Summary
يتم مترافق البروتينات الأسرة الصغيرة المتصلة ubiquitin المعدل (سومو) للمخلفات يسين من البروتينات المستهدفة لتنظيم مختلف العمليات الخلوية. وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول للكشف عن البروتين الشبكية (الميزانية العادية) سومويلاتيون في ظل الظروف الداخلية والخارجية في الخلايا البشرية.
Abstract
تعديلات بوستترانسلاشونال للبروتينات حاسمة بالنسبة للتنظيم السليم لتوصيل الإشارة داخل الخلايا. بين هذه التعديلات، الصغيرة المتصلة ubiquitin المعدل (سومو) هو بروتين ubiquitin مثل تساهمي المرتبط ببقايا يسين من مجموعة متنوعة من البروتينات المستهدفة لتنظيم العمليات الخلوية، مثل النسخ الجيني وإصلاح الحمض النووي والبروتين التفاعل والتدهور والنقل سوبسيلولار وتوصيل الإشارة. ويستند النهج الأكثر شيوعاً للكشف عن البروتين سومويليشن التعبير وتنقية البروتينات المعلمة المؤتلف في البكتيريا، مما يسمح في المختبر بيوكيميائية فعل وبسيطة وملائمة لمعالجة ميكانيكية الأسئلة. ومع ذلك، نظراً لتعقد عملية سومويلاتيون في فيفو، أنها أكثر تحديا لكشف وتحليل البروتين سومويلاتيون في الخلايا، وخاصة عندما تكون تحت الظروف الذاتية. كشف دراسة حديثة أجراها أصحاب هذه الورقة أن الشبكية الذاتية (الميزانية العادية) البروتين، القامع ورم أمر حيوي لتنظيم السلبية لتطور دورة الخلية، سومويلاتيد على وجه التحديد في المرحلة G1 المبكر. وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لكشف وتحليل "الميزانية العادية سومويليشن" في ظل الظروف الداخلية والخارجية على حد سواء في الخلايا البشرية. هذا البروتوكول مناسبة للتحقيق الشكلية والوظيفية في السومو-تعديل الميزانية العادية، فضلا عن العديد من استهداف سومو البروتينات الأخرى، في الخلايا البشرية.
Introduction
مراقبة دقيقة لتطور دورة الخلية في الخلايا حقيقية النواة يستند إلى شبكة تنظيمية ضيقة، مما يضمن أن أحداث معينة تجري طريقة مرتبة1،2. واحد من اللاعبين الرئيسيين في هذه الشبكة هو البروتين الشبكية (الميزانية العادية)،1،القامع الورم المستنسخة الأولى3. البروتين Rb يعتقد أن منظم سلبية لتطور دورة الخلية، لا سيما بالنسبة G0/G1 S المرحلة الانتقالية، والورم النمو4،5. فشل الدالة Rb أما مباشرة يؤدي إلى خبيثة اللاصقة الأكثر شيوعاً في الأطفال، والشبكية، أو يساهم في تطوير العديد من أنواع أخرى من السرطان5. وعلاوة على ذلك، تشارك في العديد من المسارات الخلوية بما في ذلك الخلية التمايز، الكروماتين يعيد البناء، والمبرمج بوساطة الميتوكوندريا3،،من67الميزانية العادية.
تعديلات بوستترانسلاشونال تلعب دوراً محوريا في تنظيم الميزانية العادية وظيفة8،9. الفسفرة واحد مثل هذا التعديل، وأنه يؤدي عادة إلى المنظمة الممولة من الميزانية العادية. في هادئة G0 الخلايا، الممولة من الميزانية العادية بنشاط مع مستوى منخفض الفسفرة. كما خلايا التقدم من خلال مرحلة G0/G1، الميزانية العادية التتابع فرط--فوسفوريلاتيد سلسلة من مؤنزم cyclin تعتمد على البروتين (كدكس) وسيكلينس، مثل cyclin E/CDK2 و cyclin د/CDK4/6، الذي يعطل Rb والقضاء على قدرتها على قمع دورة الخلية المتعلقة بالجينات التعبير4،10. يمكن أيضا تعديل الميزانية العادية بمعدل المتصلة ubiquitin الصغيرة (سومو)11،،من1213.
سومو هو بروتين ubiquitin مثل تساهمي المرتبط بمجموعة متنوعة من البروتينات المستهدفة. من الأهمية بمكان للعمليات الخلوية المتنوعة، بما في ذلك تنظيم دورة الخلية، والنسخ، والبروتين الخلوي التعريب وتدهور، والنقل والحمض النووي الإصلاح14،،من1516، 17 , 18-مسار التصريف "سومو" يتكون من الإنزيم تفعيل E1 سومو ديميريك SAE1/UBA2، واحد E2 التصريف الإنزيم Ubc9 ومتعددة E3 ligases والبروتياز سومو على حدة. عموما، يجب معالجة الوليدة سومو البروتينات بروتيوليتيكالي لتوليد شكل ناضج. تنشيط بواسطة هيتيروديمير E1 سومو ناضجة وثم نقل إلى E2 الإنزيم Ubc9. أخيرا، هو تساهمي مترافق جليكاين ج--المحطة الطرفية من السومو إلى يسين المستهدفة من الركازة، ومما ييسر هذه العملية عادة ب E3 ligases. يمكن إزالة البروتين السومو من الركازة معدلة من البروتياز محددة. وقد كشفت دراسة سابقة بواضعي هذه الورقة أن "سومويلاتيون م ع" الزيادات الملزمة بأن CDK2، مما يؤدي إلى فرط الفسفرة في المرحلة G1 المبكر، هي عملية ضرورية ل تقدم دورة الخلية13. كما أثبتنا أن فقدان "سومويليشن م ع" أسباب تكاثر خلية انخفض. وعلاوة على ذلك، أنه اتضح مؤخرا أن يحمي سومويليشن Rb البروتين Rb من proteasomal دوران، مما يزيد من مستوى الميزانية العادية البروتين في خلايا19. ولذلك، سومويليشن دوراً هاما في وظيفة الميزانية العادية في مختلف العمليات الخلوية. لمزيد من الدراسة نتيجة الوظيفية والفسيولوجية أهمية "سومويليشن الميزانية العادية"، من المهم تطوير وسيلة فعالة لتحليل حالة السومو من الميزانية العادية في الخلايا البشرية أو أنسجة المريض.
سومويليشن عملية ديناميكية للغاية، وعكسها. وبالتالي، من الصعب عادة لكشف البروتينات سومو تعديل الظروف الذاتية تماما. وتعرض هذه الورقة طريقة لاكتشاف الذاتية "م ع سومويليشن". وعلاوة على ذلك، فإنه يوضح كيفية الكشف عن خارجية "سومويلاتيون م ع" م ع البرية من نوع و الطفرات السومو التي تفتقر إلى11. على وجه الخصوص، وصف جاكوبس et al. أسلوب لزيادة تعديل سومو الركازة معين على وجه التحديد بتوجه الانصهار Ubc9 سومويلاتيون (UFDS)20. استناداً إلى هذا الأسلوب، يصف هذا البروتوكول كيفية تحليل سومويلاتيون القسري "من الميزانية العادية" وآثارها الفنية. نظراً لأن مئات ركائز سومو قد وصفت سابقا وتم تحديد أكثر من ركائز سومو المفترضة من العديد من الاختبارات المستندة إلى البروتين، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على تحليل السومو-تعديل هذه البروتينات في الخلايا البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-"الكشف عن سومويلاتيون م ع الذاتية" في مرحلة مبكرة G1
- الخلية المزامنة الثقافة ودورة الخلية.
- HEK293 الحفاظ على الخلايا في النمو المتوسطة التي تحتوي على دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 1% بكتيريا القلم و 10% الجنيني البقري المصل (FBS) في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 في حاضنة. مزامنة
- الخلايا HEK293 في مرحلة G0.
- عدد الخلايا HEK293 باستخدام ~1.5 x 10 هيموسيتوميتير والبذور 7 خلايا في 15 سم طبق مع 25 مل النمو المتوسط ل 24 ساعة قبل العلاج. بعد التوصل إلى مجموعة من 70% إلى 80%، أسبيراتي المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع 5 مل بريوارميد مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
- إضافة 25 مل دميم التي تحتوي على 1% البنسلين والستربتوميسين واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ل 72 h. تغسل الخلايا خارج اللوحة باستخدام برنامج تلفزيوني المثلج مل 3. نقل الخلايا في أنبوب مل 5 جديدة-
- رهنا بجزء صغير من خلايا تحليل دورة الخلية بالتدفق الخلوي (الخطوة 1، 2)؛ وجمع غالبية الخلايا المتبقية بالطرد المركزي في 200 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وثم تخزينها في الثلاجة الترا-انخفاض درجة حرارة حتى التحليل من سومويليشن م ع.
- للحصول على المرحلة G1 الخلايا، في نهاية عملية المزامنة G0، إزالة دميم وإضافة المتوسطة النمو مرة أخرى جديدة، مما يسمح للخلايا HEK293 لإعادة إدخال دورة الخلية. ثم جمع الخلايا في مراحل مختلفة من G1 (G1 المبكر: 30 دقيقة؛ G1: ح 2) لدورة الخلية تحليل وكذلك سومو الاعتداء. مزامنة
- الخلايا HEK293 إلى المرحلة S باستخدام الأسلوب كتلة thymidine مزدوجة.
الخلايا
- HEK293 تنمو خلايا إلى كونفلوينسي نسبة 50% والمياه والصرف الصحي مع برنامج تلفزيوني بريوارميد. ثم أضف المتوسطة النمو وتستكمل مع thymidine 2.5 ملم ح 18 (الخانة الأولى)-
- إزالة المتوسطة المحتوية على thymidine ومن ثم تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني بريوارميد. إضافة المتوسطة النمو الطازجة ح 14 بالإفراج عن الخلايا.
- تجاهل المتوسطة مع ماصة وإضافة النمو المتوسطة وتستكمل مع thymidine 2.5 ملم لآخر ح 18 (الخانة الثانية) قبل إجراء تحليل لدورة الخلية و "الميزانية العادية سومويليشن".
- التزامن G2/M، لوحة ~1.5 × 10 7 HEK293 الخلايا إلى طبق 15 سم مع 25 مل النمو المتوسط ح 24. قم بإضافة نوكودازولي إلى المتوسط حتى يتم الحصول على تركيز نهائي من 400 نانوغرام/مليلتر. وأخيراً، احتضان الخلايا ح 16 قبل إجراء تحليل دورة الخلية و "سومويلاتيون م ع".
- تحليل دورة الخلية بالتدفق الخلوي-
- إعادة تعليق HEK293 متزامنة في برنامج تلفزيوني، ومن ثم إصلاحها تعليق خلية مستخدماً المثلج 70% إيثانول ح 2 4 درجة مئوية. لاحظ أنه للتقليل إلى أدنى حد تقسيم الخلية، إضافة تعليق خلية dropwise إلى الإيثانول 100% المثلج للحصول على تركيز نهائي ل إيثانول 70% بينما بلطف فورتيكسينج.
- الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 500 x ز، ثم بعناية تجاهل المادة طافية وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة للطرد المركزي-
- إضافة 500 ميليلتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 50 ميكروغرام/مل الحمض النووي وصمة عار يوديد propidium، 0.1% تريتون X-100 و 1 ميكروغرام/مل رناسي A في الخلايا، ومزيج جيد. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- تخزين العينات في 4 درجات مئوية حتى التحليل عن طريق التدفق الخلوي-
- إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية Rb البروتين.
ليساتيس
- تحضير HEK293 الخلية.
- الخلايا HEK293 متزامنة بلطف إعادة تعليق لهم في 1 مل إيمونوبريسيبيتيشن راديو المثلج المقايسة (ريبا) تحلل المخزن المؤقت (الجدول 1) التي تتضمن طازجة إضافة 20 مم ن-اثيلماليميدي، مثبطات إيسوبيبتيداسي التي يمكن أن كتلة البروتياز السومو واستقرار يصرف السومو.
- كذلك تجانسه الخلايا على الجليد بتجانس دونس أو سونيكيشن أو ببساطة يمر عبر 10 مرات من خلال إبرة ز 21 يعلق على حقنه 2 مل. ثم احتضان الخلايا على الجليد للحد الأدنى 5
ملاحظة: الصوديوم المنظفات أنيونى دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي) في المخزن المؤقت للمعهد الملكي أمر حاسم لتحديد لاحقة من الميزانية العادية-سومو، كما أنها يمكن أن تقضي على الإشارة غير محدد سومو مشتقة من التفاعل غير التساهمية بين البروتين الميزانية العادية وأخرى سومو-الأنواع غير العادية-
- الطرد المركزي ليساتيس الخلية في ز س 18,000 لمدة 30 دقيقة على 4 درجة مئوية. نقل سوبيرناتانتس إلى 1.5 مل الصغير-الطرد المركزي أنابيب جديدة.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين البروتينات في-80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل. - لإعداد عنصر تحكم الإدخال لكل عينة لوصمة عار الغربية لاحقاً، حفظ جزء صغير من المادة طافية الموصوفة أعلاه بأنبوب جديد ومخزن في-80 درجة مئوية.
- إلى supernatants أعلاه، أضف ميكروغرام 1 من الماوس غير محددة غلوبيولين مناعي G (IgG) من نفس الأنواع وايستب كجسم Rb [مونوكلونل]، و 20 ميليلتر من الملاط A/G-سيفاروسي البروتين 50%. ثم احتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف.
- الطرد المركزي هذه العينات في 3,000 س ز لمدة 3 دقائق على 4 ° "جيم بعناية" جمع supernatants دون إزعاج الخرز، وتحويلها إلى 1.5 مل الصغير-الطرد المركزي أنابيب جديدة. لكل من العينات، إضافة 5 ميليلتر م ع جسم الأولية وميليلتر 40 50% بروتين الملاط A/G-سيفاروسي. ثم احتضانها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف.
- جمع الخرز بالطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية بعناية قبل بيبيتينج. لاحظ أنه لتفادي فقدان حبة، لا نضح الجاف الخرز. أغسل
- الخرز أربع مرات مع 1 مل من المخزن المؤقت ريبا. كل مرة، ومزج الأنابيب جيدا بالتناوب عليها في 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة جمع الخرز بانخفاض سرعة الطرد المركزي في س 3,000 ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية وتجاهل ثم سوبيرناتانتس-
- بعد إزالة سوبيرناتانتس من الغسيل النهائي، إعادة تعليق الخرز في 30 ميليلتر 1 × الصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) تحميل المخزن المؤقت (الجدول 1)، ومزيج جيد.
- إينكوباتي كتلة الأنابيب عند 100 درجة مئوية في حرارة للحد الأدنى 10 العينات في 12,000 س ز لمدة 1 دقيقة بيليه الخرز الطرد المركزي. عناية جمع supernatants دون إزعاج الخرز، وتحويلها إلى 1.5 مل الصغير-الطرد المركزي أنابيب.
- الغربية وتحليل العينات من 4% إلى 20% التدرج الحزب الديمقراطي الصربي صفحة جل لطخة أو تخزينها في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
- تحضير HEK293 الخلية.
2. تحليل لمعلم 6XHis "سومويليشن م ع الخارجية" في "الخلايا البشرية"
- خلية الثقافة وتعداء-
طبق
- البذور ~ 6 × 10 6 HEK293 الخلايا في 10 سم واحتضانها ل 24 ساعة في المتوسط النمو تحت ظروف ثقافة الخلية العادية للحصول على خلايا المتلاقية 75-85%. قبل تعداء، إزالة المتوسطة النمو وإضافة 6 مل من المصل انخفاض بريوارميد المتوسطة (انظر الجدول للمواد) ثم ضع الأطباق العودة إلى الحاضنة.
- الإنزيم سومويلاتيون التأسيسي "للميزانية العادية"، إضافة 15 ميكروغرام في كل معلم 6XHis Rb-Ubc9-WT والميزانية العادية-Ubc9-C93S، Ubc9-WT ووالبلازميدات Ubc9-C93S في 500 ميليلتر المصل انخفاض المتوسط في أنابيب 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي، على التوالي.
- لتحليل السومو-تصريف البرية نوع الميزانية العادية ولها متحولة معيبة سومويلاتيون، خلط 10 ميكروغرام لأي معلم 6XHis Rb-WT أو K720R م ع بلازميد جنبا إلى جنب مع التجارة والنقل-SUMO1 (10 ميكروغرام) خفضت في 500 ميليلتر المتوسطة المصل في 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي 13-الأنابيب-
- وفي الوقت نفسه، في أنبوب منفصل، مزيج 50 ميليلتر تعداء كاشف (انظر الجدول للمواد) خفضت في 500 ميليلتر المتوسطة المصل، واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5
- تماما الجمع بين أنابيب منفصلة اثنين المذكورة أعلاه، واحتضان في درجة حرارة الغرفة 15 دقيقة إضافة تعداء لمجمعات الكاشف/بلازميد إلى الخلايا وتواصل الثقافة 8 h الساعة 5% CO 2 و 37 درجة مئوية
- استبدال المتوسطة المصل انخفاض متوسط النمو، واحتضان الخلايا تحت ظروف طبيعية الثقافة ح 48 بعد تعداء-
- النيكل تقارب هدم البروتين Rb معلم 6XHis.
- Transfected الخلايا HEK293 واستخراج البروتينات الكلية كقسم وصف 1.3.1. °
- الطرد المركزي ليساتيس الخلية في ز س 18,000 لمدة 30 دقيقة في 4 "جيم بعناية" جمع في supernatants وتحويلها إلى أنابيب نظيفة.
ملاحظة: يمكن تجميد البروتين عند هذه النقطة لأكثر من 6 أشهر في-80 درجة مئوية. - لإعداد عنصر تحكم الإدخال لكل عينة لوصمة عار الغربية لاحقاً، قم بحفظ جزء صغير من سوبيرناتانتس الموصوفة أعلاه إلى أنبوب جديد ومخزن في-80 درجة مئوية.
- يغسل 25 ميليلتر من 50% نيكل (ني-جاتا) حمض نيتروتراياكتيك [اغروس] الخرز مع المخزن المؤقت ريبا مرتين في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 1.5 مل لكل عينة. جمع الخرز بالطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 3 دقائق على 4 درجة مئوية.
- ايميدازول إضافة 1 م لكل نموذج للحصول على تركيز نهائي 10 ملم. ثم إضافة كل عينة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرز [اغروس] ني-جاتا استعداد.
- احتضان الخرز وليساتيس ح 2 في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف. تدور الخرز في 3,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة بعناية في supernatants بيبيتينج. لتجنب فقدان حبة، لا نضح الجاف الخرز. أغسل
- الخرز مع 1 مل من يغسل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 20 مم ايميدازول (الجدول 1). كل مرة، ومزج الأنابيب جيدا بالتناوب في 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة جمع الخرز بالغزل في 3,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل سوبيرناتانتس-
- بعد الغسيل النهائي، إضافة 30 ميليلتر من شطف العازلة التي تحتوي على 250 ملم ايميدازول (الجدول 1) لكل عينة ونفض الغبار إلى المزيج. ثم احتضانها لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية الوتي البروتينات. مزيج
- كل عينة مع 6 × الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحميل المخزن المؤقت (الجدول 1). ثم احتضان هذه الأنابيب عند 100 درجة مئوية في كتلة حرارة للحد الأدنى 10
- الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 1 دقيقة بيليه الخرز. عناية جمع supernatants دون إزعاج الخرز، ونقل العينات إلى 1.5 مل أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي. العينات التي يمكن تحليلها بواسطة لطخة غربية أو تخزينها في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
3. لطخة الغربية
- تحميل إيمونوبريسيبيتيشن أو هدم العينات التي تم الحصول عليها من الخطوات السابقة إلى 4-20% التدرج الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية. إجراء التفريد في 120 الخامس لمدة 90 دقيقة لفصل البروتينات.
- نقل البروتينات من الجل إلى غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن من اليكتروبلوتينج في 300 mA لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام أسلوب نقل الدبابات. كتلة الغشاء PVDF في المخزن المؤقت كتلة تحتوي على الحليب الخالي (الجدول 1) 5% ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
- إينكوباتي الغشاء بجسم الأولية في جسم تمييع مخزن يحتوي على 3% من ألبومين المصل البقري (BSA) (الجدول 1) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. للأجسام المضادة الأولية، استخدام تركيز عامل 0.5 ميكروغرام/مل (الأجسام المضادة-SUMO1)، أو إضعاف 1:2000 (الأجسام المضادة العادية المضادة ومكافحة Tubulin)، أو 1:5,000 (مكافحة-التجارة والنقل والأجسام المضادة له)-
- يغسل الغشاء 3 x لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام 1 × تريس مخزنة المالحة مع المخزن المؤقت توين (تبسة) (الجدول 1). احتضان الغشاء مع الأنواع 1:5,000 أجسام مضادة محددة الثانوي مترافق الفجل البيروكسيديز HRP المخفف في المخزن المؤقت كتلة تحتوي على الحليب الخالي من 5 في المائة (الجدول 1). يغسل الغشاء 3 x لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام المخزن المؤقت x TBST 1-
- احتضان الغشاء مع تشيميلومينيسسينسي المحسنة (القامة) يعمل الحل. تغطي الغشاء مع غلاف بلاستيكي وتعريضه للأشعة السينية الفيلم تبعاً لقوة إشارة-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للكشف عن "سومويليشن م ع" الذاتية أثناء تقدم دورة الخلية، مزامنة هذه الدراسة أولاً خلايا HEK293 في خمس مراحل مختلفة من دورة الخلية (G0 المبكر G1، G1, S و G2/M) كما هو موضح في قسم البروتوكول في هذه الورقة. وأكد جودة المزامنة باستخدام الحمض النووي وصمة عار مع يوديد propidium يليها تحليل التدفق الخلوي (الشكل 1). بعد ذلك، جمع الخلايا وتفكيك قبل يشوه ريبا المخزن المؤقت. السومو مثبطات البروتياز، N-اثيلماليميدي، أضيفت إلى تركيز 20 مم للحفاظ على إشارة سومو الأصلية خلال التجارب نهائية. بعد إيمونوبريسيبيتيشن الأنواع Rb الذاتية تحت يشوه الظروف لمنع التفاعل غير محدد غير التساهمية، ووصمة عار الغربية التالية استخدام جسم مضاد SUMO1 المضادة، تم اكتشاف وجود إشارة سومو على وجه التحديد في أوائل المرحلة G1 (الشكل 2). على الرغم من أن سومويليشن العالمية تعززت خلال المرحلة S/G2/M، في نقطة "م ع سومويليشن" الوقت، أنها لم تغير (الشكل 2، لوحة الإدخال). هذه النتيجة تشير إلى أن "سومويلاتيون من الميزانية العادية" ليست مجرد نتيجة لتغيير النشاط العالمي في تصريف السومو. وهكذا، تسمح هذه النتائج تظهر أن إيمونوبريسيبيتيشن البروتين وغربية لطخة تحليل ووصف في هذه الورقة للكشف عن سومويليشن البروتين Rb الذاتية.
للكشف عن سومويلاتيون القسري من البروتين Rb، هذه الدراسة التي تم إنشاؤها بناء م ع سومويلاتيد التأسيسي بالصمامات Ubc9، ليجاسى E2 سومو الوحيد، ج-محطة السماح لكفاءة وانتقائية "سومويلاتيون من الميزانية العادية" (الشكل 3أ). هو أيضا تنصهر فيها الطفرة خسارة للدالة من Ubc9، C93S، ج--المحطة الطرفية من الميزانية العادية ليكون بمثابة عنصر تحكم (الشكل 3أ). ولمواصلة تعزيز خصوصية الإشارة العادية سومو، شيد Ubc9 غير تنصهر وحدها كذلك. تم transfected الأربعة والبلازميدات صاحب معلم في خلايا HEK293 عن 48 ساعة قبل أنها تم تفكيك في المخزن المؤقت ريبا تستكمل مع 20 مم ن-اثيلماليميدي. ثم تعرض جميع البروتينات لهدم المقايسة، كما هو موضح في قسم البروتوكول في هذه الورقة. وجرى تحليل البروتينات Rb التيد بوصمة عار الغربية. Ubc9 الانصهار الموجه "سومويليشن من الميزانية العادية" تم الكشف عن استخدام جسم مضاد SUMO1 المضادة (الشكل 3ب، لوحة SUMO1)، في حين أن الطفرة المعيبة Ubc9، C93S، فشلت في تحقيق هذه الإشارات. ملاحظة أن السومو عالية الكفاءة-التعديل الناجم عن الانصهار Ubc9 يؤدي إلى فرقة وزن الجزيئي أعلى حتى يمكن أن يتم الكشف عن مباشرة باستخدام الأجسام المضادة العادية، وأنه يتوافق مع إشارة سومو (الشكل 3ب، م ع الفريق). وعلاوة على ذلك، Ubc9 وحدها لم يسبب أي تصريف سومو، كذلك يؤكد سومويليشن الخاصة بالميزانية العادية (الشكل 3ب).
لأنه هو مترافق SUMO1 إلى يسين 720 من البروتين م ع11، لمواصلة تحليل سومويلاتيون Rb، هذه الدراسة إنشاء طفرة سومو التي تفتقر بالاستعاضة عن هذه المخلفات يسين مع ارجينين (K720R). لتيسير الكشف عن سومو-تصريف البروتينات Rb عابر عن اثنين، تمت إضافة بنية التجارة والنقل-SUMO1 لتعزيز الإشارات سومو داخل الخلايا. نوع البرية صاحب معلم أو المسخ كان Rb transfected شارك في خلايا HEK293 جنبا إلى جنب مع التجارة والنقل-SUMO1، متبوعاً بالسحب لأسفل فحص وتحليل قدرة تصريف الميزانية العادية-SUMO1. وكما لاحظ، ألغى المسخ K720R تماما السومو-تعديل الميزانية العادية، مواصلة تعزيز قدرة الأسلوب المقترح للكشف عن "سومويليشن م ع" (الشكل 4).
الشكل 1 : التحقق من صحة للمقايسة تزامن دورة الخلية بالتدفق الخلوي- خلايا HEK293 مثقف ومتزامنة في G0, G1 المبكرة، ومراحل دورة الخلية ك G1, S و G2/M الموصوفة في هذا البروتوكول. حددت توزيع دورة الخلية بخلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). تظهر البيانات يمثل مثالاً للتحليل الكمي لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية (n = 1). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : هو م ع سومويلاتيد في المرحلة المبكرة من G1. تم مزامنة HEK293 الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية كما هو موضح في هذا البروتوكول. وجمعت الخلايا وتفكيك في المخزن المؤقت ريبا تستكمل مع 20 مم ن-اثيلماليميدي. عناصر تحكم الإدخال تحميلها على الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة 4-20% هلام تدرج، ونقلها، ومسح مع مكافحة--SUMO1 وتوبولين المضادة، كما هو مبين. ثم تعرضوا ليساتيس الخلايا المتبقية إلى إيمونوبريسيبيتيشن باستخدام الأجسام المضادة العادية في إضعاف 1: 200. تم فصل الوينتس الناتجة من الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة 4-20% جل التدرج وإيمونوبلوتيد باستخدام الأجسام المضادة SUMO1 والأجسام المضادة العادية. وتكررت هذه التجربة مرتين مع نفس النتيجة. وقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . كشف السومو-تعديل البروتين الانصهار Rb-Ubc9- (أ) رسم تخطيطي Ubc9 توجه الانصهار بني سومويليشن (UFDS) من الميزانية العادية-(ب) "التأسيسي سومويليشن من الميزانية العادية" الناجمة عن UFDS. تم تفكيك خلايا HEK293 عابر transfected مع بنيات UFDS صاحب معلم في المخزن المؤقت للمعهد الملكي مع 20 مم ن-اثيلماليميدي. وكان المحتضنة مجموع كل عينة مع ني-جاتا [اغروس] الخرز لهدم البروتينات الانصهار صاحب معلم Rb-Ubc9 أو Ubc9 (تستخدم كعنصر سلبي)، على التوالي. تم فصل البروتينات المنقاة صحيفة بيانات السلامة-الصفحة 4-20% جل التدرج وإيمونوبلوتيد مع مكافحة SUMO1 والأجسام المضادة له. صاحب العادية: 6XHis معلم البروتينات الانصهار Rb-Ubc9؛ صاحب--Ubc9: 6XHis معلم Ubc9 فقط. Rb-Ubc9: الميزانية العادية غير معدلة-Ubc9؛ م ع سومويلاتيد م ع-Ubc9-s:-Ubc9؛ فرط-pRb-Ubc9: م ع فوسفوريلاتيد فرط-Ubc9. أن النتائج تظهر في الشكل تمثل ثلاث محاكمات مستقلة. وقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . الطفرة K720R تفتقر إلى سومو يقلل سومويليشن Rb. وكانت الزنزانات HEK293 عابر شارك transfected مع بنيات م ع صاحب نوع البرية أو المسخ جنبا إلى جنب مع التجارة والنقل-SUMO1. وجمعت الخلايا وتفكيك في المخزن المؤقت ريبا تستكمل مع 20 مم ن-اثيلماليميدي. وقد تم تحليل جزء صغير من ليساتيس مباشرة بالغربية لطخة كعنصر تحكم الإدخال. باقي ليساتيس كانت المحتضنة مع ني-جاتا [اغروس] الخرز لهدم البروتينات Rb صاحب معلم كما هو موضح في هذا البروتوكول، وكانوا إيمونوبلوتيد مع مكافحة SUMO1 والأجسام المضادة له. ملاحظة أن توت الطفرة يسين ارجينين في 720 من الميزانية العاديةحليف يلغي التعديل السومو لهذا البروتين. وأجريت التجربة مرة واحدة مع نتيجة مماثلة للتي ذكرت سابقا11. وقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الحل | المكونات | تعليقات |
| المخزن المؤقت لتحلل ريبا | 50 مم تريس، ودرجة الحموضة = 8.0; 150 مم كلوريد الصوديوم؛ NP 1%-40؛ ديوكسيتشولاتي الصوديوم 1%؛ 0.1 الحزب الديمقراطي الصربي % | إضافة مثبطات البروتياز كوكتيل و N-اثيلماليميدي فورا قبل الاستخدام. |
| المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي | 50 مم نة2بو4 الرقم الهيدروجيني = 8.0; 300 ملم كلوريد الصوديوم؛ ايميدازول 20 مم | يستخدم لسحب أسفل الفحص فقط |
| شطف المخزن المؤقت | 50 مم نة2بو4 الرقم الهيدروجيني = 8.0; 300 ملم كلوريد الصوديوم؛ ايميدازول 250 ملم | يستخدم لسحب أسفل الفحص فقط |
| 6 × تحميل المخزن المؤقت | 0.5 تريس م، الرقم الهيدروجيني = 6.8؛ والغليسيرول 30%؛ الحزب الديمقراطي الصربي 10%؛ 5% β-ميركابتوثانول؛ 0.1 برومفينول % أزرق | مخزن في-20 درجة مئوية |
| 10 × تشغيل المخزن المؤقت | 0.25 م تريس، الأس الهيدروجيني 8.6؛ 1.9 جليكاين م؛ الحزب الديمقراطي الصربي 1% | جعل 1 × تشغيل المخزن المؤقت: مزيج 100 مل 10 × تشغيل المخزن المؤقت مع 900 مل ddH2س |
| 10 × نقل المخزن المؤقت | 0.25 "م تريس"، الأس الهيدروجيني 8.3، 1.9 م جليكاين | جعل 1 × نقل المخزن المؤقت: خلط 100 مل 10 x "نقل المخزن المؤقت" مع 200 مل الميثانول و 700 مل ddH2س |
| المخزن المؤقت 10 x TBS | في 1 لتر من ddH2ز o: 24.08 تريس الأس الهيدروجيني 7.4؛ 80 جرام كلوريد الصوديوم | جعل 1 × تبسة المخزن المؤقت: مزيج 100 مل 10 x TBS المخزن المؤقت مع 900 مل ddH2س و 1 مل 20 توين |
| حجب المخزن المؤقت | 1 x TBST مع اللبن المجفف الخالي 5% | إعداد المخزن المؤقت فورا قبل الاستخدام |
| المخزن المؤقت لتمييع جسم | 1 x TBST مع أزيد الصوديوم جيش صرب البوسنة و 0.02% 3% | يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل |
الجدول 1: الحلول والمخازن المؤقتة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لكشف وتحليل سومويلاتيون الذاتية "للميزانية العادية" في الخلايا البشرية. كما أن هذا الأسلوب هو تركز تحديداً على البروتين Rb الذاتية دون أي تناوب الإشارات العالمية المتصلة سومو، أنها أداة مهمة للتحقيق في تعديل الميزانية العادية-سومو الظروف الفسيولوجية طبيعية تماما.
ولتحقيق هذا الهدف، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن: 1) على الرغم من أن سومو تضم أربعة إيسوفورمس (SUMO1-4، كل مرمزة بواسطة جينات مختلفة) بالمقارنة مع أوبيكويتينيشن، جميع أنواع سومو وفيرة أقل بكثير؛ 2) بالنسبة لمعظم البروتينات المستهدفة سومو، سوى جزء صغير من بروتين معين هو سومويلاتيد في حالة مستقرة، الذي هو نتيجة للتنافس المستمر بين الإنزيمات المشاركة في تصريف السومو وديكونجوجيشن21من14،؛ و 3) أهداف السومو يمكن الخضوع لدورات السريع سومويليشن وديسومويليشن. على سبيل المثال، تظهر البيانات الأخيرة التي حصل عليها أصحاب هذه الورقة الحالية أن الميزانية العادية-SUMO1 موجود فقط لنافذة قصيرة جداً من الزمن في المرحلة G1 مبكرا، وما يتسق مع التصور أن سومويليشن عملية ديناميكية للغاية، وعكسها13 . كل هذه الحقائق تجعل من تحدي مباشرة الكشف عن سومويليشن الذاتية بروتين معين. وهكذا، بنجاح الكشف عن هذا، من الضروري تحديد الظروف الدقيقة التي يحدث هذا التعديل. على سبيل المثال، توقيت تزامن دورة الخلية في هذا البروتوكول المقترح، حاسمة بالنسبة للكشف عن "سومويليشن م ع". إجراء تجريبي أمثل مهم أيضا للكشف عن نجاح الأنواع تعديل سومو ذات المستوى المنخفض من بروتين معين. على سبيل المثال، sonication السليم أو يمر عن طريق الإبر يمكن منع تكوين المكونات لزجة واللزوجة بسبب الحمض النووي، مما sonication السليم يمكن أن يسهل استخراج البروتين الكلي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون جسم [مونوكلونل] جيدة مع تقارب عالية بالبروتين المستهدف مفيدة لتحسين كمية ونوعية إيمونوبريسيبيتيشن. وباختصار، المهم الطريقة المقترحة لمواصلة استكشاف الظروف الفسيولوجية التي هو Rb الذاتية سومويلاتيد، وهي فرضية المقايسة الوظيفية التالية المستندة إلى أوفيريكسبريشن.
لتضخيم الإشارات سومو بروتين معين، الشائع لشركة أوفيريكسبريس هذا البروتين وكذلك الأخرى البروتينات ذات الصلة سومو (عادة ما تكون البروتين Ubc9 وسومو) في الخلايا. على الرغم من أن وصمة عار غربية بسيطة باستخدام جسم مضاد ضد الركازة هو أسهل طريقة للعثور ارتفاع الوزن الجزيئي، ونموذج سومويلاتيد لهذا البروتين، فشلنا في الكشف عن إشارة سومو العادية مع هذا الأسلوب. وهكذا، هذه الورقة تركز فقط على أسلوب للكشف عن السومو-تعديل البروتين Rb خارجية سرع. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب وصف كيفية تعزيز مصطنعة أو القضاء على تصريف السومو من الميزانية العادية. ليجاسى E2 الوحيد، تم العثور على Ubc9 لنقل سومو مباشرة إلى أهداف محددة22. وهكذا، قبل التفجير إلى المحطة الطرفية ج من الميزانية العادية، Ubc9 إلى حد كبير يعزز السومو-تعديل الميزانية العادية-باستخدام هذا الأسلوب، واضعي هذه الورقة بنجاح أثبت أن "سومويلاتيون من الميزانية العادية" بما فيه الكفاية تعزز الفسفرة الخاصة به بزيادة ملزمة لها إلى13من CDK2. وعلاوة على ذلك، دراسة النتائج الفنية لفقدان سومويلاتيون Rb، ولدت المؤلفين بناء سومو التي تفتقر إلى الميزانية العادية، كما ذكر سابقا11. باستخدام الأسلوب المقترح في هذه الورقة الحالية، فقد تبين أن سومو-الميزانية العادية اللازمة لدورة الخلية الطبيعية خلية وتطور انتشار13.
بالإضافة إلى SUMO1، SUMO2، و SUMO3 أيضا دوراً هاما في البروتين سومويلاتيون14،17. SUMO2 و SUMO3 وكثيراً ما يشار إلى SUMO2/3 لأنها ترتبط ارتباطاً وثيقا وتقاسم هوية 97%. SUMO1 سهم تشابه 50% مع SUMO2/3. من المسلم به على نطاق واسع أن SUMO1 المسؤولة عن الوظائف الفسيولوجية الخلية الطبيعية وصيانتها، بينما يغلب تشارك سومو-2/3 في الخلية الإجهاد الاستجابات15،،من1723، 24-نظراً لأن الميزانية العادية يمكن أيضا سومويلاتيد من SUMO2/3 مع الدالة غير معروف12، الطريقة المقترحة في هذه الدراسة ما زالت مناسبة لكشف وتحليل لهذا التعديل من الميزانية العادية. وبالإضافة إلى الميزانية العادية، يمكن تطبيق الأساليب الموصوفة هنا على نطاق واسع للكشف والتحليل الوظيفي من سومويليشن من مجموعة متنوعة من البروتينات المستهدفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة المنح من العلم والتكنولوجيا لجنة شانغهاي (المنحة رقم 14411961800) ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (المنحة رقم 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
