Summary
Kleine ubiquitin-gerelateerde modifier (SUMO) familie eiwitten zijn geconjugeerd lysine residuen van doel eiwitten voor het regelen van diverse cellulaire processen. Dit witboek beschrijft een protocol voor de detectie van Retinoblastoom (Rb) eiwit SUMOylation onder endogene en exogene voorwaarden in menselijke cellen.
Abstract
De posttranslationele modificaties van eiwitten zijn kritisch voor de juiste regulering van intracellulaire signaaltransductie. Onder deze wijzigingen is kleine ubiquitin-gerelateerde modifier (SUMO) een ubiquitin-achtig eiwit dat covalent lysine residuen van een verscheidenheid van target eiwitten vastzit te reguleren van cellulaire processen, zoals gene transcriptie, DNA-reparatie, eiwit interactie en afbraak, subcellular vervoer en signaaltransductie. De meest gemeenschappelijke aanpak voor het opsporen van eiwit SUMOylation is gebaseerd op de expressie en de zuivering van recombinante tagged eiwitten bij bacteriën, waardoor voor een in vitro biochemische reactie is eenvoudig en geschikt voor adressering mechanistische vragen. Als gevolg van de complexiteit van het proces van SUMOylation in vivois het echter moeilijker te detecteren en analyseren van eiwitten in cellen, met name wanneer omstandigheden endogene SUMOylation. Een recente studie door de auteurs van deze paper openbaarden dat endogene Retinoblastoom (Rb) eiwit, een tumor suppressor dat is essentieel voor de negatieve regulering van de celcyclus, specifiek SUMOylated in de vroege fase van de G1. Dit witboek beschrijft een protocol voor de detectie en analyse van Rb SUMOylation onder zowel endogene als exogene voorwaarden in menselijke cellen. Dit protocol is geschikt voor het onderzoek van het phenotypical en functionele SUMO-wijziging van de Rb, evenals vele andere SUMO-gerichte eiwitten bevatten, in menselijke cellen.
Introduction
De nauwkeurige controle van de celcyclus in eukaryote cellen is gebaseerd op een strakke regelgeving netwerk, die ervoor zorgt dat bepaalde gebeurtenissen in een geordende wijze1,2 plaatsvinden. Een van de hoofdrolspelers in dit netwerk is het Retinoblastoom (Rb) eiwit, de eerste gekloonde tumor suppressor1,3. De Rb-eiwit wordt beschouwd als een negatieve regelgever van de celcyclus, vooral voor de G0/G1 te S faseovergang,4,5van de groei van de tumor. Gebrekkige werking van de Rb van hetzij rechtstreeks leidt tot de meest voorkomende intraoculaire maligniteit bij kinderen, retinoblastoom, of draagt bij aan de ontwikkeling van vele andere soorten kanker5. Bovendien, Rb is betrokken bij veel cellulaire routes, met inbegrip van celdifferentiatie, chromatine-remodeling en apoptosis mitochondriën-gemedieerde3,6,7.
Posttranslationele modificaties spelen een sleutelrol bij de regulering van RB functie8,9. Fosforylering is een dergelijke wijziging, en het leidt meestal tot Rb inactivatie. In rustige G0 cellen is Rb actief met een lage fosforylatie niveau. Als cellen vooruitgang door middel van G0/G1-fase, is Rb sequentieel hyper-phosphorylated door een reeks van cycline-afhankelijk proteïne kinases (CDKs) en cyclines, zoals cycline E/CDK2 en cycline D/CDK4/6, die de inactivering van Rb en elimineren van haar vermogen om het onderdrukken van de celcyclus gerelateerde gen expressie4,10. RB kan ook worden gewijzigd door kleine ubiquitin-gerelateerde modifier (SUMO)11,12,13.
SUMO is een ubiquitin-achtig eiwit die covalent is gekoppeld aan een verscheidenheid van target eiwitten. Het is van cruciaal belang voor diverse cellulaire processen, waaronder celcyclus verordening, transcriptie, cellulaire eiwit-lokalisatie en afbraak, vervoer en DNA herstellen14,15,16, 17 , 18. de SUMO vervoeging traject bestaat uit het dimeric SUMO E1 activerend enzym SAE1/UBA2, de één E2 conjugating enzym Ubc9, meerdere E3 ligases en SUMO-specifieke proteasen. In het algemeen, ontluikende SUMO eiwitten moeten proteolytically worden verwerkt voor het genereren van de volwassen vorm. De volwassen SUMO is geactiveerd door de heterodimer van de E1 en vervolgens overgebracht naar het E2-enzym Ubc9. Ten slotte, de C-terminal glycine van SUMO is covalent geconjugeerd met het doel lysine van een substraat, en dit proces wordt meestal vergemakkelijkt door E3 ligases. De SUMO-eiwit kan worden verwijderd uit het gemodificeerde substraat door specifieke proteasen. Een eerdere studie door de auteurs van deze paper bleek dat SUMOylation van Rb zijn binding aan CDK2 verhoogt, leiden tot hyper-fosforylatie in de vroege fase van de G1, een proces die nodig voor de celcyclus progressie13 is. We toonden ook aan dat het verlies van Rb SUMOylation een verminderde celproliferatie veroorzaakt. Bovendien werd onlangs aangetoond dat de SUMOylation van Rb de Rb proteïne remmen omzet beschermt, waardoor het niveau van de Rb eiwitten in cellen19. Daarom speelt SUMOylation een belangrijke rol in functie van de Rb in diverse cellulaire processen. Verdere studie de functionele gevolgen en de fysiologische relevantie van Rb SUMOylation, het is belangrijk om een effectieve methode voor het analyseren van de SUMO status van Rb in menselijke cellen of weefsels van de patiënt.
SUMOylation is een omkeerbare en zeer dynamisch proces. Het is dus meestal moeilijk op te sporen van de SUMO gemodificeerde eiwitten volledig endogene omstandigheden. Dit document stelt een methode voor het detecteren van endogene Rb SUMOylation. Bovendien, het toont hoe te detecteren van exogene Rb SUMOylation van wild-type Rb én de SUMO-deficiënte mutatie11. In het bijzonder beschreven Jacobs et al. een methode voor het vergroten van de SUMO wijziging van een bepaald substraat specifiek door Ubc9 fusion geleide SUMOylation (UFDS)20. Dit protocol wordt op basis van deze methode, en beschreven hoe de gedwongen SUMOylation van Rb en de functionele gevolgen ervan te analyseren. Gezien het feit dat honderden SUMO substraten eerder beschreven zijn en meer vermeende SUMO substraten geconstateerd van vele proteomic gebaseerde testen, kan dit protocol worden toegepast om te analyseren de SUMO-wijziging van deze eiwitten in menselijke cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. detectie van endogene Rb SUMOylation in de vroege fase van de G1
- cel cultuur en celcyclus synchronisatie.
- Handhaven HEK293 cellen in groeimedium met Dulbecco ' s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 1% Pen-Strep en 10% foetale runderserum (FBS) bij 37 ° C en 5% CO 2 in een broedmachine.
- Synchroniseren de HEK293 cellen in de G0 fase.
- , Graaf de HEK293 cellen met behulp van een hemocytometer en zaad ~1.5 x 10 7 cellen in een 15 cm schotel met 25 ml groeimedium gedurende 24 uur vóór de behandeling. Na het bereiken van een samenloop van 70% - 80%, aspirate het medium en wassen de cellen tweemaal met 5 mL voorverwarmde-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 25 mL DMEM met 1% penicilline-streptomycine en Incubeer de cellen bij 37 ° C 72 h. wassen de cellen uit de plaat met 3 mL ijskoud PBS. Breng de cellen in een nieuwe tube van 5 mL.
- Een klein deel van de cellen aan de celcyclus analyse onderworpen door stroom cytometry (stap 1.2); de resterende meerderheid van de cellen verzamelen door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en vervolgens opslaan in een vriezer van ultra-lage temperatuur tot analyse van Rb SUMOylation.
- Te verkrijgen van de G1-fase cellen, aan het eind van het synchronisatieproces G0, verwijderen van de DMEM en voeg weer vers groeimedium, waardoor de cellen van de HEK293 opnieuw invoeren van de celcyclus. Vervolgens de cellen verzamelen in verschillende fasen van de G1 (vroege G1: 30 min; G1: 2 h) voor de celcyclus analyse en verdere SUMO assay.
- Synchroniseren de HEK293 cellen in de S-fase met behulp van de methode double-thymidine blok.
De cellen van de
- groeien HEK293 cellen aan een confluentie van 50% en wassen met voorverwarmde PBS. Voeg vervolgens groeimedium aangevuld met 2.5 mM thymidine voor 18u (eerste blok).
- Verwijder het medium van thymidine-bevattende en daarna wassen de cellen tweemaal met voorverwarmde PBS. Toevoegen van verse groeimedium voor 14u vrij te geven van de cellen.
- Verwijderen van het medium met een pipet en toevoegen van groeimedium aangevuld met 2.5 mM thymidine voor een andere 18 h (tweede blok) vóór het uitvoeren van een analyse van de celcyclus en Rb SUMOylation.
- Voor de G2/M synchronisatie, plaat ~1.5 × 10 7 HEK293 cellen aan een 15 cm schotel met 25 mL groeimedium gedurende 24 uur. Voeg vervolgens nocodazole naar het medium totdat een eindconcentratie van 400 ng/mL wordt verkregen. Ten slotte, Incubeer de cellen gedurende 16 uur vóór het uitvoeren van de analyse van de celcyclus en Rb SUMOylation.
- Analyse van de celcyclus door stroom cytometry.
- Resuspendeer de gesynchroniseerde HEK293 in PBS en dan fix de celsuspensie met ijskoude 70% ethanol gedurende 2 uur bij 4 ° C. er rekening mee dat de celsuspensie ontkleuring toevoegen aan de ijskoude 100% ethanol te verkrijgen van een eindconcentratie van te minimaliseren cel clustering 70% ethanol terwijl zachtjes vortexing.
- De cellen gedurende 5 min. 500 x g centrifugeren dan zorgvuldig Verwijder het supernatant en wassen van de cellen tweemaal met PBS. Herhaal de stap van de centrifuge.
- Voeg toe 500 µL PBS met 50 µg Mo/mL nucleïnezuur vlek propidium jodide, 0,1% Triton X-100 en 1 µg/mL RNase A tot en met de cellen en meng goed. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Bewaren de monsters bij 4 ° C tot analyse door stroom cytometry.
- Immunoprecipitation van eiwit van endogene Rb.
- Voorbereiden de HEK293 cel lysates.
- Lyse de gesynchroniseerde HEK293 cellen door zachtjes schorsing opnieuw hen in 1 mL ijskoud radio-immunoprecipitation assay (RIPA) lysis-buffermengsel (tabel 1) met vers toegevoegd 20 mM N-Ethylmaleimide, een isopeptidase-remmer die kunnen blokkeren van SUMO proteasen en stabiliseren van SUMO geconjugeerde.
- Verder Meng de cellen op het ijs door Dounce homogenisering, ultrasoonapparaat of gewoon passeren 10 keer via een 21 G naald aangesloten op een 2 mL spuit. Vervolgens, Incubeer de cellen op het ijs gedurende 5 minuten
Opmerking: De anionactieve detergentia natrium dodecyl sulfaat (SDS) in de buffer RIPA is van cruciaal belang voor de latere vaststelling van de Rb-SUMO, omdat het kan elimineren het aspecifieke SUMO-signaal dat is afgeleid van de niet-covalente interactie tussen de Rb eiwit en andere niet-Rb SUMO-soort(en).
- De cel lysates bij 18.000 x g gedurende 30 min Centrifugeer bij 4 ° C. het supernatant overbrengen in nieuwe micro-centrifuge buizen van 1,5 mL.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De eiwitten kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C gedurende ten minste 6 maanden. - Ter voorbereiding van de invoercontrole van elk monster voor de latere westelijke vlek, een klein gedeelte van het supernatans dat hierboven beschreven opslaan om een nieuwe buis en sla op -80 ° C.
- Toevoegen aan de bovenstaande supernatant, 1 microgram van aspecifieke muis immunoglobulin G (IgG) van dezelfde soorten en isotype als het monoklonaal antilichaam Rb en 20 µL van 50% eiwit A/G-sepharose drijfmest. Vervolgens, Incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C met zachte rotatie.
- De monsters bij 3000 x g gedurende 3 min Centrifugeer bij 4 ° C. zorgvuldig verzamelen van het supernatant zonder verstoring van de kralen, en deze overbrengen naar de nieuwe 1,5 mL micro-centrifuge buizen. Om elk van de monsters, voeg 5 µL Rb primair antilichaam en 40 µL van 50% eiwit A/G-sepharose drijfmest. Vervolgens, na een nacht bebroeden bij 4 ° C met zachte rotatie.
- Verzamel de kralen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, en verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren. Merk op dat om te voorkomen dat het verlies van de kraal, doen niet de droge kralen gecombineerd.
- Wassen de kralen viermaal met 1 mL van de buffer RIPA. Elk tijd, meng de buizen goed door rotatie hen bij 4 ° C gedurende 15 min. verzamelen de kralen door lage snelheid centrifugeren bij 3000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en vervolgens negeren het supernatant.
- Na het verwijderen van supernatant van de laatste wasbeurt, resuspendeer de kralen in 30 µL 1 x natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) laden buffer (tabel 1) en meng goed.
- Incubate de buizen bij 100 ° C in een serie blokkeren voor 10 min. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 1 minuut aan de pellet de kralen. Zorgvuldig verzamelen van het supernatant zonder verstoring van de kralen, en deze overbrengen naar 1,5 mL micro-centrifuge buizen.
- Analyseer de monsters door 4% - 20% kleurovergang SDS-pagina gel en Western blot of bewaar ze bij-20 ° C voor later gebruik.
- Voorbereiden de HEK293 cel lysates.
2. Analyse van exogene Rb-SUMOylation 6XHis-gelabeld in menselijke cellen
- cel cultuur en transfectie.
- Zaad ~ 6 × 10 6 HEK293 cellen in een 10 cm schotel en incubeer gedurende 24 uur in groeimedium onder normale cel kweekomstandigheden te verwerven van 75% - 85% confluente cellen. Voor transfectie, neem het groeimedium en voeg 6 mL van verminderde serum voorverwarmde medium (Zie Tabel van materialen) en plaats vervolgens de gerechten terug in de incubator.
- Voor de Rb constitutieve SUMOylation assay, invoegtoepassing 15 µg 6XHis-gelabeld Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT en Ubc9-C93S-plasmiden 500 µL verminderde serum medium in 1,5 mL micro-centrifuge buizen, respectievelijk.
- Te analyseren de SUMO-vervoeging van wild type Rb en haar SUMOylation-defecte mutant, meng 10 µg ofwel 6XHis-gelabeld Rb-WT of Rb-K720R plasmide samen met GFP-SUMO1 (10 µg) in 500 µL verminderd serum medium in 1,5 mL micro-centrifuge buizen 13.
- Ondertussen, in een aparte buis, Meng 50 µL transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) in 500 µL verminderd serum medium, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten
- Volledig combineren van de twee afzonderlijke buizen hierboven beschreven, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten toevoegen de transfectie reagens/plasmide complexen aan de cellen en blijven cultuur voor 8 h bij 5% CO 2 en 37 ° C.
- Verminderde serum medium vervangen door groeimedium, en Incubeer de cellen onder normale kweekomstandigheden voor 48 h na transfectie.
- Nikkel affiniteit pull-down van de Rb 6XHis-gelabeld proteïne.
- Lyse transfected cellen HEK293 en extract van de totale eiwitten zoals beschreven punt 1.3.1.
- Centrifuge de cel lysates bij 18.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. zorgvuldig verzamelen van het supernatant en deze overbrengen naar schone buizen.
Opmerking: Het eiwit kan worden bevroren op dit punt voor meer dan 6 maanden -80 ° C. - Ter voorbereiding van de invoercontrole van elk monster voor de latere westelijke vlek, het opslaan van een klein gedeelte van het supernatant hierboven beschreven om een nieuwe buis en sla op -80 ° C.
- Wassen 25 µL van 50% nikkel nitrilotriacetic zuur (Ni-NTA) agarose kralen met RIPA buffer tweemaal in een 1,5 mL micro-centrifuge buis voor elk monster. Verzamelen van de kralen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.
- Add 1 M imidazool aan elk monster te verkrijgen van een eindconcentratie van 10 mM. Dan, voeg elk monster aan de buis met de bereid Ni-NTA agarose kralen.
- Broeden de kralen en de lysates gedurende 2 uur bij 4 ° C met zachte rotatie. Draai de kralen bij 3000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C, en verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren. Parel om verlies te voorkomen, doen niet gecombineerd droge kralen.
- Wassen de kralen met 1 mL was buffer met 20 mM imidazool (tabel 1). Elk tijd, meng de buizen goed door rotatie bij 4 ° C gedurende 15 min. Collect de kralen door spinnen bij 3000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en negeren het supernatant.
- Na de definitieve wash, 30 µL van elutie buffer met 250 mM imidazool (tabel 1) toevoegen aan elk monster en flick om te mengen. Vervolgens, Incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C tot de eiwitten Elueer. Elk monster mengen
- met 6 × SDS-pagina laden buffer (tabel 1). Vervolgens, Incubeer de buizen bij 100 ° C in een blok van de warmte voor 10 min.
- Centrifuge op 12.000 x g voor 1 min aan de pellet van de kralen. Zorgvuldig het supernatant zonder verstoring van de kralen verzamelen en overbrengen van de monsters naar 1,5 ml micro-centrifuge buizen. De monsters kunnen worden geanalyseerd door de westelijke vlek of opgeslagen bij-20 ° C voor later gebruik.
3. Western Blot
- de immunoprecipitation laden of pull-down van de vorige stappen naar 4-20% kleurovergang SDS-pagina gelen verkregen monsters. Voeren van elektroforese bij 120 V voor 90 min te scheiden van de eiwitten.
- Overbrengen in de eiwitten uit de gel een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan door electroblotting bij 300 mA gedurende 90 minuten bij 4 ° C met behulp van de methode van de overdracht van de tank. Het membraan PVDF in blok buffer met 5% nonfat melk (tabel 1) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur blokkeren.
- Incubate het membraan met primair antilichaam in antilichaam verdunning buffer met 3% bovien serumalbumine (BSA) (tabel 1) 's nachts bij 4 ° C. Voor primaire antilichamen, gebruikt u een werkende concentratie van 0,5 µg/mL (anti-SUMO1 antistof) of een verdunning van 1:2000 (anti-Rb en anti-tubuline antilichamen) of 1:5,000 (anti-GFP en anti-zijn antilichaam).
- Wassen het membraan 3 x voor 10 min telkens 1 x tris-gebufferde zoutoplossing met Tween (TBST) buffer (tabel 1). Incubeer het membraan met soorten specifieke Horseradish Peroxidase HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen verdunde 1:5,000 in blok buffer met 5% nonfat melk (tabel 1). Wassen van het membraan 3 x voor 10 min telkens met 1 x TBST buffer.
- Incubeer het membraan met Verbeterde Chemiluminescentie (ECL) oplossing werken. Betrekking hebben op het membraan met plastic wrap en worden blootgesteld aan een X-ray film afhankelijk van sterkte signaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U wilt opsporen endogene Rb SUMOylation tijdens de celcyclus, deze studie eerst gesynchroniseerd HEK293 cellen in vijf verschillende stadia van de celcyclus (G0, vroege G1, G1, S en G2/M) zoals beschreven in de sectie protocol van dit document. De kwaliteit van synchronisatie werd bevestigd met behulp van de vlek van nucleic zuur met propidium jodide gevolgd door stroom cytometry analyse (Figuur 1). Vervolgens werden de cellen verzameld en lysed door denaturering van de buffer RIPA. De SUMO proteasen remmer, N-Ethylmaleimide, is toegevoegd om een eindconcentratie van 20 mM tot behoud van de inheemse SUMO signaal tijdens de experimenten. Na immunoprecipitation van de endogene Rb soorten onder de denaturering van de voorwaarden om de niet-covalente aspecifieke interactie, en de volgende westelijke vlek met behulp van een anti-SUMO1 antistof te blokkeren, werd de aanwezigheid van het signaal van de SUMO specifiek ontdekt op de vroege G1-fase (Figuur 2). Hoewel de globale SUMOylation werd verbeterd in de S/G2/M fase, op de tijd punt van Rb SUMOylation, had het niet veranderd (Figuur 2, Invoerpaneel). Deze bevinding wordt voorgesteld dat de SUMOylation van Rb niet simpelweg het gevolg van de gewijzigde mondiale SUMO vervoeging bedrijvigheid is. Dus, deze resultaten tonen aan dat de proteïne immunoprecipitation en westelijke vlek analyse beschreven in dit document toestaan voor de detectie van SUMOylation van de endogene Rb proteïne.
Om te ontdekken de gedwongen SUMOylation van de Rb proteïne, deze studie gegenereerd bouwen een constitutief SUMOylated Rb door te smelten van Ubc9, de enige SUMO E2-ligase, aan haar C-terminal waardoor efficiënte en selectieve SUMOylation van Rb (Figuur 3A). De verlies-of-function mutatie van Ubc9, C93S, is ook gesmolten aan de C-terminal van Rb om te dienen als een besturingselement (Figuur 3A). Om het specifieke karakter van de SUMO-Rb signaal verder te versterken, niet-gesmolten Ubc9 alleen zo goed aangelegd. Alle vier de plasmiden zijn-gelabeld waren transfected in de cellen van de HEK293 voor 48 uur voordat ze werden lysed in de buffer RIPA aangevuld met 20 mM N-Ethylmaleimide. Alle de eiwitten werden vervolgens onderworpen aan een pull-down assay, zoals beschreven in de sectie protocol van dit document. De eluted Rb-eiwitten werden geanalyseerd door westelijke vlek. De Ubc9 geleide fusion dat sumoylation van Rb werd ontdekt met behulp van een anti-SUMO1 antistof (Figuur 3B, SUMO1 paneel), overwegende dat de Ubc9 defect mutatie, C93S, niet voor de productie van dit signaal. Merk op dat de hoogefficiënte SUMO-wijziging veroorzaakt door Ubc9-fusion leidt tot een hoger molecuulgewicht band dat kon zelfs direct worden opgespoord door middel van het antilichaam van de Rb, en het komt overeen met het signaal van de SUMO (Figuur 3B, Rb paneel). Bovendien, Ubc9 alleen niet veroorzaakten een SUMO-conjugatie, verdere bevestiging van de Rb-specifieke SUMOylation (Figuur 3B).
Omdat SUMO1 is geconjugeerd met lysine 720 van de Rb eiwit11, verdere analyse van de Rb SUMOylation, deze studie gegenereerd een SUMO-deficiënte mutatie door dit lysine residu te vervangen door een arginine (K720R). Ter vergemakkelijking van de opsporing van SUMO-vervoeging van de twee Transient uitgedrukt Rb eiwitten, is een GFP-SUMO1-construct toegevoegd ter verbetering van het intracellulaire SUMO-signaal. Wild-type zijn-gelabeld of mutant Rb was mede transfected in HEK293 cellen samen met GFP-SUMO1, gevolgd door de pull-down bepaling en analyse van Rb-SUMO1 vervoeging vermogen. Zoals opgemerkt, de mutant K720R helemaal afgeschaft de SUMO-wijziging van de Rb, verdere versterking van de voorgestelde methode capaciteit om te ontdekken de Rb SUMOylation (Figuur 4).
Figuur 1 : Validatie van de celcyclus synchronisatie assay door stroom cytometry. HEK293 cellen werden gekweekt en gesynchroniseerd op de G0, vroege G1, G1, S en G2/M fasen van de celcyclus als beschreven in dit protocol. Celcyclus distributies werden vastgesteld door fluorescentie-activated cell sorting (FACS). De vertegenwoordigde gegevens ziet u een voorbeeld van de kwantitatieve analyse van de FACS assay (n = 1). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Rb is SUMOylated in vroeg stadium van de G1. HEK293 cellen zijn gesynchroniseerd in verschillende fasen van de celcyclus, zoals beschreven in dit protocol. De cellen werden verzameld en lysed in de buffer RIPA aangevuld met 20 mM N-Ethylmaleimide. De input besturingselementen zijn geladen op een kleurovergang gel van SDS-pagina 4-20%, overgedragen en wiste met anti-SUMO1 en anti-tubuline, zoals aangegeven. De resterende cel lysates werden vervolgens onderworpen aan immunoprecipitation met behulp van anti-Rb antilichaam bij een verdunning van 1:200. De resulterende eluents werden gescheiden door 4% - 20% kleurovergang SDS-pagina gel en immunoblotted met behulp van anti-SUMO1 antistof en anti-Rb antilichaam. Dit experiment werd herhaald tweemaal met hetzelfde resultaat. Dit cijfer is aangepast met toestemming13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Detectie van de SUMO-wijziging van de Rb-Ubc9 fusieproteïne. (A)-Diagram van de Ubc9 fusion geleide SUMOylation (UFDS) constructies van Rb. (B) constitutieve SUMOylation van Rb veroorzaakt door UFDS. HEK293 cellen Transient transfected met zijne-gelabeld UFDS constructies werden lysed in RIPA buffer met 20 mM N-Ethylmaleimide. De totale lysate van elk monster werd geïncubeerd met Ni-NTA agarose kralen naar pull-down de zijne-gelabeld Rb-Ubc9 fusion proteïnen of Ubc9 (gebruikt als de negatieve controle), respectievelijk. De gezuiverde eiwitten werden gescheiden door 4% - 20% kleurovergang SDS-pagina gel en immunoblotted met anti-SUMO1 en anti-zijn antilichamen. Zijne-Rb: 6XHis gelabeld Rb-Ubc9 fusion eiwitten; Zijne-Ubc9: 6XHis gelabeld Ubc9 alleen. RB-Ubc9: ongewijzigde Rb-Ubc9; RB-Ubc9-S: SUMOylated Rb-Ubc9; Hyper-pRb-Ubc9: hyper-phosphorylated Rb-Ubc9. De resultaten die worden weergegeven in de afbeelding zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is aangepast met toestemming13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . De mutatie SUMO-deficiënte K720R vermindert het SUMOylation van Rb. HEK293 cellen werden Transient mede-transfected met de wild type of mutant Rb-Hsi constructies samen met GFP-SUMO1. De cellen werden verzameld en lysed in de buffer RIPA aangevuld met 20 mM N-Ethylmaleimide. Een klein gedeelte van de lysates was rechtstreeks geanalyseerd door Western blot als de invoercontrole. De rest van de lysates met Ni-NTA agarose kralen te trekken van de Rb zijn-gelabelde proteïnen zoals beschreven in dit protocol werden geïncubeerd, en ze waren immunoblotted met anti-SUMO1 en anti-zijn antilichamen. Merk op dat de lysine-arginine-mutatie op 720 van Rb totbondgenoot schaft de SUMO wijziging van dit eiwit. Het experiment werd uitgevoerd eenmaal met een soortgelijk resultaat dat eerder werd gemeld11. Dit cijfer is aangepast met toestemming13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Oplossing | Onderdelen | Opmerkingen |
| RIPA Lysis Buffer | 50 mM Tris, pH = 8.0; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 1% natrium deoxycholate; 0,1% SDS | Voeg proteaseinhibitor cocktail en N-ethylmaleimide onmiddellijk vóór gebruik. |
| Wassen van de Buffer | 50 mM NaH2PO4 pH = 8.0; 300 mM NaCl; 20 mM imidazool | Gebruikt voor Pull down assay alleen |
| Elutie Buffer | 50 mM NaH2PO4 pH = 8.0; 300 mM NaCl; 250 mM imidazool | Gebruikt voor Pull down assay alleen |
| 6 x het laden van de Buffer | 0,5 M Tris, pH = 6,8; 30% glycerol; 10% SDS; 5% β-mercaptoethanol; 0,1% broomfenolblauw | Opslag bij-20 ° C |
| 10 x actief Buffer | 0,25 M Tris, pH 8.6; 1.9 M Glycine; 1% SDS | 1 x Running Buffer maken: Meng 100 ml 10 x uitvoeren Buffer met 900 mL ddH2O |
| 10 x overdracht Buffer | 0,25 M Tris, pH 8.3, 1.9 M Glycine | 1 x overdracht Buffer maken: Meng 100 mL 10 x Transfer Buffer met 200 ml Methanol en 700 mL ddH2O |
| 10 x TBS Buffer | In 1 L van ddH2O: 24.08 g Tris pH 7.4; 80 g NaCl | 1 x Buffer TBST maken: Meng van 100 mL 10 x TBS Buffer met 900 mL ddH2O en 1 mL Tween-20 |
| Blokkeerbuffer | 1 x TBST met 5% nonfat droge melk | Voorbereiden van de buffer onmiddellijk vóór gebruik |
| Antilichaam verdunning Buffer | 1 x TBST met 3% BSA en 0,02% natriumazide | Deze Buffer kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende ten minste 6 maand |
Tabel 1: Oplossingen, en buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit witboek beschrijft een protocol om te detecteren en analyseren van de endogene SUMOylation van Rb in menselijke cellen. Als deze methode specifiek op de endogene Rb eiwit zonder een afwisseling van globale SUMO-gerelateerde signaal gericht is, is het een belangrijk instrument voor het onderzoeken van de Rb-SUMO wijziging volledig natuurlijke fysiologische omstandigheden.
Dit om doel te bereiken, is het belangrijk om in gedachten te houden dat: 1) Hoewel SUMO vier isoforms (SUMO1-4, elk door verschillende genen gecodeerd) in vergelijking met ubiquitination omvat, alle de SUMO-soorten zijn veel minder overvloedig; 2) voor de meeste SUMO doel eiwitten is slechts een klein gedeelte van een bepaald eiwit SUMOylated om steady state, die is het resultaat van de constante competitie tussen de enzymen die betrokken zijn bij SUMO conjugatie en deconjugation van14,21; en 3) SUMO streefcijfers snelle cycli van SUMOylation en deSUMOylation kunnen ondergaan. Bijvoorbeeld, aantonen recente gegevens die zijn verkregen door de auteurs van deze huidige paper dat Rb-SUMO1 alleen voor een zeer korte venster van tijd in de vroege fase van de G1, die met de opvatting bestaat strookt dat SUMOylation een omkeerbare en zeer dynamisch proces13 is . Al deze feiten maken het uitdagend om direct detecteren de endogene SUMOylation van een bepaald eiwit. Om dit met succes wordt gedetecteerd, is het dus essentieel voor het identificeren van de exacte voorwaarden waaronder deze wijziging zich voordoet. Bijvoorbeeld, in deze voorgestelde protocol is de timing van de celcyclus synchronisatie cruciaal voor de detectie van Rb SUMOylation. Een geoptimaliseerde experimentele procedure is ook belangrijk voor de succesvolle opsporing van de low-level SUMO gemodificeerde soorten een bepaald eiwit. Bijvoorbeeld, juiste ultrasoonapparaat of passerende-via naalden kon verhinderen de vorming van plakkerig en viskeuze componenten toe te schrijven aan de genomic DNA, dus goede ultrasoonapparaat totaal eiwit extractie kan vergemakkelijken. Een goede monoklonaal antilichaam met hoge affiniteit aan de target-eiwit zou bovendien nuttig voor de verbetering van de kwantiteit en de specificiteit van immunoprecipitation. Kortom is de voorgestelde methode belangrijk voor het verder verkennen van de fysiologische omstandigheden waaronder endogene Rb SUMOylated is, dat is het uitgangspunt van de volgende overexpressie gebaseerde functionele test.
Als u wilt het SUMO-signaal van een bepaald eiwit te versterken, is het gebruikelijk om co-overexpress dit eiwit evenals andere SUMO-gerelateerde eiwitten (meestal Ubc9 en SUMO-eiwit) in cellen. Hoewel een eenvoudige westelijke vlek met behulp van een antilichaam tegen het substraat de makkelijkste manier om te vinden de hoger moleculair gewicht, vorm van de SUMOylated van dit eiwit is, wij niet de SUMO-Rb-signaal te detecteren met deze methode. Dus, dit papier alleen gericht op een methode om te ontdekken de SUMO-wijziging van de neergeslagen eiwitten voor exogene Rb. Bovendien, deze methode beschreven hoe kunstmatig verbeteren of te elimineren van de SUMO-vervoeging van Rb. Als de enige E2 ligase, is Ubc9 gebleken dat rechtstreeks overbrengen SUMO naar concrete doelstellingen22. Dus door te smelten naar de C-terminal van Rb, Ubc9 aanzienlijk bevordert de SUMO-wijziging van Rb. met behulp van deze methode, de auteurs van deze paper succesvol gebleken dat SUMOylation van Rb voldoende eigen fosforylatie bevorderd doordat haar bindende CDK213. Bovendien studeren de functionele gevolgen van het verlies van Rb SUMOylation, de auteurs gegenereerd een SUMO-deficiënte Rb constructie, als eerder gemeld11. Met behulp van de methode die in deze huidige voorgesteld, werd aangetoond dat SUMO-Rb noodzakelijk voor normale celcyclus progressie en cel proliferatie13 is.
Naast SUMO1, SUMO2 en SUMO3 spelen ook belangrijke rollen in eiwit SUMOylation14,17. SUMO2 en SUMO3 zijn vaak genoemd SUMO2/3 omdat ze hangen nauw samen en delen van 97% identiteit. SUMO1 deelt een 50% gelijkenis met SUMO2/3. Het is algemeen aanvaard dat SUMO1 verantwoordelijk voor normale cel fysiologische functies en onderhoud, is terwijl de SUMO-2/3 is voornamelijk betrokken bij cel stress reacties15,17,23, 24. gezien het feit dat Rb kan ook SUMOylated door SUMO2/3 met onbekende functie12, de methode voorgesteld in deze studie is nog steeds geschikt zijn voor de detectie en analyse van deze wijziging van de Rb. Naast Rb, kunnen de hier beschreven methoden algemeen worden toegepast op de detectie- en functionele analyse van het SUMOylation van een verscheidenheid van target eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de wetenschap en de technologie Commissie van Shanghai (Grant nr. 14411961800) en de National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
