 tiff 파일로 저장하십시오.
- 분석을 위해 슬라이드를 준비하십시오. "로드 배열 목록"을 선택하고 슬라이드의 각 블록에있는 배열을 매핑하는 적절한 GAL 파일을 업로드합니다 ( 추가 그림 9C ).
참고 : GAL 파일에는 슬라이드의 각 지점의 ID와 위치 (X, Y)에 관한 정보가 들어 있습니다. 이 파일을 만들 수 있습니다.384-well 소스 플레이트의 샘플 ID와 정의 된 인쇄 디자인을 기반으로 탭으로 구분 된 텍스트 파일을 내보내는 프린터 소프트웨어가 있습니다. - 정렬 및 분석 매개 변수를 설정하십시오. 소프트웨어 탐색 패널 메뉴에서 "Option"버튼을 누릅니다 ( 추가 그림 10 ).
- 정렬 매개 변수를 정의하십시오. 원형 피쳐를 찾고 50 ~ 350 % 정렬 할 때 피쳐의 크기를 조정하고 최대 이동 거리를 40μm로 제한하고 배경 임계 값 (CPI 임계 값 0)에 실패한 피쳐를 제거하고 블록을 찾을 때 줄 바꿈 및 회전을 추정하고 이미지 등록을 자동화합니다. (10 픽셀) ( 보충 그림 10 ).
- 분석 매개 변수를 정의하십시오 : W1 / 532 비율, 표준 표준 편차, 부재 부재 분석 및 배경 빼기. "선택"을 클릭 한 다음 "로컬 기능 배경 중앙값"을 클릭하고 배제 할 2 픽셀 및 배경의 3 픽셀 너비를 설정합니다. "확인"을 누르십시오. Set 스캐너 채도 레벨을 기본값으로 설정합니다 ( 보충 그림 10 ).
참고 : 배경 빼기 방법은 실험 설계에 따라 다르며 필요에 따라 수정할 수 있습니다. - 기능 맵을 정렬하십시오. 프로그램을 블록 모드로 설정하고 ( "B"누름) 모든 블록 (Ctrl + A)을 선택하고 배열 맵 격자를 배치하고 모든 블록을 정렬합니다 (Alt + Shift + F7) ( 보충 그림 11 ).
- 각 블록의 형상 정렬을 수정합니다. 왼쪽 상단 블록에 확대 / 축소 ( "Z"를 줌 모드로 들어가기), 다시 "B"를 눌러 (블록 모드),이 블록의 그리드를 누르십시오. 이 블록이 블록 스팟과 완벽하게 정렬 될 때까지이 블록의 그리드를 이동하고 F5를 눌러이 선택된 블록의 피쳐를 정렬합니다. 스팟들이 완벽하게 원이 될 때까지 그리드 이동과 F5 정렬을 반복하십시오. 모든 격자가 제 위치에 놓일 때까지 16 개의 블록 중 하나에 대해 동일하게하십시오.
- 데이터를 분석하고 저장하십시오. 모든 블록을 선택하십시오 (Crtl +A)를 선택하고 데이터를 분석하십시오 (Alt + A). 분석 결과 (Ctrl + U)를 .gpr 파일로 저장하십시오.
- 스프레드 시트 프로그램에서 저장된 .gpr 파일을 열고 로컬 배경 빼기 (F532-B532) 후 형광을 기반으로 각 지점의 강도를 분석합니다.
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Representative Results
배열 인쇄, 개발 및 분석 :
여러 개의 glycan 시료와 human IgG STD 곡선을 가진 sialoglycan microarray를 16 개 블록으로 인쇄하려면 모든 시료가 슬라이드 당 16 개의 블록과 동일한 인쇄 작업에서 모든 슬라이드에 가능한 한 균일하게 인쇄되도록 철저한 보정이 필요합니다. 따라서 각 시료 유형, 슬라이드 유형 및 제조, 384-well plate type, 습도 수준, 384-well plate의 시료 부피, pre-of-plate의 양에 대한 buffer 조성을 포함하여 특정 인쇄 매개 변수가 결정되기 전에 여러 교정 실험이 필요합니다 모든 샘플 유형, 인간 IgG STD 곡선 농도 및 마커 유형에 대한 인쇄. 인쇄 된 sialoglycan 어레이 슬라이드의 내구성은 실온에서 어두운 곳에서 진공 밀봉 된 상자에서 최대 10 개월 동안 지속되는 것으로 확인되었습니다. 모든 인쇄 실험에서 균일 성은Sia 결합 렉틴 및 항체를 이용한 품질 관리 실험을 통해 추가로 모니터링 및 검증되었습니다. 개발 및 스캐닝 프로토콜은 동일한 인쇄 작업에서 슬라이드 내의 샘플을 비교함으로써 균일 성과 정확성을 달성하도록 최적화되었습니다. 슬라이드는 최적화 된 블로킹 조건 (화학 및 생물학적), 세척 및 배양 시간을 사용하여 블록 사이의 적절한 분리를 보장하는 16-well 분배기로 개발됩니다. 1 차 및 2 차 검출은 최소한의 배경 및 비특이적 결합으로 최대 검출을 보장하기 위해 광범위하게 보정되었습니다. 슬라이드 스캐닝 및 분석시 출력 결과가 스프레드 시트 파일로 전송되어 분석되어 각 지점에서의 탐지가 결정됩니다. 각 지점은 이상치 검사를 받았고 QC를 만족하지 못하면 생략되었습니다 (% CV가> 20이고 지점이 네 번의 복제물의 평균에서 표준 편차 1 표준 편차 범위를 벗어나는 경우). 그런 다음 평균 신호 강도 after 표본 당 반복 스폿에 대해 국부적 배경의 뺄셈을 수행하여 인쇄 샘플 당 상대 형광 유닛 (RFU) 데이터 포인트를 생성 하였다. 시험 된 모든 블록에서 IgG STD 곡선의 균일 성이 검증되면 RFU 값을 ng / μL IgG로 표준화하여 실험 내 및 실험간에 시료를 더 잘 비교할 수 있습니다.
Sia 결합 고 처리량 분석 :
Sialoglycan 어레이는 Sia 함유 glycans에 결합하는 결정 인자 ( 예 : 단백질, 렉틴, 항체, 바이러스 등 )를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 인쇄 후 QC의 경우, Sia 결합 식물 렉틴과 항 -Neu5Gc IgY가 사용됩니다 19 . SNA는 α2-6 결합 된 Sia를 결합시키고, MALII는 α2-3 결합 된 Sia를 결합시키고, Anti-Neu5Gc IgY는 Neu5Gc- 함유 사이 알글리칸을 결합 시키지만 Neu5A를 결합시키지 않는다C 함유도 2a에 도시 된 바와 같이, 19 sialoglycans. QC 실험은 스폿 프린팅 및 ID 및 4 개의 서로 다른 핀을 사용하는 인쇄 블록 간의 가변성 부족 여부를 검증하는 것을 목표로합니다. 블록 대 블록의 가변성은 슬라이드 당 매 1 차 검출에 대해 4 개의 블록을 개발하고 4 개의 핀 각각에 인쇄 된 블록을 동일한 1 차 검출 부분으로 비교함으로써 모니터링됩니다. 큰 차이가 없는지 비교하기 위해 비교가 이루어집니다.
인체 혈청은 여러 가지 인간 질병 2 , 21 , 22 , 23에 대한 암시와 함께 다양한 Anti-Neu5Gc 항체 6 을 포함합니다. 인간 혈청 IgG에서의 시알로 글리 칸 인식을 평가하기 위해, 건강한 사람 공여자로부터의 12 개의 혈청을 인쇄 된 시알로 글리 칸 microarray로 표지하고 형광 표지 된 항 - 인간 IgG를 사용하여 발색시켰다 ( 도 2B ). 각각의 인쇄 된 블록은 모든 블록에서 유사하고 균질 인 인간 IgG STD 곡선을 포함합니다 ( 그림 2C ). 각 블록에서 STD 곡선의 품질을 검증 한 후에 ( 그림 2C ) 블록의 기울기에 따라 표준화 된 글리 칸 스팟 결과가 나온 다음 희석 계수가 곱 해집니다. 도 2B에 도시 된 바와 같이, 시험 된 모든 인간 혈청은 여러 수준의 항 -Neu5Gc IgG를 함유하고, 일치하는 쌍의 Neu5Ac- 함유 사이 알글리칸을 인식하지 못한다. 더욱이, 항 -Neu5Gc IgG 인식 패턴은 강도와 다양성 모두에서 이들 12 가지 상이한 혈청 사이에서 매우 다양하다.
그림 1 : 개요배열 인쇄, 개발 및 이미지 분석 ( A ) Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2는 에폭시 코팅 유리 슬라이드에 인쇄 된 1 급 아민과 함께 대표적인 Neu5Gc 함유 Sia 글리 칸으로 표시됩니다. ( B ) 인쇄 배열은 다양한 Sia 결합 단백질로 개발되고,이어서 적절한 형광 표지 된 2 차 항체로 검출된다. 각 하위 어레이는 개별적으로 개발할 수 있습니다. ( C ) 형광 스캐너에서 프로브 슬라이드를 스캔하면 스캐너 이미지 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석되는 이미지가 생성됩니다. 서브 어레이는 어레이상의 각각의 스폿을 맵핑하는 그리드로 중첩되며 각 스폿에 대해 검출 된 형광이있다. 결과는 스프레드 시트 파일로 전송됩니다. 단일 웰 내의 단일 어레이가 개략적으로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 2 : 각종 Sia 결합 단백질을 사용하는 Sialoglycan Microarrays의 단면도.
슬라이드는 각 블록에 하나씩, 16 개의 다른 1 차 검출 부분으로 개발되었습니다. ( A ) Sia 특이 적 식물 lectin SNA와 MALII 및 polyclonal 단일 특이성 닭 항 -Neu5Gc IgY의 결합 패턴을 보여주는 QC 슬라이드의 대표 3 블록. 이 결과는 각 블록에 대하여 히트 맵 형식으로 제시 RFU (적색, 백색, 청색, 100 번째, 50 번째를 나타내는 0 번째 백분위 각각)된다. ( B ) 12 개의 상이한 건강한 사람 혈청을 1 : 100 희석하여 시험하고 항 -Huamn IgG로 검출하여 항 -Neu5Gc IgG 반응성을 측정 하였다. RFU 데이터는 각각의 값을 각각의 특정 bl에서의 IgG STD 곡선 기울기로 나눔으로써 ng / μL로 정규화 하였다그 다음에 희석 계수를 곱합니다. 데이터는 조합 된 모든 블록 (히트 맵 형식)으로 표현됩니다 (빨간색, 흰색 및 파란색, 각각 100 번째 , 50 번째 및 0 번째 백분위 수를 나타냄). ( C ) 데이터를 정상화하는 데 사용 된 인간 혈청으로 개발 된 12 개 블록의 인간 IgG STD 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 글 리칸 ID | 구조 | |||
| 1 | Neu5,9Ac α3Galβ4GlcNAcβO 2 (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 2 | Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 </ sub> NH 2 | |||
| 삼 | Neu5,9Ac α6Galβ4GlcNAcβO 2 (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 4 | Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 5 | Neu5Acα6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 6 | Neu5Gcα6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 7 | Neu5,9Ac α3Galβ3GlcNAcβO 2 (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 8 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 9 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 10 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 11 | Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 12 | Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 13 | Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 14 | Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 15 명 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 16 | 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 17 | Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 18 개월 | Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 19 | Neu5Acα6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 20 | Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 21 | Neu5Acα3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 22 개월 | Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 2삼 | Neu5,9Ac α6GalNAcαO 2 (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 24 | Neu5Gc9Acα6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 25 명 | Neu5Acα3GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 26 세 | Neu5Gcα3GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 27 | Neu5Acα6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 28 | Neu5Gcα6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 29 | Neu5,9Ac α3GalβO 2 (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 30 | 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 31 | Neu5,9Ac α6GalβO 2 (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 32 | Neu5Gc9Acα6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 33 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 34 | Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 35 세 | Neu5,9Ac α3Galβ3GalNAcβO 2 (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 36 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| Neu5,9Ac α6Galβ4GlcβO 2 (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | ||||
| 38 세 | Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 39 세 | Neu5,9Ac α3Galβ4GlcβO 2 (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 40 | Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
표 1 : 인쇄 된 글리 칸 목록.
| 초등 / 중등 학교 | 항체 / 렉틴 | 스톡 농도 | 특성 | 작업 희석 / 농도 |
| 1 차 탐지 | Biotinilated-MALII | 1 mg / mL | α2-3 결합 시알 산 | 1:50, 20 μg / mL |
| 비오틴 - SNA | 2 mg / mL | α2-6 연결의 시알 산 | 1 : 100, 20 ㎍ / mL | |
| 치킨 안티 Neu5Gc IgY | 노스 다코타 | Neu5Gc 시알 산 | 1 : 7,000 | |
| 인간 혈청 | 100 % | 수많은 에피토프 | 1 : 100 | |
| 2 차 탐지 | Cy3-Streptavidin | 0.75 mg / mL | 비오틴 | 1 : 500, 1.5㎍ / ㎖ |
| Cy3- 치킨 IgY | 0.75 mg / mL | 치킨 IgY | 1 : 2,000, 0.375 μg / mL | |
| Cy3- 항 인간 IgG H + L | 0.6 mg / mL | 휴마n IgG | 1 : 1,500, 0.4 μg / mL |
표 2 : 1 차 및 2 차 검출 단백질의 목록.
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Discussion
성공적인 glycan microarray 제작에는 신중한 계획이 필요하며 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 여기에는 (1) 모든 후속 매개 변수 ( 예 : 거리, 간격, 샘플 양 및 인쇄)를 정의하는 블록 및 플레이트 레이아웃 계획. (2) 핀을 클리닝하고 핀의 완전성을 보장하는 것, 이는 스팟 동질성을 제어하는 데 중요합니다. (3) 인쇄 중 습도를 높게 유지하며, 장시간 인쇄시 샘플 증발을 피하는 것이 중요하며, 이는 얼룩 동질성을 손상시킬 수 있습니다. (4) 결과에 영향을 줄 수있는 적절한 정렬 및 분석 매개 변수 ( 예 : 배경 빼기 방법, 임계 값 및 스폿 크기 유연성)를 선택합니다.
이 방법은 특정 실험 설계 및 목표를 충족시키기 위해 추가로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 예비 스포팅 번호는 어레이에 인쇄 할 각 유형의 재료에 더 잘 맞도록 수정할 수 있습니다. 핀 세척 단계인쇄물을 다른 인쇄물에 맞게 최적화 할 수 있으며 짧은 또는 넓은 세척주기가 있습니다. 또한 딥 (dip) 당 핀 인쇄되는 스폿의 양은 더 많거나 적은 스팟을 포함하도록 수정 될 수 있지만 어레이에 사용 된 각 유형의 재료에 대해 별도의 캘리브레이션이 필요합니다. 형광 마커의 유형과 그 농도는 접합을위한 적절한 화학 그룹 ( 예 : 에폭시 코팅 슬라이드 용 1 차 아민)이 포함되어있는 한 수정할 수 있습니다. STD 곡선의 농도와 유형을 확장 할 수 있습니다 ( 예 : 사람 / 마우스 / 다른 생물체 IgG, IgM, IgA 등 ). 완충제 조건은 상이한 물질에 적합하도록 최적화 될 수 있으며, 어레이에 대한 비특이적 결합을 피하기 위해 1 차 아민을 함유하지 않는 것이 바람직하며, 이는 배경을 증가시킬 수있다. 중요한 것은, Neu5Gc를 최적으로 검출하기 위해서는 생물학적 블로킹 시약이 Neu5Gc가 없어야합니다 ( 예 : BSA 우유를 피하십시오). 그러면 Neu5Gc- 시알로 글리 칸 검출이 저해 될 수 있습니다.배경을 늘리십시오 19 , 20 . 1 차 및 2 차 검출 농도는 높은 배경 및 비특이적 결합을 피하기 위해 최적화되어야한다. 또한 스캐닝 매개 변수 ( 예 : 전력, 이득 및 해상도)를 수정하여 배경을 줄이거 나 낮은 신호를 향상시킬 수 있습니다. 마지막으로 정렬 및 분석 매개 변수를 높은 배경 또는 모양이 다른 모양에 맞게 수정할 수 있습니다. 글리 칸 마이크로 어레이 데이터를보고하는 데 권장되는 표준에 관한 추가 정보 및 가이드 라인은 최근 MIRAGE 이니셔티브 17 에 기술되어 있으며, 이는 데이터 공유 및 해석을 용이하게 할 수 있습니다.
요약하면, 글리 칸 마이크로 어레이는 글리 칸 - 생체 분자 상호 작용을 연구하기위한 강력한 도구를 제공하며 다양한 생물학적 시료에 적용 할 수 있습니다. Anti-Neu5Gc 항체는 인간 질병 23 에서 다른 역할을합니다. 예를 들어, 암에서, 항 -Neu5Gc 항체는 이중 역할을한다 : 한편으로는 잠재적 인 바이오 마커 역할을하지만 다른 한편으로는 잠재적 인 치료법 7 , 21 , 24로 작용한다 . 이 항체는 또한 동맥 경화 (25)의 악화, 이종 이식 (20), (26)의 효능 및 당화 biotherapeutics (27)의 효과에 기여한다. 따라서 다양한 인간 시료에서 anti-Neu5Gc 항체를 프로파일 링하는 것이 관심의 대상이며, 여기에 설명 된 것과 같은 high-throughput assay는 인체 건강 및 질병에서의 역할에 대한 우리의 이해를 증진시키는 데 기여할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 부분적으로 Israel Cancer Research Fund의 Research Career Development Award, Israeli National Nanotechnology Initiative의 보조금 및 Personalized Theranostics (VP-K)의 Nanomedicines에 대한 Focal Technology Area의 Helmsley 자선 신탁 및 National 보건 당국 R01GM076360 (XC에).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
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