Summary
En sialoglykan-mikroarray-analyse kan brukes til å evaluere anti-Neu5Gc-antistoffer i humane sera, noe som gjør den til en potensiell diagnostisk analyse med høy gjennomstrømning for kreft og andre kroniske betennelsesfremmende menneskelige sykdommer.
Abstract
Celler er dekket med kapp av karbohydratkjeder (glykaner) som ofte endres i kreft, og som inkluderer variasjoner i sialinsyre (Sia) -uttrykk. Disse er sure sukker som har en 9-karbon ryggrad og det hekker vertebrat glykaner på celleoverflater. To av de viktigste Sia-formene i pattedyr er N- acetylneuraminsyre (Neu5Ac) og dets hydroksylerte form, N- glykylylururaminsyre (Neu5Gc). Mennesker kan ikke produsere endogen Neu5Gc på grunn av inaktivering av genet som koder for cytidin 5'monofosfat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroksylase (CMAH). Utenlandsk Neu5Gc er kjøpt av menneskelige celler gjennom kostholdet av rødt kjøtt og meieri og vises senere på ulike glykaner på celleoverflaten, som hovedsakelig akkumuleres på karcinomer. Følgelig har mennesker sirkulerende anti-Neu5Gc-antistoffer som spiller ulike roller i kreft og andre kroniske betennelsemidlede sykdommer, og som blir potensielle diagnostiske og terapeutiske targets. Her beskriver vi en high-throughput sialoglycan microarray assay for å vurdere slike anti-Neu5Gc antistoffer i humane sera. Neu5Gc-holdige glykaner og deres matchede par av kontroller (Neu5Ac-holdige glykaner), hver med en kjernemessig primær amin, er kovalent bundet til epoksybelagte glassruter. Vi eksemplifiserer utskrift av 56 lysbilder i 16-brønnformat ved hjelp av en bestemt nanoprinter som kan generere opptil 896 arrayer per utskrift. Hvert lysbilde kan brukes til å skjerme 16 forskjellige humane serumprøver for evaluering av anti-Neu5Gc-antistoff-spesifisitet, intensitet og mangfold. Protokollen beskriver kompleksiteten til dette robuste verktøyet og gir en grunnleggende retningslinje for dem som har som mål å undersøke svaret på Neu5Gc diettkarbohydratantigen i ulike kliniske prøver i et arrayformat.
Introduction
Sias er sure sukker som dekker glykankjeder på celleoverflate glykoproteiner og glykolipider hos vertebrater. Sia-ekspresjon er modifisert i kreftceller 1 og korrelerer med progresjon og / eller metastase 2 , 3 . To av de viktigste Sia-formene i pattedyr er Neu5Ac og dets hydroksylerte form, Neu5Gc 2 . Mennesker kan ikke syntetisere Neu5Gc på grunn av en spesifikk inaktivering av genet som koder for CMAH-enzymet. Denne ikke-humane Sia inkorporerer metabolisk i menneskelige celler som "selv", som stammer fra kostholdige Neu5Gc-rike matvarer ( f.eks. Rødt kjøtt) 4 , 5 . Neu5Gc er tilstede i lave nivåer på celleoverflatene av human epithelia og endothelia, men det akkumuleres spesielt i karcinomer. Neu5Gc er anerkjent som fremmed av humant humoral immune system 2 , 6 .Den antigene kompleksiteten av Neu5Gc-glykaner kan oppstå på flere nivåer, inkludert Neu5Gc modifisering, binding, underliggende glykaner og stillaser, og deres tetthet, alt reflektert av kompleksiteten av anti-Neu5Gc antistoffrespons hos mennesker 6 . Noen av disse antistoffene fungerer som karsinombiomarkører og potensielle immunoterapeutiske midler 7 . Tilkomsten av den kjemoenzymatiske syntesen av forskjellige sialoglykaner 8 banet vei for en mer grundig analyse av slike antistoffer, lettet ved bruk av glykansk mikroarray teknologi 9 , 10 . Således, med den enkle forberedelsen og manipuleringen av store biblioteker av naturlige og syntetiske karbohydrater, har glykanmikroarrays blitt en kraftig høy-throughput-teknologi for å undersøke samspillet mellom karbohydrater med et myriade av biomolekyler 10 , 11 , 12 , 13 . I et arrayformat blir det brukt små mengder materialer, og denne multivalente visning av biologisk relevante glykaner tillater undersøkelse av tusenvis av bindende interaksjoner i et enkelt eksperiment. Det er viktig at denne teknologien også kan brukes til biomarkørfunn og for å overvåke immunrespons i ulike prøver 7 , 12 .
Vellykket glykan mikroarray-fabrikasjon krever behandling av tre viktige aspekter: skriverrobotypen, glykan-konjugasjonskjemien og deteksjonsoptikk. Når det gjelder utskriftinstrumentet, er det to teknikker tilgjengelig: kontakt- og ikke-kontaktprintere. Ved kontaktutskrift dyppes 1-48 stålpinner i en multi-brønn kildeplate som inneholder glykanoppløsning og er oppdaget på funksjonsglassplater ved direkte å kontakte glassglassoverflaten. Løsningen er deLeveret til lysbildet er en funksjon av den lengende varigheten på lysbildeoverflaten. Vanligvis blir prøvene først forhåndsplettet på en glassblokk (for å nå homogene punkter) før de skrives ut på glidoverflaten. I ikke-kontakt skrivere ( f.eks. Piezo-elektroniske skriveren), skrives glykansene fra en glasskapillær ved hjelp av kontrollerte elektriske signaler. Det elektriske signalet kan finjusteres for å oppnå mer presis utskrift i forhold til kontaktutskrift. Plassens størrelse og morfologi er også relativt mer homogene. En ekstra fordel er gjenvinningen av prøven tilbake til kildeplaten etter utskrift. Ikke desto mindre er den største ulempen ved piezo-elektroniske skrivere trykkbegrensningsbegrensningen (4 eller 8), noe som resulterer i en meget lang utskriftstid, noe som krever spesiell oppmerksomhet til glidestabilitet, temperatur, fuktighet og prøvefordampning. Inkjet-skriveren uten kontakt krever større prøvevolumer 14 .
10 , 11 , 12 , 13 . For svært detaljert informasjon om trykt glykan microarray teknologi for uninitiateD-undersøker, referer til disse gode anmeldelser 13 , 15 . Viktig er at den nyeste Minimumsinformasjon som kreves for et Glycomics Experiment (MIRAGE) -initiativ, beskriver retningslinjer for prøvepreparasjon 16 og for rapportering av data fra glykanmikarrayanalyser 17 for å forbedre standardene i dette voksende feltet.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for fremstilling av sialoglycan mikroarrays ved hjelp av en bestemt kontakt nano-skriver i 16-brønnformat. Hver av glykansene har en primær amin som formidler sin kovalente kobling til epoksyaktiverte glassglass. Vi beskriver også utviklingen og analysen av ett lysbilde ved bruk av forskjellige humane seraprøver, antistoffer og Sia-bindende plantelektiner. Sialoglycan microarray analyser innebærer flere hovedtrinn som inkluderer array fabrikasjon, behandling, utvikling og analyse. Array fabrication krever planlegging av arRay-layout, forbereder glykaner og kildeplate, programmerer nano-skriveren og skriver ut lysbildene. Deretter behandles, utvikles og analyseres lysbildene ( figur 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human sera prøver ble hentet fra den israelske blodbanken og ble brukt i samsvar med Helsinki-erklæringen og Tel Aviv University Institutional Review Board.
1. Array Fabrication Planlegging og Layout
- Bestem lysbildet.
MERK: Hvert lysbilde inneholder 16 delrapporter delt inn i 16 identiske blokker nummerert B1 til B16 ( Figur 1B , tilleggs figur 1A ). - Bestem pin-oppsettet. Bruk fire pinner, hver skriver ut fire underarrayer (blokker) per lysbilde:
Pin 1 skriver ut blokkene 1, 2, 9 og 10;
Pin 2 skriver ut blokkene 3, 4, 11 og 12;
Pin 3 skriver ut blokker 5, 6, 13 og 14; og
Pin 4 skriver ut blokker 7, 8, 15 og 16 ( tilleggs figur 1A ). - Bestem blokk og layout med 384 brønner.
MERK: Ordren der glykanene vises i hver blokk krever nøye planlegging. I dette eksemplet arrAy, skriv ut hver prøve ved fire replikater, designe fluorescerende markørpunkter som skal ligge nederst til høyre (for å lette punktanalyse) og skrive ut standardkurve-IgG (STD) flekker ved seks økende konsentrasjoner ( tilleggs figur 1B ).- For hvert trykt sted skal du først disponere materialet i fire brønner (en for hver pinne) i en 384 brønnplate.
MERK: Ordren av materialene i 384-brønnplaten er basert på det utformede blokkoppsettet ( tilleggs figur 1B-C ).
- For hvert trykt sted skal du først disponere materialet i fire brønner (en for hver pinne) i en 384 brønnplate.
2. Fremstilling av glykaner og kildeplaten
- Klargjør glykanskriverbuffer (50 ml 300 mM fosfatbuffer, pH 8,4). Veie 58,5 mg mononatriumfosfat-monohydrat (NaH 2PO 4 .1H 2 O) og 3,9 g dinatriumfosfat heptahydrat (Na 2HPO 4 .7H 2 O) i 40 ml deionisert vann (DIW). Titrer til pH 8,4 ved å bruke 4 M NaOH. Juster volumet til 50 ml anD filtrer gjennom en 0,2 μm membran for sterilisering.
- Tilbered markørbuffer (50 ml 187 mM fosfatbuffer, pH 5). Veie 289 mg av mononatriumfosfat-monohydrat (NaH 2PO 4 .1H 2 O) og 1,94 g dinatriumfosfat heptahydrat (Na 2HPO 4 .7H 2 O) i 40 ml av DIW. Titrer til pH 5 ved å bruke 1 M HC1. Juster volumet til 50 ml og filtrer gjennom en 0,2 μm membran for sterilisering.
- Forbered STD-kurvebuffer (50 ml PBS-glycerol: fosfatbuffert saltvann, pH 7,4, supplert med 10% glyserol fra en 100% glycerolmasse) og filtrer den gjennom en 0,2 μm membran for sterilisering.
- Klargjør hver glykan-stamopløsning ved 10 mM i DIW. Verifiser de sialylerte glykankonsentrasjoner ved fluorescensdeteksjon på revers-fase høytrykks væskekromatografi analyse 18 .
- Fortynn hver glykan til 100 μM i et totalt volum på 100 μl glykan-trykkbufferI mikrocentrifugerør.
- Forbered primær amin inneholdende fluorescerende fargestoff. Solubiliser Alexa 555-hydrazid til 1 mg / ml med markørbuffer og fortynnes deretter til 1 μg / ml i et totalt volum på 1 ml.
MERK: Ethvert annet primær aminholdig fargestoff kan brukes med en passende bølgelengde i henhold til lysbildescanneren.
MERK: Markeringspunktene letter nettverksjustering i hver blokk under analyse. - Forbered menneskelige IgG STD-kurvfortynninger: lag 0,5 ml av en stamopløsning av humant IgG ved 160 ng / μl i STD-kurvebuffer. Fortynn stammen 1: 1 seks ganger for å oppnå 80, 40, 20, 10, 5 og 2,5 ng / μl, alt i STD-kurvebuffer i et totalt volum på 200 μl hver.
MERK: Andre Ig-isotyper kan brukes hvis det er egnet for forsøket ( f.eks. Humant IgA, IgM, IgE eller et Ig av en annen organisme). - Plasser 384-brønnplaten på is. Ved hjelp av en elektronisk multi-pipette, alikvot 7 μl av hver glykan, markør og STD-kurve IgG-fire replikereS av hver-i henhold til plateoppsettet ( tilleggs figur 1C ). For bedre nøyaktighet, last 35 μL av hver prøve og alikvot 7 μl i hver av de fire brønnene i prøven. Sett de resterende 7 μL av hver glykan tilbake i originalrøret.
- Dekk platen med parafilm og spinn ned i 2 minutter ved 250g og 12 ° C. Plasser platen ved romtemperatur (RT), beskyttet mot lys. Ikke avdekk platen før fuktigheten i rommet når 60-70%.
3. Programmering av nano-skriveren
- Åpne "Microarray Manager" -programvaren. Bruk "Metodeegenskaper" -vinduet.
- Sett opp arbeidsbordet layout: velg "56 lysbilde konfigurasjon."
MERK: Dette er en forhåndsdefinert konfigurasjon som tillater utskrift av 56 lysbilder. Kalibrere for hver type plate, pin og utskriftsformat ( tilleggs figur 2 , trinn 1). - Velg "Pin Configuration"| "Pin Tool 1x4 9 mm."
MERK: Dette er en forhåndsdefinert konfigurasjon for bruk av fire pins ( tilleggs figur 2 , trinn 2). - Definer "Pin type". Beregn og opprett pin type som passer for utskrift.
MERK: Dette trinnet definerer hvor mange flekker en pinne skal skrive ut før omdyping i prøven 384 brønn og bør optimaliseres for de forskjellige stifttypene og glidoverflatenes kjemi.
MERK: Ved bruk av 946MP3-pinner, sett på to viktige problemer: 1) Hver pinne kan skrive opptil 140 homogene punkter og 2) Forspotting er viktig for å tømme overflødig væske fra spissen av pinnen før du skriver ut på lysbildene. Derfor programmerer du hvert stift for å skrive ut 20 pre-spots på en pre-printing blokk (optimalisert for 946MP3 pinner på epoxy-belagte lysbilder).- Beregn totalt antall trykte flekker per prøve.
MERK: Her skriver hver pinne 4 punkter per underarray (blokk); Totalt 4 delrapporter per lysbilder = 16 punkter / slide. Etter 7 lysbilder, skriver hver pin 16 x 7 = 112 punkter. I tillegg gir 20 pre-spots før utskrift 132 steder / dip. Derfor er pin type definert som "946MP3-132 flekker" (4 flekker per prøve per blokk x 4 blokker x 7 lysbilder + 20 pre-spots = 132). - Opprett "Pin type" ( tilleggs figur 2 , trinn 3). Trykk på "Setup" (venstre panel av programvaren) | "Micro Spotting Pins" | "Nytt navn" (946MP3-132 flekker). Definer antall punkter per dip (132), spotdiameteren (100 μm), opptaket (0,25 μL), levering (0,7 nL) og minimumpunktavstanden (100 μm). Trykk "OK" | "OK".
- I vinduet Metodeegenskaper velger du den opprettede pin typen: "946MP3-132 flekker."
- Beregn totalt antall trykte flekker per prøve.
- Definer vaskeforholdene. Sett "Vask før start" og "Vask etter etterbehandling" til "Normal vask" ( Tillegg Figur 2 , trinn 4).
- Definer "Plate liste."
MERK: Dette er prøvemønsteret fra platen (rekkefølgen av dips fra 384 brønnplaten) i henhold til plateoppsettet. For å laste opp platen i platelisten, sett opp et platerprøvemønster.- Opprett tallerken "Sampling Pattern." Gå til "Maler" ( tilleggs figur 3 ) | "Sampling Patterns." Gi et nytt navn ( f.eks. JoVE array) og velg "Insert" | "Fyll øverst på bunnen" | "Pin Tool 1 x4 9 mm." Velg rekkefølgen av brønnhenting i henhold til forhåndsdefinert plateoppsett ( tilleggs figur 1A ). Trykk "OK" | "OK".
- Legg plateuttakmønsteret. Klikk på høyre side av "Plate list" -cellen ( tilleggs figur 3 ) | "Legg til tallerken" og velg det riktige plateprøvemønsteret ("JoVE array" beskrevet i trinn 3.6.1.). Velg "Normal vask". trykk"OK" | "OK".
- Gå til "Eksempelplater" og endre posisjonsforskyvningen til 1 (som bestemmer hvor platen er plassert på arraydekselet).
MERK: Forskjellige posisjoner på 0 er nærmere sonikatorbadet. - Definer "Microarray Print Design." Beregn blokkene mellom blokkene og avstanden.
- Vurder dimensjonene til utviklingsverktøyet som deler lysbildet i 16 brønner på 7 x 7 mm, med 2 mm mellomrom mellom delarrayer (totalt 9 mm mellom blokkene, tilleggsbilde 4 ).
- Vurder dimensjonene for underarrangementer.
MERK: Avstanden mellom flekkene er 0,275 mm og det er 12 kolonner og 18 rader i dette utskriftsdesignet. De totale dimensjonene er: bredde (11 x 0.275 mm = 3.025 mm) og høyde (17 x 0.275 mm = 4.675 mm). Beregn det horisontale avstanden: 9 mm - (11 0,275) = 5,97 mm. Beregn det vertikale avstandet: 9 mm - (17 x 0.275) = 4.325 mm. Regnet utIstance fra venstre side av lysbildet: 4,43 mm + 1,07 mm = 5,5 mm. Beregn avstanden fra oversiden av lysbildet: 2,95 mm + 0,55 mm = 3,5 mm ( tilleggsbilde 4 ). - Definer "Print Designs" ( tilleggs figur 5 ). Velg "Maler" | "Print Designs" | "Ny."
- Velg "Pin Setup" | "Pin Tool 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 flekker." I kategorien "Generelt", endre "Navn på Microarray Print" ( dvs. "JoVE array"). Velg "Spot Speed" | "Replikatnummer" (4) | "Touch Point Height" (0 mm) | "Soft Touch Height" (3 mm) | "Skriv ut til alle ledige stillinger" ( tilleggs figur 5A ).
- I "Microarray" -kategorien velger du horisontal og vertikal avstand (5,9 mm og 4,325 mm fra trinn 3.8.2) og antall horisontale og vertikale mikroarrays (2). Velg "Skriv utMicroarray Horizontal "|" Print Duplicate Microarray "( tilleggs figur 5B ).
- I kategorien underdeler velger du maksimum antall kolonner (12), maksimum antall rader (18) og avstanden mellom kolonnene og radene (275 μm) ( tilleggs figur 5C ).
- På målefanen velger du avstanden fra glidens venstre side (5,5 mm), avstanden fra toppen av lysbildet (3,5 mm, beregnet i trinn 3.8.2), bredden på utskriftsknappen (25 mm) , Og høyden på utskriftslyset (75 mm) ( tilleggs figur 5D ). Trykk "OK" | "OK".
- Klikk på høyre side av "Microarray Print Designs" -cellen og velg definert design ("JoVE array" fra trinn 3.8.3; Supplerende figur 6 ).
- Definer "Slide Count" (56), og endre "Posisjon Offset" (0). Dette bestemmer poSisjon for det første lysbildet som skal skrives ut på arraydekselet ( tilleggsbilde 6 ).
- Definer "Microarray Pre-Print Design" ( tilleggs figur 6 ). Velg "Glass Block" | "Pre-Print 1 x 4 mm pin verktøy."
MERK: Denne innstillingen for spot-avstand gir 46,464 forhåndsflater (for alle 4 pinner) på glassblokken, og dermed 46,464 / 4 = 11,616 pre-spots per pin. Når plassen på pre-print-blokken var blitt brukt, stopper skriveren, og blokken må vendes over.
MERK: For å beregne etter hvor mange prøver pre-print-blokken er full, vurder følgende: Alle prøver blir tatt med 8 pin-dips i 384-brønnplaten for å fullføre 56 lysbilder (7 lysbilder per dip) og hver dip Har ytterligere 20 pre-spots, noe som gir totalt 160 pre-spots per prøve. Derfor er 11.616 / 160 = 72.6 prøver. Dermed vil pre-print glassblokken bli vendt over etter 72 prøver (for å evaluere tiden for blinking, måle hOw lang det tar for en prøve å fullføre en full kjøre på 56 lysbilder og deretter multiplisere med 72). - Velg "Bruk PrePrint Design" | "Ja" | "Scan strekkoder" (Nei) | "Skriv ut en enkelt kopi" (Nei) ( tilleggsbilde 6 ).
- Klikk på "Bekreft" ( Supplerende Figur 6 ).
- Klikk på "Lagre" og lagre metoden som en arr-fil ( f.eks. "JoVE array.arr," Supplementary Figure 6 ).
4. Skrive ut designede arrays
MERK: Alle trinn skal utføres i et rent rom med en fuktighet på 60-70% og med passende hansker og klær for beskyttelse
- Slå på nano-skriveren og luftfukteren.
- For vaskbufferen og fuktingen fylles med DI vann. Tøm vaskeflasken (avløp) og fuktighetsfelle-karboen ( Tillegg Figur 7A ).
- Sett luftfukteren til70% fuktighet og start fuktighet.
- Rengjør alle pinner før utskrift. Klargjør 50 ml varmt (65 ° C) rensepipepinne rengjøringsmiddel (15 g rensepreparat reagens og 50 ml 65 ° C vann, blandes grundig til det faste reagenset oppløses helt).
- Påfør rengjøringsløsningen på hvert tippespiss ved å dyppe tippens pensel (fin) inn i tappens rengjøringsløsning og børst overflaten på hver tippespiss.
MERK: Pin-tip rengjøringsløsning er etsende og giftig. Sørg for at du alltid bruker hansker og vernebriller når du bruker denne løsningen. Soaking pins i pin-tips rengjøring løsning i mer enn noen få minutter kan føre til permanent pin skade. - Fyll ultralydsbadet med 1 liter destillert vann og sett tappene i et flytbart stiftrengestativ i badekaret. Sonikere i 5 minutter og fjern pinnene. Tørk og forsiktig tørk med spesielle kluter.
- Påfør rengjøringsløsningen på hvert tippespiss ved å dyppe tippens pensel (fin) inn i tappens rengjøringsløsning og børst overflaten på hver tippespiss.
- Åpne "Microarray Manager" -utskriftEr programvare; Ved tilkobling settes skriverlampen på (rød / grønn). Trykk på "Stopp" | "Clear" | "Init" ( tilleggs figur 7B , trinn 1-3); Skrivehodet arm vil deretter nullstille X, Y, Z justeringer.
- For å laste pinnene inn i skrivehodet, trykk på "Load" ( tilleggs figur 7B , trinn 4) og plasser pinnene i skrivehodet i henhold til den definerte konfigurasjonen av utskrift / pinneverktøysoppsettet ( tilleggsskjema 7C ); Denne utformingen bruker 4 pins, hver skriver 4 delrader på hvert lysbilde for å få totalt 16 delrapporter per lysbilde ( tilleggsbilde 1A ). Etter å ha plassert pinnene, trykk "Init" igjen.
- Monter lysbildene på arraydekselet. Åpne glideboksen og rengjør hvert lysbilde ved å blåse nitrogengass med høy renhet. Plasser ønsket antall lysbilder på matriseplattformen. Hold lysbildene med to fingre i nederste hjørner, og legg deretter lysbildet inn i detposisjon. Hold de to høyre hjørnene og skyv de venstre hjørnene forsiktig til glidelåsen passer godt inn i sin stilling. Skyv forsiktig mot venstre nederste hjørne for å sikre tett passform ( tilleggsskjema 7D ).
- Rengjør forblokkglasset med destillert vann, 70% etanol og 100% etanol og la det lufttørke (bruk kun dedikert vaskerør). Plasser pre-block glasset i sin posisjon på dekk.
- Fyll et sonikatorbad ( tilleggs figur 7B ). Trykk på "Fyll" i 55 s og trykk deretter på "OK". Tørk sonikatoren ved å klikke "Avløp" i 20 s og trykk deretter på "OK". Gjenta fyllingen og avløp en gang til, og fyll deretter igjen i 55 s.
- Fyll vaskebadet ( tilleggsbilde 7B ): trykk "Prime" i 40 s og trykk deretter "OK".
- Plasser 384-brønnplaten med alikvoterte prøver inn på plassering på arraydekselet og fjern parafilmdekselet.
- Når utskrift er fullført, må du tømme sonikatorbadet ( tilleggsskjema 7B ) og slå av luftfukteren.
- Tillat lysbildene å tørke på arraydekselet i 16-24 timer uten fukting.
- Nummer lysbildene med en alkohol / løsningsmiddelresistent merkepenn og oppbevar dem i en vakuumforseglet boks i mørket.
5. Behandling og utvikling av arrays
- Ta ut et lysbilde fra vakuumforseglet boks og legg den i en kjemisk hette i 5 minutter, oppreist forsiden for å fordampe overflødig væske.
- Skann lysbildet ved høyeste forsterkning (950 PMT) for å sikre at alle flekkene er skrevet ut.
- Fortsett med kjemisk blokkering av epoksygrupper på lysbildet
- Tilbered 50 ml etanolaminblokkerende oppløsning (0,1 M Tris-HCl, pH 8 og 0,05 M etanolamin). Bland 140 ml DIW med 8,8 ml Tris-HCl (1,7 M, pH 8) og 0,45 ml etanolamin (16,6 M). Overfør til en 50-mL-fargerør ( tilleggsbilde 8A ) og varm til 50 ° C.
- Hydrater lysbildet. Plasser lysbildet i et flekkerør fylt med DIW, dekk det med folie, og inkuber i 5 minutter med langsom og forsiktig risting ved RT.
- Blokker de reaktive epoksygruppene på lysbildet. Dyp lysbildet i 50 ml flekkerøret fylt med forvarmet etanolaminblokkerende oppløsning, deksel med folie, og inkuber i 30 minutter med langsom og forsiktig risting ved romtemperatur.
- Kast løs etanolaminblokkløsningen i den riktige biohazard-søppelbeholderen, og legg glidelåsen i et nytt, rent flekkerør fylt med 50 ° C DIW. Dekk med folie og inkuber i 10 minutter med langsom og forsiktig risting ved RT.
- Kast vannet og overfør lysbildene til en glassfargebolter ( tilleggsbilde 8B ). Plasser glassfargebolten i en svingplateholder og centrifuger tørketrøret i 5 minutter ved 200 xg og RT.
- Legg lysbildet på en 16-brønn divider ( tilleggs figur 8C ).
- Klargjør PBST-vaskeløsning: 50 ml fosfatbuffert saltvann (PBS), pH 7,4 + 0,1% Tween-20.
- Forbered biologisk blokkeringsløsning (PBS-OVA): 5 ml PBS, pH 7,4 + 1% kyllingalvalbumin (10 mg / ml).
MERK: Valget av blokkerende reagens er kritisk for suksessen med deteksjon av anti-Neu5Gc-antistoffer. Ovalbumin er laget av kyllinger som, som mennesker, ikke kan syntetisere Neu5Gc, forårsaker mangel på uttrykk for denne Sia. For påvisning av Neu5Gc kan selv mindre forurensninger dramatisk redusere analysens følsomhet, noen ganger ikke til å oppdage noen anti-Neu5Gc-reaktivitet. For eksempel inneholder det mest brukte blokkeringsreagenset, bovint serumalbumin (BSA), selv om det ikke er glykosylert i seg selv, bovin IgG-forurensninger som bærer Neu5Gc-molekyler og konkurrerer derfor med wMed trykte glykaner når de bindes til prøve med anti-Neu5Gc-antistoffer 19 , 20 . - Prewet brønnene. Bruk en multi-pipette, alikvot 200 μl PBST i glidebroene, plasser dem i et dekket fuktig kammer og rist i 5 minutter.
MERK: Fuktighetskammeret er et glassskuff med et vått håndklepapir, dekket med nylonfolie og folie for å beskytte prøvene mot lys. - Fjern PBST ved å bla og tappe forsiktig på et rent papirhåndkle og alikvote 200 μl PBS-OVA-blokkeringsbuffer i hver brønn. Plasser i et fuktig kammer og inkuber i 1 time ved romtemperatur ved forsiktig risting.
- Klargjør primær deteksjon fortynnet i PBS-OVA blokkeringsbuffer, som angitt i tabell 2 .
MERK: For kvalitetskontroll (QC) av denne sialoglycan-mikroarrayen, bruk flere Sia-bindingsproteiner: Sambucus nigra lectin (SNA), isolert fra elderbærbark, forventes å gjenkjenne Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis Lectin II (MALII) forventes å gjenkjenne Siaa23; Og kylling anti-Neu5Gc IgY forventes å gjenkjenne alle Neu5Gc-holdige sialoglykaner. I tillegg bruker forskjellige humane sera prøver til profil anti-Neu5Gc IgG respons. Konsentrasjonen av lektiner / antistoffer / serum bør kalibreres eksperimentelt. - Flett tørr PBS-OVA blokkeringsbuffer og tilsett 200 μL primær antistoff per brønn (minimum volum per brønn: 70 μl), inkuber i et fuktig kammer i 2 timer.
- Flick tørke den primære deteksjons og det vaskes 4 ganger med PBST (mellom den 3. og 4. vask, inkuber sleiden i PBST i 5 minutter i den fuktige kammer). Vask en gang med PBS.
- Forbered det sekundære antistoffet i PBS, som angitt i tabell 2 .
- Flick tørk PBS og tilsett 200 μL sekundær antistoff. Inkubér i 1 time ved RT med risting.
- Flick tørk det sekundære antistoffet og vask fire ganger med PBST (mellom 3rd og 4. vask, inkuber sleiden i PBST i 5 minutter i den fuktige kammer).
- Fjern forsiktig rammen og plasser lysbildene i et 50 ml lysrør fyllt med PBS og rist i 5 min.
- Fyll to lysrørbatterier ( tilleggsbilde 8D ) med DIW, plasser lysbildet i glidebryteren, og dypp det inn i badekaret. Dukkert raskt 10 ganger og deretter overfør til det andre badet og dukkert 10 flere ganger. Inkuber i 10 minutter ved RT med risting.
- Kast vannet og overfør lysbildet til en glassfargelager ( tilleggsbilde 8B , la lysbildet lufttørke). Plasser glassfargebolten i en svingplateholder og centrifug tørr lysbildet i 5 minutter ved 200 g og RT.
- Skann lysbildet og lagre det i en vakuumforseglet boks i mørket.
6. Array Skanning og data analyse
- Åpne lysrørskannerens lysrør og la den varme i 5 min. ÅpneSkanning og analyse av programvare.
- Still inn skanneparametrene ( tilleggsbilde 9A ): Skann ved 532 nm og 100% strøm med en forsterkning på 350 PMT, med en linje til gjennomsnittlig og en 0 μm fokusposisjon. Bruk en oppløsning på 10,0 μm pikselstørrelse.
MERK: Skanneparametere kan justeres til forskjellige lysbilder, fluorescens og oppløsning. - Skann den utviklede lysbilden. Åpne skannerdøren og plasser lysbildet inne, array vendt nedover. Start skanning (grønn "Spill" -knappen på menyen for programvarenavigasjonspanelet, tilleggsbilde 9B ).
- Lagre de skannede lysbildene som en tiff-fil.
- Forbered lysbildet for analyse. Velg "Load array list" og last opp den aktuelle GAL filen som kartlegger arrayene i hver blokk på lysbildet ( tilleggs figur 9C ).
MERK: GAL-filen inneholder informasjon om både identiteten og plasseringen (X, Y) for hvert sted på lysbildet. Denne filen kan opprettesAv skriverprogramvaren som eksporterer en tabulatoravgrenset tekstfil basert på samplingsidentiteter i 384 brønnkildeplaten og det definerte utskriftsdesignet. - Still innjusterings- og analyseparametrene. Trykk på "Alternativ" -knappen på menyen for programvarenavigasjonspanelet ( tilleggsskjema 10 ).
- Definer justeringsparametrene. Finn sirkulære funksjoner, endre størrelse på funksjoner under justering med 50 - 350%, begrense funksjonsbevegelse til en maksimal oversettelse på 40 μm, unflag-funksjoner som mislykkes bakgrunnsterskel (KPI-terskel 0), anslår innpakning og rotasjon når du finner blokker og automatiser bilderegistrering (10 piksler) ( tilleggsbilde 10 ).
- Definer analyseparametrene: W1 / 532-forhold, normal standardavvik, analyser fraværende funksjoner og bakgrunnsuttraksjon. Klikk på "velg" og deretter "Lokal bakgrunnsmedian", og sett 2 piksler for å ekskludere og en 3-pikslers bredde på bakgrunnen. Trykk "OK". SeT skannermetningsnivået til standard ( tilleggs figur 10 ).
MERK: Bakgrunnsuttrekkingsmetoden er avhengig av eksperimentell design og kan endres etter spesifikke behov. - Juster funksjonene kartene. Sett inn programmet i blokkmodus (trykk på "B"), velg alle blokker (Ctrl + A), plasser array kartnettene, og juster alle blokker (Alt + Shift + F7) ( Supplerende Figur 11 ).
- Avgrens funksjonstilpasningen i hver blokk. Zoom (trykk på "Z" for å komme inn i zoom-modus) i øvre venstre blokk, trykk "B" igjen (blokkmodus), og trykk på rutenettet på denne blokken. Bare flytt rutenettet til denne blokken til den justeres perfekt med blokken og trykk F5 for å justere funksjonene i denne valgte blokken. Gjenta nettbevegelsen og F5 justeringen til flekkene er perfekt sirklet. Gjør det samme for hver av de 16 blokkene til alle nettene er på plass.
- Analyser og lagre dataene. Velg alle blokkene (Crtl +A) og analyser deretter dataene (Alt + A). Lagre analyseresultatene (Ctrl + U) som en .gpr-fil.
- Åpne den lagrede .gpr-filen i et regnearkprogram og analyser intensiteten til hvert sted basert på fluorescens etter lokal bakgrunnsuttraksjon (F532-B532).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Array Utskrift, utvikling og analyse:
Utskrift av en sialoglycan-mikroarray med flere glykanprøver og humane IgG STD-kurver i 16 forskjellige blokker krever grundig kalibrering for å sikre at alle prøver skrives ut så jevnt som mulig i alle 16 blokker per lysbilde og til alle lysbilder i samme utskrift. Derfor er det nødvendig med flere kalibreringsforsøk før de spesifikke utskriftsparametrene bestemmes, inkludert buffersammensetning for hver type prøve, glidetype og fremstilling, 384 brønnplattetype, fuktighetsnivåer, prøvevolum i 384 brønnplaten, mengde pre -printing for hver type prøve, humant IgG STD-kurvekonsentrasjoner og markørtype. Holdbarheten til slike trykte sialoglycan array-lysbilder ble validert for å vare i opptil 10 måneder i en vakuumforseglet boks i mørket ved romtemperatur. I alle utskriftseksperiment er uniformitetVidere overvåket og validert gjennom kvalitetskontrolleksperimenter ved bruk av Sia bindende lectiner og antistoffer. Utviklings- og skanningsprotokollene ble optimalisert for å oppnå jevnhet og nøyaktighet ved å sammenligne prøver innenfor og mellom lysbilder fra samme utskriftsrute. Lysbildene er utviklet med 16-brønndeler, som sikrer riktig separasjon mellom blokkene, ved hjelp av optimaliserte blokkeringsforhold (kjemiske og biologiske), vasker og inkubasjonstider. Den primære og sekundære deteksjonen ble omfattende kalibrert for å sikre maksimal deteksjon med minimal bakgrunn og ikke-spesifikk binding. Ved skanning og analyse ble resultatene overført til en regnearkfil og analysert for å bestemme gjenkjenningen i hvert sted. Hvert punkt ble utsatt for en outlier-kontroll og utelatt hvis den ikke møtte QC (hvis% CV er> 20 og stedet er utenfor rekkevidden av ett standardavvik bort fra gjennomsnittet av de fire replikatene). Så, den gjennomsnittlige signalintensiteten avteR subtraksjonen av lokal bakgrunn ble gjennomsnittlig for replikaterte punkter per prøve for å generere det relative fluorescens-enhetens (RFU) datapunkt per trykt prøve. Når ensartetheten av IgG STD-kurvene ble validert i alle testede blokker, ble RFU-verdiene normalisert i ng / μL IgG, slik at det var sjansen til bedre å sammenligne prøver innenfor og mellom eksperimenter.
Sia-binding High-throughput Assay:
Sialoglycan arrays kan brukes til å detektere determinanter ( f.eks. Proteiner, lektiner, antistoffer, virus, etc. ) som binder Sia-holdige glykaner. For QC etter utskrift brukes Sia-bindende plantelektiner og anti-Neu5Gc IgY 19 . SNA binder a2-6-bundet Sia, MALII binder α2-3-bundet Sia, og anti-Neu5Gc IgY binder Neu5Gc-holdige sialoglykaner, men binder ikke Neu5AC-holdige sialoglykaner 19 , som vist i figur 2A . QC-eksperimentet tar sikte på å validere spotutskrift og identitet og mangel på variasjon mellom de trykte blokkene ved hjelp av de fire forskjellige pinnene. Blokk-til-blokkvariabilitet overvåkes ved å utvikle fire blokker for hver primær deteksjon per lysbilde og ved å sammenligne blokker som ble skrevet ut med hver av de fire pinnene med samme primære detekteringsdel. En sammenligning gjøres da for å sikre at ingen store forskjeller er tilstede.
Humane sera inneholder forskjellige anti-Neu5Gc antistoffer 6 med implikasjon for forskjellige humane sykdommer 2 , 21 , 22 , 23 . For å evaluere sialoglycan-anerkjennelse i humant sera-IgG ble 12 sera fra friske humane donorer analysert på den trykte sialoglykan-micrOarray og utviklet ved hjelp av fluorescensmerket anti-humant IgG ( figur 2B ). Hver trykt blokk inneholder en human IgG STD-kurve som er sammenlignbar og homogen i alle blokkene ( figur 2C ). Først etter validering av kvaliteten på STD-kurvene i hver blokk ( Figur 2C ), blir glykanflekker resultater normalisert i henhold til skråningen i blokken og deretter multiplisert med fortynningsfaktoren. Som vist i figur 2B inneholder alle testede humane sera forskjellige nivåer av anti-Neu5Gc IgG, med nesten ingen gjenkjenning av de sammenpassede parene av Neu5Ac-holdige sialoglykaner. Videre er anti-Neu5Gc IgG-gjenkjenningsmønstre svært varierte mellom disse 12 forskjellige serumene, både i intensitetsnivået og mangfoldet.
Figur 1: OversiktAv Array Utskrift, Utvikling og Bildeanalyse. ( A ) Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2 er vist som en representativ Neu5Gc-containg Sia-glykan, med en primær amin som er trykt på epoksybelagte glassruter. ( B ) Trykte arrays er utviklet med forskjellige Sia-bindende proteiner, etterfulgt av deteksjon med et passende fluorescensmerket sekundært antistoff. Hver undergruppe kan utvikles individuelt. ( C ) Skanning av det probede lysbildet i en fluorescensskanner genererer et bilde som analyseres videre ved hjelp av skannerens bildeprogramvare. Under-arrays er overlaid med et grid kartlegging hvert sted på arrays og fluorescens oppdaget for hvert sted. Resultatene blir deretter overført til en regnearkfil. Et enkelt utvalg i en enkelt brønn er skjematisk representert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Profiler av Sialoglycan Microarrays Bruke forskjellige Sia-bindende Proteiner.
Lysbildene ble utviklet med 16 forskjellige primære deteksjonsdeler, en i hver blokk. ( A ) Representant 3 blokker av et QC-lysbilde som viser bindingsmønstrene av de Sia-spesifikke plantelektene SNA og MALII og polyklonal monospesifikk kylling anti-Neu5Gc IgY. Resultatene er presentert som RFU i heatmap format for hver enkelt blokk (røde, hvite og blå, som representerer 100 th, 50 th, og 0 th persentiler, henholdsvis). ( B ) 12 forskjellige sunne humane sera ble testet ved en 1: 100 fortynning og påvist med anti-huamn IgG til profil anti-Neu5Gc IgG-reaktivitet. RFU-data ble normalisert til ng / μL ved å dividere hver verdi med IgG STD-kurvehellingen i hver spesifikke blOck og deretter multiplisert med fortynningsfaktoren. De data som er representert i heatmap format for alle blokker kombinert (røde, hvite og blå, som står te 100 th, 50 th, og 0 th persentiler, henholdsvis). ( C ) Human IgG STD kurver av de 12 blokkene utviklet med humane sera som hadde blitt brukt til å normalisere dataene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Glycan ID | Struktur | |||
| 1 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 2 | Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH 2 </ Sub> NH 2 | |||
| 3 | Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 4 | Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 5 | Neu5Acα6GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 6 | Neu5Gcα6GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 7 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 8 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 9 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 10 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 11 | Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 12 | Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 1. 3 | Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 14 | Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 15 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 16 | (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 17 | Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 18 | Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 19 | Neu5Acα6Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 20 | Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 21 | Neu5Acα3Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 22 | Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 23 | Neu5,9Ac 2 α6GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 24 | Neu5Gc9Acα6GalNAcαO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 25 | Neu5Acα3GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 26 | Neu5Gcα3GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 27 | Neu5Acα6GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 28 | Neu5Gcα6GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 29 | Neu5,9Ac 2 α3GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 30 | (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 31 | Neu5,9Ac 2 α6GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 32 | Neu5Gc9Acα6GalβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 33 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 34 | Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 35 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 36 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | ||||
| 38 | Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 39 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
| 40 | Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO (CH2) 2-CH2-NH2 | |||
Tabell 1: Liste over trykte glycaner.
| Primær sekundær | Antistoff / Lectin | Lager konsentrasjon | spesifisitet | Arbeidsfortynning / konsentrasjon |
| Primær deteksjon | Biotinilated-MALII | 1 mg / ml | Sialinsyre i a2-3-binding | 1:50, 20 μg / ml |
| Biotinilated-SNA | 2 mg / ml | Sialinsyre i a2-6-binding | 1: 100, 20 ug / ml | |
| Kylling anti-Neu5Gc IgY | ND | Neu5Gc sialinsyre | 1: 7000 | |
| Humant serum | 100% | Tallrike epitoper | 1: 100 | |
| Sekundær gjenkjenning | Cy3-streptavidin | 0,75 mg / ml | biotin | 1: 500, 1,5 μg / ml |
| Cy3-anti kylling IgY | 0,75 mg / ml | Kylling IgY | 1: 2000, 0,375 μg / ml | |
| Cy3-anti humant IgG H + L | 0,6 mg / ml | HumaN IgG | 1: 1500, 0,4 μg / ml |
Tabell 2: Liste over primære og sekundære deteksjonsproteiner.
Supplerende figurer: Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En vellykket glycan microarray-fabrikasjon krever nøye planlegging og inneholder flere viktige trinn i protokollen. Disse inkluderer: (1) planlegging av blokk- og plateoppsett som definerer alle etterfølgende parametere ( f.eks. Avstander, avstand, mengde prøver og utskrift); (2) rengjøring av pinnene og sikring av pin integritet, noe som er kritisk for å kontrollere spot homogenitet; (3) opprettholder høy luftfuktighet under utskrift, kritisk for å unngå prøvefordampning under lange utskrifter, noe som kan kompromittere spot homogenitet; (4) velge riktige justerings- og analyseparametere, som kan påvirke resultatene ( f.eks. Bakgrunnsuttrekkingsmetode, terskel og fleksibilitet i spotstørrelse).
Metoden kan endres ytterligere for å møte spesifikke eksperimentelle design og mål. For eksempel kan forspottingsnummeret modifiseres for å bedre passe til hver type materiale som skal skrives ut på matrisen. Stiftvasketrinnet underUtskriften kan optimaliseres for å passe til forskjellige utskriftsmaterialer, med enten kortere eller utvidede vaskesykluser. Videre kan mengden av flekker en pinne skrives ut per dip, endres for å inkludere flere eller færre flekker, men krever separat kalibrering for hver type materiale som brukes på matrisen. Typen av fluorescensmarkøren og dens konsentrasjon kan modifiseres, så lenge den inneholder den riktige kjemiske gruppen for konjugering ( dvs. primær amin for epoksybelagte lysbilder). Konsentrasjoner og typer STD-kurver kan utvides ( f.eks. Human / mus / andre organismer IgG, IgM, IgA, etc. ). Buffervilkårene kan optimaliseres for å passe forskjellige materialer, fortrinnsvis mangler materialer med primær amin for å unngå ikke-spesifikk binding til matrisen, noe som vil føre til økt bakgrunn. Viktig, for optimal påvisning av Neu5Gc, må det biologiske blokkeringsreagenset være fritt for Neu5Gc (for eksempel unngå BSA amd-melk), da dette kan redusere Neu5Gc-sialoglykan-deteksjon og jegNcrease bakgrunn 19 , 20 . Primær og sekundær detekteringskonsentrasjoner bør optimaliseres for å unngå høy bakgrunn og ikke-spesifikk binding. I tillegg kan skanneparametere ( f.eks. Effekt, forsterkning og oppløsning) modifiseres for å redusere bakgrunn eller forbedre lave signaler. Endelig kan justerings- og analyseparametere modifiseres for å passe til høy bakgrunn eller forskjellig formede funksjoner. Ytterligere informasjon og retningslinjer angående anbefalte standarder for rapportering av glykan mikroarray data er nylig beskrevet av MIRAGE-initiativet 17 , som til slutt kan lette datadeling og tolkning.
Oppsummert gir glykanmikroarrays et robust verktøy for å undersøke glykan-biomolekyl-interaksjoner og kan tilpasses ulike biologiske prøver. Anti-Neu5Gc-antistoffer spiller forskjellige roller i human sykdom 23 . For eksempel i kreftAnti-Neu5Gc-antistoffer spiller to roller: på den ene side tjener de som potensielle biomarkører, men på den annen side tjener de som potensielle terapeutiske midler 7 , 21 , 24 . Disse antistoffene bidrar også til forverring av aterosklerose 25 , effekten av xenotransplantasjon 20 , 26 og effekten av glykosylerte bioterapeutiske midler 27 . Dermed er profilering av anti-Neu5Gc-antistoffer i forskjellige humane prøver av voksende interesse, og høy gjennomstrømningsanalyser, som den her beskrevne, kan bidra til å fremme vår forståelse av deres roller i menneskers helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av en forskningskarriereutviklingstildeling fra Israels forskningsfond, et tilskudd fra det israelske nasjonale nanoteknologiinitiativet og Helmsley Charitable Trust for et fokalt teknologisk område for nanomedisiner for personlig terapeutisk medisin (VP-K) og nasjonalt Institutt for helse tilskudd R01GM076360 (til XC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
